RU2411915C1 - Method of diagnosing patients with brain tumours - Google Patents
Method of diagnosing patients with brain tumours Download PDFInfo
- Publication number
- RU2411915C1 RU2411915C1 RU2009136829/14A RU2009136829A RU2411915C1 RU 2411915 C1 RU2411915 C1 RU 2411915C1 RU 2009136829/14 A RU2009136829/14 A RU 2009136829/14A RU 2009136829 A RU2009136829 A RU 2009136829A RU 2411915 C1 RU2411915 C1 RU 2411915C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- medium
- added
- cytostatics
- cell suspension
- sample
- Prior art date
Links
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
Способ диагностики больных, пораженных опухолями головного мозга относится к области медицины, а именно к нейроонкологической хирургии.A method for the diagnosis of patients affected by brain tumors belongs to the field of medicine, namely to neuro-oncological surgery.
Статический анализ показывает, что заболеваемость злокачественными опухолями (глиомами) головного мозга составляет 5-8 случаев на 100000 населения. Несмотря на улучшение диагностики смертность больных интракраниальными опухолями остается высокой, а результаты лечения неудовлетворительными. Ведущая роль в терапии больных с интракраниальными опухолями принадлежит хирургическому методу лечения. Медиана выживаемости после хирургического лечения составляет 20 недель. Однако использование только хирургического лечения данной нозологической группы приводит к быстрому рецидивированию процесса, т.е. является паллиативным методом при отсутствии дальнейшей терапии. Наряду с хирургическим лечением важнейшим компонентом терапии больных глиомами является лучевая и лекарственная терапия. Проведение в послеоперационном периоде лучевой терапии увеличивает медиану выживаемости до 36 недель и улучшает качество жизни больных. Химиотерапия дает возможность увеличить медиану выживаемости с 40 до 50 недель. Таким образом, используемые в настоящее время подходы к терапии больных интракраниальными опухолями (глиомами) в лучшем случае увеличивает продолжительность времени здорового состояния пациента после операции по удалению опухоли до развития рецидива (продолжение роста глиомы). Так как ситуация кардинально изменяется при развитии рецидива опухоли, возможности хирургического лечения, в том числе операций, направленных на удаление опухоли (лазерной деструкции, криодеструкции), и лучевой терапии ограничены. Поэтому перспектива на увеличение продолжительности и улучшение качества жизни больных после проведения хирургических операций по удалению опухолей прежде всего связана с эффективностью лекарственной терапии. Чувствительность глиальных опухолей различных гистотипов к различным лекарственным препаратам, в частности к цитостатикам, существенно различается. Даже среди опухолей одинакового гистологического строения в связи с выраженной гетерогенностью клеточной популяции чувствительность к цитостатикам различна. Например, анапластические астроцитомы более чувствительны к лекарственным воздействиям в сравнении с глиобластомой. Медиана выживаемости у этой категории больных достигает 157 недель. Причины недостаточной эффективности химиотерапии при лечении больных с глиомами могут быть обусловлены наличием гематоэнцефалического барьера, отека мозга, гетерогенностью клеточной популяции, обуславливающей различную чувствительность клеток к цитостатикам, биохимической и фармакологической резистентностью. Причины резистентности опухолей головного мозга, в частности, глиобластом к к химиотерапии могут заключаться и в молекулярных особенностях, таких как потеря проапоптического гена (р53) или изменение продукции антиапоптических генов (BCL-2 семейства), или присутствие белка множественной лекарственной резистентности (mdr), Р - гликопротеина или mdr - связанных протеинов, а также ряда биологических характеристик, таких как плохая перфузия опухоли, гипоксия опухоли и ацидоз, что позволяет говорить о глиомах высокой степени злокачественности как о группе опухолей, имеющих разнообразную биологию развития индивидуальную для каждого больного, и предположить отсутствие единого универсального ключа для лечения глиом. Сравнительные исследования эффективности использования при лечении различных цитостатиков у больных злокачественными интракраниальными опухолями малочисленны, поскольку эталона для оценки эффективности новых цитостатиков не существует.Static analysis shows that the incidence of malignant tumors (gliomas) of the brain is 5-8 cases per 100,000 population. Despite the improved diagnosis, the mortality rate of patients with intracranial tumors remains high, and the treatment results are unsatisfactory. The leading role in the treatment of patients with intracranial tumors belongs to the surgical method of treatment. The median survival after surgical treatment is 20 weeks. However, the use of only surgical treatment of this nosological group leads to a rapid recurrence of the process, i.e. is a palliative method in the absence of further therapy. Along with surgical treatment, radiation and drug therapy are an important component of the treatment of patients with gliomas. Conducting radiation therapy in the postoperative period increases the median survival to 36 weeks and improves the quality of life of patients. Chemotherapy makes it possible to increase the median survival from 40 to 50 weeks. Thus, the currently used approaches to the treatment of patients with intracranial tumors (gliomas) at best increase the length of time a patient's healthy state after surgery to remove the tumor until relapse develops (continued glioma growth). Since the situation changes dramatically with the development of tumor recurrence, the possibilities of surgical treatment, including operations aimed at removing the tumor (laser destruction, cryodestruction), and radiation therapy are limited. Therefore, the prospect of increasing the duration and improving the quality of life of patients after surgical operations to remove tumors is primarily associated with the effectiveness of drug therapy. The sensitivity of glial tumors of various histotypes to various drugs, in particular to cytostatics, varies significantly. Even among tumors of the same histological structure, due to the pronounced heterogeneity of the cell population, sensitivity to cytostatics is different. For example, anaplastic astrocytomas are more sensitive to drug effects than glioblastoma. The median survival in this category of patients reaches 157 weeks. The reasons for the insufficient effectiveness of chemotherapy in the treatment of patients with gliomas may be due to the presence of a blood-brain barrier, cerebral edema, heterogeneity of the cell population, which determines the different sensitivity of cells to cytostatics, biochemical and pharmacological resistance. The reasons for the resistance of brain tumors, in particular, glioblastoma to chemotherapy, may also lie in molecular features, such as the loss of a proapoptotic gene (p53) or a change in the production of anti-apoptotic genes (BCL-2 family), or the presence of a multidrug resistance protein (mdr), P - glycoprotein or mdr - related proteins, as well as a number of biological characteristics, such as poor perfusion of the tumor, hypoxia of the tumor and acidosis, which makes it possible to speak of high-grade gliomas as Rupp tumors having diverse developmental biology individual for each patient, and assume lack of a single universal key for the treatment of gliomas. Comparative studies of the effectiveness of use in the treatment of various cytostatics in patients with malignant intracranial tumors are scarce, since there is no standard for evaluating the effectiveness of new cytostatics.
В нейрохирургии известны способы диагностики больных, пораженных опухолями головного мозга, например, статья Johannes E.A., Wolff, Thomas Trilling, Gabriele Molenkamp, R. Maarten Egeler, Herbert Jurgens Chemosensitivity of glioma cels in vitro: a mota analysis, J. Res. Clin Oncol // 1999 // 125 p.481-486/. В данной статье приведены данные по чувствительности клеток глиом к химиотерапевтическим препаратам in vitro: метаанализ. При использовании химиотерапии клеток гистологических образцов глиом была использована оценка воздействия лекарственных препаратов на клетки опухоли вычислением значений коэффициента LC50 летальной концентрации - клеточной гибели 50% клеток глиомы при концентрации препаратов, которые убивают 50% и более клеток опухоли - LC10. Оценка производилась по разным методикам, в том числе и по методу Моссмана по окраске живых клеток с использованием МТТ - в растворе 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромид, продукт реакции которого с формазаном приобретает темно-синюю окраску. Анализ различных исследований позволял определить рамочные концентрации чувствительности клеточных линий опухолей к различным цитостатикам.Methods of diagnosing patients with brain tumors are known in neurosurgery, for example, an article by Johannes EA, Wolff, Thomas Trilling, Gabriele Molenkamp, R. Maarten Egeler, Herbert Jurgens Chemosensitivity of glioma cels in vitro: a mota analysis, J. Res. Clin Oncol // 1999 // 125 p. 481-486 /. This article presents data on the sensitivity of glioma cells to in vitro chemotherapeutic drugs: a meta-analysis. When using chemotherapy for cells of histological glioma samples, we used the assessment of the effect of drugs on tumor cells by calculating the LC coefficient of 50 lethal concentration - cell death of 50% of glioma cells at a concentration of drugs that kill 50% or more tumor cells - LC 10 . Evaluation was carried out using various methods, including the Mossman method for staining living cells using MTT in a solution of 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide, the reaction product of which acquires formazan dark blue color. Analysis of various studies allowed us to determine the frame concentration of sensitivity of tumor cell lines to various cytostatics.
Недостатками таких исследований являются: результаты исследований носят больше теоретический характер, т.к. использованный модельный объект (клеточные линии опухолей головного мозга крысы и человека) не позволяют оценивать чувствительность к цитостатикам опухолей каждого конкретного пациента, страдающего глиомой головного мозга, кроме того, исследования проводились in vitro, не на человеке, что недостаточно для постановки конкретного диагноза по лечению опухоли с назначением определенных лекарственных средств с определенной концентрацией.The disadvantages of such studies are: the research results are more theoretical in nature, because the model object used (cell lines of rat and human brain tumors) does not allow evaluating the sensitivity to the cytostatics of tumors of each particular patient suffering from brain glioma, in addition, the studies were conducted in vitro, not in humans, which is not enough to make a specific diagnosis for the treatment of tumors with the appointment of certain drugs with a certain concentration.
Наиболее близким решением по способу установки диагноза лечения больных, пораженных опухолями головного мозга, является материал, указанный в статье Апшкалне Д.А., Котельников В.М., Пурыньш И.Ж., Сафронов В.А. Определение индивидуальной чувствительности глиальных опухолей человека к действию химиотерапевтических препаратов // Вопросы нейрохирургии, №4, 1979 г., с.30-36. Предложенная методика включает следующие действия. После гистологического взятия образца фрагменты опухоли помещают в 12 пробирок со средой жидкостей - 10 мл среды №199 = 10% бычьей сыворотки, получали 13 пробирок. Одну пробирку со средой использовали в качестве контроля. В остальные 12 пробирок добавляли химиотерапевтические препараты: фторафур, 5-фторурацил (5-ФУ), сарколизин и метротрексат, каждый в трех концентрациях: 1 терапевтическая доза (ТД), 10ТД и 100ТД. За терапевтическую дозу принимают такую концентрацию препарата в 1 мл среды, которая равняется его концентрации, приходящейся на 1 г массы тела после однократного введения этого препарата больному в стандартной дозировке в клинических условиях. Пробирки помещают в герметический ящик с газовой смесью, содержащий 95% кислорода и 5% - углекислого газа. В течение 23 часов фрагменты опухоли инкубируют в термостате при 37°С, затем в каждую пробирку добавляли 3H-тимидин из расчета 1 мкКи на 1 мл среды и продолжали инкубировать в течение 1 часа. Суточная инкубации фрагментов опухоли в питательной среде не влияет на индекс мечения. За этот срок значительная часть клеток пролиферующей популяции в опухоли проходит фазу синтеза ДНК. Величину индекса мечения в контроле и для каждой концентрации исследовавшихся препаратов определяют в участках с наибольшим количеством меченых клеток, подсчитывая их долю среди 2000 опухолевых клеток. По полученным данным подсчитывали разницу между величиной индекса мечения в контроле и для каждой концентрации препаратов. Эту разницу нормировали по величине индекса в контроле и выражали в процентах. В случае снижения индекса мечения под воздействием препарата считали положительным, а в случае увеличения - отрицательным. По глиальным опухолям наблюдения велись по астроцитоме, глиобластоме, медуллобластоме, олигодендроглиоме и олигодендроглиобластоме. В большинстве случаев при тестировании всех химиотерапевтических препаратов отмечалось снижение величины индекса мечения по мере увеличения доз препаратов. При оценке полученных результатов было отмечено, что ни один из препаратов не оказался эффективнее остальных, каждая отдельная опухоль в различной степени реагирует на действие разных препаратов и реакция опухолевой ткани на действие препаратов in vitro не зависит от того, является данная опухоль быстро или медленнорастущей. В конце исследований было отмечено, что каждая глиальная опухоль обладает своим индивидуальным спектром чувствительности к химиотерапевтическим препаратам in vitro, отличающим ее от других опухолей.The closest solution to the method for diagnosing the treatment of patients with brain tumors is the material indicated in the article by Apshkalne D.A., Kotelnikov V.M., Purynsh I.Zh., Safronov V.A. Determination of the individual sensitivity of human glial tumors to the action of chemotherapeutic drugs // Questions of Neurosurgery, No. 4, 1979, p.30-36. The proposed methodology includes the following steps. After histological sampling, fragments of the tumor are placed in 12 tubes with a medium of liquids - 10 ml of medium No. 199 = 10% bovine serum, 13 tubes were obtained. One tube of medium was used as a control. Chemotherapeutic drugs were added to the remaining 12 tubes: fluorofur, 5-fluorouracil (5-FU), sarcolisin and metrotrexate, each in three concentrations: 1 therapeutic dose (TD), 10 TD and 100 TD. For a therapeutic dose, take such a concentration of the drug in 1 ml of medium, which is equal to its concentration per 1 g of body weight after a single administration of this drug to a patient in a standard dosage in a clinical setting. The tubes are placed in an airtight box with a gas mixture containing 95% oxygen and 5% carbon dioxide. Tumor fragments were incubated for 23 hours in an incubator at 37 ° C, then 3 H-thymidine was added to each tube at the rate of 1 μCi per 1 ml of medium and continued to incubate for 1 hour. The daily incubation of tumor fragments in a nutrient medium does not affect the labeling index. During this period, a significant part of the cells of the proliferating population in the tumor goes through the phase of DNA synthesis. The value of the labeling index in the control and for each concentration of the studied drugs is determined in areas with the largest number of labeled cells, calculating their share among 2000 tumor cells. According to the data obtained, the difference between the value of the tagging index in the control and for each concentration of drugs was calculated. This difference was normalized by the value of the index in the control and expressed as a percentage. In the case of a decrease in the labeling index under the influence of the drug was considered positive, and in the case of an increase - negative. On glial tumors, observations were made on astrocytoma, glioblastoma, medulloblastoma, oligodendroglioma and oligodendroglioblastoma. In most cases, when testing all chemotherapeutic drugs, a decrease in the labeling index was noted with increasing doses of drugs. When evaluating the results, it was noted that none of the drugs turned out to be more effective than the others, each individual tumor reacts to different degrees to the effects of different drugs, and the reaction of tumor tissue to the effect of drugs in vitro does not depend on whether the tumor is fast or slow-growing. At the end of the study, it was noted that each glial tumor has its own individual spectrum of sensitivity to chemotherapeutic drugs in vitro, distinguishing it from other tumors.
Недостатками такого способа диагностики опухолей головного мозга являются: исследования не обнаружили преимущественной эффективности использованных препаратов; при лечении больных, пораженных злокачественными опухолями, данные in vitro по сравнению in vivo недостаточно; при данной системе тестирования слишком длительный срок обработки образцов (10 дней), выраженность реакции опухоли на действие химиотерапевтического препарата часто не зависит от его концентрации, ни один из исследованных препаратов не был достаточно эффективным для 100% подавления синтеза ДНК в опухолевой ткани.The disadvantages of this method for the diagnosis of brain tumors are: studies have not found the predominant effectiveness of the drugs used; in the treatment of patients affected by malignant tumors, in vitro data are not sufficient in comparison with in vivo; with this testing system, the sample processing time is too long (10 days), the severity of the tumor response to the action of a chemotherapeutic drug often does not depend on its concentration, none of the studied drugs was effective enough for 100% suppression of DNA synthesis in tumor tissue.
Техническим результатом данного решения является повышение точности, качества и эффективности диагностики посредством индивидуального подбора новых современных цитостатиков и их комбинаций с определением их концентраций с оценкой максимальной чувствительности цитостатической функции кортикостероидов, обеспечивающих большую проницаемость из выбранных препаратов гематоэнцефалического барьера, т.е. обладающих увеличенной способностью к проникновению в центральную нервную систему; повышение качества диагностики для тестирования малых объемов опухолевой ткани in vivo, получаемых в результате малоинвазивных операций (при стереотаксической биопсии злокачественных глиом головного мозга) в случае локализации опухоли в областях малодоступных для открытого хирургического вмешательства, улучшение оценки цитотаксической функции определения индивидуальных химиопрепаратов в максимально эффективных концентрациях.The technical result of this solution is to increase the accuracy, quality and effectiveness of diagnostics by individually selecting new modern cytostatics and their combinations, determining their concentrations and evaluating the maximum sensitivity of the cytostatic function of corticosteroids, which provide greater permeability of the selected blood-brain barrier preparations, i.e. possessing an increased ability to penetrate the central nervous system; improving the quality of diagnostics for testing small volumes of tumor tissue in vivo obtained as a result of minimally invasive operations (with stereotactic biopsy of malignant gliomas of the brain) in the case of localization of the tumor in areas inaccessible for open surgical intervention, improving the assessment of the cytotactic function of determining individual chemotherapeutic drugs in the most effective concentrations.
Этот результат достигается тем, что в способе диагностики больных, пораженных опухолями головного мозга, включающем гистологическое исследование образца опухоли после ее хирургического удаления с определением ее типа и согласно этому типу назначения лекарственных препаратов, например цитостатиков, гистологический образец удаленной опухоли растирают в среде жидкости DMEM/F12 4 мл, 10% фетальной бычьей сыворотки 0,5 мл, 5% L-глуталина 0,05 мл и 5% гентамицина 0,01 мл, фильтруют, центрифугируют смесь в течение 5' со скоростью 1200 об/мин, после окончания цитофереза добавляют в смесь фосфатно-солевой буфер, отделяют клеточную взвесь и в лунки планшета вносят последнюю в концентрации 1×10 клеток на лунку в 0,1 мл среды и среду без клеток, инкубируют содержимое планшета в термостате при температуре 37°С в присутствии 5% CO2 в течение 24 часов, после инкубации в лунки с клеточной взвесью и средой вносят разные цитостатики с разной их концентрацией, после последующей инкубации смесь планшета в течение 72 часов при температуре 37°С в присутствии 5% CO2 в каждую лунку планшета добавляют 10 µМ раствора МТТ с концентрацией 5 мг/мл в фосфатно-солевом буфере, после опять инкубируют содержимое планшета в термостате в течение 4-х часов при 37°С в присутствии 5% CO2 и добавляют в каждую лунку по 100 µМ изопропанола с 0.04М HCL, затем после размешивания образцов в лунках планшета измеряют их оптическую плотность при длине волны 570 нм, оценку результатов измерения производят, сравнивая показатели измеренных оптических плотностей среды и клеточной взвеси с цитостатиком и оценивая % клеточной гибели в цитостатиках с различной их концентрацией образцов опухоли с формированием сводной таблицы результатов исследования соответствия чувствительности образца к каждой исследуемой концентрации по всем использованным цитостатикам.This result is achieved by the fact that in a method for the diagnosis of patients affected by brain tumors, including histological examination of a tumor sample after surgical removal with determination of its type and, according to this type of prescription of drugs, for example cytostatics, the histological sample of the removed tumor is ground in a DMEM liquid F12 4 ml, 10% fetal bovine serum 0.5 ml, 5% L-glutaline 0.05 ml and 5% gentamicin 0.01 ml, filtered, centrifuged the mixture for 5 'at a speed of 1200 rpm, after c Tofereza is added to the mixture with phosphate-buffered saline, the cell suspension is separated, and the last is added to the wells of the tablet at a concentration of 1 × 10 cells per well in 0.1 ml of medium and medium without cells, the contents of the tablet are incubated in a thermostat at a temperature of 37 ° C in the presence of 5 % CO 2 for 24 hours, after incubation, different cytostatics with different concentrations are added to the wells with cell suspension and medium; after subsequent incubation, the tablet mixture is added for 72 hours at 37 ° C in the presence of 5% CO 2 to each well of the tablet 10 μM MTT solution with co centration of 5 mg / ml in phosphate-buffered saline, incubated again after the content of the plate in an oven for 4 hours at 37 ° C in the presence of 5% CO 2 and were added to each well by 100 .mu.M isopropanol with 0.04M HCL, then after stirring the samples in the wells of the tablet measure their optical density at a wavelength of 570 nm, evaluate the measurement results by comparing the measured optical densities of the medium and cell suspension with a cytostatic agent and assessing the% cell death in cytostatics with different concentrations of tumor samples with ph by forming a summary table of the results of the study of the correspondence of the sensitivity of the sample to each studied concentration for all cytostatics used.
Сущность изобретения выражается в совокупности существенных признаков, достаточной для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата.The invention is expressed in the aggregate of essential features sufficient to achieve the technical result provided by the invention.
Существенными признаками предложенного способа диагностики, совпадающими с признаками прототипа, являются: А - гистологическое исследование образца опухоли после ее хирургического удаления с определением ее типа; Б - согласно типу опухоли назначение лекарственных препаратов, например, цитостатиков.The essential features of the proposed diagnostic method, coinciding with the features of the prototype, are: A - histological examination of the tumor sample after its surgical removal with determination of its type; B - according to the type of tumor, the appointment of drugs, for example, cytostatics.
Существенными отличительными признаками предлагаемого решения являются: В -гистологический образец удаленной опухоли растирают в среде жидкостей DMEM/F12 4 мл, 10% фетальной бычьей сыворотки 0,5 мл, 5% L-глуталина 0,05 мл и 5% гентамицина 0,01 мл; Г - фильтруют и центрифугируют смесь в течение 5' со скоростью 1200 об/мин; Д - после окончания цитофереза добавляют в смесь фосфатно-солевой буфер, отделяют клеточную взвесь и в лунки планшета вносят клеточную взвесь в концентрации 1×104 клеток на лунку в 0,1 мл среды и среду без клеток; Ж - инкубируют содержимое планшета в термостате при температуре 37°С в присутствии 5% CO2 в течение 24 часов; И - после инкубации в лунки с клеточной взвесью и средой вносят разные цитостатики с разной их концентрацией; К - после последующей инкубации смеси планшета в течение 72 часов при температуре 37°С в присутствии 5% СО2 добавляют в каждую лунку планшета 10 µМ раствора МТТ с концентрацией 5 мг/мл в фосфатно-солевом буфере; Л - после опять инкубируют содержимое планшета в термостате в течение 4 часов при 37°С в присутствии 5% CO2 и добавляют в каждую лунку по 100 µМ изопропанола с 0.04 м HCL; М - после размешивания образцов в лунках планшета измеряют их оптическую плотность при длине волны 570 нм; Н - оценку результатов измерения производят, сравнивая показатели оптических плотностей среды и клеточной взвеси с цитостатиком и оценивая % клеточной гибели в цитостатиках с различной их концентрацией образцов опухоли с формированием сводной таблицы результатов исследования соответствия чувствительности образца к каждой исследуемой концентрации по всем использованным цитостатикам.The salient features of the proposed solution are: A 4-ml histological sample of the removed tumor is triturated with DMEM / F12 fluids, 0.5 ml bovine fetal serum, 5% L-glutaline 0.05 ml, and 5% gentamicin 0.01 ml ; G - filter and centrifuge the mixture for 5 'at a speed of 1200 rpm; D - after the end of cytopheresis, phosphate-buffered saline is added to the mixture, the cell suspension is separated, and the cell suspension is introduced into the wells of the tablet at a concentration of 1 × 10 4 cells per well in 0.1 ml of medium and the medium without cells; G - incubate the contents of the tablet in a thermostat at a temperature of 37 ° C in the presence of 5% CO 2 for 24 hours; And - after incubation, different cytostatics with different concentrations are introduced into the wells with cell suspension and medium; K - after subsequent incubation of the tablet mixture for 72 hours at 37 ° C in the presence of 5% CO 2 , 10 μM MTT solution with a concentration of 5 mg / ml in phosphate-buffered buffer is added to each well of the tablet; L - then the contents of the tablet are again incubated in a thermostat for 4 hours at 37 ° C in the presence of 5% CO 2 and 100 μM isopropanol with 0.04 m HCL are added to each well; M - after stirring the samples in the wells of the tablet measure their optical density at a wavelength of 570 nm; Н - assessment of the measurement results is carried out by comparing the optical density of the medium and cell suspension with a cytostatic agent and evaluating the% of cell death in cytostatics with different concentrations of tumor samples with the formation of a summary table of the results of the study of the sensitivity of the sample to each studied concentration for all cytostatics used.
Способ диагностики больных, пораженных опухолями головного мозга, заключается в следующем. После хирургической операции по удалению интракраниальной опухоли головного мозга часть операционного материала (2-3 см3) - биоптат помещают в чашку объемом 20 мл. Наливают в эту чашку смесь жидкостей: DMEM/F12 - 4 мл, 10% инактивированную фетальную бычью сыворотку - 0,5 мл, 5% L-глуталина 0,05 мл и 0,01 мл 5% гентамицина, механически измельчают образец опухоли, т.е. растирают его, фильтруют и центрифугируют в течение 5 минут со скоростью 1200 об/мин. После окончания цитофереза добавляют в смесь фосфатно-солевой буфер, отделяют клеточную взвесь и разносят по 72 лункам 96 луночного планшета в концентрации 1×104 клеток на лунку в 0,1 мл среды (смесь жидкостей в чашке). А в оставшиеся 24 лунки вносят только среду. Инкубируют содержимое планшета в термостате в течение 24 часов при температуре 37°С в присутствии 5% CO2. Берутся шесть цитостатиков, наиболее эффективных при лечении глиом головного мозга, а именно: цис-платин, вепезид, винкристин, производные нитрозомочевины, доксорубицин, темодал в разной концентрации: 0,1 µМ, 1,0 µМ,10 µМ и 100 µМ (µМ - микромоль). Каждый цитостатик из 6 с разными концентрациями (в данном случае 4-мя) вносят в 3 (три) лунки (в каждых 3-х лунках помещают один цитостатик и с одной какой-либо концентрацией), таким образом, занимая 72 лунки. В остальные 24 лунки из 96 луночного планшета, содержащих среду, т.е. смесь жидкостей: DMEM/F12, 10% бычью сыворотку, 5% L глуталин, 5% гентамицин, вносят по 1 лунке разный цитостатик из шести по одной его концентрации из 4-х. Затем в каждую лунку из 96 добавляют 10 µМ раствора МТТ (МТТ - это 3-(4,5 диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум, бромид) с концентрацией 5 мг/мл в фосфатно-солевом буфере. Инкубируют содержимое планшета в течение 4-х часов в термостате при 37°С в присутствии 5% CO2. После инкубации в каждую лунку планшета добавляют по 100 µМ изопропанола с 0,04 М HCL. После тщательного размешивания образцов в лунках планшета измеряют оптическую плотность содержимого в каждой лунке при длине волны, равной 570 нм, с использованием швейцарского автоматического цитомера фирмы ПИКОН. Оценку результатов измерения производят, сравнивая показатели оптической плотности среды и клеточной взвеси с цитостатиком с различными концентрациями. Расчет % клеточной гибели производят на основе определения цитотаксического индекса С1 (по Моссману) в процентах по известной формуле.A method for the diagnosis of patients affected by brain tumors is as follows. After a surgical operation to remove an intracranial brain tumor, part of the surgical material (2-3 cm 3 ) - the biopsy sample is placed in a 20 ml cup. A mixture of liquids is poured into this cup: DMEM / F12 - 4 ml, 10% inactivated fetal bovine serum - 0.5 ml, 5% L-glutaline 0.05 ml and 0.01 ml 5% gentamicin, a tumor sample is mechanically ground, t .e. triturated, filtered and centrifuged for 5 minutes at a speed of 1200 rpm After the end of cytopheresis, phosphate-buffered saline is added to the mixture, the cell suspension is separated and 72 wells of 96 wells are placed in a concentration of 1 × 10 4 cells per well in 0.1 ml of medium (liquid mixture in a cup). And in the remaining 24 holes contribute only Wednesday. Incubate the contents of the tablet in a thermostat for 24 hours at 37 ° C in the presence of 5% CO 2 . Six cytostatics are taken that are most effective in treating brain gliomas, namely: cis-platinum, vepezid, vincristine, nitrosourea derivatives, doxorubicin, temodal in different concentrations: 0.1 µM, 1.0 µM, 10 µM and 100 µM (µM - micromole). Each of the 6 cytostatics with different concentrations (in this case 4) is added to 3 (three) wells (in each 3 wells one cytostatic is placed and with one concentration of any kind), thus occupying 72 wells. The remaining 24 wells of a 96 well plate containing medium, i.e. a mixture of liquids: DMEM / F12, 10% bovine serum, 5% L glutaline, 5% gentamicin, 1 different cytostatic of 6 each in one concentration of 4 are added per well. Then, in each well of 96, 10 μM MTT solution is added (MTT is 3- (4,5 dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium, bromide) with a concentration of 5 mg / ml in phosphate-buffered saline. Incubate the contents of the tablet for 4 hours in an incubator at 37 ° C in the presence of 5% CO 2 . After incubation, 100 μM isopropanol with 0.04 M HCL is added to each well of the plate. After thoroughly stirring the samples in the wells of the tablet, the optical density of the contents in each well was measured at a wavelength of 570 nm using a PICON Swiss automatic cytometer. The measurement results are evaluated by comparing the optical density of the medium and the cell suspension with a cytostatic agent with different concentrations. Calculation of% cell death is carried out on the basis of the determination of the cytotactic index C1 (according to Mossman) in percent according to the known formula.
Cl % = (1-OD1/OD2)×100, где Cl - цитотаксический индекс (% клеточной гибели),Cl% = (1-OD 1 / OD 2 ) × 100, where Cl is the cytotactic index (% cell death),
OD1 - оптическая плотность цитостатика определенной концентрации с культурой клеток опухоли головного мозга пациента;OD 1 - the optical density of the cytostatic drug of a certain concentration with a cell culture of a tumor of the brain of the patient;
OD2 - оптическая плотность среды, содержащей цитостатик в определенной концентрации (контроль).OD 2 is the optical density of the medium containing the cytostatic in a certain concentration (control).
Образец опухоли, находящийся в исследуемой лунке, считается чувствительным к воздействию цитостатика в случае, если цитотаксический индекс Cl (% клеточной гибели) более 50% по сравнению с контролем. В этом случае результат исследования в данной лунке (т.е. при данной концентрации цитостатика) считается положительным и обозначается как «+», в случае, если цитотоксический индекс менее 50% по сравнению с контролем, то результат исследования считается отрицательным и обозначается как «-». На основании этих данных формируется сводная таблица соответствия чувствительности образца опухоли к каждой исследуемой концентрации цитостатика (0,1 µМ, 1,0 µМ, 10 µМ и 100 µМ) по всем исследуемым цитостатикам (шести: цис-платин, вепезид, винкристин, производные нитрозомочевины, доксорубицин, темодал). Вывод о чувствительности опухоли к исследуемому цитостатику делается на основании совокупной оценки чувствительности по всем исследуемым концентрациям и представляется в виде следующей градации: «++++» - опухоль чувствительна к данному цитостатику во всех 4-х исследуемых концентрациях (0,1. 1,0, 10, 100 µМ); «+++» - опухоль чувствительна к данному цитостатику в 3-х исследуемых концентрациях из 4-х исследуемых; «++» - опухоль чувствительна к данному цитостатику в 2-х исследуемых концентрациях; «+» -опухоль чувствительна к данному цитостатику в 1-ой исследуемой концентрации.A tumor sample located in the test well is considered sensitive to the effects of cytostatic if the cytotactic index Cl (% cell death) is more than 50% compared with the control. In this case, the test result in this well (ie, at a given cytostatic concentration) is considered positive and is designated as “+”, if the cytotoxic index is less than 50% compared to the control, then the test result is considered negative and is indicated as “ - ". Based on these data, a summary table is formed of the correspondence of the sensitivity of the tumor sample to each studied cytostatic concentration (0.1 μM, 1.0 μM, 10 μM and 100 μM) for all studied cytostatics (six: cis-platinum, vepezid, vincristine, nitrosourea derivatives , doxorubicin, temodal). The conclusion about the sensitivity of the tumor to the studied cytostatics is made on the basis of a cumulative sensitivity assessment for all the studied concentrations and is presented in the form of the following gradation: “++++” - the tumor is sensitive to this cytostatic in all 4 studied concentrations (0.1. 1, 0, 10, 100 μM); “+++” - the tumor is sensitive to this cytostatic in 3 studied concentrations from 4 tested; “++” - the tumor is sensitive to this cytostatic in 2 studied concentrations; The “+” tumor is sensitive to this cytostatic in the 1st test concentration.
Индивидуальный подбор химиотерапии проведен у 20 больных с различными результатами гистологического исследования материала (образца), полученного в результате хирургических операций опухолей головного мозга. Были исследованы следующие гистологические типы опухолей: астроцитомы - 4, анапластические астроцитомы - 3, глиобластомы - 9, олигоастроцитома - 1, анапластическая олигодендроглиомы - 2, пилоцитарная астроцитома - 1. Проведена оценка эффективности цитотоксического действия стероидов в рамках подбора у 18 больных, у 14 больных получен эффект различной степени эффективности, у 4-х больных эффекта не получено.An individual selection of chemotherapy was carried out in 20 patients with various results of histological examination of the material (sample) obtained as a result of surgical operations of brain tumors. The following histological types of tumors were studied: astrocytomas - 4, anaplastic astrocytomas - 3, glioblastomas - 9, oligoastrocytomas - 1, anaplastic oligodendrogliomas - 2, pilocytic astrocytoma - 1. The efficacy of the cytotoxic effect of steroids was evaluated in 18 patients, 14 were evaluated. the effect of varying degrees of effectiveness was obtained, in 4 patients the effect was not obtained.
Клинический пример №1. Больная Г., 38 лет, госпитализирована 11.03.08 г., диагноз - олигодендроглиома правой лобной доли, имеются жалобы при поступлении на эпиприступы различной длительности в течение 3-х месяцев (с января 2008 г.). Неврологическая симптоматика представлена левосторонней пирамидной недостаточностью. По данным МРТ (магнитно-резонансной томографии) головного мозга и ПЭТ (позитроно-эмиссионной томографии) с С11 метионином олигодендроглиома с анаплазией правой лобной доли. 18.03.08 г. выполнена операция: костно-пластическая трепанация черепа в правой лобной области с заходом за среднюю линию, удаление внутримозговой опухоли передних отделов правой лобной доли парасагиттальной локализации. Гистологическое заключение - анапластическая олигодендроглиома. Выполнен подбор химиотерапии на материале образца глиомы пациентки по предложенному способу диагностики. Результаты исследований представлены в таблице 1.Clinical example No. 1. Patient G., 38 years old, was hospitalized on 03/11/08, diagnosed with oligodendroglioma of the right frontal lobe, there are complaints of admission to epiprises of various durations for 3 months (since January 2008). Neurological symptoms are represented by left-sided pyramidal insufficiency. According to MRI (magnetic resonance imaging) of the brain and PET (positron emission tomography) with C 11 methionine oligodendroglioma with anaplasia of the right frontal lobe. 03/18/08, the operation was performed: osteoplastic trepanation of the skull in the right frontal region with approaching the midline, removal of the intracerebral tumor of the anterior portions of the right frontal lobe of parasagittal localization. The histological conclusion is anaplastic oligodendroglioma. The selection of chemotherapy on the material of the patient’s glioma sample was performed according to the proposed diagnostic method. The research results are presented in table 1.
На основании данных исследования по предложенному способу диагностики начат курс химиотерапии по схеме PCV - из цитостатиков - винкристин и CCNU, а также и другие лекарственные средства согласно схемы лечения. Проведено 4 курса полихимиотерапии. По состоянию на 01.08.09 г. у больной в результате лечения достигнута полная клиническая ремиссия, больная приступила к работе, активных жалоб не предъявляет.Based on the research data on the proposed diagnostic method, a chemotherapy course was started according to the PCV regimen - from cytostatics - vincristine and CCNU, as well as other drugs according to the treatment regimen. Conducted 4 courses of chemotherapy. As of 01.08.09, the patient as a result of treatment achieved complete clinical remission, the patient started to work, does not show active complaints.
Пример 2. Больная Б., 24 года, госпитализирована 02.11.06 г. Диагноз: анапластическая астроцитома правой лобной доли. Ведущие жалобы при поступлении на появление эпиприступов виде судорог в левых конечностях без утраты сознания 1-2 раза в неделю. Неврологическая симптоматика представлена умеренной общемозговой симптоматикой. По данным МРТ головного мозга и ПЭТ с С11 метионином выявлена глиома правой лобной доли. 14.11.06 г. выполнена операция краниотомия, удаление астроцитомы верхнезадних отделов правой лобной доли. Гистологическое заключение - анапластическая астроцитома (Grade 111). Выполнен подбор лекарственных препаратов для химиотерапии на материале глиомы пациентки по предложенному способу диагностики. Результаты исследований представлены в таблице 2.Example 2. Patient B., 24 years old, was hospitalized 02.11.06, the Diagnosis: anaplastic astrocytoma of the right frontal lobe. Leading complaints upon receipt of the appearance of epiprises in the form of seizures in the left limbs without loss of consciousness 1-2 times a week. Neurological symptoms are represented by moderate cerebral symptoms. According to brain MRI and PET with C 11 methionine, a glioma of the right frontal lobe was revealed. November 14, 2006, the operation was performed craniotomy, removal of astrocytoma of the upper posterior sections of the right frontal lobe. The histological conclusion is anaplastic astrocytoma (Grade 111). The selection of drugs for chemotherapy based on the patient’s glioma material was performed according to the proposed diagnostic method. The research results are presented in table 2.
На основании данных исследования по предложенному способу с 23.11.06 проведены курсы химиотерапии с применением цитостатиков винкристин и капсул CCNU. По состоянию на 01.08.09 г. у больной достигнута полная клиническая ремиссия, активных жалоб не предъявляет. Согласно таблице оценки цитотаксической активности лекарственных средств выбирают группы препаратов, имеющих максимальную эффективность и оптимальное сочетание. Выбор винкристина и CCNN обусловлен большой проницаемостью для данных препаратов гемоатоэнцефалического барьера, т.е. большей способностью к проникновению в центральную нервную систему.Based on the research data on the proposed method, from November 23, 2006, chemotherapy courses were conducted using vincristine cytostatics and CCNU capsules. As of 01.08.09, the patient has achieved complete clinical remission, has no active complaints. According to the evaluation table of the cytotactic activity of drugs, groups of drugs are selected that have maximum effectiveness and the optimal combination. The choice of vincristine and CCNN is due to the high permeability for these preparations of the blood-brain barrier, i.e. greater ability to penetrate the central nervous system.
Таким образом, как показывают приведенные клинические примеры, предлагаемый «Способ диагностики больных, пораженных опухолями головного мозга» повышает эффективность лечения.Thus, as shown by the clinical examples, the proposed "Method for the diagnosis of patients affected by brain tumors" increases the effectiveness of treatment.
Использование изобретения «Способ диагностики больных, пораженных опухолями головного мозга» по сравнению с прототипом повышает качество и эффективность диагностики благодаря индивидуальному подбору новых современных цитостатиков и их комбинаций с определением их концентраций, оценивая и контролируя максимальную чувствительность определенного цитостатика или их совокупность по максимально эффективной их концентрации. Способ повышает также качество диагностики для тестирования малых объемов опухолевой ткани in vivo, получаемых в результате малоинвазийных операций (при стереотаксической биопсии злокачественных глиом головного мозга) в случае локализации опухоли в областях малодоступных для открытого хирургического вмешательства. По указанному способу диагностики процесс лечения был осуществлен у 20 больных, пораженных различными интракраниальными опухолями головного мозга в том числе и с злокачественными в клинике Института мозга человека ИМ. Н.П.Бехтеревой Российской Академии наук. Эффект лечения составил около 80%. Индивидуальный подход к каждому больному в зависимости от его возраста, состояния здоровья, возможности воспринимать цитостатики в определенных концентрациях показал наиболее эффективный путь лечения онкологических больных, поэтому предложенный способ диагностики может быть рекомендован для использования при лечении больных с такой патологией.The use of the invention, “A method for the diagnosis of patients with brain tumors” in comparison with the prototype, improves the quality and effectiveness of diagnosis due to the individual selection of new modern cytostatics and their combinations with the determination of their concentrations, evaluating and controlling the maximum sensitivity of a particular cytostatic agent or their combination according to their most effective concentration . The method also improves the quality of diagnostics for testing small volumes of tumor tissue in vivo obtained as a result of minimally invasive operations (with stereotactic biopsy of malignant gliomas of the brain) in the case of localization of the tumor in areas inaccessible for open surgery. According to the indicated diagnostic method, the treatment process was carried out in 20 patients affected by various intracranial brain tumors, including those with malignant diseases in the clinic of the Institute of the Human Brain IM. N.P. Bekhtereva of the Russian Academy of Sciences. The treatment effect was about 80%. An individual approach to each patient, depending on his age, state of health, and the ability to perceive cytostatics in certain concentrations, has shown the most effective way to treat cancer patients, therefore, the proposed diagnostic method can be recommended for use in treating patients with such a pathology.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009136829/14A RU2411915C1 (en) | 2009-10-05 | 2009-10-05 | Method of diagnosing patients with brain tumours |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009136829/14A RU2411915C1 (en) | 2009-10-05 | 2009-10-05 | Method of diagnosing patients with brain tumours |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2411915C1 true RU2411915C1 (en) | 2011-02-20 |
Family
ID=46309947
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009136829/14A RU2411915C1 (en) | 2009-10-05 | 2009-10-05 | Method of diagnosing patients with brain tumours |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2411915C1 (en) |
-
2009
- 2009-10-05 RU RU2009136829/14A patent/RU2411915C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ГАЙДАЕНКО К.П. и др. Возможность использования системы индивидуального подбора химиотерапии у больных злокачественными глиомами головного мозга, IV съезд нейрохирургов Украины. - Днепропетровск, 27-30 мая 2008, с.102. ATASEVER В. et al. Cytotoxic activities of new iron(III) and nickel(II) chelates of some S-methyl-thiosemicarbazones on K562 and ECV304 cells, Invest New Drugs. 2010 Aug; 28(4):421-32. Epub 2009 Jun 4, [он-лайн], [найдено 08.06.2010], найдено из базы данных PubMed. ОГОРОДНИКОВА М.В. и др. Оценка цитотоксической активности препаратов группы платина с использованием МТТ-теста. - Проблемы клинической медицины, №1(5) 2006, с.39-42. * |
| ЧЕРЕПОВИЧ B.C. и др. Оптимизация критических параметров МТТ-теста для оценки клеточной и лекарственной цитотоксичности. - БМЖ 2(16), 2006, [найдено 08.06.2010], Найдено из Интернет: <URL:http://itlab.anitex.by/msmi/bmm/02.2006/44.html. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105979958A (en) | Use of cbp/ep300 bromodomain inhibitors for cancer immunotherapy | |
| WO2018133635A1 (en) | Tumor cell zebrafish xenotransplantation model, and method of constructing and applying the same | |
| CN105641716A (en) | Imaging model in small animal living bodies with echinococcus granulosus and construction method thereof | |
| KR20210011479A (en) | Luterial and Method for Isolating and Culturing the Same | |
| CN109790585A (en) | Method for diagnosing and treating cancer of the esophagus | |
| CN112575069A (en) | Tumor evolution regulation and control model based on subclone level sensitive drug screening and establishment method thereof | |
| CN110812496A (en) | Rapid drug sensitivity detection method for antitumor drugs | |
| CN109055561A (en) | LncRNA-AP003774.1 is diagnosing and/or treating the application in breast cancers | |
| RU2411915C1 (en) | Method of diagnosing patients with brain tumours | |
| CN104884097B (en) | For drug resistant breast cancer prognosis and treatment as the miRNA for newly treating auxiliary agent and biomarker | |
| CN107012207A (en) | LRP5 is used as clinical diagnosis and the application of suppression digestive system tumor | |
| CN107753143A (en) | Build the method and system of gastric lymphoma animal model | |
| CN113025715A (en) | Application of HOP in prediction of gastric cancer prognosis | |
| KR101046883B1 (en) | How to collectively determine sensitivity to anticancer drugs | |
| RU2251692C2 (en) | Method for predicting the duration of relapse-free period in patients with mammary cancer | |
| Gu et al. | Mechanism of long-chain non-coding RNA hypoxia-inducible factor 1α-antisense RNA 1 regulating chemotherapy resistance of retinoblastoma by inhibiting hypoxia-inducible factor-α expression | |
| CN114533696B (en) | Preparation method and application of brain-targeted delivery sinPLA 2 and metformin recruitment Cheng Huawai secretion | |
| CN108743597A (en) | Application of the rhodioside in preparing Parkin protein agonist drugs | |
| CN108272795A (en) | A kind of application of monascin in preparing treatment and delaying osteoarthritis drugs | |
| CN109744199A (en) | A kind of tumour cell heterograft zebra fish model, its construction method and application | |
| RU2780780C2 (en) | Prediction of efficiency of using radiation therapy | |
| CN114478629B (en) | Super-oxygen anion free radical near infrared fluorescent probe and preparation method and application thereof | |
| CN105061378B (en) | Compound for promoting Abelta gathering and preparation method and application thereof | |
| TWI703215B (en) | A method of in vitro diagnostic for prediction of drug efficacy | |
| WO2015193702A1 (en) | Methods for determining the sensitivity or resistance of cancer cells to at least one anticancer drug and/or therapeutically active molecule |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TK4A | Correction to the publication in the bulletin (patent) |
Free format text: AMENDMENT TO CHAPTER -FG4A- IN JOURNAL: 5-2011 FOR TAG: (72) |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20121006 |