RU2410432C1 - Modified dna aptamers inhibiting thrombin activity - Google Patents

Modified dna aptamers inhibiting thrombin activity Download PDF

Info

Publication number
RU2410432C1
RU2410432C1 RU2009142862/10A RU2009142862A RU2410432C1 RU 2410432 C1 RU2410432 C1 RU 2410432C1 RU 2009142862/10 A RU2009142862/10 A RU 2009142862/10A RU 2009142862 A RU2009142862 A RU 2009142862A RU 2410432 C1 RU2410432 C1 RU 2410432C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
thrombin
aptamer
peg
aptamers
modified
Prior art date
Application number
RU2009142862/10A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Вера Алексеевна Спиридонова (RU)
Вера Алексеевна Спиридонова
Андрей Викторович Головин (RU)
Андрей Викторович Головин
Алексей Михайлович Копылов (RU)
Алексей Михайлович Копылов
Анатолий Борисович Добровольский (RU)
Анатолий Борисович Добровольский
Алексей Владимирович Мазуров (RU)
Алексей Владимирович Мазуров
Original Assignee
Государственное учреждение Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова
Федеральное Государственное Учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Государственное учреждение Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, Федеральное Государственное Учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" filed Critical Государственное учреждение Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова
Priority to RU2009142862/10A priority Critical patent/RU2410432C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2410432C1 publication Critical patent/RU2410432C1/en

Links

Images

Landscapes

  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

FIELD: chemistry; biochemistry.
SUBSTANCE: invention relates to biotechnology and medicine and specifically to direct thrombin inhibitors. The invention discloses a modified aptamer oligodeoxyribonucleotide of general formula d R-GTGACGTANGGTTGGTGTGGTTGGGGCGTCAC-R where d is deoxyribose (oligonucleotide contains deoxyribose in all positions), R denotes chemical substitutes. The substitute used is aminohexanol (NH2 group), which esterifies the phosphate group on the 5' or 3' end and PEG which is bonded on the 5' and/or 3' end. At least one of the substitutes bonded on the 5' or 3' end is polyethylene glycol (PEG). The disclosed modified DNA aptamer inhibits thrombin activity in human blood plasma by prolonging thrombin clotting time, prothrombin time and activated partial thromboplastin time and inhibits thrombin-stimulated aggregation of thrombocytes. During intravenous administration to an experimental animal, the modified DNA aptamer circulates in the blood longer than the basic aptamer RE31.
EFFECT: said DNA aptamer can serve as the base for antithrombotic medicinal agents.
6 dwg, 3 ex

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к модифицированным ДНК аптамерам, представляющим собой олигодезоксирибонуклеотиды (базовые аптамеры), конъюгированные с химическими заместителями, и обладающие антикоагулянтными свойствами, и более конкретно к прямым ингибиторам тромбина, которые могут служить основой для лекарственных антитромботических препаратов.The invention relates to the field of biotechnology and medicine, namely to modified DNA aptamers, which are oligodeoxyribonucleotides (basic aptamers) conjugated with chemical substituents and possessing anticoagulant properties, and more particularly, to direct thrombin inhibitors that can serve as the basis for antithrombotic drugs.

Для лечения и профилактики тромбозов, применяются препараты, которые либо растворяют уже образовавшийся тромб, либо препятствуют процессу тромбообразования (Машковский М.Д. Лекарственные средства, М., Медицина, 2000, т.2, стр.73-76; Энциклопедия лекарств, изд. 8, М., РЛС, 2001, стр.1503, Справочник ВИДАЛЬ, М., АстраФармСервис, 2001, стр.725).For the treatment and prevention of thrombosis, drugs are used that either dissolve an already formed thrombus or interfere with the process of thrombosis (Mashkovsky M.D. Medicines, M., Medicine, 2000, v.2, p. 73-76; Encyclopedia of drugs, ed 8, M., Radar, 2001, p. 1503, Reference VIDAL, M., AstraPharmService, 2001, p. 725).

По механизму действия все известные препараты разбиты на три группы.According to the mechanism of action, all known drugs are divided into three groups.

- Тромболитики, действие которых направлено на активацию фибринолитической системы крови и растворение тромба (стрептокиназа, урокиназа, тканевой активатор плазминогена).- Thrombolytics, the action of which is aimed at activating the fibrinolytic system of the blood and dissolving the thrombus (streptokinase, urokinase, tissue plasminogen activator).

- Антиагреганты, действие которых направлено на ингибирование агрегации тромбоцитов (аспирин, антагонисты P2Y12 рецепторов АДФ клопидогрель и др.), антагонисты гликопротеинов IIb-IIIa).- Antiplatelet agents, the action of which is aimed at inhibiting platelet aggregation (aspirin, antagonists of P2Y12 ADP receptors clopidogrel, etc.), glycoprotein antagonists IIb-IIIa).

- Антикоагулянты - препараты, действующие на свертывающую систему крови и ингибирующие образование фибрина (гепарин и его производные, непрямые антикоагулянты, прямые ингибиторы тромбина).- Anticoagulants - drugs that act on the blood coagulation system and inhibit the formation of fibrin (heparin and its derivatives, indirect anticoagulants, direct thrombin inhibitors).

То, что препараты действуют на разные системы тромбообразования, дает возможность их комбинированного применения, что повышает эффективность и специфичность терапии.The fact that the drugs act on different systems of thrombus formation makes it possible to use them in combination, which increases the effectiveness and specificity of therapy.

Тромбин играет ключевую роль в процессах внутрисосудистого тромбообразования. Эта протеиназа участвует как в реакциях коагуляции крови, так и в активации тромбоцитов. Наиболее известная реакция тромбина - это отщепление фибринопептидов А и В с образованием мономеров дезААВВ-фибрина, которые затем агрегируют, сшиваются и переходят в нерастворимое состояние. В процессе свертывания крови тромбин не только вызывает образование фибрина из фибриногена, но и активирует многие факторы коагуляционного каскада. Другая важная функция тромбина - индукция активации и агрегации тромбоцитов, реакции запускающей образование тромбов в сосудах артериального русла. Эта функция осуществляется путем взаимодействия тромбина со специфическими PAR рецепторами (protease activated receptors, рецепторы, активируемые протеазами). Тромбин отщепляет N-концевой пептид рецептора, а появляющийся новый N-концевой фрагмент взаимодействует со специальным внеклеточным участком рецептора, что и приводит к инициации активирующего сигнала. В реакциях гидролиза высокомолекулярных субстратов принимают участие, как минимум, два участка молекулы тромбина - активный центр фермента и область специфичного «узнавания» субстрата, связывание с которой ориентирует субстрат относительно активного центра. Высокоаффинное и специфичное связывание двух упомянутых выше субстратов тромбина - фибриногена и PAR рецептора осуществляется через участок, получивший название экзосайт I. Учитывая ключевую роль тромбина в основных тромботических реакциях - образовании фибрина и активации тромбоцитов, очевидно, что ингибирование активности тромбина представляет собой один из наиболее перспективных и эффективных путей профилактики и терапии тромбозов. [Lane D.A., Philippou H., Huntington J.A. Blood 2005, v.106, pp.2605-2612].Thrombin plays a key role in the processes of intravascular thrombosis. This proteinase is involved both in blood coagulation reactions and in platelet activation. The most famous thrombin reaction is the cleavage of fibrinopeptides A and B to form monomers of desAABB fibrin, which then aggregate, crosslink and become insoluble. In the process of blood coagulation, thrombin not only causes the formation of fibrin from fibrinogen, but also activates many factors of the coagulation cascade. Another important function of thrombin is the induction of platelet activation and aggregation, a reaction that triggers the formation of blood clots in the vessels of the arterial bed. This function is carried out by the interaction of thrombin with specific PAR receptors (protease activated receptors, protease activated receptors). Thrombin cleaves the N-terminal peptide of the receptor, and the emerging new N-terminal fragment interacts with a special extracellular region of the receptor, which leads to the initiation of an activating signal. At least two sections of the thrombin molecule — the active center of the enzyme and the region of specific “recognition” of the substrate, the binding to which orientes the substrate relative to the active center, take part in the hydrolysis of high molecular weight substrates. High affinity and specific binding of the two thrombin substrates mentioned above - fibrinogen and PAR receptor - is carried out through a site called exosite I. Considering the key role of thrombin in the main thrombotic reactions - fibrin formation and platelet activation, it is obvious that inhibition of thrombin activity is one of the most promising and effective ways to prevent and treat thrombosis. [Lane D.A., Philippou H., Huntington J.A. Blood 2005, v.106, pp.2605-2612].

Традиционным антикоагулянтным препаратом, ингибирующим реакции тромбина является гепарин и его производные. Гепарин подавляет активность тромбина не напрямую - механизм его действия основан на активации антитромбина III, главного эндогенного ингибитора тромбина. Кроме того, гепарин способен связывать не только антитромбин, но и многие другие белки плазмы крови и клеток сосудистого русла. Последние обстоятельства определяют негативные побочные эффекты применения гепарина, например тромбоцитопению. Недостатков гепарина лишены прямые ингибиторы тромбина, такие как полипептид гирудин и его производные (бивалирудин) и некоторые низкомолекулярные синтетические ингибиторы (аргатробан, дабигатран), которые подавляют активность тромбина, действуя непосредственно на сам фермент. Гирудин и его производные взаимодействуют как с активным центром, так и с участком связывания субстратов (экзосайт 1), а низкомолекулярные ингибиторы - только с активным центром. Также, в отличие от гепарина, эти соединения не взаимодействуют с другими (кроме тромбина) плазменными и клеточными белками, и не вызывают развития такого нежелательного побочного эффекта, как тромбоцитопения. (Di Nisio M., Middeldorp S., Buller H.R. New Eng. J. Med. 2005, v.353, pp.1028-1040].A traditional anticoagulant drug that inhibits thrombin reactions is heparin and its derivatives. Heparin does not directly inhibit thrombin activity - its mechanism of action is based on the activation of antithrombin III, the main endogenous thrombin inhibitor. In addition, heparin is able to bind not only antithrombin, but also many other plasma proteins and vascular bed cells. Recent circumstances determine the negative side effects of heparin, such as thrombocytopenia. Direct thrombin inhibitors, such as the hirudin polypeptide and its derivatives (bivalirudin) and some low molecular weight synthetic inhibitors (argatroban, dabigatran), which inhibit thrombin activity, acting directly on the enzyme itself, are deprived of heparin deficiencies. Hirudin and its derivatives interact with both the active center and the site of substrate binding (exosite 1), while low molecular weight inhibitors interact only with the active center. Also, unlike heparin, these compounds do not interact with other (except for thrombin) plasma and cellular proteins, and do not cause the development of such an undesirable side effect as thrombocytopenia. (Di Nisio M., Middeldorp S., Buller H. R. New Eng. J. Med. 2005, v. 353, pp. 1028-1040].

Известны пептиды Gly-Pro, Trp-Pro, Pro-Gly, Gly-Pro-Gly-Gly и Pro-Gly-Pro, обладающие антикоагулянтной и фибринолитической активностью (В.Е.Пасторова, Л.Я.Ляпина, Т.Ю.Смолина, И.П.Ашмарин. Антикоагулянтные и фибринолитические эффекты некоторых пролинсодержащих пептидов. Известия АН. Серия биологическая. 1998. №3, с.390-394).The peptides Gly-Pro, Trp-Pro, Pro-Gly, Gly-Pro-Gly-Gly and Pro-Gly-Pro are known to have anticoagulant and fibrinolytic activity (V.E. Pastorova, L.Ya. Lyapina, T.Yu. Smolina, IP Ashmarin, Anticoagulant and Fibrinolytic Effects of Some Proline-Containing Peptides, Izvestiya AN, Biological Series. 1998. No. 3, p. 390-394).

Однако все эти пептиды не обладают антитромбоцитарной и антитромботической активностью.However, all of these peptides do not have antiplatelet and antithrombotic activity.

Известны пептиды Pro-Gly и Pro-Gly-Pro, обладающие антитромбоцитарной активностью (В.Е.Пасторова, Л.Я.Ляпина, И.П.Ашмарин, Р.У.Островская, Т.А.Гудашева, Э.В.Луговской. Фибриндеполимеризационная активность и антитромбоцитарный эффект циклического и линейных коротких пролинсодержащих пептидов. Известия АН. Серия биологическая, 2001, №5, с.593-596).Peptides Pro-Gly and Pro-Gly-Pro with antiplatelet activity are known (V.E. Pastorova, L.Ya. Lyapina, I.P. Ashmarin, R.U. Ostrovskaya, T.A. Gudasheva, E.V. Lugovskoy, Fibrindepolymerization activity and antiplatelet effect of cyclic and linear short proline-containing peptides. Izvestiya AN, Biological Series, 2001, No. 5, pp. 593-596).

Однако данные известные пептиды обладают слабым антикоагулянтным действием.However, these known peptides have a weak anticoagulant effect.

В качестве прямых ингибиторов тромбина могут быть использованы и аптамеры - ДНК или РНК олигонуклеотиды, способные к высокоспецифичному связыванию и ингибированию активности молекул-мишеней.Aptamers - DNA or RNA oligonucleotides capable of highly specific binding and inhibition of the activity of target molecules can also be used as direct thrombin inhibitors.

Подобно антителам молекулы ДНК способны допускать различные трехмерные структуры в зависимости от их последовательности. Некоторые из них могут иметь значение для связывания с мишенью. Такими мишенями могут служить как небольшие лиганды, так и крупные белковые комплексы. Аптамеры отбираются с помощью метода SELEX по связыванию с выбранной мишенью. (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment) (Систематическое развитие лигандов посредством экспоненциального обогащения) для отбора и идентификации молекул одноцепочечных молекул ДНК или РНК, называемых аптамерами.Like antibodies, DNA molecules are capable of admitting various three-dimensional structures depending on their sequence. Some of them may be relevant for binding to the target. Small ligands as well as large protein complexes can serve as such targets. Aptamers are selected using the SELEX method for binding to the selected target. (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment) for the selection and identification of single-stranded DNA or RNA molecules called aptamers.

При необходимости проводится направленный дизайн и/или модификация отобранного аптамера. По своему сродству по отношению к молекуле мишени аптамеры сравнимы с антителами. Однако в отличие от антител, и других соединений, имеющих пептидную структуру (например, гирудин и его производные), олигонуклеотидные аптамеры являются неиммуногенными соединениями.If necessary, a directed design and / or modification of the selected aptamer is carried out. In their affinity for the target molecule, aptamers are comparable to antibodies. However, unlike antibodies, and other compounds having a peptide structure (for example, hirudin and its derivatives), oligonucleotide aptamers are non-immunogenic compounds.

Технология аптамеров объединяет генерирование огромного структурного разнообразия в случайных пулах олигонуклеотидов с мощностью полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации отобранных последовательностей. Эта технология включает в себя скрининг большого пула со случайными последовательностями олигонуклеотидов и основана на том факте, что они допускают большое количество третичных структур, некоторые из которых могут обладать желаемой связывающей или каталитической активностью против молекул - мишеней. Хотя ингибирование не является необходимым для этого отбора, во многих случаях эти лиганды непосредственно ингибируют биологические функции белков-мишеней. В этих случаях ингибиторные функции этих лигандов предположительно обусловлены перекрыванием их сайтов с функциональным районом белков.Aptamer technology combines the generation of tremendous structural diversity in random oligonucleotide pools with the power of polymerase chain reaction (PCR) to amplify selected sequences. This technology involves screening a large pool with random sequences of oligonucleotides and is based on the fact that they allow a large number of tertiary structures, some of which may have the desired binding or catalytic activity against target molecules. Although inhibition is not necessary for this selection, in many cases, these ligands directly inhibit the biological functions of the target proteins. In these cases, the inhibitory functions of these ligands are presumably due to the overlap of their sites with the functional region of proteins.

В последние годы аптамеры рассматривают как потенциальные фармакологические субстанции, которые могут быть использованы для разработки лекарственных препаратов. [Кульбачинский А.В. Успехи биол. химии. 2006. Т.246. С.193-224; Lee J.F., Stovall G.M., Ellington A.D. Curr. Opin. Chem. Biol. 2006, v.10, pp.282-289]. Одно из направлений, связанное с возможностью фармакологического использования аптамеров - это создание на их основе антитромботического препарата - прямого ингибитора тромбина [Спиридонова В.А., Рог Е.В., Дугина Т.Н. Струкова СМ., Копылов A.M. Биоорг. Химия. 2003. Т.29, №5. С.495-498]In recent years, aptamers are considered as potential pharmacological substances that can be used to develop drugs. [Kulbachinsky A.V. Success biol. chemistry. 2006.V.246. S.193-224; Lee J.F., Stovall G.M., Ellington A.D. Curr. Opin. Chem. Biol. 2006, v.10, pp. 282-289]. One of the areas associated with the possibility of pharmacological use of aptamers is the creation on their basis of an antithrombotic drug - a direct thrombin inhibitor [Spiridonova V.A., Rog E.V., Dugina T.N. Strukova SM., Kopylov A.M. Bioorg. Chemistry. 2003. V. 29, No. 5. S.495-498]

Для тромбина получены аптамерные ДНК, свойства которых описаны, например, в ряде публикаций, приведенных ниже:Aptamer DNAs were obtained for thrombin, the properties of which are described, for example, in a number of publications below:

Bock L.C., Griffin L.C., Latham J.A., Vermaas E.H., Toole J.J. Nature 1992. v.355. p.564-566]Bock L.C., Griffin L.C., Latham J.A., Vermaas E.H., Toole J.J. Nature 1992. v. 355. p.564-566]

Macaya R.F., Gao H., Joesten M.E., Yang M., Patel R., Bertelsen A.H., Cook A.F. Biochemistry, 1995, v.34, p.4478-92.Macaya R.F., Gao H., Joesten M.E., Yang M., Patel R., Bertelsen A.H., Cook A.F. Biochemistry, 1995, v. 34, p.4478-92.

Tasset D.M., Kubik M.F., Steiner W.J. Mol.Biol, 1997, v.272, p.688-698.Tasset D.M., Kubik M.F., Steiner W.J. Mol. Biol, 1997, v. 272, p. 688-698.

Kubik M.F., Stephens A.W., Schneider D., Marlar R.A., Tasset D. Nucleic Acid Res. 1994, v.22, p.2619-2626.Kubik M.F., Stephens A.W., Schneider D., Marlar R.A., Tasset D. Nucleic Acid Res. 1994, v.22, p. 2619-2626.

Ikebukuro К., Okumura Y., Sumikura K., Karube I., Nucleic Acid Res. 2003, RS 3, p.205-206.Ikebukuro K., Okumura Y., Sumikura K., Karube I., Nucleic Acid Res. 2003, RS 3, p.205-206.

Ikebukuro K, Okumura Y, Sumikura K, Karube I, Nucleic Acid Res. 2005, v.33, N12, e108.Ikebukuro K, Okumura Y, Sumikura K, Karube I, Nucleic Acid Res. 2005, v. 33, N12, e108.

Ikebukuro K., Yoshida W., NomaT., Sode K. Biotechnol Lett. 2006, v. 28, p.1933-1937.Ikebukuro K., Yoshida W., NomaT., Sode K. Biotechnol Lett. 2006, v. 28, p. 1933-1937.

Pagano В., Martino L., Randazzo A., Giancola С.Biophys. J. 2008 v.94, p.562-569.Pagano B., Martino L., Randazzo A., Giancola C. Biophys. J. 2008 v. 94, p. 562-569.

Griffin L.C., Tidmarsh G.F., Bock L.C., Toole J.J., Leung L.L.K. Blood 1993, v.12, p.3271-3276.Griffin L.C., Tidmarsh G.F., Bock L.C., Toole J.J., Leung L.L.K. Blood 1993, v. 12, p. 3271-3276.

Li W-X., Kaplan A.V., Grant G.W., Toole J.J., Leung L.L. Blood 1994, v.3, p.677-682.Li W-X., Kaplan A.V., Grant G.W., Toole J.J., Leung L.L. Blood 1994, v. 3, p. 677-682.

Reyderman L., Stavchansky S. Pharmaceutical research 1998, v.15, p.904-910.Reyderman L., Stavchansky S. Pharmaceutical research 1998, v. 15, p. 904-910.

Shaw J.P., Fishback J.A., Cundy K.C., Lee W.A. Pharmaceutical research 1995, v.12, p.1937-1942.Shaw J.P., Fishback J.A., Cundy K.C., Lee W.A. Pharmaceutical research 1995, v. 12, p. 1937-1942.

Lee W.A., Fishback J.A., Shaw J.P., Bock L.C., Griffin L.C., Cundy K.C. Pharmaceutical research 1995, v.12, p.1943-1947.Lee W.A., Fishback J.A., Shaw J.P., Bock L.C., Griffin L.C., Cundy K.C. Pharmaceutical research 1995, v. 12, p. 1943-1947.

Добровольский А.Б., Титаева Е.В., Хаспекова С.Г., Спиридонова В.А., Копылов A.M., Мазуров А.В. Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 2009. Т.147, №7. С.41-45.Dobrovolsky A.B., Titaeva E.V., Khaspekova S.G., Spiridonova V.A., Kopylov A.M., Mazurov A.V. Bull. Exp. Biol. Honey. 2009. V.147, No. 7. S.41-45.

В частности, в RU 2360000, 27.06.2009 описаны новые катепсин G-ингибирующие аптамеры, которые являются одно- или двухцепочечными линейными ДНК-последовательностями или полинуклеотидными последовательностями, характеризующимися тем, что они имеют длину цепи по меньшей мере 60 нуклеотидов, предпочтительно 70 нуклеотидов и по существу не подвергаются межмолекулярному и/или внутримолекулярному спариванию.In particular, RU 2360000, 06/27/2009 describes new cathepsin G-inhibiting aptamers, which are single or double stranded linear DNA sequences or polynucleotide sequences, characterized in that they have a chain length of at least 60 nucleotides, preferably 70 nucleotides and essentially do not undergo intermolecular and / or intramolecular pairing.

Эти ДНК-последовательности могут иметь длину цепи 70-120 нуклеотидов, предпочтительно 70-110 нуклеотидов, даже более предпочтительно 80-100 нуклеотидов. Хотя последовательности могут быть одно- или двухцепочечными, предпочтительными являются одноцепочечные последовательности. Последовательности характеризуются также предпочтительно тем, что они имеют молярное содержание гуанина приблизительно 25-50%, предпочтительно 35-45% и/или имеют молярное отношение AG/TC приблизительно 1,0-2,0, предпочтительно 1,2-1,8 (для целей данного изобретения AG обозначает общее число нуклеотидов А и G этой последовательности, тогда как ТС обозначает общее число нуклеотидов Т и С этой последовательности).These DNA sequences can have a chain length of 70-120 nucleotides, preferably 70-110 nucleotides, even more preferably 80-100 nucleotides. Although the sequences may be single or double stranded, single stranded sequences are preferred. The sequences are also preferably characterized in that they have a molar guanine content of about 25-50%, preferably 35-45% and / or have an AG / TC molar ratio of about 1.0-2.0, preferably 1.2-1.8 ( for the purposes of this invention, AG is the total number of nucleotides A and G of this sequence, while TC is the total number of nucleotides T and C of this sequence).

Предпочтительными вариантами являются:Preferred options are:

олигомеры (GT)n или (АС)n, в которых n находится в диапазоне 35-60, предпочтительно 40-50;oligomers of (GT) n or (AC) n in which n is in the range of 35-60, preferably 40-50;

гомополимеры (Т)n, или (G)n, или (А)n, или (С)n, или (инозин)n, в которых n находится в диапазоне 70-120, предпочтительно 80-100.homopolymers of (T) n , or (G) n , or (A) n , or (C) n , or (inosine) n , in which n is in the range of 70-120, preferably 80-100.

Эти аптамеры селективно и эффективно ингибируют катепсин G, и, следовательно, они могут быть использованы в приготовлении лекарственного средства для лечения и профилактики воспалительных заболеваний, прокоагулянтных состояний, генетических заболеваний, дегенеративных заболеваний, повреждений ДНК, неоплазии и/или кожных заболеваний.These aptamers selectively and effectively inhibit cathepsin G, and therefore, they can be used in the manufacture of a medicament for the treatment and prophylaxis of inflammatory diseases, procoagulant conditions, genetic diseases, degenerative diseases, DNA damage, neoplasia and / or skin diseases.

Ранее авторами заявленного изобретения был разработан оригинальный 31-звенный ДНК аптамер, получивший кодовое название RE31 и имеющий последовательность GTGACGTAGGTTGGTGTGGTTGGGGCGTCAC. Этот аптамер не уступает по своей способности ингибировать активность тромбина, также 31-звенному аптамеру 31ТВА (ТВА - thrombin binding aptamer) с последовательностью CACTGGTAGGTTGGTGTGGTTGGGGCCAGTG, одному из наиболее высокоэффективных из ранее описанных антитромбиновых аптамеров. [Спиридонова В.А., Головин А.В., Копылов A.M., Добровольский А.Б., Мазуров А.В. Заявка на патент РФ №2008149583 от 17 декабря 2008 г.].Previously, the inventors of the claimed invention developed an original 31-link DNA aptamer, code-named RE31 and having the sequence GTGACGTAGGTTGGTGTGGTTGGGGCGTCAC. This aptamer is not inferior in its ability to inhibit the activity of thrombin, also to the 31-unit aptamer 31ТВА (TBA - thrombin binding aptamer) with the sequence CACTGGTAGGTTGGTGTGGTTGGGGCCAGTG, one of the most highly effective antithrombin aptamers described above. [Spiridonova V.A., Golovin A.V., Kopylov A.M., Dobrovolsky A.B., Mazurov A.V. Application for patent of the Russian Federation No. 2008149583 dated December 17, 2008].

Однако известно, что немодифицированные аптамеры, и, в том числе ДНК аптамеры против тромбина, характеризуются очень коротким (не более нескольких минут) временем жизни в кровотоке [Griffin L.C., Tidmarsh G.F., Bock L.C., Toole J.J., Leung L.L.K. Blood 1993, v.12, p.3271-3276]. Это свойство может препятствовать созданию на их основе эффективных лекарственных препаратов. В связи с этим для удлинения времени жизни in vivo базовые олигонуклеотидные последовательности могут подвергаться химическим модификациям. Эти модификации, во-первых, защищают аптамеры от действия нуклеаз, а, во-вторых, замедляют их выведение через почки. Известны модифицированные аптамеры с потенциальными антитромботическими свойствами, направленные против фактора Виллебранда [Gilbert J.C., De Feo-Fraulini Т., Hutabarat R.M., Horvath C.J., Merlino P.C., Marsh H.N. et al. Circulation 2007, v. 116, pp.2678-2686] и фактора IX [Dyke C.K., Steinhubl S.R., Kleiman N.S., Cannon R.O., Aberle L.G., Lin M., et al. Circulation 2006, v.114, pp.2490-2497].However, it is known that unmodified aptamers, including DNA aptamers against thrombin, are characterized by a very short (not more than a few minutes) lifetime in the bloodstream [Griffin L.C., Tidmarsh G.F., Bock L.C., Toole J.J., Leung L.L.K. Blood 1993, v.12, p.3271-3276]. This property can prevent the creation of effective drugs on their basis. In this regard, to extend the lifetime in vivo base oligonucleotide sequences can undergo chemical modifications. These modifications, firstly, protect aptamers from the action of nucleases, and, secondly, slow down their excretion through the kidneys. Modified aptamers with potential antithrombotic properties are known against the von Willebrand factor [Gilbert J.C., De Feo-Fraulini T., Hutabarat R.M., Horvath C.J., Merlino P.C., Marsh H.N. et al. Circulation 2007, v. 116, pp. 2678-2686] and factor IX [Dyke C.K., Steinhubl S.R., Kleiman N.S., Cannon R.O., Aberle L.G., Lin M., et al. Circulation 2006, v.114, pp.2490-2497].

Технической задачей настоящего изобретения является модификация антитромбинового ДНК аптамера RE31 с целью удлинения времени его жизни в кровотоке без существенного снижения способности ингибировать реакции тромбина.The technical task of the present invention is the modification of antithrombin DNA aptamer RE31 in order to extend its life time in the bloodstream without significantly reducing the ability to inhibit thrombin reactions.

Поставленная техническая задача достигнута модифицированным аптамерным олигонуклеотидом, представляющим собой олигодезоксирибонуклеотид ДНК-аптамер, характеризующийся нуклеотидной последовательностьюThe stated technical problem is achieved by a modified aptamer oligonucleotide, which is an oligodeoxyribonucleotide DNA aptamer, characterized by a nucleotide sequence

GTGACGTAGGTTGGTGTGGTTGGGGCGTCAC и конъюгированный по 5′ или 3′ концу с NH2 группой этерификацией аминогексанолом фосфатной группы на 5′ или 3′ конце и/или с полиэтиленгликолем PEG, присоединенным по 5′ и/или 3′ концу, при этом как минимум один из присоединенных по 5′ и 3′ концу заместителей представляет собой полиэтиленгликоль (PEG), и отвечающий общей формулеGTGACGTAGGTTGGTGTGGTTGGGGGCGTCAC and conjugated at the 5 ′ or 3 ′ end to the NH 2 group by esterification with a phosphate group aminohexanol at the 5 ′ or 3 ′ end and / or with PEG polyethylene glycol attached at the 5 ′ and / or 3 ′ end, with at least one of the attached at the 5 ′ and 3 ′ end of the substituents is polyethylene glycol (PEG), and corresponding to the General formula

d R-GTGACGTANGGTTGGTGTGGTTGGGGCGTCAC-R,d R-GTGACGTANGGTTGGTGTGGTTGGGGCGTCAC-R,

где d - дезоксирибоза, при этом олигонуклеотид содержит дезоксирибозу во всех позициях, R - химические заместители - NH2 группа и/или полиэтиленгликоль (PEG).where d is deoxyribose, while the oligonucleotide contains deoxyribose in all positions, R are chemical substituents — NH 2 group and / or polyethylene glycol (PEG).

Итак, задача достигается присоединением по 5′ и 3′ концам базового олигонуклеотидного аптамера RE31 с последовательностью GTGACGTANGGTTGGTGTGGTTGGGGCGTCAC аминогексанола (NH2 группы) или полиэтиленгликоля (PEG).So, the task is achieved by joining at the 5 ′ and 3 ′ ends of the base oligonucleotide aptamer RE31 with the sequence GTGACGTANGGTTGGTGTGGTTGGGGCGTCAC aminohexanol (NH 2 groups) or polyethylene glycol (PEG).

Таким образом, общая формула модифицированных ДНК аптамеров по изобретению может быть представлена как:Thus, the general formula of the modified DNA aptamers of the invention can be represented as:

Figure 00000001
Figure 00000001

где d - дезоксирибоза (олигонуклеотид содержит дезоксирибозу во всех позициях), R - химичекие заместители. В качестве заместителей (модифицирующих агентов) R используют аминогексанол, который этерифицирует фосфатную группу на 5′ или 3′ конце и PEG, при этом как минимум один из присоединенных по 5′ и 3′ концу заместителей представляет собой полиэтиленгликоль (PEG).where d is deoxyribose (oligonucleotide contains deoxyribose in all positions), R are chemical substituents. As substituents (modifying agents) R, aminohexanol is used, which esterifies the phosphate group at the 5 ′ or 3 ′ end and PEG, while at least one of the substituents attached at the 5 ′ and 3 ′ end is polyethylene glycol (PEG).

На основании формулы (1) было создано 3 модифицированных аптамера с кодовыми названиями NH2-RE-PEG, PEG-RE-NH2 и PEG-RE-PEG. В аптамере NH2-RE-PEG произведено введение NH2 группы по 5′ и PEG по 3′ концам олигонуклеотида, в аптамере PEG-RE-NH2 - введение PEG по 5′ и NH2 по 3′ концам олигонуклеотида, и в аптамере PEG-RE-PEG - введение PEG по обоим концам олигонуклеотида.Based on formula (1), 3 modified aptamers with the code names NH 2 -RE-PEG, PEG-RE-NH 2 and PEG-RE-PEG were created. The NH 2 -RE-PEG aptamer introduced 5 ′ NH 2 groups and PEG at the 3 ′ ends of the oligonucleotide, the PEG-RE-NH 2 aptamer introduced 5 ′ NH and PEG 2 at the 3 ′ ends of the oligonucleotide, and the aptamer PEG-RE-PEG - the introduction of PEG at both ends of the oligonucleotide.

Все 3 аптамера по изобретению:All 3 aptamers according to the invention:

- ингибируют активность тромбина в плазме крови человека, удлиняя АЧТВ, протромбиновое и тромбиновое время, в концентрациях, сравнимых с базовым аптамером RE31;- inhibit the activity of thrombin in human blood plasma, prolonging APTT, prothrombin and thrombin time, in concentrations comparable to the basic aptamer RE31;

- ингибируют стимулируемую тромбином агрегацию тромбоцитов, опосредуемую связыванием тромбина с PAR рецепторами тромбоцитов в концентрациях сравнимых с базовым аптамером RE31;- inhibit thrombin-stimulated platelet aggregation mediated by the binding of thrombin to PAR platelet receptors in concentrations comparable to the basic aptamer RE31;

- при внутривенном введении экспериментальным животным циркулируют в кровотоке дольше, чем базовый аптамер RE31.- when administered intravenously to experimental animals, they circulate in the bloodstream longer than the basic aptamer RE31.

Получают модифицированные ДНК-аптамеры по изобретению следующим образом.The modified DNA aptamers of the invention are prepared as follows.

Базовую олигонуклеотидную последовательность аптамера RE31 синтезируют на автоматическом синтезаторе Applied BioSystems 380b с использованием стандартных производных (синтонов) нуклеотидов, как подробно описано в приложении А к научно-техническому отчету по этапу 1.The basic oligonucleotide sequence of the RE31 aptamer is synthesized on an Applied BioSystems 380b automated synthesizer using standard derivatives (synthons) of nucleotides, as described in detail in Appendix A to the scientific and technical report in step 1.

После окончания синтеза основной олигонуклеотидной последовательности на 5′-конец вводится нужная модификация. Сначала вводят гликольную группировку, которая фосфорилирована по концевой гидроксильной группе. На 5′-концевой остаток фосфора присоединяют аминогексанол, так что концевой становится алифатическая аминогруппа.After the synthesis of the main oligonucleotide sequence is completed, the desired modification is introduced at the 5′-end. First, a glycol moiety is introduced that is phosphorylated at the terminal hydroxyl group. Aminohexanol is added to the 5′-terminal phosphorus residue, so that the aliphatic amino group becomes terminal.

Введение аминогруппы на 3′-конец проводят по аналогичной схеме - после снятия олигонуклеотида с полимерного носителя фосфитного эфира окисляют до фосфатного производного и присоединяют к нему гексанол, который образует эфир с пятивалентным концевым фосфорным остатком, а аминогруппа остается экспонированной в раствор. Масштаб синтеза составлял 0,1-0,2 мкмоля/г.The introduction of the amino group at the 3'-end is carried out according to a similar scheme - after removing the oligonucleotide from the polymer carrier, the phosphite ester is oxidized to the phosphate derivative and hexanol is added to it, which forms an ether with a pentavalent terminal phosphorus residue, and the amino group remains exposed to the solution. The synthesis scale was 0.1-0.2 μmol / g.

При введении полиэтиленгликоля нуклеотид, закрепленный на стекле, этерифицируют полиэтиленгликолем (PEG), затем фосфорилируют для дальнейших работ. При введении полиэтиленгликоля на 3′- конец используют спейсеры - небольшие по длине олигонуклеотидные последовательности, которые позволяют придать гибкость полимерной цепочке и дают возможность далее присоединять протяженные гликольные звенья нужной длины.With the introduction of polyethylene glycol, the nucleotide attached to the glass is esterified with polyethylene glycol (PEG), then phosphorylated for further work. When polyethylene glycol is introduced at the 3'-end, spacers are used — oligonucleotide sequences that are small in length, which allow flexibility to be added to the polymer chain and make it possible to further attach extended glycol units of the desired length.

Отщепление олигодезоксирибонуклеотида с полимерного носителя и снятие защитных групп проводят слудующим образом. Полимер из колонки помещают в пробирку на 1,5 мл, заливают 0,5 мл конц. NH3 и инкубируют при комнатной температуре 1,5-2,0 часа. Осадок собирали центрифугированием, промывали 0,3 мл конц. NH3, супернатанты объединяли и выдерживали при 55° 10-12 часов. После охлаждения раствора аммиак упаривают и остаток растворяют в 1 мл дистиллированной воды.The cleavage of the oligodeoxyribonucleotide from the polymer carrier and the removal of the protective groups are carried out as follows. The polymer from the column is placed in a 1.5 ml tube, pour 0.5 ml conc. NH 3 and incubated at room temperature for 1.5-2.0 hours. The precipitate was collected by centrifugation, washed with 0.3 ml conc. NH 3 supernatants were combined and kept at 55 ° for 10-12 hours. After cooling the solution, ammonia was evaporated and the residue was dissolved in 1 ml of distilled water.

Анализ реакционной смеси проводят на хроматографе Tracor, колонка 4×250 мм с обращенно-фазовым сорбентом Диасорб С16Т с размером пор 7 мкм. Колонку предварительно уравновешивают буфером: 48 мМ фосфат калия (рН=7,0), 2 мМ дигидрофосфат тетрабутиламмония, 5% ацетонитрил, при 45° и скорости потока 1 мл/мин. Измерения проводят при 260 нм, вещество вводят шприцем в объеме 2,5 мкл. На хроматограмме реакционной смеси, кроме целевого олигонуклеотида, как правило, видны более короткие продукты. Их образование связано с невозможностью полного проведения конденсации, со 100% выходом. Препаративное разделение реакционной смеси проводят обращенно-фазовой хроматографией. Носитель тот же, который используется в первом случае. Как правило, объем реакционной смеси составляет 0,5-1,0 мл. Вещество элюируется в следующем диапазоне (50-80%) буфера 48 мМ фосфат калия (рН=7,0), 2 мМ дигидрофосфат тетрабутиламмония, 40% ацетонитрил. Собранное вещество многократно упаривают при добавлении 1 мл 50% раствора метанола в воде для удаления следов аммония. Удаление 5′-О-диметокситритильной защиты проводят в 1,5 мл 80% уксусной кислоты, 30 мин при комнатной температуре. Для удаления уксусной кислоты раствор многократно упаривают на роторном испарителе, добавляя каждый раз 1,5 мл 50% раствора метанола в воде. Полученный продукт растворяют в 1 мл воды. Для определения количества полученного олигонуклеотида по окончании разделения проводили обработку хроматограмм, интегрируя площадь пиков и рассчитывали концентрацию целевого продукта по формуле S×4×10-6.Analysis of the reaction mixture was carried out on a Tracor chromatograph, a 4 × 250 mm column with a reverse phase sorbent Diasorb C16T with a pore size of 7 μm. The column is pre-equilibrated with buffer: 48 mM potassium phosphate (pH = 7.0), 2 mM tetrabutylammonium dihydrogen phosphate, 5% acetonitrile, at 45 ° and a flow rate of 1 ml / min. The measurements are carried out at 260 nm, the substance is injected with a syringe in a volume of 2.5 μl. On the chromatogram of the reaction mixture, in addition to the target oligonucleotide, as a rule, shorter products are visible. Their formation is associated with the impossibility of complete condensation, with 100% yield. Preparative separation of the reaction mixture is carried out by reverse phase chromatography. The media is the same as that used in the first case. Typically, the volume of the reaction mixture is 0.5-1.0 ml. The substance elutes in the following range (50-80%) of a buffer of 48 mM potassium phosphate (pH = 7.0), 2 mM tetrabutylammonium dihydrogen phosphate, 40% acetonitrile. The collected material was evaporated many times by adding 1 ml of a 50% solution of methanol in water to remove traces of ammonia. Removal of 5′-O-dimethoxytrityl protection is carried out in 1.5 ml of 80% acetic acid, 30 min at room temperature. To remove acetic acid, the solution was repeatedly evaporated on a rotary evaporator, each time adding 1.5 ml of a 50% solution of methanol in water. The resulting product is dissolved in 1 ml of water. To determine the amount of oligonucleotide obtained at the end of the separation, chromatograms were processed by integrating the peak areas and the concentration of the target product was calculated by the formula S × 4 × 10 -6 .

Нижеследующие примеры иллюстрируют свойства модифицированных ДНК-аптамеров, как прямых ингибиторов тромбина с удлиненным временем жизни в кровотоке, и их применение (использование), но не ограничивают их.The following examples illustrate the properties of modified DNA aptamers, as direct inhibitors of thrombin with an extended lifetime in the bloodstream, and their use (use), but do not limit them.

Пример 1. Ингибирование модифицированными аптамерами коагуляционных реакций тромбина. Сравнение с базовым, немодифицированным аптамером RE31.Example 1. Inhibition of modified thrombin coagulation reactions with aptamers. Comparison with the basic, unmodified aptamer RE31.

Анализ влияния модифицированных аптамеров (NH2-RE-PEG, PEG-RE-NH2 и PEG-RE-PEG) на свертывание крови включал исследование 3-х показателей: тромбинового времени, протромбинового времени и активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ). Исследования проводили в сравнении с базовым аптамером RE31.Analysis of the effect of modified aptamers (NH 2 -RE-PEG, PEG-RE-NH 2 and PEG-RE-PEG) on blood coagulation included the study of 3 indicators: thrombin time, prothrombin time and activated partial thromboplastin time (APTT). Studies were carried out in comparison with the basic aptamer RE31.

В тесте «тромбиновое время» определяли действие аптамеров на образование фибрина, катализируемое экзогенным тромбином. В кювету коагулометра вносили 0,1 мл раствора аптамеров в 25 мМ HEPES буфере (рН 7,4), содержащем 150 мМ NaCl и 5 мМ KCl и 0.1 мл цитратной плазмы человека. После инкубирования в течение 2 мин при 37°С реакцию стартовали добавлением 0,1 мл раствора тромбина человека с концентрацией 6 ед/мл (удельная активность 4400 ед/мл). Регистрировали время образования сгустка.In the thrombin time test, the effect of aptamers on the formation of fibrin catalyzed by exogenous thrombin was determined. 0.1 ml of the aptamer solution in 25 mM HEPES buffer (pH 7.4) containing 150 mM NaCl and 5 mM KCl and 0.1 ml of human citrate plasma was added to the coagulometer cuvette. After incubation for 2 min at 37 ° C, the reaction was started by adding 0.1 ml of a human thrombin solution with a concentration of 6 units / ml (specific activity 4400 units / ml). The clot formation time was recorded.

Из фиг.1 видно, что все три модифицированных аптамера в концентрациях до 0,38 мкМ существенно (более чем в 8-10 раз) удлиняют время образования фибрина после добавления экзогенного тромбина к человеческой плазме. По способности ингибировать действие экзогенного тромбина они уступают базовому аптамеру RE31, в среднем приблизительно в 1,5 раза в соответствии с концентрациями, при которых достигаются одинаковые эффекты на время свертывания плазмы.Figure 1 shows that all three modified aptamers in concentrations up to 0.38 μM significantly (more than 8-10 times) increase the time of fibrin formation after adding exogenous thrombin to human plasma. In terms of their ability to inhibit the action of exogenous thrombin, they are inferior to the basic aptamer RE31, on average by approximately 1.5 times in accordance with the concentrations at which the same effects are achieved on the time of plasma coagulation.

На фиг.1 показано влияние модифицированных аптамеров и базового аптамера RE31 на тромбиновое время. Представлены результаты одного из 3 воспроизводимых экспериментовFigure 1 shows the effect of the modified aptamers and the basic aptamer RE31 on thrombin time. The results of one of 3 reproducible experiments are presented.

В двух следующих сериях экспериментов изучали влияние аптамеров на образование фибринового сгустка, катализируемое эндогенным тромбином при активации свертывания по «внешнему» (протромбиновое время) и «внутреннему» пути (АЧТВ). Влияние аптамеров на протромбиновое время исследовали следующим образом. В кювету коагулометра вносили 20 мкл раствора аптамера в 25 мМ HEPES буфере (рН 7,4), содержащем 150 мМ NaCl и 5 мМ KCl, затем 100 мкл нормальной цитратной плазмы человека. После инкубации в течение 2 мин при 37° реакцию стартовали добавлением 100 мкл Са-тромбопластина ("STA Neoplastin Plus" производства "Diagnostica Stago"). Влияние аптамеров на АЧТВ исследовали следующим образом. В кювету коагулометра вносили 20 мкл раствора аптамера в 25 мМ HEPES буфере (рН 7,4), содержащем 150 мМ NaCl и 5 мМ КС1, затем 100 мкл нормальной цитратной плазмы человека. Инкубировали в течение 2 мин при 37°, добавляли 100 мкл реактива "STA АРТТ" и через 3 мин реакцию стартовали добавлением 100 мкл 25 мМ CaCl2. В обоих тестах регистрировали время образования сгустка.In the next two series of experiments, we studied the effect of aptamers on the formation of a fibrin clot catalyzed by endogenous thrombin upon activation of coagulation along the “external” (prothrombin time) and “internal” pathways (APTT). The effect of aptamers on prothrombin time was investigated as follows. 20 μl of the aptamer solution in 25 mM HEPES buffer (pH 7.4) containing 150 mM NaCl and 5 mM KCl, then 100 μl of normal human citrate plasma was added to the coagulometer cuvette. After incubation for 2 min at 37 ° C, the reaction was started by adding 100 μl of Ca-thromboplastin (STA Neoplastin Plus manufactured by Diagnostica Stago). The effect of aptamers on APTT was investigated as follows. 20 μl of the aptamer solution in 25 mM HEPES buffer (pH 7.4) containing 150 mM NaCl and 5 mM KCl, then 100 μl of normal human citrate plasma was added to the coagulometer cuvette. Incubated for 2 min at 37 ° C, 100 μl of STA ARTT reagent was added and after 3 minutes the reaction was started by adding 100 μl of 25 mM CaCl 2 . In both tests, clot formation time was recorded.

На фиг.2 показано влияние модифицированных аптамеров и базового аптамера RE31 на протромбиновое время.Figure 2 shows the effect of the modified aptamers and the basic aptamer RE31 on prothrombin time.

На фиг.3 показано влияние модифицированных аптамеров и базового аптамера RE31 на АЧТВ. Представлены результаты одного из 3 воспроизводимых экспериментов.Figure 3 shows the effect of the modified aptamers and the basic aptamer RE31 on APTT. The results of one of 3 reproducible experiments are presented.

Из фиг.2 и 3 видно, что в обоих случаях все три модифицированных аптамера в концентрациях до 3 мкМ существенно удлиняли времена свертывания крови - протромбиновое время не менее чем в 5 раз, а АЧТВ приблизительно в 3-4 раза. Концентрации модифицированных аптамеров, при которых достигались эффекты, сходные с базовым аптамером RE31, были выше в обоих тестах - в тесте протромбиновое время не более чем в 2 раза, а тесте АЧТВ в 1,5-4 раза для разных аптамеров.Figure 2 and 3 shows that in both cases, all three modified aptamers at concentrations up to 3 μM significantly lengthened the coagulation time — the prothrombin time was no less than 5 times, and APTT about 3-4 times. The concentrations of modified aptamers, at which effects similar to the basic aptamer RE31 were achieved, were higher in both tests - in the test, the prothrombin time was no more than 2 times, and the APTT test was 1.5-4 times for different aptamers.

Можно отметить, что во всех 3 коагуляционных тестах наибольшую ингибирующую активность среди модифицированных аптамеров проявлял аптамер NH2-RE-PEG. Для этого аптамера различия в одинаково эффективных концентрациях по сравнению с базовым аптамером RE31 не превышали 50%.It can be noted that in all 3 coagulation tests, the NH 2 -RE-PEG aptamer showed the highest inhibitory activity among the modified aptamers. For this aptamer, differences in equally effective concentrations compared to the basic RE31 aptamer did not exceed 50%.

Пример 2. Ингибирование модифицированными аптамерами тромбин-индуцированной агрегации тромбоцитов. Сравнение с базовым, немодифицированным аптамером RE31.Example 2. Inhibition of modified aptamers of thrombin-induced platelet aggregation. Comparison with the basic, unmodified aptamer RE31.

Влияние модифицированных аптамеров (NH2-RE-PEG, PEG-RE-NH2 и PEG-RE-PEG) на тромбин-индуцированную агрегацию тромбоцитов, исследовали в сравнении с базовым аптамером RE31.The effect of modified aptamers (NH 2 -RE-PEG, PEG-RE-NH 2 and PEG-RE-PEG) on thrombin-induced platelet aggregation was investigated in comparison with the basic aptamer RE31.

Отмытые тромбоциты получали из крови здоровых доноров в соответствии с ранее описанным методом [Mazurov A.V., D.V.Vinogradov, N.V.Kabaeva, G.N. Antonova, Yu.A.Romanov, T.N.Vlasik, et al. Thromb. Haemost, 1991, v.66, pp.494-499]. Отмытые тромбоциты суспендировали в растворе Тироде/Hepes (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 0,36 мМ NaH2PO4, 0,1% декстрозы, 1 мМ MgCl2, 0,35% БСА, 5 мМ Hepes, рН 7,35) в концентрации 3×108 на 1 мл. После ресуспендирования к отмытым тромбоцитам добавляли CaCl2 в конечной концентрации 1 мМ. Агрегацию тромбоцитов изучали в агрегометре БИОЛА. В кювету агрегометра добавляли по 300 мкл суспензии отмытых тромбоцитов и регистрировали агрегацию по изменению светопропускания суспензии (Т, %) при 37° и перемешивании со скоростью 800 об/мин. Для стимуляции агрегации использовали тромбин человека в конечной концентрации 0,25 ед/мл (удельная активность 4400 ед/мг). Аптамеры добавляли в агрегационную кювету не менее чем за 2 мин до добавления тромбина, а тромбин (0,1 ед/мл) через 30 с после начала регистрации светопропускания.Washed platelets were obtained from the blood of healthy donors in accordance with the previously described method [Mazurov AV, DVVinogradov, NVKabaeva, GN Antonova, Yu.A. Romanov, TNVlasik, et al. Thromb. Haemost, 1991, v. 66, pp. 494-499]. The washed platelets were suspended in a Tyrode / Hepes solution (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.36 mM NaH 2 PO 4 , 0.1% dextrose, 1 mM MgCl 2 , 0.35% BSA, 5 mM Hepes, pH 7.35) at a concentration of 3 × 10 8 per 1 ml. After resuspension, CaCl 2 was added to the washed platelets at a final concentration of 1 mM. Platelet aggregation was studied in a BIOL aggregometer. 300 μl of the washed platelet suspension was added to the aggregometer cuvette and aggregation was recorded by the change in the light transmission of the suspension (T,%) at 37 ° and stirring at a speed of 800 rpm. To stimulate aggregation, human thrombin was used at a final concentration of 0.25 units / ml (specific activity 4400 units / mg). Aptamers were added to the aggregation cuvette at least 2 min before the addition of thrombin, and thrombin (0.1 u / ml) 30 s after the start of light transmission.

На фиг.4 и 5 представлены кривые тромбин-индуцированной агрегации тромбоцитов в отсутствие и присутствии исследованных аптамеров. Видно, что в концентрации 0,01 мкМ все три модифицированных аптамера в той или иной степени подавляли тромбин-индуцированную агрегацию. При этом максимальный эффект достигался в присутствии NH2-RE-PEG, который ингибировал агреагцию практически также, как и исходный немодифициованный аптамер RE31. (фиг.4). При увеличении концентрации модифицированных аптамеров до 0,02-0,025 мкМ все они полностью подавляли тромбин-индуцированную агрегацию. На фиг.5 в качестве примера представлены кривые агрегации при добавлении различных концентраций наименее эффективного аптамера PEG-RE-PEG.Figures 4 and 5 show the curves of thrombin-induced platelet aggregation in the absence and presence of the studied aptamers. It can be seen that at a concentration of 0.01 μM, all three modified aptamers to one degree or another suppressed thrombin-induced aggregation. The maximum effect was achieved in the presence of NH 2 -RE-PEG, which inhibited aggregation almost as much as the original unmodified aptamer RE31. (figure 4). With an increase in the concentration of modified aptamers to 0.02-0.025 μM, all of them completely suppressed thrombin-induced aggregation. Figure 5 shows, by way of example, aggregation curves when various concentrations of the least effective PEG-RE-PEG aptamer are added.

На фиг.4 и 5 показано влияние модифицированных аптамеров и базового аптамера RE31 на тромбин-индуцированную агрегацию тромбоцитов. Фиг.4. К тромбоцитам не добавляли аптамеров (кривая 0) или добавляли аптамеры RE31 (кривая 1), NH2-RE-PEG (кривая 2), PEG-RE-NH2 (кривая 3), PEG-RE-PEG (кривая 4) в концентрации 0,01 мкМ. Фиг.5. К тромбоцитам не добавляли аптамеров (кривая 0) или добавляли аптамер PEG-RE-PEG в концентрациях 0,025, 0,02, 0,015 и 0,01 мкМ (кривые 1-4 соответственно). На обоих чертежах представлены результаты одного из 3 воспроизводимых экспериментов.Figures 4 and 5 show the effect of the modified aptamers and the basic RE31 aptamer on thrombin-induced platelet aggregation. Figure 4. No aptamers were added to platelets (curve 0) or aptamers RE31 (curve 1), NH 2 -RE-PEG (curve 2), PEG-RE-NH 2 (curve 3), PEG-RE-PEG (curve 4) were added to concentration of 0.01 μm. Figure 5. No aptamers were added to platelets (curve 0) or PEG-RE-PEG aptamers were added at concentrations of 0.025, 0.02, 0.015 and 0.01 μM (curves 1-4, respectively). Both drawings show the results of one of 3 reproducible experiments.

Несмотря на существенный (иногда в несколько раз) разброс абсолютных значений концентраций аптамеров, при которых наблюдалось полное ингибирование агрегации в различных экспериментах, соотношение между эффектами изучаемых аптамеров сохранялось неизменным. По своей ингибирующей активности NH2-RE-PEG незначительно уступал базовому аптамеру RE31, но несколько превосходил 2 других модифицированных аптамера - PEG-RE-NH2 и PEG-RE-PEG (см. фиг.4).Despite the significant (sometimes several times) scatter in the absolute values of the aptamer concentrations at which complete inhibition of aggregation was observed in various experiments, the ratio between the effects of the studied aptamers remained unchanged. In its inhibitory activity, NH 2 -RE-PEG was slightly inferior to the basic aptamer RE31, but slightly superior to 2 other modified aptamers - PEG-RE-NH 2 and PEG-RE-PEG (see figure 4).

Пример 3. Выведение модифицированных аптамеров из кровотока крысы. Сравнение с базовым, немодифицированным аптамером RE31.Example 3. The removal of modified aptamers from the bloodstream of rats. Comparison with the basic, unmodified aptamer RE31.

Определяли скорость выведения модифицированных аптамеров (NH2-RE-PEG, PEG-RE-NH2 и PEG-RE-PEG) из кровотока крысы после их внутривенного введения в сравнении с базовым аптамером RE31. Присутствие аптамеров в кровотоке регистрировали по их способности ингибировать действие тромбина на свертывание крови в тесте тромбиновое время.The rate of removal of modified aptamers (NH 2 -RE-PEG, PEG-RE-NH 2 and PEG-RE-PEG) from the bloodstream of rats after their intravenous administration was determined in comparison with the basic aptamer RE31. The presence of aptamers in the bloodstream was recorded by their ability to inhibit the effect of thrombin on blood coagulation in the thrombin time test.

Крысам линии Wistar (вес от 350 до 500 г) через установленный в предсердие катетер внутривенно вводили аптамеры в дозе 60 мкг на 100 г веса. Кровь отбирали до и затем через 5, 15, 30 и 60 мин после введения аптамеров. В качестве антикоагулянта использовали 0,11 М цитрат натрия в соотношении кровь:антикоагулянт 1:9. Объем крови в каждой пробе - 1 мл. Кровь центрифугировали при 10000 g в течение 5 мин и затем отбирали плазму. Плазму крысы смешивали со стандартной плазмой человека в соотношении 1:3 и измеряли тромбиновое время, стимулируя свертывание раствором тромбина человека с активностью 3 ед/мл. (Разведение крысиной плазмы проводили с целью стандартизации условий измерения). За 100% принимали время образования сгустка в пробах, отобранных до введения аптамеров.To Wistar rats (weight from 350 to 500 g), aptamers were administered intravenously at a dose of 60 μg per 100 g of weight through a catheter installed in the atrium. Blood was taken before and then 5, 15, 30 and 60 minutes after the administration of aptamers. As an anticoagulant, 0.11 M sodium citrate was used in a blood: anticoagulant ratio of 1: 9. The blood volume in each sample is 1 ml. Blood was centrifuged at 10,000 g for 5 min and then plasma was taken. Rat plasma was mixed with standard human plasma in a ratio of 1: 3 and thrombin time was measured, stimulating coagulation with human thrombin solution with an activity of 3 u / ml. (Rat plasma was diluted to standardize the measurement conditions). For 100%, the time of clot formation in the samples taken before the introduction of aptamers was taken.

На фиг.6 показано выведение аптамеров из кровотока крысы. Крысам вводили указанные аптамеры и отбирали кровь до и через указанные промежутки времени после введения аптамеров. Плазму крысы смешивали со стандартной плазмой человека в соотношении 1:3 и определяли в полученной смеси тромбиновое время. Представлены средние значения из 3 экспериментов.Figure 6 shows the removal of aptamers from the bloodstream of rats. Rats were given the indicated aptamers and blood was taken before and at the indicated intervals after administration of the aptamers. Rat plasma was mixed with standard human plasma in a ratio of 1: 3 and thrombin time was determined in the resulting mixture. Average values from 3 experiments are presented.

Как видно из фиг.6 эффекты немодифицированного базового аптамера RE31 на тромбиновое время удается регистрировать лишь через 5 минут после введения в кровоток крысе, а через 15 мин тромбиновое время уже не отличалось от контрольного (до введения аптамера). При введении всех модифицированных аптамеров удлинение тромбинового времени через 5 минут было более выражено, чем при введении аптамера RE31 - в 2-2,5 раза по сравнению с 60-70% соответственно. В отличие от RE31 все модифицированные аптамеры сохраняли свое действие через 15 мин и 30 мин после введения (удлинение тромбинового времени на 40-60% и 15-40% соответственно) и лишь через 60 мин показатели сравнивались с контрольным уровнем. Наиболее выраженные эффекты через 15 и 30 минут были зарегистрированы для аптамера NH2-RE-PEG.As can be seen from Fig.6, the effects of the unmodified base RE31 aptamer on thrombin time can be recorded only 5 minutes after the rat was introduced into the bloodstream, and after 15 minutes the thrombin time did not differ from the control (before the introduction of the aptamer). With the introduction of all modified aptamers, the elongation of the thrombin time after 5 minutes was more pronounced than with the introduction of the aptamer RE31 - 2-2.5 times compared with 60-70%, respectively. In contrast to RE31, all modified aptamers retained their effect 15 minutes and 30 minutes after administration (prolongation of thrombin time by 40-60% and 15-40%, respectively) and only after 60 minutes the indicators were compared with the control level. The most pronounced effects after 15 and 30 minutes were recorded for the aptamer NH 2 -RE-PEG.

Необходимо отметить, что более длительное действия модифицированных аптамеров на тромбиновое время отмечалось, несмотря на то, что в условиях in vitro степень ингибирования ими активности тромбина была несколько ниже по сравнению с базовым аптамером RE31 (см. пример 1). Полученные результаты указывают на то, что проведенные модификации позволили существенно - не менее чем в 3-5 раз (для разных вариантов модификации) увеличить время жизни аптамеров в кровотоке in vivo.It should be noted that a longer action of modified aptamers on thrombin time was observed, despite the fact that in vitro the degree of inhibition of thrombin activity by them was slightly lower compared to the basic aptamer RE31 (see example 1). The results obtained indicate that the modifications made significantly - not less than 3-5 times (for different modification options) increase the lifetime of aptamers in the bloodstream in vivo.

Claims (1)

Модифицированный аптамерный олигонуклеотид, обладающий способностью ингибировать реакции тромбина с увеличенным временем жизни в кровотоке, представляющий собой олигодезоксирибонуклеотид ДНК - аптамер, характеризующийся нуклеотидной последовательностью
GTGACGTAGGTTGGTGTGGTTGGGGCGTCAC
и конъюгированный по 5′ или 3′ концу с NH2 группой этерификацией аминогексанолом фосфатной группы на 5′ или 3′ конце и/или с полиэтиленгликолем (PEG), присоединенным по 5′ и/или 3′ концу, при этом как минимум один из присоединенных по 5′ или 3′ концу заместителей представляет собой полиэтиленгликоль (PEG), и отвечающий общей формуле
d R-GTGACGTANGGTTGGTGTGGTTGGGGCGTCAC-R,
где d - дезоксирибоза, при этом олигонуклеотид содержит дезоксирибозу во всех позициях, R - химические заместители - NH2 группа и/или полиэтиленгликоль (PEG).
A modified aptamer oligonucleotide with the ability to inhibit thrombin reactions with an increased lifetime in the bloodstream, which is a DNA oligodeoxyribonucleotide - an aptamer characterized by a nucleotide sequence
GTGACGTAGGTTGGTGTGGTTGGGGCGTCAC
and conjugated at the 5 ′ or 3 ′ end to the NH 2 group by esterification with a phosphate group aminohexanol at the 5 ′ or 3 ′ end and / or to polyethylene glycol (PEG) attached at the 5 ′ and / or 3 ′ end, with at least one of attached at the 5 ′ or 3 ′ end of the substituents is polyethylene glycol (PEG), and corresponding to the general formula
d R-GTGACGTANGGTTGGTGTGGTTGGGGCGTCAC-R,
where d is deoxyribose, while the oligonucleotide contains deoxyribose in all positions, R are chemical substituents — NH 2 group and / or polyethylene glycol (PEG).
RU2009142862/10A 2009-11-23 2009-11-23 Modified dna aptamers inhibiting thrombin activity RU2410432C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2009142862/10A RU2410432C1 (en) 2009-11-23 2009-11-23 Modified dna aptamers inhibiting thrombin activity

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2009142862/10A RU2410432C1 (en) 2009-11-23 2009-11-23 Modified dna aptamers inhibiting thrombin activity

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2410432C1 true RU2410432C1 (en) 2011-01-27

Family

ID=46308416

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2009142862/10A RU2410432C1 (en) 2009-11-23 2009-11-23 Modified dna aptamers inhibiting thrombin activity

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2410432C1 (en)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2520094C1 (en) * 2013-03-22 2014-06-20 Общество с ограниченной ответственностью "ИРВИН 2" Combinatorial method for obtaining dna-aptamer thrombin inhibitors and aptamer oligonucleotides (versions)
RU2559545C1 (en) * 2014-05-29 2015-08-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "РКНПК" Минздрава России) Method of inhibiting thrombus formation and acceleration of fibrinolysis with dna aptamers inhibiting activity of thrombin in experiment
RU2571210C1 (en) * 2014-11-12 2015-12-20 Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) Sequence of dna-aptamers, binding to proteolytic subunit of neurotoxin of type a clostridium botulinum
RU2631829C1 (en) * 2016-12-21 2017-09-26 Общество С Ограниченной Ответственностью "Апто-Фарм" Anticoagulant with direct action based on modular bivalent dna of aptamer selective to thrombin
RU2644229C1 (en) * 2017-06-29 2018-02-08 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) Rna-aptamer with ability to learnrecognize autoantibodies, characteristic for multiple sclerosis
RU2686992C2 (en) * 2014-03-24 2019-05-06 Рибомик Инк. Aptamer for fgf2 and use thereof
RU2699522C2 (en) * 2017-11-30 2019-09-05 Общество с ограниченной ответственностью "ИБМХ-ЭкоБиоФарм" (ООО "ИБМХ-ЭкоБиоФарм") Method for enzymatic production of modified dna for producing reagents which specifically bind to hydrophobic areas of high molecular weight organic compounds
RU2703799C1 (en) * 2018-05-31 2019-10-22 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Dna-aptamers interacting with prothrombin
RU2723398C1 (en) * 2019-10-31 2020-06-11 Общество С Ограниченной Ответственностью "Апто-Фарм" Modified dna-aptamers linking extracellular domain egfr
RU2730000C1 (en) * 2019-09-23 2020-08-13 Общество С Ограниченной Ответственностью "Апто-Фарм" Dosage form of dna-aptamer

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
СПИРИДОНОВА В.А. и др. Аптамерные ДНК-ингибиторы тромбина нового типа. Биоорганическая химия, 2003, т.29, №45, с.495-498. BRODY E.N. ET AL.: "Aptamers as therapeutic and diagnostic agents", Reviews in molecular biotechnology, 2004, v.4, n.1, p.5-13. *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2520094C1 (en) * 2013-03-22 2014-06-20 Общество с ограниченной ответственностью "ИРВИН 2" Combinatorial method for obtaining dna-aptamer thrombin inhibitors and aptamer oligonucleotides (versions)
RU2686992C2 (en) * 2014-03-24 2019-05-06 Рибомик Инк. Aptamer for fgf2 and use thereof
RU2559545C1 (en) * 2014-05-29 2015-08-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "РКНПК" Минздрава России) Method of inhibiting thrombus formation and acceleration of fibrinolysis with dna aptamers inhibiting activity of thrombin in experiment
RU2571210C1 (en) * 2014-11-12 2015-12-20 Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) Sequence of dna-aptamers, binding to proteolytic subunit of neurotoxin of type a clostridium botulinum
RU2631829C1 (en) * 2016-12-21 2017-09-26 Общество С Ограниченной Ответственностью "Апто-Фарм" Anticoagulant with direct action based on modular bivalent dna of aptamer selective to thrombin
RU2644229C1 (en) * 2017-06-29 2018-02-08 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) Rna-aptamer with ability to learnrecognize autoantibodies, characteristic for multiple sclerosis
RU2699522C2 (en) * 2017-11-30 2019-09-05 Общество с ограниченной ответственностью "ИБМХ-ЭкоБиоФарм" (ООО "ИБМХ-ЭкоБиоФарм") Method for enzymatic production of modified dna for producing reagents which specifically bind to hydrophobic areas of high molecular weight organic compounds
RU2703799C1 (en) * 2018-05-31 2019-10-22 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Dna-aptamers interacting with prothrombin
WO2019231361A1 (en) * 2018-05-31 2019-12-05 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" Dna aptamers which interact with prothrombin
RU2730000C1 (en) * 2019-09-23 2020-08-13 Общество С Ограниченной Ответственностью "Апто-Фарм" Dosage form of dna-aptamer
RU2723398C1 (en) * 2019-10-31 2020-06-11 Общество С Ограниченной Ответственностью "Апто-Фарм" Modified dna-aptamers linking extracellular domain egfr

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2410432C1 (en) Modified dna aptamers inhibiting thrombin activity
JP4718541B2 (en) Improved coagulation factor regulator
CN108064313B (en) Compositions and methods for inhibiting gene expression of factor XII
Griffin et al. In vivo anticoagulant properties of a novel nucleotide-based thrombin inhibitor and demonstration of regional anticoagulation in extracorporeal circuits
Griffin et al. The discovery and characterization of a novel nucleotide-based thrombin inhibitor
Fischer et al. Extracellular nucleic acids as novel alarm signals in the vascular system
Mazurov et al. Characteristics of a new DNA aptamer, direct inhibitor of thrombin
Gopinath et al. A potent anti-coagulant RNA aptamer inhibits blood coagulation by specifically blocking the extrinsic clotting pathway
RU2429293C1 (en) Thrombin inhibiting dna-aptamers and method of structure stabilisation
Raviv et al. 4‐Thio‐deoxyuridylate‐modified thrombin aptamer and its inhibitory effect on fibrin clot formation, platelet aggregation and thrombus growth on subendothelial matrix
JP4257939B2 (en) Cathepsin G inhibitor aptamer
Gopinath Anti-coagulant aptamers
Yu et al. Applications and future of aptamers that achieve rapid-onset anticoagulation
EP3241904B1 (en) Factor xia-specific aptamers
RU2401306C2 (en) Aptamer oligonucleotide - direct thrombin inhibitor
Dobrovolsky et al. Inhibition of thrombin activity with DNA-aptamers
Lancellotti et al. Nucleotide-derived thrombin inhibitors: a new tool for an old issue
Gaddes et al. Regulation of fibrin-mediated tumor cell adhesion to the endothelium using anti-thrombin aptamer
RU2703799C1 (en) Dna-aptamers interacting with prothrombin
RU2631829C1 (en) Anticoagulant with direct action based on modular bivalent dna of aptamer selective to thrombin
US20120052058A1 (en) Methods of managing the blood coagulation and pharmaceutical compositions related thereto
Li et al. Aptamers for Thrombotic Diseases
RU2730000C1 (en) Dosage form of dna-aptamer
Yu et al. Applications and Future of Anticoagulant Aptamers for Surgical and Percutaneous Interventional Cardiac Procedures
WO2008107489A1 (en) Aptamer-based reagents for a target molecule involved in hemostasis

Legal Events

Date Code Title Description
PC43 Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions

Effective date: 20150507

PD4A Correction of name of patent owner
PD4A Correction of name of patent owner