RU2403288C1

RU2403288C1 - Method of producing high-polymeric rna from dry baker's yeast

Info

Publication number: RU2403288C1
Application number: RU2009128847/10A
Authority: RU
Inventors: Татьяна Витальевна Ямковая (RU); Татьяна Витальевна Ямковая; Станислав Николаевич Загребельный (RU); Станислав Николаевич Загребельный; Лев Евгеньевич Панин (RU); Лев Евгеньевич Панин; Виталий Иванович Ямковой (RU); Виталий Иванович Ямковой
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "ВИТАЛАНГ"
Priority date: 2009-07-27
Filing date: 2009-07-27
Publication date: 2010-11-10

Abstract

FIELD: chemistry; biochemistry.

SUBSTANCE: invention relates to biotechnology, in particular to extraction of physiologically active compounds and can be used in medicine. Dry yeast is suspended in a 1-2% aqueous solution of oleic acid titrated with an alkali to pH 7-8. The suspension is kept at 99-102°C for 40-60 minutes. Lysate cooled to 35-45°C is centrifuged without cooling. The supernatant fluid is discharged and NaCl is added to the discharged fluid until achieving concentration of 2-3 M. The suspension is kept for 20-24 hours at room temperature and centrifuged without cooling. Low-polymeric RNA is extracted from the obtained supernatant and the precipitate-extraction cake is washed with two portions of 2-3 M solution of NaCl and with four portions of 92-97% ethanol via successive resuspension at room temperature and centrifuging. High-polymeric RNA is extracted from the obtained extraction cake using distilled water and then dried using a conventional method. Ethanol is reclaimed through distillation. Natural oligoribonucleotides are extracted from the low-polymeric RNA through gel filtration on Sepharose-4B.

EFFECT: invention enables to obtain high-polymeric RNA with considerably high molecular weight as a result of using dry baker's yeast without preliminary soaking or using high temperature.

5 cl, 1 dwg, 1 ex

Description

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к выделению физиологически активных соединений.The invention relates to the field of biotechnology, in particular to the selection of physiologically active compounds.

Известные способы получения РНК из дрожжей позволяют получать низкополимерную РНК, например, патент РФ № 2103365, патент РФ № 1708845 [1], [2]. Она давно применяется в медицине при лечении широкого круга заболеваний: от вирусных инфекций до расстройств памяти (Земсков В.М., Лидак М.Ю., Земсков A.M., Микстайс У.Я. // Низкомолекулярная РНК: получение, гидролиз и применение в медицине. - Рига: Зинатне, 1985. - 191 с.) [3]. Однако этот препарат вводится пациентам всегда перорально, и механизм его действия включает, скорее всего, поставку мономеров для синтеза эндогенных нуклеиновых кислот. Механизм действия высокополимерной дрожжевой РНК принципиально иной. Она гораздо менее токсична, чем низкополимерная, и вводится животным путем инъекций, что приводит к избирательной индукции синтеза некоторых белков, например гемоглобина (Ямковая Т.В., Ямковой В.И., Панин Л.Е. Биологическая активность разных препаратов РНК из пекарских дрожжей. // Бюллетень Сибирского отделения РАМН. - Новосибирск, 2006. - № 3(121). - C.117-121) [4].Known methods for producing RNA from yeast make it possible to obtain low polymer RNA, for example, RF patent No. 2103365, RF patent No. 1708845 [1], [2]. It has long been used in medicine in the treatment of a wide range of diseases: from viral infections to memory disorders (Zemskov V.M., Lidak M.Yu., Zemskov AM, Mikstays U.Ya. // Low molecular weight RNA: production, hydrolysis and use in medicine . - Riga: Zinatne, 1985. - 191 p.) [3]. However, this drug is always administered to patients orally, and the mechanism of its action most likely includes the supply of monomers for the synthesis of endogenous nucleic acids. The mechanism of action of high polymer yeast RNA is fundamentally different. It is much less toxic than low polymer and is administered by animal injection, which leads to the selective induction of the synthesis of certain proteins, for example, hemoglobin (Yamkova T.V., Yamkova V.I., Panin L.E. Biological activity of various RNA preparations from baker's yeast. // Bulletin of the Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences. - Novosibirsk, 2006. - No. 3 (121). - C.117-121) [4].

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения высокополимерной РНК из прессованных или предварительно замоченных сухих дрожжей путем суспендирования их в водном 0,3-1,2 М растворе 2-этилгексановой кислоты, содержащем 0,1-0,5 М NaCl (pH 7,0-7,5), суспензию выдерживают при 92-98°С в течение 10-40 мин, охлаждают до комнатной температуры, центрифугируют при 4000 об/мин в течение 15 мин при 0-4°С, к надосадочной жидкости добавляют этанол до содержания 50-55 об.%, центрифугируют (4000 об/мин, 15 мин, 0-4°С), полученный осадок суммарной РНК растворяют в воде до содержания 150-200 ОЕ₂₆₀/мл. Раствор осветляют центрифугированием при 20000 об/мин в течение 20 мин при 0-4°С. Затем к надосадочной жидкости добавляют NaCl до концентрации 2 М, выдерживают смесь при 0-4°С в течение 1-2 ч и осадок высокополимерной РНК отделяют путем центрифугирования, растворяют до 150-200 ОЕ₂₆₀/мл, после центрифугирования полученного раствора (20000 об/мин, 20 мин, 0-4°С) к надосадочной жидкости добавляют NaCl до содержания 1,5 М и этанол до содержания 50-55 об.%. Полученный осадок натриевой соли высокополимерной РНК собирают центрифугированием при 0-4°С и высушивают обычными методами (а.с. SU 936701) [5].Closest to the proposed is a method for producing high-polymeric RNA from pressed or pre-soaked dry yeast by suspending them in an aqueous 0.3-1.2 M solution of 2-ethylhexanoic acid containing 0.1-0.5 M NaCl (pH 7.0 -7.5), the suspension is kept at 92-98 ° С for 10-40 min, cooled to room temperature, centrifuged at 4000 rpm for 15 min at 0-4 ° С, ethanol is added to the supernatant until the content 50-55 vol.%, Centrifuged (4000 rpm, 15 min, 0-4 ° C), the resulting precipitate of total RNA is dissolved in water to soda neighs 150-200 OE ₂₆₀ / ml. The solution is clarified by centrifugation at 20,000 rpm for 20 minutes at 0-4 ° C. Then, NaCl was added to the supernatant to a concentration of 2 M, the mixture was kept at 0-4 ° С for 1-2 h, and the precipitate of high-polymer RNA was separated by centrifugation, dissolved to 150-200 OE ₂₆₀ / ml, after centrifugation of the resulting solution (20,000 vol. / min, 20 min, 0-4 ° C) NaCl is added to the supernatant to a content of 1.5 M and ethanol to a content of 50-55 vol.%. The obtained precipitate of the sodium salt of high polymer RNA was collected by centrifugation at 0-4 ° C and dried by conventional methods (a.s. SU 936701) [5].

Данный способ предполагает использование не природного, редкого и высокотоксичного литического агента - 2-этилгексановой кислоты, и обводненных дрожжей, что требует глубокой очистки сильно деградированного конечного продукта, вследствие чего этот способ не экономичен и практически не масштабируем.This method involves the use of a non-natural, rare and highly toxic lytic agent - 2-ethylhexanoic acid, and watered yeast, which requires deep cleaning of the highly degraded final product, as a result of which this method is not economical and practically not scalable.

Целью изобретения является замена не природного, редкого и высокотоксичного литического агента на крупнотоннажный пищевой, что существенно удешевляет процесс, поскольку делает его безотходным. Кроме того, для подавления активности лизосомальных рибонуклеаз мы предлагаем сыпать сухие дрожжи без предварительного их замачивания непосредственно в крутой кипяток раствора литического агента.The aim of the invention is the replacement of non-natural, rare and highly toxic lytic agent for large-tonnage food, which significantly reduces the cost of the process, since it makes it waste-free. In addition, to suppress the activity of lysosomal ribonucleases, we suggest pouring dry yeast without first soaking it directly in boiling water of a solution of a lytic agent.

Цель достигается тем, что сухие дрожжи суспендируют в водном 1-2%-ном растворе олеиновой кислоты, оттитрованной щелочью до рН 7-8, суспензию выдерживают при 99-102°С в течение 40-60 мин, охлаждают до 35-45°С, центрифугируют (2500-3500 g, 5-15 мин, без охлаждения) и к слитой надосадочной жидкости добавляют NaCl до концентрации 2-3 М. Суспензию выдерживают 20-24 ч при комнатной температуре, центрифугируют (2500-3500 g, 5-40 мин, без охлаждения), осадок промывают 2-мя порциями 2-3 М раствора NaCl и 3-5-ю порциями 92-97%-ного этанола путем последовательного его ресуспендирования при комнатной температуре и центрифугирования (2500-3500 g, 5-40 мин, без охлаждения). Из полученного шрота высокополимерную РНК экстрагируют дистиллированной водой и высушивают обычным методом. Попутно получают концентрат кормового белка, низкополимерную РНК и природные олигорибонуклеотиды.The goal is achieved in that dry yeast is suspended in an aqueous 1-2% solution of oleic acid, titrated with alkali to pH 7-8, the suspension is maintained at 99-102 ° C for 40-60 minutes, cooled to 35-45 ° C centrifuged (2500-3500 g, 5-15 min, without cooling) and NaCl was added to the drained supernatant to a concentration of 2-3 M. The suspension was held for 20-24 hours at room temperature, centrifuged (2500-3500 g, 5-40 min, without cooling), the precipitate is washed with 2 portions of a 2-3 M NaCl solution and 3-5 portions of 92-97% ethanol by sequentially resuspending it with atnoy temperature and centrifugation (2500-3500 g, 5-40 min, without refrigeration). From the obtained meal, the high polymer RNA is extracted with distilled water and dried in the usual way. Along the way, a feed protein concentrate, low polymer RNA and natural oligoribonucleotides are obtained.

При снижении центробежного ускорения ниже 2500 g и времени центрифугирования менее 5 мин осадок высокополимерной РНК образуется рыхлый и тянется за декантируемым супернатантом, а увеличение ускорения более 3500 g и времени центрифугирования более 40 мин не приводит к дополнительному его уплотнению.With a decrease in centrifugal acceleration below 2500 g and a centrifugation time of less than 5 min, the precipitate of high-polymer RNA forms friable and reaches for the decanted supernatant, and an increase in acceleration of more than 3500 g and centrifugation time of more than 40 min does not lead to its additional densification.

Пример осуществления предлагаемого способаAn example implementation of the proposed method

30 г свежих сухих пекарских дрожжей (Saccharomyces cerevisiae, Новосибирский дрожжевой завод, ГОСТ 28483-90) с содержанием влаги ~7,4% суспендировали по порциям в течение 1-2 мин в 0,3 л кипящей воды, содержащей 4,5 г олеиновой кислоты, оттитрованной 2 мл 2,5 М NaOH так, чтобы температура суспензии не опускалась ниже 99°С. Суспензию кипятили 40 мин при 99-102°С и частом перемешивании. По мере упаривания добавляли в нее кипящую воду до 0,3 л. Через 10, 20 и 30 мин после суспендирования последней порции дрожжей в кипящую суспензию добавляли по 1 мл 2,5 М NaOH. По окончании экстракции горячую суспензию охлаждали до ~40°С, центрифугировали (3000 g, 10 мин, без охлаждения), супернатант (~0,16 л) сливали в стеклянную емкость на 0,5 л. Дрожжевой шлам, собирающийся на дне центрифужных стаканов и содержащий до 70% денатурированного белка, сушили при 58-62°С обычным способом. В супернатант же добавляли 53 г NaCl (ФГУП комбината «СИБСОЛЬ», г.Усолье-Сибирское, Иркутская обл., ГОСТ Р 51574-2000) и свежую дистиллированную воду до 0,3 л. Суспензию интенсивно перемешивали до полного растворения соли и оставляли при комнатной температуре на 22 ч. Высоленный осадок-шрот, содержащий высокополимерную РНК, отделяли от супернатанта центрифугированием (3000 g, 10 мин, без охлаждения), промывали 2-мя порциями по 80 мл 3 М раствора NaCl и 4-мя порциями по 20 мл 96-97%-ного этанола (ОАО «Спиртовый комбинат», г.Мариинск, Кемеровская обл., ГОСТ Р 51652-2000); при этом шрот отделяли от 3 М раствора NaCl и этанола центрифугированием (3000 g, 10 мин, без охлаждения). Отработанный спирт регенерировали перегонкой (возврат ~90%). Содержащуюся же в супернатанте (~0,3 л) из-под высокополимерной РНК низкополимерную РНК осаждали добавлением 0,6 мл концентрированной HCl. Сформировавшийся в течение 2 сут при температуре 5-25°С осадок низкополимерной РНК выделяли центрифугированием (3000 g, 10 мин, без охлаждения), промывали 2-мя порциями по 35 мл 94%-ного этанола и сушили на воздухе при комнатной температуре. Природные олигорибонуклеотиды получали гель-хроматографией низкополимерной РНК на Сефарозе 4 В. Они элюировались 0,15 М раствором NaCl двумя пиками с К_av=1,33 и 1,58.30 g of fresh dry baker's yeast (Saccharomyces cerevisiae, Novosibirsk Yeast Plant, GOST 28483-90) with a moisture content of ~ 7.4% was suspended in portions for 1-2 minutes in 0.3 l of boiling water containing 4.5 g of oleic acid titrated with 2 ml of 2.5 M NaOH so that the temperature of the suspension does not fall below 99 ° C. The suspension was boiled for 40 min at 99-102 ° C with frequent stirring. As evaporated, boiling water up to 0.3 l was added to it. After 10, 20 and 30 minutes after suspension of the last portion of yeast, 1 ml of 2.5 M NaOH was added to the boiling suspension. At the end of the extraction, the hot suspension was cooled to ~ 40 ° C, centrifuged (3000 g, 10 min, without cooling), the supernatant (~ 0.16 L) was poured into a 0.5 L glass container. The yeast sludge collected at the bottom of the centrifuge cups and containing up to 70% of the denatured protein was dried at 58-62 ° C in the usual way. In the supernatant, 53 g of NaCl were added (FSUE of the SIBSOL plant, Usolye-Sibirsky, Irkutsk region, GOST R 51574-2000) and fresh distilled water up to 0.3 l. The suspension was vigorously stirred until the salt was completely dissolved and left at room temperature for 22 hours. The salted cake-cake containing high-polymer RNA was separated from the supernatant by centrifugation (3000 g, 10 min, without cooling), washed with 2 portions of 80 ml of 3 M NaCl solution and 4 portions of 20 ml of 96-97% ethanol (Alcohol Plant OJSC, Mariinsk, Kemerovo Region, GOST R 51652-2000); while the meal was separated from a 3 M solution of NaCl and ethanol by centrifugation (3000 g, 10 min, without cooling). The spent alcohol was regenerated by distillation (return ~ 90%). The low polymer RNA contained in the supernatant (~ 0.3 L) from under the high polymer RNA was precipitated by adding 0.6 ml of concentrated HCl. The precipitate of low polymer RNA formed for 2 days at a temperature of 5-25 ° C was isolated by centrifugation (3000 g, 10 min, without cooling), washed with 2 portions of 35 ml of 94% ethanol, and dried in air at room temperature. Natural oligoribonucleotides were obtained by gel chromatography of low polymer RNA on Sepharose 4 V. They were eluted with a 0.15 M NaCl solution with two peaks with K _av = 1.33 and 1.58.

Товарную высокополимерную РНК получали экстракцией ее из промытого шрота дистиллированной водой, осветлением экстракта центрифугированием (3000 g, 10 мин, без охлаждения) и заключительной лиофилизацией.Commodity high-polymer RNA was obtained by extracting it from washed meal with distilled water, clarifying the extract by centrifugation (3000 g, 10 min, without cooling) and final lyophilization.

Из 30 г свежих сухих пекарских дрожжей получали 0,70-1,35 г высокополимерной РНК со следующими характеристиками: цвет лиофилизованного препарата - белый; растворимость в воде - удовлетворительная, водный раствор мылкий; весовая экстинкция, ОЕ₂₆₀/мг - 17-18; содержание КРФ, % ≤2,5; прирост КРФ за 1 сут при 22-25°С в дистиллированной воде, % ≤0,4; спектральные отношения: D₂₃₀/D₂₆₀ - 0,30-0,45; D₂₅₀/D₂₆₀ - 0,88-0,92; D₂₈₀/D₂₆₀ - 0,45-0,60.From 30 g of fresh dry baker's yeast, 0.70-1.35 g of high polymer RNA was obtained with the following characteristics: the color of the lyophilized preparation is white; solubility in water - satisfactory, soapy aqueous solution; weight extinction, OE ₂₆₀ / mg - 17-18; CRF content,% ≤2.5; an increase in CRF for 1 day at 22-25 ° C in distilled water,% ≤0.4; spectral ratios: D ₂₃₀ / D ₂₆₀ - 0.30-0.45; D ₂₅₀ / D ₂₆₀ - 0.88-0.92; D ₂₈₀ / D ₂₆₀ - 0.45-0.60.

Выход из 30 г свежих сухих пекарских дрожжей концентрата кормового белка - 24-26 г, низкополимерной РНК - 0,17-0,24 г, природных олигорибонуклеотидов - 15-21 мг.The yield from 30 g of fresh dry baker's yeast feed protein concentrate is 24-26 g, low polymer RNA - 0.17-0.24 g, natural oligoribonucleotides - 15-21 mg.

Предлагаемый способ получения высокополимерной дрожжевой РНК (предполагаемое рыночное название «Виталанг-2») является простой, легко масштабируемой, экологически чистой и практически безотходной технологией, поскольку предполагает использование сухих дрожжей и крупнотоннажного и дешевого литического агента - олеиновой кислоты, являющейся, к тому же, незаменимым продуктом питания.The proposed method for producing high-polymer yeast RNA (the alleged market name "Vitalang-2") is a simple, easily scalable, environmentally friendly and virtually waste-free technology, since it involves the use of dry yeast and large-capacity and cheap lytic agent - oleic acid, which, moreover, an indispensable food product.

Весовая экстинкция, характеризующая степень чистоты полученной предлагаемым способом высокополимерной РНК (17-18 ОЕ₂₆₀/мг), практически соответствует таковой (>16 ОЕ₂₆₀/мг) для препарата высокополимерной РНК сорта А, полученного по способу-прототипу [5]. Теоретическая весовая экстинкция для чистой РНК - 20 ОЕ₂₆₀/мг, т.е. при весовой экстинкции 17-18 ОЕ₂₆₀/мг чистой РНК в препарате - 85-90%.Weight extinction, characterizing the degree of purity of the obtained high-polymer RNA (17-18 OE ₂₆₀ / mg) obtained by the proposed method, practically corresponds to that (> 16 OE ₂₆₀ / mg) for the high-polymer RNA grade A obtained by the prototype method [5]. The theoretical weight extinction for pure RNA is 20 OE ₂₆₀ / mg, i.e. with a weight extinction of 17-18 OE ₂₆₀ / mg of pure RNA in the preparation, 85-90%.

Как видно из чертежа, полученная предлагаемым способом высокополимерная РНК имеет значительно большую молекулярную массу, чем образцы, выделенные из прессованных пекарских дрожжей по способу [6] и способу-прототипу [5]. Таким образом, всыпая сухие пекарские дрожжи без предварительного их замачивания непосредственно в крутой кипяток, мы подавляем высокой температурой активность лизосомальных рибонуклеаз, прежде чем они обводнятся и начнут гидролизовать собственную РНК.As can be seen from the drawing, the high-polymeric RNA obtained by the proposed method has a significantly higher molecular weight than the samples isolated from pressed baking yeast by the method [6] and the prototype method [5]. Thus, pouring dry baker's yeast without first soaking it directly in boiling water, we suppress the activity of lysosomal ribonucleases by a high temperature before they are irrigated and begin to hydrolyze their own RNA.

Источники информацииInformation sources

1. Патент РФ № 2103365.1. RF patent No. 2103365.

2. Патент РФ № 1708845.2. RF patent No. 1708845.

3. Земсков В.М., Лидак М.Ю., Земсков A.M., Микстайс У.Я. // Низкомолекулярная РНК: получение, гидролиз и применение в медицине. - Рига: Зинатне, 1985. - 191 с.3. Zemskov V.M., Lidak M.Yu., Zemskov A.M., Mikstays U.Ya. // Low molecular weight RNA: production, hydrolysis and use in medicine. - Riga: Zinatne, 1985 .-- 191 p.

4. Ямковая Т.В., Ямковой В.И., Панин Л.Е. Биологическая активность разных препаратов РНК из пекарских дрожжей. // Бюллетень Сибирского отделения РАМН. - Новосибирск, 2006. - № 3(121). - C.117-121.4. Yamkova T.V., Yamkova V.I., Panin L.E. The biological activity of various preparations of RNA from baker's yeast. // Bulletin of the Siberian branch of RAMS. - Novosibirsk, 2006. - No. 3 (121). - C.117-121.

5. Авторское свидетельство SU № 936701.5. Copyright certificate SU No. 936701.

6. Заявка на изобретение № 2008139832/13 (051491).6. Application for invention No. 2008139832/13 (051491).

Claims

1. A method of producing high-polymeric RNA from dry baker's yeast by suspending them in a boiling solution of a lytic agent, followed by prolonged boiling of the suspension, centrifuging a cooled lysate, precipitating high-polymeric RNA from the supernatant with sodium chloride and washing the precipitate with sodium chloride and ethanol by sequentially resuspending and centrifuging it isolation of the final product from the obtained meal by extraction with water, characterized in that the dry baking yeast is suspended alkaline titrated in an aqueous solution of oleic acid, the suspension is maintained at 99-102 ° C for 40-60 minutes, the lysate cooled to 35-45 ° C is centrifuged in a low-speed centrifuge without cooling, NaCl is added to the drained supernatant to a concentration of 2- 3 M, the suspension was incubated for 20-24 hours at room temperature, centrifuged in a low speed centrifuge without cooling, the resulting meal was washed sequentially with 2-3 M NaCl solution and 92-97% ethanol by resuspension at room temperature and low-speed ntrifugirovaniya.

2. The method according to claim 1, characterized in that the food detergent is oleic acid at a concentration of 1-2% as a lytic agent.

3. The method according to claim 1, characterized in that the dry yeast without preliminary soaking is poured in portions directly into the boiling water of a 1-2% solution of oleic acid, titrated with alkali to a pH of 7-8.

4. The method according to claim 1, characterized in that the low-speed centrifugation is carried out at an acceleration of 3000 g for 10 minutes without cooling.

5. The method according to claim 1, characterized in that at the same time as the high-polymeric RNA, a feed protein concentrate, low molecular weight RNA and natural oligoribonucleotides are obtained.