RU2401115C1 - Method of treating mycotic infections and preparation for implementation thereof - Google Patents
Method of treating mycotic infections and preparation for implementation thereof Download PDFInfo
- Publication number
- RU2401115C1 RU2401115C1 RU2009105771/15A RU2009105771A RU2401115C1 RU 2401115 C1 RU2401115 C1 RU 2401115C1 RU 2009105771/15 A RU2009105771/15 A RU 2009105771/15A RU 2009105771 A RU2009105771 A RU 2009105771A RU 2401115 C1 RU2401115 C1 RU 2401115C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- exoenzyme
- lytic
- strain
- preparation
- per
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к лечению микотических инфекций, и может быть использовано в частности в гинекологической практике.The invention relates to medicine, namely to the treatment of mycotic infections, and can be used in particular in gynecological practice.
Среди микотических оппортунистических инфекций кандидоз играет ведущую роль. Около 75% женщин за всю жизнь имеет хотя бы один эпизод вагинального кандидоза (далее ВК), доминирующим возбудителем которого является Candida albicans. Очень часто ВК протекает как рецидивирующая инфекция и трудно поддается лечению. Существенную проблему представляют рецидивы кандидоза слизистых оболочек у отдельных категорий пациентов. У некоторых из них причина высокой частоты рецидивов определена (рецидивы кандидоза у больных СПИДом), в других случаях она остается неясной (рецидивы кандидозного вагинита у женщин с нормальным иммунитетом) (см., например, Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии, п/р Л.С.Страчунского, Ю.С.Белоусова, С.Н.Козлова. - М., 2002). Применение антимикотических препаратов не всегда оказывается успешным, поскольку хронизация инфекции может сопровождаться формированием лекарственной устойчивости возбудителя. Это обстоятельство определяет актуальность поиска альтернативных средств терапии ВК. Одним из возможных подходов к решению этой задачи является изучение терапевтического эффекта ферментов микробного происхождения, воздействующих на специфические для клетки гриба морфофункциональные структуры.Among mycotic opportunistic infections, candidiasis plays a leading role. About 75% of women in their entire lives have at least one episode of vaginal candidiasis (hereinafter VK), the dominant pathogen of which is Candida albicans. Very often, VC occurs as a recurring infection and is difficult to treat. A significant problem is the relapse of candidiasis of the mucous membranes in certain categories of patients. In some of them, the cause of the high relapse rate is defined (relapse of candidiasis in AIDS patients), in other cases it remains unclear (relapse of candida vaginitis in women with normal immunity) (see, for example, Practical Guide to Anti-Infectious Chemotherapy, p / p L. S. Strachunsky, Yu.S. Belousov, S.N. Kozlova. - M., 2002). The use of antimycotic drugs is not always successful, since chronic infection can be accompanied by the formation of drug resistance of the pathogen. This fact determines the relevance of the search for alternative therapies for VK. One of the possible approaches to solving this problem is to study the therapeutic effect of enzymes of microbial origin that affect morphofunctional structures specific for fungal cells.
Известен способ коррекции микрофлоры вагины (RU 2131258, Смирнов и др., 10.06.1999). Способ заключается в интравагинальном введении препарата Биоспорин (в свечах или тампонах). Изобретение позволяет корректировать микрофлору вагины при ее нарушениях, вызываемых патогенными и условно-патогенными микроорганизмами различных таксономических групп. Однако действие этого препарата является опосредованным и при любом нарушении микробиоты возможен рецидив кандидоза.A known method of correcting the microflora of the vagina (RU 2131258, Smirnov and others, 06/10/1999). The method consists in the intravaginal administration of the drug Biosporin (in suppositories or tampons). The invention allows you to adjust the microflora of the vagina with its violations caused by pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms of various taxonomic groups. However, the effect of this drug is indirect and a relapse of candidiasis is possible with any violation of the microbiota.
Известна фармкомпозиция (RU 2007105476, Диковский и др., 10.09.2008) для лечения кандидозных вульвовагинитов, включающая в качестве активного компонента пребиотик лактулозу в виде вагинальных суппозиториев, в качестве активного компонента антимикотик (азолы: интраконазол, терконазол, эконазол; нифуратель и натамицин) в количестве 100 мг или 500 мг, а пребиотик - в количестве 200 мг. Однако известно, что при назначении антимикотиков из группы азолов у 20% пациенток в течение шести месяцев наблюдается рецидивы.Known pharmaceutical composition (RU 2007105476, Dikovsky et al., September 10, 2008) for the treatment of candidal vulvovaginitis, including as an active component prebiotic lactulose in the form of vaginal suppositories, as an active component antimycotics (azoles: intraconazole, terconazole, econazole; nifuratel and in an amount of 100 mg or 500 mg, and a prebiotic in an amount of 200 mg. However, it is known that when prescribing antimycotics from the azole group in 20% of patients, relapse is observed within six months.
Описан способ комплексного лечения ВК (RU 2254857, Коломойцева и др., 27.06.2005) вагинальными суппозиториями Гексикон; препаратами Мультитабс, Рекицен-РД, которые могут значительно улучшить состояние больных в острый период, однако не являются специфической антимикотической терапией, и не гарантируют отсутствие рецидивов в течение шести месяцев после лечения.A method for the complex treatment of VK (RU 2254857, Kolomoytseva et al., June 27, 2005) with vaginal suppositories Hexicon is described; Multitabs, Rekitsen-RD drugs, which can significantly improve the condition of patients in the acute period, but are not specific antimycotic therapy, and do not guarantee the absence of relapse within six months after treatment.
Известен препарат - вагинальные суппозитории (RU 2257197, Дулькис и др., 12.05.2004), содержащие в частности бензалкония хлорид, бензойную кислоту, витеспол при определенном содержании ингредиентов. Бензалкония хлорид бактерицидно влияет на целую гамму бактерий, однако он менее активен в отношении патогенных грибов, в частности Candida albicans, а бензойная кислота является регулятором рН, препятствует росту патогенных грибов, не являясь средством прямого воздействия на грибы, и не приводит полной эмилинации кандид из влагалища.A well-known drug is vaginal suppositories (RU 2257197, Dulkis et al., 12.05.2004) containing, in particular, benzalkonium chloride, benzoic acid, vitespol with a certain content of ingredients. Benzalkonium chloride has a bactericidal effect on a whole gamut of bacteria, however, it is less active against pathogenic fungi, in particular Candida albicans, and benzoic acid is a pH regulator, inhibits the growth of pathogenic fungi, not being a means of directly affecting fungi, and does not completely exclude candida from the vagina.
Известен способ лечения вагинальных кандидозов (NZ 539019 (A), HUTMAN, 27.10.2006) с использованием антифунгальных и антибактериальных препаратов, таких как метронидазол и миконазол нитрат, а также пробиотиков и антивирусных добавок. Однако известно, что для указанных препаратов возможно развитие резистентности возбудителей, а повышение дозы может вызвать токсический эффект. С другой стороны, добавки не обладают специфической активностью к кандидам.A known method for the treatment of vaginal candidiasis (NZ 539019 (A), HUTMAN, 10.27.2006) using antifungal and antibacterial drugs such as metronidazole and miconazole nitrate, as well as probiotics and antiviral additives. However, it is known that for these drugs, the development of resistance of pathogens is possible, and an increase in the dose can cause a toxic effect. On the other hand, supplements do not have specific activity for candida.
Известен также способ лечения хронического рецидивирующего вульвовагинального кандидоза (RU 2309761, Хамадьянов и др., 10.11.2007), в котором в три этапа интравагинально и перорально вводят энтеросорбент, интраназально - тимоген и, дополнительно, вакцину «СолкоТриховак», линимент циклоферона интравагинально, эуфлорин В перорально и эуфлорин L интравагинально. Однако при положительном воздействии иммуномодулирующих компонентов на неспецифическую резистентность не оказывается специфическое воздействие на возбудителей кандидоза, что не гарантирует полной защиты от рецидивов.There is also known a method of treating chronic recurrent vulvovaginal candidiasis (RU 2309761, Khamadyanov et al., 10.11.2007), in which enterosorbent, intranasally thymogen and, in addition, SolcoTrihovac vaccine, cycloferon liniment intravaginally, are administered intravaginally and orally in three stages. In oral administration and euphorin L intravaginally. However, with a positive effect of immunomodulating components on nonspecific resistance, there is no specific effect on the causative agents of candidiasis, which does not guarantee complete protection against relapses.
Известен способ лечения микотических инфекций, использующих энзимы с литическим действием на клетки (US 4062941, Davies, 13.12.1977 - ближайший аналог). Комплекс литических экзоферментов экстрагировался из штаммов Corpinus comatus, Licoperdon depressum или Licoperdon pyriforme. Энзимы идентифицировали по ламинариназе (хитиназе, хитобиазе). Однако указанные ферменты разрушают компонент клеточной стенки гриба - хитин, но не воздействуют на маннановый слой, который определяет основную структуру стенки гриба.A known method of treating mycotic infections using enzymes with a lytic effect on cells (US 4062941, Davies, 12/13/1977 - the closest analogue). The complex of lytic exoenzymes was extracted from strains of Corpinus comatus, Licoperdon depressum or Licoperdon pyriforme. Enzymes were identified by laminarinase (chitinase, chitobiasis). However, these enzymes destroy the component of the fungal cell wall - chitin, but do not affect the mannan layer, which determines the basic structure of the fungal wall.
Задачей настоящего изобретения является способ лечения микотических инфекций и препарат для его осуществления, которые позволяют оказывать специфическое воздействие непосредственно на Candida albicans без угнетения нормальной микрофлоры, т.к. точкой приложения препарата являются маннановый и фибриллярный слои клеточной стенки грибов. Этим самым достигается необратимость потери кандидами вирулентных свойств и жизнеспособности, что обуславливает отсутствие рецидивов.The present invention is a method of treating mycotic infections and a preparation for its implementation, which allow you to have a specific effect directly on Candida albicans without inhibiting normal microflora, because the point of application of the drug are the mannan and fibrillar layers of the cell wall of the fungi. This ensures the irreversibility of Candida losing its virulent properties and viability, which leads to the absence of relapse.
Патентуемый способ лечения микотических инфекций с использованием в качестве активного вещества литического экзофермента в форме средства для местного применения характеризуется тем, что используют литический экзофермент штамма Cellulomonas cellulans ВКПМ АС-870, имеющий молекулярную массу в интервале от 100 до 30 кДа и удельную активность не менее 48,3 ЕД/мг белка.A patented method for treating mycotic infections using a lytic exoenzyme as an active substance in the form of a topical preparation is characterized in that they use a lytic exoenzyme of the strain Cellulomonas cellulans VKPM AC-870, having a molecular weight in the range from 100 to 30 kDa and a specific activity of at least 48 3 U / mg protein.
Способ может характеризоваться тем, что упомянутый экзофермент представляет собой литиказу, а также тем, что при интравагинальном и ректальном применении упомянутый экзофермент используют в дозе 10-50 ЕД один раз в сутки в течение 5-7 дней.The method can be characterized by the fact that the said exoenzyme is a lyticase, and also by the fact that with intravaginal and rectal use, the said exoenzyme is used in a dose of 10-50 ED once a day for 5-7 days.
Способ может характеризоваться и тем, что при местном применении упомянутый экзофермент используют в количестве 2-10 ЕД на 1 г биологически приемлемого носителя, преимущественно в форме мази или геля, 1 раз в сутки в течение 5-7 дней.The method can be characterized by the fact that when applied locally, the said exoenzyme is used in an amount of 2-10 ED per 1 g of a biologically acceptable carrier, mainly in the form of an ointment or gel, 1 time per day for 5-7 days.
Способ может характеризоваться также тем, что дополнительно назначают ингибитор протеиназ контрикал, который вводят совместно с упомянутым экзоферментом в количестве 500-1000 АТрЕ на одну дозу последнего.The method may also be characterized in that it additionally prescribes a contrical proteinase inhibitor, which is administered together with the said exoenzyme in an amount of 500-1000 ATre per dose of the latter.
Препарат для лечения микотических инфекций с использованием в качестве активного вещества литического экзофермента в форме средства для местного применения характеризуется тем, что используют литический экзофермент штамма Cellulomonas cellulans ВКПМ АС-870, имеющий молекулярную массу в интервале от 100 до 30 кДа и удельную активность не менее 48,3 ЕД/мг белка, а также тем, что упомянутый экзофермент представляет собой литиказу.A preparation for treating mycotic infections using a lytic exoenzyme as an active substance in the form of a topical preparation is characterized in that they use a lytic exoenzyme of the strain Cellulomonas cellulans VKPM AC-870, having a molecular weight in the range from 100 to 30 kDa and a specific activity of at least 48 , 3 IU / mg of protein, as well as the fact that said exoenzyme is a lyticase.
Препарат для местного, интравагинального и ректального применения содержит 10-50 ЕД упомянутого экзофермента на единичную фармацевтическую форму, преимущественно суппозиторий, тампон или гигиеническую прокладку.The preparation for local, intravaginal and rectal administration contains 10-50 units of the mentioned exoenzyme per unit pharmaceutical form, mainly a suppository, tampon or sanitary pad.
Препарат может характеризоваться тем, что содержит упомянутый экзофермент в количестве 2,0-10,0 ЕД на 1,0 г биологически приемлемого носителя, и выполнен в форме мази или геля, а также тем, что содержит ингибитор протеиназ контрикал в количестве 500-1000 АТрЕ на одну дозу упомянутого упомянутого литического экзофермента.The drug can be characterized in that it contains the mentioned exoenzyme in an amount of 2.0-10.0 UNITS per 1.0 g of a biologically acceptable carrier, and is made in the form of an ointment or gel, and also contains a proteinase inhibitor kontrikal in an amount of 500-1000 ATPE per dose of said mentioned lytic exoenzyme.
Технический результат - снижение рецидивов при лечении микотических инфекций, повышение антимикотической активности без угнетения нормальной микрофлоры. Это обеспечивается за счет воздействия упомянутого экзофермента как на маннановый слой клеточной стенки Candida albicans, так и на фибриллярный слой с последующим его отщеплением. Дополнительный технический результат - синергетический эффект при совместном использовании упомянутого литического экзофермента и контрикала: у грибов рода Candida образуется развитая поверхность, однако не проявляющая патогенных свойств.EFFECT: reduced relapse in the treatment of mycotic infections, increased antimycotic activity without inhibiting normal microflora. This is due to the effect of the mentioned exoenzyme both on the mannan layer of the cell wall of Candida albicans and on the fibrillar layer with its subsequent cleavage. An additional technical result is a synergistic effect when using the aforementioned lytic exoenzyme and contrycal together: in the fungi of the genus Candida, a developed surface is formed, but not showing pathogenic properties.
Существо изобретения поясняется на графиках, где на фиг.1 - представлена динамика роста культуры-продуцента и изменения протеолитической активности культуральной жидкости (КЖ); на фиг.2 - изменение активности литиказы в динамике культивирования Cellulomonas cellulans; на фиг.3, 4 - клиренс влагалища по отношению к дрожжеподобным грибам под действием литиказы в дозе 2 ЕД/мл и 10 ЕД/мл, соответственно.The invention is illustrated in the graphs, where in Fig.1 - presents the growth dynamics of the producer culture and changes in the proteolytic activity of the culture fluid (QL); figure 2 - change in the activity of lyticase in the dynamics of cultivation of Cellulomonas cellulans; figure 3, 4 - clearance of the vagina in relation to yeast-like fungi under the action of lyticase at a dose of 2 U / ml and 10 U / ml, respectively.
В качестве активного вещества используют литический экзофермент - литиказу штамма Cellulomonas cellulans ВКПМ АС-870. Перед засевом на матрасы культура С.cellulans стабилизируется путем создания холодового шока (экспозиция инокулята 20 минут при температуре +4°С). Далее штамм культивируют при постоянном шуттели-ровании в течение 2,5-3 суток при температуре 37°С на модифицированном сердечно-мозговом бульоне (СМБ) с добавкой убитых пекарских дрожжей в количестве 9,5-10,5 г на 1 л среды в качестве индуктора литиказы. Динамика роста контролировалась по оптической плотности (ОП). Установлено, что активность литиказы увеличивалась в период экспоненциального роста культуры и достигала максимума в стационарной фазе, после чего снижалась. Оптимальным периодом эффективного культивирования является 65-72 час, так как в течение этого периода происходит наибольшее накопление искомого продукта (фиг.1, 2).As an active substance, a lytic exoenzyme is used - a lyticase of the strain Cellulomonas cellulans VKPM AC-870. Before seeding on mattresses, C.cellulans culture is stabilized by creating a cold shock (inoculum exposure for 20 minutes at a temperature of + 4 ° C). Next, the strain is cultivated with constant juggling for 2.5-3 days at a temperature of 37 ° C on a modified cardiac broth (SMB) with the addition of killed baking yeast in the amount of 9.5-10.5 g per 1 liter of medium in as an inducer of lithicase. Growth dynamics was controlled by optical density (OD). It was found that the activity of lithicase increased during the period of exponential growth of the culture and reached a maximum in the stationary phase, after which it decreased. The optimal period of effective cultivation is 65-72 hours, since during this period there is the greatest accumulation of the desired product (figure 1, 2).
По окончании культивирования КЖ в объеме 1,5 литра центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин и пропускали через стерилизующий фильтр с диаметром пор 0,02 мкм. Далее, КЖ подвергали диафильтрации на ячейках фирмы «AMICON» с использованием мембран ХМ-300, ХМ-100 и РМ-20. Каждая из фракций была сконцентрирована до объема 20 мл, после чего определяли активность литиказы. Установлено, что активность фермента отсутствовала во фракциях, содержащих биополимеры с молекулярной массой более 100 кДа и 300 кДа, но полностью проявлялась в интервале от 100 до 30 кДа. Полученные параметры согласуются с характеристиками, описанными в литературе. После промывки и концентрирования данной фракции удельная активность конечного продукта составляет не менее 48,3 ЕД/мг белка, что более чем в 2 раза превышает удельную активность коммерческого препарата «Lyticase» фирмы Sigma (20 ЕД/мг белка), принятого нами как стандарт.At the end of cultivation, QOL in a volume of 1.5 liters was centrifuged at 3000 rpm for 15 min and passed through a sterilizing filter with a pore diameter of 0.02 μm. Further, QOL was subjected to diafiltration on AMICON cells using XM-300, XM-100, and RM-20 membranes. Each of the fractions was concentrated to a volume of 20 ml, after which the activity of lyticase was determined. It was established that the enzyme activity was absent in fractions containing biopolymers with a molecular mass of more than 100 kDa and 300 kDa, but was fully manifested in the range from 100 to 30 kDa. The obtained parameters are consistent with the characteristics described in the literature. After washing and concentrating this fraction, the specific activity of the final product is at least 48.3 U / mg protein, which is more than 2 times the specific activity of the commercial drug Lyticase from Sigma (20 U / mg protein), which we adopted as a standard.
На животных была оценена острая токсичность препарата, для чего по 0,4 мл раствора, содержащего 117 мг белка, вводили 10-ти мышам в дорсальную вену хвоста. Животные в течение 10 дней оставались здоровыми, из чего был сделан вывод о том, что препарат не токсичен в дозах, которые в сотни раз превышают лечебные.In animals, the acute toxicity of the drug was evaluated, for which 0.4 mice of a solution containing 117 mg of protein were administered to 10 mice in the tail dorsal vein. The animals remained healthy for 10 days, from which it was concluded that the drug is not toxic at doses that are hundreds of times higher than the therapeutic ones.
Действие полученного экзофермента - литиказы проявляется в виде лизиса клеток грибов. Литический эффект выражается в снижении количества жизнеспособных грибов и зависит от дозы фермента, использованного в опыте. При обработке суспензии С.albicans литиказой с активностью 10 ЕД наблюдается снижение оптической плотности взвеси до 53% относительно контроля в течение 1 часа. Дозозависимый эффект наблюдается при оценке результатов высева оставшихся жизнеспособных клеток. Оба процесса описываются двумя уравнениями регрессии, отражающими зависимость литического эффекта от дозы фермента:The action of the obtained exoenzyme - lyticase is manifested in the form of lysis of fungal cells. The lytic effect is expressed in a decrease in the number of viable fungi and depends on the dose of the enzyme used in the experiment. When processing a suspension of C. albicans with lyticase with an activity of 10 PIECES, a decrease in the optical density of the suspension to 53% relative to the control within 1 hour is observed. A dose-dependent effect is observed when evaluating the results of seeding of the remaining viable cells. Both processes are described by two regression equations that reflect the dependence of the lytic effect on the dose of the enzyme:
у(х)=-10,5497856·ln(х)+67,1981181, при стандартном отклонении, равном 5,128; где: у - величина снижения оптической плотности взвеси грибов под воздействием литиказы, по сравнению с контролем; х - доза литиказы;y (x) = - 10.5497856 · ln (x) +67.1981181, with a standard deviation of 5.128; where: y is the magnitude of the decrease in the optical density of the suspension of fungi under the influence of lithicase, compared with the control; x is the dose of lithicase;
У(х)=-11.6411733·ln(х)+83.5368459, при стандартном отклонении, равном 5,945; где: У - процент жизнеспособных клеток относительно контроля; х - доза литиказы.Y (x) = - 11.6411733 · ln (x) +83.5368459, with a standard deviation of 5.945; where: Y is the percentage of viable cells relative to the control; x is the dose of lithicase.
Уравнения дают возможность рассчитать 50%-ный эффект действия литиказы: 5,0 ЕД - по показателю лизиса культуры, 7,8 ЕД - по цитостатическому эффекту.The equations make it possible to calculate the 50% effect of the action of lyticase: 5.0 IU - according to the indicator of culture lysis, 7.8 IU - according to the cytostatic effect.
Исследования показали, что оставшиеся после воздействия литиказы жизнеспособные грибы теряют свою вирулентность, которая обеспечивает развитие инфекционного процесса. Это обусловлено снижением адгезивности грибов к вагинальным эпителиоцитам влагалища и, в связи с этим, уменьшением их колонизирующей способности. Воздействие литиказы на поверхностные структуры клеточной стенки грибов путем разрушения маннанового и фибриллярного слоев усиливает примерно в 1,5 раза захват их фагоцитами и способствует активизации внутриклеточного переваривания. Так, в результате исследований установлено, что после контакта нативных грибов с макрофагами переваривалось 41,0±0,4% клеток. В результате обработки литиказой этот показатель увеличился до 48,0±1,0%. Полученные данные указывают на то, что переваривающая фаза фагоцитоза проходит более эффективно в случае повреждающего клеточную стенку действия литического экзофермента литиказы. Эксперименты с изолированными макрофагами позволили установить, что эффективность фагоцитарного процесса проявляется в развитии завершенного фагоцитоза. Снижение вирулентности кандид под действием литиказы вследствие отщепления фибриллярного слоя и разрушения мананового слоя клеточных стенок грибов приводит к потере их адгезивности и увеличению эффективности фагоцитоза макрофагами. Кроме того, установлено, что антимикотическое действие литиказы можно усилить путем введения препарата «Контрикал». Препарат «Контрикал» (Апротинин/APROTININ) - ингибитор протеолитических ферментов и протеаз плазмы крови обычно используется для купирования приступов и лечения панкреатита (производитель AWD pharma GmbH & Со, Германия). Заявителем впервые установлено неизвестное ранее свойство контрикала ингибировать продукцию ферментов агрессии аспартил-протеиназ у кандид. Ингибирование контрикалом аспартил-протеиназ препятствует реализации инвазивных свойств возбудителя, блокирует переход в патогенную мицелиальную форму, сохраняя в дрожжевой форме, и способствует элиминации возбудителя. Контрикал вводят в количестве 500-1000 АТрЕ совместно с литиказой, на одну дозу последней. Патентуемый препарат содержит в единой композиции литиказу и контрикал. Доказательством синергетического антимикотического эффекта двух препаратов является механизм, обнаруженный в эксперименте in vitro. Литиказа обеспечивает лизирующее воздействие на грибы, а контрикал - блокирует ферменты агрессии аспартил-протеиназы у кандид, сохранивших жизнеспособность.Studies have shown that viable fungi remaining after exposure to lithicase lose their virulence, which ensures the development of the infectious process. This is due to a decrease in the adhesion of fungi to vaginal vaginal epithelial cells and, in this regard, a decrease in their colonizing ability. The effect of lithicase on the surface structures of the cell wall of fungi by the destruction of the mannan and fibrillar layers enhances their capture by phagocytes by about 1.5 times and contributes to the activation of intracellular digestion. Thus, as a result of studies, it was found that after contact of native fungi with macrophages, 41.0 ± 0.4% of the cells were digested. As a result of lithification treatment, this indicator increased to 48.0 ± 1.0%. The data obtained indicate that the digesting phase of phagocytosis proceeds more efficiently in the case of damaging the cell wall of the action of lytic lyticase exoenzyme. Experiments with isolated macrophages made it possible to establish that the effectiveness of the phagocytic process is manifested in the development of complete phagocytosis. A decrease in the virulence of candida under the action of lyticase due to cleavage of the fibrillar layer and destruction of the manan layer of the cell walls of fungi leads to a loss of their adhesion and an increase in the efficiency of phagocytosis by macrophages. In addition, it was found that the antimycotic effect of lithicase can be enhanced by the introduction of the drug "Contrical". The drug "Contrical" (Aprotinin / APROTININ), an inhibitor of proteolytic enzymes and plasma proteases, is usually used to relieve seizures and treat pancreatitis (manufacturer AWD pharma GmbH & Co., Germany). The applicant for the first time established a previously unknown property of counter-inhibiting the production of aspartyl proteinase aggression enzymes in candida. Inhibition of aspartyl proteinases with a counter-protein prevents the invasive properties of the pathogen from being realized, blocks the transition to a pathogenic mycelial form, retaining it in yeast form, and helps to eliminate the pathogen. Contrical is administered in an amount of 500-1000 ATre together with lithase, per dose of the latter. The patented preparation contains lithicase and countercal in a single composition. Evidence of the synergistic antimycotic effect of the two drugs is the mechanism found in an in vitro experiment. Lithicase provides a lysing effect on fungi, and contracal blocks the aggression enzymes of aspartyl proteinase in candida that have remained viable.
Исследование терапевтического действия литиказы проведено на модели вагинального кандидоза (ВК) с использованием клинического штамма Candida albicans №40, который был выделен из влагалища беременной женщины с диагнозом вагинальный кандидоз. Указанный штамм вводили по 20 мкл интравагинально в дозе 108 КОЕ/мл, на фоне дисбиоза, вызванного антибиотиками и искусственно индуцированной течки посредством гормона Месалина. После элиминации возбудителя из влагалища провоцировали рецидив инфекции путем повторной обработки животных антибиотиками и гормоном без введения культуры возбудителя. Контроль течения инфекции производили по двум показателям обсемененности: по числу КОЕ в 1 мкл влагалищного отделяемого и клиренсу, рассчитанному по формуле: К=(С0-Ct)/С0·100%; где: К - клиренс (очищение), С0 - число грибов в 1 мкл влагалищного отделяемого мышей в начальный момент времени после заражения; Ct - число грибов в 1 мкл влагалищного отделяемого через известный промежуток времени.The study of the therapeutic effect of lithicase was carried out on a model of vaginal candidiasis (VK) using a clinical strain of Candida albicans No. 40, which was isolated from the vagina of a pregnant woman with a diagnosis of vaginal candidiasis. The specified strain was injected 20 μl intravaginally at a dose of 10 8 CFU / ml, against the background of dysbiosis caused by antibiotics and artificially induced estrus through the hormone Mesalin. After elimination of the pathogen from the vagina, a relapse of the infection was provoked by repeated treatment of the animals with antibiotics and a hormone without introducing the culture of the pathogen. The control of the course of infection was carried out according to two indicators of contamination: according to the number of CFU in 1 μl of the vaginal discharge and clearance calculated by the formula: K = (C 0 -C t ) / C 0 · 100%; where: K - clearance (purification), C 0 - the number of mushrooms in 1 μl of vaginal discharge of mice at the initial time after infection; C t is the number of fungi in 1 μl of vaginal discharge after a known period of time.
На высоте манифестации рецидива животным опытной группы с интервалом в 2 дня интравагинально вводили литиказу. Контроль санации в опытной и контрольной группах осуществляли по высеву грибов. Две серии опытов были проведены с использованием разных доз фермента: 2 и 10 ЕД/мл (на фиг.3, 4). Провокация отмечена литерами А (антибиотик) и М (гормон месалин).At the height of the manifestation of relapse, the animals of the experimental group with an interval of 2 days were intravaginally injected with lyticase. Remediation control in the experimental and control groups was carried out by seeding fungi. Two series of experiments were carried out using different doses of the enzyme: 2 and 10 IU / ml (Figs. 3, 4). The provocation is marked with the letters A (antibiotic) and M (hormone mesaline).
Из данных опытов, приведенных на фиг.3 (1-5 дни - антибиотик; 5 день - заражение С.albicans; 36-40 дни - антибиотик; 43-72 дни - литиказа), следует, что уже после первого введения литиказы происходит значительное снижение обсемененности влагалища кандидами по сравнению с контролем.From the data of the experiments shown in Fig. 3 (1-5 days - antibiotic; 5 days - infection with C. albicans; 36-40 days - antibiotic; 43-72 days - lithicase), it follows that already after the first administration of lithicase decreased vaginal contamination by candida compared to control.
При использовании литиказы в дозе 10 ЕД/мл (фиг.4) санация завершается на 8 дней раньше, чем при дозе 2 ЕД/мл. На фиг.4 данные опытов: 1-5 дни - антибиотик и гормон; 5 день - заражение С.albicans; 38-42 дни - антибиотик и гормон (месалин); 47-73 дни - литиказа; 76-80 дни - антибиотик и гормон. При провокации кандидоза антибиотиками и гормонами повторных рецидивов не развивалось, что является доказательством полной санации влагалища под влиянием литиказы.When using lithicase at a dose of 10 PIECES / ml (figure 4), rehabilitation is completed 8 days earlier than at a dose of 2 PIECES / ml. In Fig.4, the data of the experiments: 1-5 days - antibiotic and hormone; 5 day - infection of C. albicans; 38-42 days - antibiotic and hormone (mesaline); 47-73 days - lithicase; 76-80 days - antibiotic and hormone. When candidiasis was provoked by antibiotics and hormones, repeated relapses did not develop, which is evidence of complete sanitation of the vagina under the influence of lithicase.
При определении дозы исходили из экспериментальной модели вагинального кандидоза. Проведен расчет, позволяющий экстраполировать экспериментальные данные, полученные in vitro и in vivo на животных, на терапевтические дозы лечения для человека. Исходили из следующего. Объем влагалища мыши - 25 мкл (25.10-6 л). Лечебная терапевтическая доза, выведенная в эксперименте, составляла 2-10 ЕД/мл в течение 7 дней. Объем влагалища женщины 0,05 л. Соответственно, экстраполируя дозу на объем влагалища женщины получаем указанный диапазон значений 10-50 ЕД (п.3 формулы), и 2-10 ЕД на грамм носителя.When determining the dose, we proceeded from the experimental model of vaginal candidiasis. A calculation has been made that allows extrapolating the experimental data obtained in vitro and in vivo in animals to therapeutic doses of treatment for humans. We proceeded from the following. The vaginal volume of the mouse is 25 μl (25.10 -6 L). The therapeutic therapeutic dose, derived in the experiment, was 2-10 U / ml for 7 days. The vaginal volume of a woman is 0.05 liters. Accordingly, by extrapolating the dose to the woman’s vaginal volume, we obtain the indicated range of values of 10-50 U (
Необходимо отметить, что штамм С.albicans №40 является клиническим штаммом, выделен от беременной женщины больной вагинальным кандидозом. Поэтому эксперименты с литиказой и штаммом С.albicans №40 in vitro и in vivo на модели вагинального кандидоза можно рассматривать как экспериментально обоснованные доказательства применимости препарата для лечения микотических инфекций.It should be noted that strain C. albicans No. 40 is a clinical strain isolated from a pregnant woman with vaginal candidiasis. Therefore, experiments with lithase and C. albicans strain No. 40 in vitro and in vivo on a model of vaginal candidiasis can be considered as experimentally substantiated evidence of the applicability of the drug for the treatment of mycotic infections.
Исследования посредством электронной микроскопии позволили зафиксировать какие именно изменения претерпевает клеточная клетка штамма C.albicans под действием литиказы. По химическому составу клеточная стенка представлена: хитином, глюканом и маннаном, при этом четко обозначен фибриллярный слой. Выяснено, что если даже разрушения мананового слоя не происходит, наблюдается заметное его истончение, а также происходит разрушение поверхности фибриллярного слоя и его отщепление. Вокруг кандиды видна зона просветления, в некоторых местах происходит разрыв клеточной стенки, при этом глюкановый и хитиновый слои остаются без изменений.Investigations by electron microscopy made it possible to record exactly what changes the cell cell of the C. albicans strain under the influence of lithicase undergoes. By chemical composition, the cell wall is represented by: chitin, glucan and mannan, while the fibrillar layer is clearly marked. It was found that even if the destruction of the manan layer does not occur, its noticeable thinning is observed, as well as the destruction of the surface of the fibrillar layer and its cleavage. Around the candida, a zone of enlightenment is visible, in some places the cell wall ruptures, while the glucan and chitin layers remain unchanged.
Результатом такой деструкции является изменение адгезивных свойств грибов рода кандида: снижается их адгезия на поверхности клеток-мишеней (вагинального эпителия), но не изменяется адгезивная активность в отношении представителей нормальной микрофлоры влагалища (лактобактерий). Рекомендуемая доза литиказы гораздо ниже, чем необходимо для лизиса клеток. Это позволяет снизить лекарственную нагрузку с сохранением терапевтического эффекта.The result of this destruction is a change in the adhesive properties of candida fungi: their adhesion on the surface of target cells (vaginal epithelium) decreases, but the adhesive activity does not change with respect to representatives of the normal microflora of the vagina (lactobacilli). The recommended dose of lithicase is much lower than necessary for cell lysis. This allows you to reduce the drug load while maintaining a therapeutic effect.
В предлагаемом препарате используется литиказа, исходная активность которой составляет не менее 48,3 ЕД/мг белка. Указанный литический экзофермент можно вводить в различных количествах в состав разных фармацевтических форм препарата для достижения активности 10-50 ЕД на одну дозу.The proposed drug uses lithicase, the initial activity of which is at least 48.3 U / mg protein. The specified lytic exoenzyme can be introduced in various amounts into the composition of different pharmaceutical forms of the drug to achieve an activity of 10-50 units per dose.
Препарат литиказа может быть использован для местного, вагинального или ректального применения в виде водного раствора, полученного при стационарной или промышленной технологии. В качестве растворителя может быть использован забуфе-ренный физиологический раствор, рН 7,2.The drug lithicase can be used for local, vaginal or rectal use in the form of an aqueous solution obtained by stationary or industrial technology. As a solvent, buffered saline can be used, pH 7.2.
Препарат литиказа может также дополнительно содержать наполнитель, обычно применяемый при изготовлении соответствующих рецептурных форм. При изготовлении суппозиториев или свечей в качестве наполнителя применяется, например, кондитерский жир, ланолин, масло какао, гель гидроокиси алюминия, парафин и т.п. При получении мази или геля - вазелин, ланолин, витепсол, альгинат натрия, метилцеллюлоза, метоцель, гиспагель, ГПМЦ и т.п. Препарат может быть также лиофилизирован.The drug lyticase may also optionally contain a filler, usually used in the manufacture of the corresponding prescription forms. In the manufacture of suppositories or suppositories, for example, confectionery fat, lanolin, cocoa butter, aluminum hydroxide gel, paraffin, and the like are used as a filler. Upon receipt of the ointment or gel - petrolatum, lanolin, vitepsol, sodium alginate, methyl cellulose, metocel, gispagel, HPMC, etc. The drug can also be lyophilized.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.
Пример 1. Получение жидкого препарата литиказы. При промышленной технологии культивирование штамма Cellulomonas cellulans ВКПМ АС-870 проводят в реакторе/ферментере с питательной средой для культивирования при температуре 35-37°С в течение 10-24 час до выхода культуры на стационарную фазу роста. По окончании инкубации культуральную жидкость сепарируют и путем фракционирования на картриджах выделяют и концентрируют экстрацеллюлярный биополимер с молекулярной массой в интервале от 100 до 30 кДа. Активность литиказы определяют по лизису дрожжевых грибов рода Sacharomyces, и полученный препарат при значении удельной активности не менее 48,3 ЕД/мг белка считают пригодным для последующего использования и разливают по флаконам с введением известных стабилизирующих добавок.Example 1. Obtaining a liquid preparation of lithicase. With industrial technology, the cultivation of the strain Cellulomonas cellulans VKPM AC-870 is carried out in a reactor / fermenter with culture medium at a temperature of 35-37 ° C for 10-24 hours until the culture reaches the stationary growth phase. At the end of the incubation, the culture fluid is separated and, by fractionation on cartridges, an extracellular biopolymer with a molecular weight in the range from 100 to 30 kDa is isolated and concentrated. The activity of lyticase is determined by the lysis of yeasts of the genus Sacharomyces, and the resulting preparation with a specific activity of at least 48.3 U / mg of protein is considered suitable for subsequent use and poured into vials with the introduction of known stabilizing additives.
При лечении жидкий препарат в количестве, содержащем разовую дозу (например, 5 мл забуференного физиологического раствора, рН 7,2, содержащего 50 ЕД литиказы) наносят на тампон или прокладку. Применяют местно, ректально или интравагинально.During treatment, a liquid preparation in an amount containing a single dose (for example, 5 ml of buffered saline, pH 7.2, containing 50 IU of lyticase) is applied to a tampon or pad. Apply topically, rectally or intravaginally.
Пример 2. Получение препарата в форме суппозитория. Полученный в примере 1 жидкий препарат обезвоживают на распылительной или вакуум-сушильной установке, соединяют с наполнителями (кондитерским жиром, ланолином, парафином, витепсолом и т.п.) в количестве, обеспечивающем не менее 10-50 ЕД активности литиказы на один суппозиторий. Так, для приготовления 100 суппозиториев массой по 5 г каждый, необходимо ввести на 500 г наполнителя 103,5 мг литиказы (с исходной активностью 48,3 ЕД/мг белка). Если суппозитории содержат контрикал, то его вводят одновременно с литиказой в соответствии с расчетом: на один суппозиторий - 500-1000 АТрЕ. Далее суппозитории формируют на специальной установке.Example 2. Obtaining the drug in the form of a suppository. The liquid preparation obtained in Example 1 is dehydrated on a spray or vacuum-drying unit, combined with excipients (confectionery fat, lanolin, paraffin, vitepsol, etc.) in an amount providing at least 10-50 PIECES of lyticase activity per suppository. So, for the preparation of 100 suppositories weighing 5 g each, it is necessary to introduce 103.5 mg of lyticase per 500 g of excipient (with an initial activity of 48.3 U / mg of protein). If suppositories contain contrycal, then it is administered simultaneously with lithase in accordance with the calculation: for one suppository - 500-1000 ATre. Further, suppositories are formed on a special installation.
Изучена стабильность 8-ми экспериментально-производственных серий препарата. Как показывают полученные результаты, непосредственно после формирования суппозиториев активность литиказы составляет не менее 40 ЕД, а по истечении 12 мес хранения - не регистрировалась активность менее 10 ЕД на один суппозиторий.The stability of 8 experimental production series of the drug was studied. As the results show, immediately after the formation of suppositories, the activity of lithicase is at least 40 PIECES, and after 12 months of storage, activity of less than 10 PIECES per suppository was not recorded.
Пример 3. Получение препарата в форме мази или геля. Полученный в примере 1 жидкий препарат обезвоживают на распылительной или вакуум-сушильной установке, соединяют с мазевой (вазелин, ланолин, т.п.) или гелевой основой (метилцеллюлозой, альгинатом натрия и т.п.) в количестве, обеспечивающем не менее 2-10 ЕД активности литиказы на один грамм основы. Так, для приготовления мази (геля) необходимо на 100 г основы ввести 20,7 мг литиказы (при исходной активности не менее 48,3 ЕД/мг белка). Если мазь (гель) содержит контрикал, то его вводят одновременно с литиказой в соответствии с расчетом: на один грамм мази (геля) 100-200 АТрЕ. Далее мазь (гель) фасуют по тубам или склянкам.Example 3. Obtaining the drug in the form of an ointment or gel. The liquid preparation obtained in Example 1 is dehydrated on a spray or vacuum dryer, combined with an ointment (petrolatum, lanolin, etc.) or a gel base (methyl cellulose, sodium alginate, etc.) in an amount providing at least 2- 10 IU of lithicase activity per gram of base. So, to prepare an ointment (gel), it is necessary to introduce 20.7 mg of lithicase per 100 g of base (with an initial activity of at least 48.3 U / mg of protein). If the ointment (gel) contains contrycal, then it is administered simultaneously with lithase in accordance with the calculation: for one gram of ointment (gel) 100-200 ATre. Next, the ointment (gel) is Packed in tubes or bottles.
Изучена стабильность 6 экспериментально-производственных серий препарата. Как показывают полученные результаты, непосредственно после приготовления активность литиказы составляет не менее 10 ЕД на 1 грамм основы, а по истечении 12 мес хранения - не оказалось серий препарата с активностью менее 2 ЕД на 1 грамм основы.The stability of 6 experimental production series of the drug was studied. As the results show, immediately after preparation, the activity of lithicase is at least 10 PIECES per 1 gram of base, and after 12 months of storage, there were no series of the drug with activity less than 2 PIECES per 1 gram of base.
Препараты, полученные по вышеописанным примерам, характеризуются безвредностью. Для определения безвредности мышам вводят интравагинально препарат в объеме 20 мкл. Для каждого варианта опыта используют не меньше 10 мышей массой 15-16 г. Препарат считают безвредным, если все мыши остаются живыми в течение 5 суток наблюдения и ни у одной из них не выявлено заболевания.The drugs obtained by the above examples are characterized by harmlessness. To determine the safety of mice, the preparation is intravaginally administered in a volume of 20 μl. For each experiment, at least 10 mice weighing 15-16 g are used. The drug is considered harmless if all the mice remain alive for 5 days of observation and no disease is detected.
Препарат Литиказа характеризуется фунгицидной активностью относительно тест-штамма C.albicans №40, который является внутренним стандартом для определения антимикотического действия заявленного препарата.The drug Litikaza is characterized by fungicidal activity against test strain C.albicans No. 40, which is an internal standard for determining the antimycotic effect of the claimed drug.
Фунгицидное действие литиказы определяли методом серийных разведений в жидкой питательной среде (по Лабинской). Из культуры C.albicans приготовляли взвесь, содержащую 105 микробных тел в 1 мл бульона, пользуясь бактерийным оптическим стандартом. Затем осуществляли ряд разведений литиказы (содержащих от 10 до 5120 ЕД) в мясо-пептонном бульоне по 2 мл, во все пробирки добавляли по 0,2 мл культуры C.albicans. Проведено два контроля: контроль жизнеспособности культуры C.albicans без введения литиказы и контроль микробиологической чистоты фермента, содержащего 5120 ЕД литиказы без внесения культуры. Через 48 часов инкубирования в термостате учитывали результаты по наличию или отсутствию роста. Из всех пробирок делали высев газоном по 0,1 мл на плотную среду Сабуро. Через 24 часа инкубации в термостате подсчитывали число КОЕ на чашках. Установлено, что минимальная концентрация литиказы, полностью ингибирующая рост и размножение C.albicans, составила 1280 ЕД, что было подтверждено при высевах на плотную среду. При активности свыше 640 ЕД ни в одном случае проведенного опыта не было отмечено роста C.albicans №40.The fungicidal effect of lithicase was determined by the method of serial dilutions in a liquid nutrient medium (Labinskaya). A suspension containing 10 5 microbial bodies in 1 ml of broth was prepared from a C. albicans culture using the bacterial optical standard. Then a series of dilutions of lithicase (containing from 10 to 5120 PIECES) was carried out in 2 ml meat-peptone broth, 0.2 ml of C. albicans culture was added to all tubes. Two controls were carried out: control of the viability of the C. albicans culture without lithicase administration and control of the microbiological purity of the enzyme containing 5120 units of lyticase without culture. After 48 hours of incubation in a thermostat, the results for the presence or absence of growth were taken into account. Of all the tubes, 0.1 ml of lawn was sown in a dense Saburo medium. After 24 hours of incubation, the number of CFU per plates was counted in a thermostat. It was found that the minimum concentration of lithicase, which completely inhibits the growth and reproduction of C. albicans, was 1280 units, which was confirmed by plating on a solid medium. With activity over 640 PIECES, in no case of the experiment was observed growth of C.albicans No. 40 was noted.
Фунгистатическое и фунгицидное действие фермента по отношению к С.albicans определяли также в опыте на плотной среде АГВ. 10 образцов по 1 мл раствора литиказы в забуференном физиологическом растворе (ЗФР) с исходной удельной активностью 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640, 1280, 2560, 5120 ЕД наслаивали на среду АГВ и выдерживали 5 часов при температуре 37°С для впитывания жидкости. В контрольный образец вводили ЗФР. После этого засевали 10 мкл суспензии С.albicans, обеспечивающей рост около 50 КОЕ в контроле. Учет результатов проводили через 24 часа инкубации в термостате по проценту сохранивших жизнеспособность С.albicans после обработки ферментом. Опыт повторяли десять раз. Полное подавление роста кандид наблюдалось при действии литиказы свыше 640 ЕД в отношении взвеси кандиды. Фунгистатическое действие литиказы начинало проявляться со значений, соответствующих 10 ЕД активности. При 40 ЕД подавлялся рост более чем у 50% клеток С.albicans, при 640 ЕД - более, чем у 98% и при 1280 ЕД в 100% случаев регистрировалось полное бактерицидное действие литиказы.The fungistatic and fungicidal effect of the enzyme in relation to C. albicans was also determined in an experiment on a dense AGV medium. 10 samples of 1 ml of a solution of lithicase in buffered physiological saline (PBS) with an initial specific activity of 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640, 1280, 2560, 5120 PIECES were layered on the AGV medium and kept for 5 hours at a temperature of 37 ° C to absorb liquid. PBS was added to the control sample. After that, 10 μl of a suspension of C. albicans was seeded, providing growth of about 50 CFU in the control. The results were taken into account after 24 hours of incubation in a thermostat according to the percentage of surviving C. albicans viability after treatment with the enzyme. The experiment was repeated ten times. Complete suppression of candida growth was observed under the action of lithicase over 640 units in relation to candida suspension. The fungistatic action of lithicase began to manifest itself with values corresponding to 10 units of activity. At 40 IU, growth was suppressed in more than 50% of C. albicans cells, at 640 IU - more than in 98%, and at 1280 IU in 100% of cases the complete bactericidal effect of lyticase was recorded.
Таким образом, проведенные исследования позволяют заключить, что патентуемый способ лечения микотических инфекций с использованием литиказы - литического экзофермента штамма Cellulomonas cellulans ВКПМ АС-870, имеющего удельную активность не менее 48,3 ЕД/мг белка, содержащегося в экстрацеллюлярной фракции биополимера с молекулярной массой в интервале от 100 до 30 кДа и избирательно разрушающего основную структуру клеточной стенки грибов, способствует полной санации инфекционного очага. При этом элиминация возбудителя из влагалища настолько эффективна, что провокация рецидива инфекции становится невозможной.Thus, the conducted studies allow us to conclude that the patented method of treating mycotic infections using a lyticase - lytic exoenzyme of the strain Cellulomonas cellulans VKPM AC-870 having a specific activity of at least 48.3 U / mg of the protein contained in the extracellular fraction of the biopolymer with a molecular weight of the range from 100 to 30 kDa and selectively destroying the basic structure of the cell wall of fungi, contributes to the complete rehabilitation of the infectious focus. In this case, the elimination of the pathogen from the vagina is so effective that provoking a relapse of infection becomes impossible.
Claims (10)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009105771/15A RU2401115C1 (en) | 2009-02-19 | 2009-02-19 | Method of treating mycotic infections and preparation for implementation thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009105771/15A RU2401115C1 (en) | 2009-02-19 | 2009-02-19 | Method of treating mycotic infections and preparation for implementation thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2009105771A RU2009105771A (en) | 2010-08-27 |
| RU2401115C1 true RU2401115C1 (en) | 2010-10-10 |
Family
ID=42798371
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009105771/15A RU2401115C1 (en) | 2009-02-19 | 2009-02-19 | Method of treating mycotic infections and preparation for implementation thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2401115C1 (en) |
-
2009
- 2009-02-19 RU RU2009105771/15A patent/RU2401115C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| САЧИВКИНА Н.П. и др. Изучение фермента литиказы как нового антимикотического препарата, Вестник РУДН, серия Агрономия и животноводство, 2008, №3, с.37-43. КЛËНОВА И.Ф. и др. Ветеринарные препараты в России. - М.: Сельхозиздат, 2004, т.1, с.495-513. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2009105771A (en) | 2010-08-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8765819B2 (en) | Composition comprising benzoic acid in combination with organic acid preservatives as active ingredients and the use thereof | |
| RU2398575C2 (en) | Composition containing lactic acid and lactoferrin | |
| US6537538B2 (en) | Method for the prevention, inhibition, or treatment of vaginitis and/or bacterial vaginosis using polystyrene sulfonate | |
| JP2009269922A (en) | Topical use of probiotic bacillus spore for preventing or controlling microbe infection | |
| EP2158916A1 (en) | Administration unit comprising lactic acid bacteria | |
| EP2343088A1 (en) | Antimycotic and prebiotic pharmaceutical composition and a method for treating candidal vaginitis | |
| CN114588253B (en) | Pharmaceutical composition for repairing and preventing vaginal mucosa aging and preparation thereof | |
| CN105232526A (en) | Application of medicine containing catechin to preparation of antibacterial medicines | |
| RU2354385C2 (en) | Pharmacological composition for treatment of candidose vulvavaginates | |
| AU2006229642B2 (en) | A method for preventing and/or treating vaginal and vulval infections | |
| RU2401115C1 (en) | Method of treating mycotic infections and preparation for implementation thereof | |
| CN102048729A (en) | Preparation for treating vaginitis | |
| WO2012033427A1 (en) | Method for treating mycotic infections and drug for carrying out said method | |
| CN109069413A (en) | For treating the gluconic acid delta-lactone of Vaginal Fungi infection | |
| KR20140041493A (en) | Vaginal composition based on alkyl polyglucosides | |
| KR102014810B1 (en) | Composition for prevention and treatment of vaginitis | |
| KR20060128125A (en) | Agent for the treatment of vaginitis containing mandelic acid as an active ingradient | |
| CN114209835B (en) | Medicine for treating candida infection diseases | |
| GARDNER et al. | Hexetidine in the treatment of vaginitis | |
| KR20240036492A (en) | Compositions for use in breaking down biofilms or preventing biofilm formation | |
| CN105012316B (en) | Cholic acid is preparing the application in treating Echinococcus Granulosus Cysts medicine as active component | |
| WO2021255472A1 (en) | Antimicrobial combinations | |
| CN109771639A (en) | The application method of Radix Glycyrrhizae ribosome inactivating protein in medicine preparation | |
| CN101062033A (en) | Medicine combination for treating inflammation of vagina | |
| CN109771635A (en) | A kind of preparation method adjusting women Bacillus acidi lactici microecological balance Chinese medicine composition |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180220 |