RU2401099C2

RU2401099C2 - Skin treatment composition containing human growth hormones as active ingredient

Info

Publication number: RU2401099C2
Application number: RU2008115031/15A
Authority: RU
Inventors: Даль Киун ОХ (KR); Даль Киун ОХ
Original assignee: Регерон, Инк.
Priority date: 2005-10-12
Filing date: 2005-10-12
Publication date: 2010-10-10
Also published as: RU2008115031A

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention refers to cosmetology and dermatology, and represents a skin treatment composition for skin external application which contains a human growth hormone within a dosage range 0.001 ng to 100 ng per 1 cm² of skin and a cosmetically acceptable carrier.

EFFECT: substantial skin improvement.

7 cl, 14 ex, 2 tbl, 11 dwg

Description

Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION

Настоящее изобретение относится к улучшающим состояния кожи композициям для поверхностного нанесения на кожу, которые содержат в качестве активного компонента гормон роста человека, и к способу улучшения состояний кожи человека.The present invention relates to skin condition improving compositions for topical application to the skin that contain human growth hormone as an active component, and to a method for improving human skin conditions.

Уровень техникиState of the art

В данной области в основном известно, что макромолекулы, такие как гормон роста человека (молекулярный вес около 22 кДа), не могут проникать сквозь роговичный слой кожи. Обычно считается, что молекулярный вес веществ, способных эффективно переноситься через эпидермис кожи, не превышает приблизительно 500 Да или не более 2 кДа, даже с помощью усилителей проницаемости кожи. Поэтому нанесение макромолекул таких, как гормон роста человека, на поверхность интактной (неповрежденной) кожи и косметическое или медицинское воздействие макромолекул считались безуспешными.It is generally known in the art that macromolecules, such as human growth hormone (molecular weight of about 22 kDa) cannot penetrate the corneal layer of the skin. It is generally believed that the molecular weight of substances that can be effectively transported through the epidermis of the skin does not exceed about 500 Da or not more than 2 kDa, even with skin permeation enhancers. Therefore, the application of macromolecules such as human growth hormone to the surface of intact (intact) skin and the cosmetic or medical effects of macromolecules were considered unsuccessful.

Делались некоторые попытки доставлять белки в дермальный слой кожи путем местного нанесения липосом со включенными в них белками. Было отмечено, что инкапсулированные внутрь липосом белки проходят в дермис или в волосяные фолликулы. Отмечалось, что для доставки сквозь волосяные фолликулы требуется либо система доставки в форме липосом, либо липидная композиция, содержащая липиды такие, как жирные кислоты. Кроме того, для доставки сквозь волосяные фолликулы в качестве способствующей среды испытывались также водные растворы, содержащие органический растворитель такой, как этанол, или содержащие полимер такой, как полиэтиленгликоль, хотя эффективности доставки были намного ниже. Что касается эффективностей доставки белков сквозь кожу с помощью несущих белки липосом, общий принцип пока не был определен, поскольку случаев доставки липосомных форм белков пока было мало, и даже в этих редких случаях эффективности доставки белков различались в широких пределах в зависимости от эмпирического выбора целевых белков и природы использованных липосом. Заслуживает упоминания то, что хотя идея доставки белков сквозь волосяные фолликулы получает большее одобрение, даже когда белок доставляется в инкапсулированной в липосомы форме, липосомы не могут проходить интактными сквозь воронкообразную часть волосяных фолликул. Скорее всего они могут претерпевать различные морфологические преобразования или фазовые переходы, благодаря, во-первых, характеристикам фосфолипидов, создающих рН снаружи и внутри, и зарядовые валентности липосом, во-вторых, в зависимости от белков, прикрепленных к липосомам или инкапсулированных в липосомы, и, в-третьих, в зависимости от составных ингредиентов окружающих волосяные фолликулы тканей. Поэтому эти три фактора и их сложные взаимоотношения определяют, по-видимому, в целом эффективность доставки содержащих целевые белки липосом в волосяные фолликулы. Однако в настоящий момент здесь работают скорее эмпирические соотношения, а не общий руководящий принцип. В отношении настоящего изобретения особого внимания заслуживает наличие сообщения о том, что рецепторы гормона роста человека располагаются на слоях живых клеток эпидермиса и на всех вспомогательных органах и тканях, составляющих и окружающих волосяные фолликулы.Some attempts have been made to deliver proteins to the dermal layer of the skin by local application of liposomes with the proteins included in them. It has been noted that proteins encapsulated inside liposomes pass into the dermis or into the hair follicles. It was noted that delivery through the hair follicles requires either a liposome delivery system or a lipid composition containing lipids such as fatty acids. In addition, aqueous solutions containing an organic solvent such as ethanol or containing a polymer such as polyethylene glycol were also tested as delivery media through the hair follicles, although delivery efficiencies were much lower. Regarding the efficiency of protein delivery through the skin using protein-bearing liposomes, the general principle has not yet been determined, since there have been few cases of delivery of liposome forms of proteins, and even in these rare cases, the efficiency of protein delivery varied widely depending on the empirical choice of target proteins and the nature of liposomes used. It is worth mentioning that although the idea of delivering proteins through the hair follicles is more approved, even when the protein is delivered in a liposome-encapsulated form, liposomes cannot pass intact through the funnel-shaped part of the hair follicles. Most likely, they can undergo various morphological transformations or phase transitions, due, firstly, to the characteristics of phospholipids that create pH outside and inside, and the charge valencies of liposomes, and secondly, depending on the proteins attached to the liposomes or encapsulated in liposomes, and thirdly, depending on the constituent ingredients surrounding the hair follicles of the tissues. Therefore, these three factors and their complex relationships apparently determine the overall efficiency of the delivery of liposomes containing target proteins to the hair follicles. However, at the moment, empirical relationships work here rather than a general guiding principle. Of particular interest with respect to the present invention is the report that human growth hormone receptors are located on the layers of living epidermal cells and on all the auxiliary organs and tissues that make up and surround the hair follicles.

Гормон роста человека секретируется из передней доли гипофиза и циркулирует в крови, оказывая влияние на все органы тела человека. На стадии роста человека он главным образом участвует в росте скелета, увеличении мышечной массы, разрушении жира, росте внутренних органов, половом созревании и т.п. Кроме того, высказано предположение, что если вводить гормон роста человека взрослым в количествах, соответствующих физиологической концентрации в крови, он проявит различное действие - такое, как усиление сердечной системы циркуляции, улучшение способности к обучению, усиление мышц, уменьшение отложения жира на животе, повышение либидо, снижение атеросклероза и ослабление старческой депрессии. Известно, что воздействие гормона роста человека на его организм - это не действие самого гормона роста человека, оно скорее определяется действием инсулино-подобного фактора роста 1 (IGF-1), экспрессию которого стимулирует фактор роста человека и который продуцируется в основном в печени и секретируется в кровь. Это определяется тем, что время полужизни гормона роста человека в крови составляет около 15 мин, тогда как время полужизни IGF-1 в крови составляет около 20 ч. Поэтому IGF-1 может сохраняться намного дольше, чем гормон роста человека. В реальности секретированный из гипофиза гормон роста человека связывается с имеющимся в крови связывающим гормон роста человека белком, мигрирует вместе с кровотоком и встречается с рецепторами гормона роста человека, имеющимися во всех тканях человека. В этот момент гормон роста человека высвобождается из комплекса со связывающим гормон роста человека белком, связывается с рецептором гормона роста человека, и это связывание дает сигнал для стимуляции синтеза и секреции IGF-1. Затем секретируемый в кровь IGF-1 связывается со связывающим IGF-1 белком, циркулирует в кровотоке и связывается с рецепторами для IGF-1, имеющимися в каждой ткани человеческого тела, что обеспечивает различные физиологические эффекты, вызванные секрецией гормона роста человека. Поэтому если действительно будет продемонстрировано действие на кожу инъекции средства с гормоном роста человека, это будет эффект, вызванный действием IGF-1, и он будет неизбежно зависеть от присутствия или отсутствия рецептора для IGF-1 на поверхности клеток кожи, которые могут вступить в непосредственный контакт с кровью. Даже если считать, что на кожу воздействует непосредственно гормон роста человека, а не IGF-1, его влияние будет неизбежно опосредовано рецепторами для гормона роста человека, имеющимися в тех местах, которые контактируют с кровью. Таким образом, полагают, что оценка любого воздействия на кожу при нанесении гормона роста человека (имеющего такой молекулярный вес, что он не может проходить сквозь кожу) вместе с косметическими средствами на поверхность нормальной кожи, которая не имеет непосредственного контакта с кровью, вообще не имеет смысла. Настоящее изобретение является первым свидетельством того, что с помощью способа нанесения гормона роста человека в форме косметического препарата на поверхность нормальной кожи, которая не находится в непосредственном контакте с кровью, но не с помощью способа передачи действия гормона роста человека через кровь, гормон роста человека может оказать на кожу косметическое и лечебное действие такое, как избавление от угрей, морщин, излечение аллергической кожи, вызванных УФ-облучением повреждений кожи, удаление темных пятен, веснушек, излечение сухой и жирной кожи, уменьшение волосяных фолликул и стимуляция роста волос.Human growth hormone is secreted from the anterior pituitary gland and circulates in the blood, affecting all organs of the human body. At the stage of human growth, he mainly participates in the growth of the skeleton, the increase in muscle mass, the destruction of fat, the growth of internal organs, puberty, etc. In addition, it has been suggested that if human growth hormone is administered to adults in amounts corresponding to the physiological concentration in the blood, it will exhibit various effects - such as strengthening the cardiac circulation system, improving learning ability, strengthening muscles, decreasing belly fat deposits, increasing libido, a decrease in atherosclerosis and a weakening of senile depression. It is known that the effect of human growth hormone on his body is not the action of human growth hormone itself, it is rather determined by the action of insulin-like growth factor 1 (IGF-1), the expression of which is stimulated by human growth factor and which is produced mainly in the liver and is secreted into the blood. This is because the half-life of human growth hormone in the blood is about 15 minutes, while the half-life of IGF-1 in the blood is about 20 hours. Therefore, IGF-1 can last much longer than human growth hormone. In reality, the human growth hormone secreted from the pituitary gland binds to the protein available in the blood that binds to human growth hormone, migrates with the bloodstream, and occurs with human growth hormone receptors found in all human tissues. At this point, human growth hormone is released from the complex with the human growth hormone-binding protein, binds to the human growth hormone receptor, and this binding gives a signal to stimulate the synthesis and secretion of IGF-1. The IGF-1 secreted into the blood then binds to the IGF-1 binding protein, circulates in the bloodstream, and binds to the IGF-1 receptors found in each tissue of the human body, which provides various physiological effects caused by the secretion of human growth hormone. Therefore, if the effect of injecting an agent with human growth hormone is actually demonstrated on the skin, this will be an effect caused by the action of IGF-1, and it will inevitably depend on the presence or absence of an IGF-1 receptor on the surface of skin cells that can come into direct contact with blood. Even if we assume that the human growth hormone acts directly on the skin, and not IGF-1, its effect will inevitably be mediated by the receptors for human growth hormone available in those places that come in contact with blood. Thus, it is believed that the assessment of any effect on the skin when applying human growth hormone (having such a molecular weight that it cannot pass through the skin) together with cosmetics on the surface of normal skin that does not have direct contact with blood does not have meaning. The present invention is the first evidence that using a method of applying human growth hormone in the form of a cosmetic preparation to the surface of normal skin that is not in direct contact with blood, but not using a method of transmitting the action of human growth hormone through blood, human growth hormone can have a cosmetic and therapeutic effect on the skin, such as getting rid of acne, wrinkles, curing allergic skin caused by UV irradiation of skin lesions, removing dark spots, freckles, from treatment of dry and oily skin, reduction of hair follicles and stimulation of hair growth.

Ткань кожи состоит из эпидермиса, дермиса и гиподермиса. Эпидермис определяет свойства кожи и часто подвержен повреждению при прямом воздействии внешних факторов, поэтому залечивание и восстановление эпидермиса очень важны. Эпидермис состоит из слоя эпидермальных клеток. Эпидермальные клетки кожи называются также «кератиноцитами», так как эпидермальные клетки кожи в ходе их дифференцировки синтезируют промежуточный фибриллярный белок кератин, усиливающий эпидермис. Эти клетки в ходе дифференцировки образуют слои, мигрируя в сторону эпидермиса, становятся плоскими по мере того, как постепенно исчезают внутриклеточные органеллы, и превращаются в мертвые клетки. Слой клеток, расположенный в самой глубинной части эпидермиса, прилегает к базальному слою и называется «базальным слоем» (stratum basale), а образующие слой клетки называют «базальными клетками», среди которых присутствуют стволовые клетки эпидермиса. Клетки базального слоя дифференцируют в эпидермис, при этом они последовательно образуют stratum spinosum, stratum granulosum, stratum lucidum и stratum corneum, причем эти слои разделяются на слой живых клеток в нижнем положении по отношению к stratum granulosum и слой мертвых клеток в верхнем положении. Уплощенные чешуйчато-подобные ткани вне базального слоя называют также «чешуйками» (squames), они плотно заполнены кератином. Расположенные между внешней стороной stratum granulosum и stratum corneum клетки усилены слоем сшитого белка, и их плазматическая мембрана тонкая и плотная. Поскольку клетки эпидермиса пролиферируют из стволовых клеток эпидермиса и дифференцируются в stratum corneum, они усилены изнутри сшитыми кератинами и связаны также кератинами с десмосомами, плотно сцепленными с другими клетками того же слоя, так что они поддерживают всю структуру слоя. Клетки эпидермиса дифференцируют во внешний эпидермис, продуцируют и секретируют липид, формируя на плазматической мембране двухслойную ткань, ороговевшую вследствие наличия белка, что защищает, подобно оболочке («покрывало Сары») поверхность кожи от внешнего окружения. Поскольку человеческий эпидермис обновляется с двухнедельным интервалом, способность формирующих эпидермис стволовых клеток кожи можно считать очень высокой.The skin tissue consists of epidermis, dermis and hypodermis. The epidermis determines the properties of the skin and is often prone to damage when directly exposed to external factors, therefore healing and restoration of the epidermis are very important. The epidermis consists of a layer of epidermal cells. Epidermal skin cells are also called “keratinocytes,” since epidermal skin cells, during their differentiation, synthesize an intermediate fibrillar protein keratin, which enhances the epidermis. During differentiation, these cells form layers, migrating towards the epidermis, become flat as intracellular organelles gradually disappear, and turn into dead cells. The layer of cells located in the deepest part of the epidermis adjoins the basal layer and is called the “basal layer” (stratum basale), and the cells forming the layer are called “basal cells”, among which the epidermal stem cells are present. The cells of the basal layer differentiate into the epidermis, while they consistently form stratum spinosum, stratum granulosum, stratum lucidum and stratum corneum, and these layers are divided into a layer of living cells in the lower position relative to stratum granulosum and a layer of dead cells in the upper position. Flattened scaly-like tissues outside the basal layer are also called squames, and they are densely filled with keratin. The cells located between the outside of stratum granulosum and stratum corneum are reinforced with a layer of cross-linked protein, and their plasma membrane is thin and dense. Since epidermal cells proliferate from epidermal stem cells and differentiate into stratum corneum, they are internally reinforced with cross-linked keratins and are also linked by keratins to desmosomes tightly linked to other cells of the same layer, so that they support the entire structure of the layer. The cells of the epidermis differentiate into the external epidermis, produce and secrete lipid, forming a bilayer tissue on the plasma membrane, keratinized due to the presence of protein, which protects the skin surface from the external environment, like a cover (“Sara’s blanket”). Since the human epidermis is renewed at a two-week interval, the ability of the epidermis-forming skin stem cells can be considered very high.

Недавно было установлено, что мультипотентные стволовые клетки кожи располагаются в области расширения, которая лежит непосредственно ниже сальных желез волосяных фолликул. Эти стволовые клетки расширения служат основой для образования стволовых клеток эпидермиса, стволовых клеток матрикса волос и стволовых клеток сальных желез. Стволовые клетки расширения располагаются только в области расширения и экспрессируют специальную комбинацию белков, сохраняя свою специфичность стволовых клеток. Стволовые клетки эпидермиса в ходе пролиферации и дифференцировки поддерживают эпидермис. Когда волос выпадает, стволовые клетки матрикса волос пролиферируют и дифференцируют, создавая новый волос. Однако стволовые клетки эпидермиса, стволовые клетки матрикса волос или стволовые клетки сальных желез ограничены в их способности к пролиферации или в способности сохранять специфику стволовых клеток. Поэтому, например, большинство стволовых клеток эпидермиса дифференцируют после 3-6 актов пролиферации. С другой стороны, хотя стволовые клетки расширения пролиферируют медленнее других трех типов стволовых клеток, эти стволовые клетки могут, по-видимому, пролиферировать бесконечно в течение жизни человеческих существ, создавая стволовые клетки эпидермиса, стволовые клетки матрикса волос и стволовые клетки сальных желез, сохраняя в то же время свою специфику стволовых клеток. В ходе разработки настоящего изобретения был впервые установлен тот факт, что экспрессия и действие гормона роста человека происходят в месте локализации стволовых клеток расширения, и этот новый факт чрезвычайно важен, так как означает, что гормон роста человека проявляет действие по улучшению различных состояний кожи.It has recently been found that multipotent stem cells of the skin are located in the area of expansion, which lies directly below the sebaceous glands of the hair follicles. These expansion stem cells serve as the basis for the formation of epidermal stem cells, hair matrix stem cells, and sebaceous gland stem cells. Stem cells of expansion are located only in the area of expansion and express a special combination of proteins, while maintaining their specificity of stem cells. Stem cells of the epidermis during proliferation and differentiation support the epidermis. When the hair falls out, the stem cells of the hair matrix proliferate and differentiate, creating a new hair. However, epidermal stem cells, hair matrix stem cells, or sebaceous gland stem cells are limited in their ability to proliferate or in their ability to maintain stem cell specificity. Therefore, for example, most epidermal stem cells differentiate after 3-6 acts of proliferation. On the other hand, although expansion stem cells proliferate more slowly than the other three types of stem cells, these stem cells can apparently proliferate indefinitely throughout the life of human beings, creating epidermal stem cells, hair matrix stem cells and sebaceous gland stem cells, preserving in same time its own specificity of stem cells. During the development of the present invention, it was first established that the expression and action of human growth hormone occurs at the site of expansion stem cells, and this new fact is extremely important, since it means that human growth hormone has an effect on improving various skin conditions.

Детальное описание настоящего изобретенияDetailed description of the present invention

Авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования, разрабатывая вещество, способное улучшать состояния кожи, и в результате установили, что поверхностное нанесение гормона роста человека на кожу может существенно улучшить состояния кожи, что формирует в полном объеме настоящее изобретение.The authors of the present invention conducted intensive research, developing a substance capable of improving the condition of the skin, and as a result found that the surface application of human growth hormone to the skin can significantly improve the condition of the skin, which forms the full scope of the present invention.

В соответствии с этим цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы предоставить композицию для поверхностного нанесения на кожу, улучшающую состояния кожи.In accordance with this, the aim of the present invention is to provide a composition for surface application to the skin, improving skin conditions.

Другая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить способ улучшения состояния кожи.Another objective of the present invention is to provide a method for improving skin condition.

Другие цели и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из следующего далее детального описания в сочетании с приложенной формулой изобретения.Other objectives and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description in combination with the appended claims.

В одном из аспектов настоящего изобретения предлагается композиция для улучшения состояний кожи, содержащая в качестве активного ингредиента гормон роста человека, рецептура которой предназначена для поверхностного нанесения на кожу.In one aspect of the present invention, there is provided a composition for improving skin conditions comprising, as an active ingredient, human growth hormone, the formulation of which is intended for surface application to the skin.

В другом аспекте настоящего изобретения предлагается способ улучшения состояний кожи человека, включающий поверхностное нанесение на кожу человека композиции, содержащей в качестве активного ингредиента гормон роста человека.In another aspect of the present invention, there is provided a method for improving human skin conditions, comprising superficially applying to the human skin a composition comprising human growth hormone as an active ingredient.

Авторы настоящего изобретения провели исследования и предприняли усилия для обнаружения нового применения гормона роста человека. В результате они установили, что поверхностное нанесение на кожу гормона роста человека может существенно улучшить состояния кожи. Применяемая в настоящее время терапия с применением гормона роста человека использует способ инъекции и направлена в основном на лечение карликовости и дефицита гормона роста человека. В данной области к настоящему времени не было отмечено, что поверхностное нанесение гормона роста человека на нормальную кожу позволяет ожидать его действия. Это мнение было основано на высоком молекулярном весе гормона роста человека и на предубежденном мнении о пути действия гормона роста человека. Настоящее изобретение в значительной степени преодолевает это общепринятое мнение или знание в данной области и характеризуется тем, что впервые было обнаружено действие поверхностного нанесения на нормальную кожу гормона роста человека. Настоящее изобретение является первым изобретением, рассматривающим нанесение гормона роста человека на кожу двумя путями: через волосяные фолликулы и через эпидермис.The authors of the present invention conducted research and made efforts to detect new uses of human growth hormone. As a result, they found that surface application of human growth hormone to the skin can significantly improve skin conditions. The currently used therapy using human growth hormone uses the injection method and is mainly aimed at treating dwarfism and deficiency of human growth hormone. In this area, to date, it has not been noted that the surface application of human growth hormone to normal skin allows us to expect its action. This opinion was based on the high molecular weight of human growth hormone and on the prejudiced opinion on the mode of action of human growth hormone. The present invention overcomes this generally accepted opinion or knowledge in this field to a large extent and is characterized by the fact that the effect of superficial application of human growth hormone to normal skin was first discovered. The present invention is the first invention considering the application of human growth hormone to the skin in two ways: through the hair follicles and through the epidermis.

Настоящее изобретение впервые показывает, что при способе нанесения гормона роста человека на поверхность нормальной кожи, противоположную участку, находящемуся в контакте с кровью, но не при способе перенесения действия гормона роста человека кровью, гормон роста человека может оказывать косметическое и лечебное действие на кожу - такое, как избавление от угрей, морщин, излечение аллергической кожи, вызванных УФ-облучением повреждений кожи, удаление темных пятен, веснушек, излечение сухой и жирной кожи, уменьшение волосяных фолликул и стимуляция роста волос.The present invention shows for the first time that with the method of applying human growth hormone to the surface of normal skin, opposite to the site in contact with the blood, but not with the method of transferring the action of human growth hormone to the blood, human growth hormone can have a cosmetic and therapeutic effect on the skin - such like getting rid of blackheads, wrinkles, curing allergic skin caused by UV irradiation of skin lesions, removing dark spots, freckles, curing dry and oily skin, reducing hair follicles and timulyatsiya hair growth.

Гормон роста человека (ГРЧ), используемый в настоящем изобретении в качестве активного ингредиента, может быть любым полипептидом, проявляющим активность гормона роста человека. Например, может быть использован любой представитель, выбранный из группы, состоящей из зрелого ГРЧ, Мет-ГРЧ, вариантов ГРЧ, модифицированного ГРЧ, фрагментов ГРЧ и аналогов ГРЧ. Предпочтительны зрелый ГРЧ или Мет-ГРЧ. Зрелый ГРЧ представляет собой гормон роста человека, имеющий аминокислотную последовательность основного гормона роста человека, присутствующего в крови человека; Мет-ГРЧ относится к гормону роста человека, имеющему добавленный к N-концу зрелого ГРЧ метионин; варианты ГРЧ относятся к гормонам роста человека, имеющим аминокислотную последовательность гормонов роста человека, отличающихся от основного гормона роста человека, присутствующего в теле человека; модифицированный ГРЧ относится к гормону роста человека, модифицированному введением добавки - такой, как пептидогликан или гликан, по меньшей мере в один аминокислотный остаток гормона роста человека; фрагменты ГРЧ обозначают гормоны роста человека, полученные делецией части аминокислотных последовательностей методом генетической инженерии или биохимическим методом; а аналог ГРЧ относится к гормону роста человека, полученному преобразованием методом генетической инженерии аминокислотной последовательности гормона роста человека в другую аминокислотную последовательность, имеющую аналогичные свойства. Фраза «имеющий активность гормона роста человека», как она использована здесь, может быть точно определена в соответствии с одним из следующих двух методов. В одном из методов она может быть определена в соответствии с тем, вызывает ли гормон роста человека передачу сигнала при связывании с белком, связывающимся с гормоном роста человека, или с рецептором для гормона роста человека. В другом методе она может быть определена в соответствии с тем, проявляются ли биологические эффекты, вызванные действием гормона роста человека.Human Growth Hormone (HGH), used as an active ingredient in the present invention, can be any polypeptide exhibiting human growth hormone activity. For example, any representative selected from the group consisting of mature hGH, Met-hGH, hGH variants, modified hGH, fragments of hGH and hGH analogues can be used. Mature hGH or Met-hGH is preferred. Mature hGH is a human growth hormone having the amino acid sequence of the main human growth hormone present in human blood; Meth-hGH refers to human growth hormone having methionine added to the N-terminus of mature hGH; hGH variants relate to human growth hormones having the amino acid sequence of human growth hormones different from the main human growth hormone present in the human body; modified hGH refers to a human growth hormone modified by the administration of an additive - such as peptidoglycan or glycan, into at least one amino acid residue of human growth hormone; hGH fragments denote human growth hormones obtained by deletion of a part of amino acid sequences by genetic engineering or biochemical method; and the hGH analog relates to human growth hormone obtained by genetic engineering conversion of the amino acid sequence of human growth hormone into another amino acid sequence having similar properties. The phrase “having human growth hormone activity,” as used herein, can be precisely determined in accordance with one of the following two methods. In one method, it can be determined according to whether a human growth hormone causes signal transmission when bound to a protein that binds to human growth hormone, or to a receptor for human growth hormone. In another method, it can be determined according to whether the biological effects of the human growth hormone are manifested.

В настоящем изобретении гормон роста человека может быть нанесен на кожу в виде водного раствора или вместе с носителем. Одна из неожиданных характеристик настоящего изобретения состоит в том, что, как показано в примере XII и на фиг.10б, даже в том случае, когда непосредственно на кожу наносится водный раствор самого гормона роста человека, до некоторой степени может быть достигнут эффект улучшения состояний кожи. Даже если водный раствор самого гормона роста человека наносится поверхностно на кожу, гормон роста человека достигает расположения стволовых клеток расширения в волосяных фолликулах и может обеспечить эффект улучшения состояний кожи.In the present invention, human growth hormone can be applied to the skin as an aqueous solution or together with a carrier. One of the unexpected characteristics of the present invention is that, as shown in Example XII and FIG. 10b, even when an aqueous solution of human growth hormone itself is applied directly to the skin, an effect of improving skin conditions can be achieved to some extent. . Even if an aqueous solution of the human growth hormone itself is applied superficially to the skin, the human growth hormone reaches the location of the expansion stem cells in the hair follicles and can provide an effect of improving skin conditions.

Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения композиция согласно настоящему изобретению представляет собой фосфолипидную или липосомную композицию, предпочтительно липосомную композицию. Предпочтительно, чтобы гормон роста человека, как активный ингредиент, был инкапсулирован в липосомы и нанесен на кожу. Согласно более предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения настоящая композиция представляет собой нанолипосомную композицию. Термин «нанолипосомы», как он использован здесь, относится к липосомам, имеющим форму обычных липосом и средний диаметр частиц от 20 до 1000 нм. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения средний диаметр частиц нанолипосом составляет 50-500 нм, более предпочтительно 50-350 нм и наиболее предпочтительно 50-250 нм.According to a preferred embodiment of the present invention, the composition of the present invention is a phospholipid or liposome composition, preferably a liposome composition. Preferably, human growth hormone, as an active ingredient, is encapsulated in liposomes and applied to the skin. According to a more preferred embodiment of the present invention, the present composition is a nanoliposome composition. The term “nanoliposomes,” as used herein, refers to liposomes in the form of conventional liposomes and an average particle diameter of from 20 to 1000 nm. According to a preferred embodiment of the present invention, the average particle diameter of the nanoliposomes is 50-500 nm, more preferably 50-350 nm, and most preferably 50-250 nm.

Липосому определяют как сферическую фосфолипидную везикулу из коллоидных частиц, ассоциированных друг с другом, причем липосомы, составленные из бифильных молекул, каждая из которых имеет водорастворимую головку (гидрофильную группу) и водонерастворимый хвост (гидрофобную группу), имеют структуру, выстроенную путем их спонтанного соединения за счет взаимодействий между ними. Их классифицируют, в соответствии с их размером и слоистостью, как малые однослойные везикулы (small unilamellar vesicle, SUV), крупные однослойные везикулы (large unilamellar vesicle, LUV) и многослойные везикулы (multi lamellar vesicle, MLV). Липосомы с различной степенью слоистости, как они описаны выше, имеют двухслойную структуру мембраны, подобную структуре клеточной мембраны.A liposome is defined as a spherical phospholipid vesicle of colloidal particles associated with each other, and liposomes made up of biphilic molecules, each of which has a water-soluble head (hydrophilic group) and a water-insoluble tail (hydrophobic group), have a structure built by spontaneously connecting them for account of the interactions between them. They are classified, according to their size and lamination, as small unilamellar vesicle (SUV), large unilamellar vesicle (LUV) and multilayer vesicles (multi lamellar vesicle, MLV). Liposomes with varying degrees of layering, as described above, have a two-layer membrane structure similar to that of a cell membrane.

(Нано)липосомы согласно настоящему изобретению могут быть приготовлены с использованием фосфолипида, полиола, поверхностно-активного вещества, жирной кислоты, соли и/или воды.The (nano) liposomes of the present invention can be prepared using a phospholipid, polyol, surfactant, fatty acid, salt and / or water.

Фосфолипид, используемый как компонент в приготовлении данных (нано)липосом, применяется в виде бифильного липида, и его примеры включают природные фосфолипиды (например, лецитин яичного желтка, лецитин соевых бобов и сфингомиелин) и синтетические фосфолипиды (например, дипальмитоилфосфатидилхолин или гидрированный лецитин), причем предпочтителен лецитин. Более предпочтительно, чтобы лецитин был ненасыщенным или насыщенным лецитином природного происхождения, выделенным из соевых бобов или яичного желтка.The phospholipid used as a component in the preparation of (nano) liposome data is used as a biphilic lipid, and examples thereof include natural phospholipids (e.g., egg yolk lecithin, soya bean lecithin and sphingomyelin) and synthetic phospholipids (e.g. dipalmitoylphosphatidylcholine or hydrogenated) with lecithin being preferred. More preferably, the lecithin is an unsaturated or saturated naturally occurring lecithin isolated from soybeans or egg yolk.

Полиолы, которые можно использовать для приготовления данных (нано)липосом, никак специально не ограничены и предпочтительно включают пропиленгликоль, дипропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, глицерин, метилпропан-диол, изопренгликоль, пентиленгликоль, эритритол, ксилитол и сорбитол.The polyols that can be used to prepare these (nano) liposomes are not specifically limited in any way and preferably include propylene glycol, dipropylene glycol, 1,3-butylene glycol, glycerin, methylpropane-diol, isoprene glycol, pentylene glycol, erythritol, xylitol and sorbitol.

Поверхностно-активное вещество, которое можно использовать для приготовления данных (нано)липосом, может быть любым известным в данной области поверхностно-активным веществом, и его примеры включают анионные поверхностно-активные вещества (например, алкилацил-глутамат, алкилфосфат, алкиллактат, диалкилфосфат и триалкилфосфат), катионные поверхностно-активные вещества, амфотерные поверхностно-активные вещества и неионные поверхностно-активные вещества (например, алкоксилированный алкильный простой эфир, алкоксилированный алкильный сложный эфир, алкилполигликозид, полиглицерильный сложный эфир и сахарный сложный эфир).A surfactant that can be used to prepare these (nano) liposomes can be any surfactant known in the art, and examples thereof include anionic surfactants (e.g., alkylacyl glutamate, alkyl phosphate, alkyl lactate, dialkyl phosphate and trialkyl phosphate), cationic surfactants, amphoteric surfactants and non-ionic surfactants (e.g. alkoxylated alkyl ether, alkoxylated alkyl ester, alkyl polyglycoside, polyglyceryl ester and sugar ester).

Жирные кислоты, которые можно использовать для приготовления данных (нано)липосом, представляют собой высшие жирные кислоты, предпочтительно насыщенные или ненасыщенные жирные кислоты, имеющие С_12-22 алкильную цепь. Их примеры включают лауриловую кислоту, миристоиловую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, олеиновую кислоту и линолевую кислоту.The fatty acids that can be used to prepare these (nano) liposomes are higher fatty acids, preferably saturated or unsaturated fatty acids having a C _12-22 alkyl chain. Examples thereof include lauric acid, myristoyl acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid and linoleic acid.

Соль, используемая для приготовления данных (нано)липосом, может быть любой известной в данной области солью, ее примеры включают фосфатную соль, сульфатную соль, нитратную соль, хлоридную соль, соль гидроксида, натриевую соль, калиевую соль, кальциевую соль, аммонийную соль, соль аминокислоты и аминокислоту.The salt used to prepare these (nano) liposomes may be any salt known in the art, examples thereof include phosphate salt, sulfate salt, nitrate salt, chloride salt, hydroxide salt, sodium salt, potassium salt, calcium salt, ammonium salt, amino acid salt and amino acid.

Используемая для приготовления данных (нано)липосом вода - это обычно деионизованная дистиллированная вода.The water used to prepare the (nano) liposomes is usually deionized distilled water.

Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения данные (нано)липосомы приготовлены только из фосфолипида, соли и воды, как детально описано далее в примерах.According to a preferred embodiment of the present invention, these (nano) liposomes are prepared only from phospholipid, salt and water, as described in more detail in the examples below.

Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения данные нанолипосомы, содержащие гормон роста человека (ГРЧ), готовят путем процесса, включающего следующие этапы: (а) растворение фосфолипида, способного образовать липосомы (предпочтительно лецитин яичного желтка или лецитин соевых бобов), в буферном водном растворе соли, содержащем гормон роста человека; и (б) пропускание содержащего гормон роста человека и фосфолипид водного раствора через гомогенизатор высокого давления при постепенном повышении с увеличением числа пропусканий содержания фосфолипида и давления в гомогенизаторе высокого давления; таким путем получают нанолипосомы, содержащие гормон роста человека.According to a preferred embodiment of the present invention, these nanoliposomes containing human growth hormone (hGH) are prepared by a process comprising the following steps: (a) dissolving a phospholipid capable of forming liposomes (preferably egg yolk lecithin or soya bean lecithin) in a buffered saline solution containing human growth hormone; and (b) passing a human growth hormone-containing phospholipid-containing aqueous solution through a high pressure homogenizer with a gradual increase with increasing number of passes of the phospholipid content and pressure in the high pressure homogenizer; In this way, nanoliposomes containing human growth hormone are obtained.

Водный раствор, содержащий гормон роста человека, предпочтительно представляет собой буферный раствор, имеющий рН в диапазоне от 6 до 8, более предпочтительно около 7. Это, например, буферный раствор фосфата натрия. Если используют буферный раствор фосфата натрия, его концентрация предпочтительно составляет 5-100 мМ, более предпочтительно - 5-60 мМ, еще предпочтительнее - 10-30 мМ и наиболее предпочтительно - около 20 мМ.The aqueous solution containing human growth hormone is preferably a buffer solution having a pH in the range of 6 to 8, more preferably about 7. This is, for example, a sodium phosphate buffer solution. If a sodium phosphate buffer solution is used, its concentration is preferably 5-100 mM, more preferably 5-60 mM, more preferably 10-30 mM and most preferably about 20 mM.

Наиболее выдающейся особенностью данного процесса является то, что смесь фосфолипида и содержащего ГРЧ водного раствора пропускают через гомогенизатор высокого давления несколько раз, причем по мере увеличения числа пассажей количество фосфолипида и давление в гомогенизаторе повышают ступенчато. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения давление в гомогенизаторе повышают ступенчатым образом от 0 до 1000 бар, предпочтительно от 0 до 800 бар. Давление может повышаться ступеньками по 50 бар или по 100 бар, предпочтительно по 100 бар. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения количество фосфолипида ступенчато повышают от 5 до 40% (вес к объему), более предпочтительно - от 5 до 30% (вес к объему).The most outstanding feature of this process is that a mixture of a phospholipid and an hGH-containing aqueous solution is passed several times through a high-pressure homogenizer, and as the number of passages increases, the amount of phospholipid and pressure in the homogenizer are increased stepwise. According to a preferred embodiment of the present invention, the pressure in the homogenizer is increased stepwise from 0 to 1000 bar, preferably from 0 to 800 bar. The pressure can be increased in steps of 50 bar or 100 bar, preferably 100 bar. According to a preferred embodiment of the present invention, the amount of phospholipid is stepwise increased from 5 to 40% (weight to volume), more preferably from 5 to 30% (weight to volume).

В ходе процесса пропускания через гомогенизатор высокого давления, включающего эти ступенчатые повышения содержания фосфолипида и давления, получают содержащие ГРЧ нанолипосомы, предпочтительно жидкие содержащие ГРЧ нанолипосомы.During the process of passing through a high pressure homogenizer, including these stepwise increases in phospholipid content and pressure, hGH-containing nanoliposomes, preferably liquid, hGH-containing nanoliposomes are obtained.

Композиция согласно настоящему изобретению полезна для улучшения различных состояний кожи. Предпочтительно данная композиция эффективна для улучшения состояний кожи, в том числе для избавления от угрей, морщин, темных пятен, повышения эластичности кожи, усиления роста волос, предотвращения старения кожи, усиления способности кожи к удержанию влаги или стимуляции пролиферации стволовых клеток кожи. Более предпочтительно улучшаемые настоящим изобретением состояния кожи включают угри, морщины или рост волос.The composition of the present invention is useful for improving various skin conditions. Preferably, this composition is effective for improving skin conditions, including getting rid of acne, wrinkles, dark spots, increasing skin elasticity, enhancing hair growth, preventing skin aging, enhancing skin's ability to retain moisture or stimulating proliferation of skin stem cells. More preferably, skin conditions improved by the present invention include acne, wrinkles, or hair growth.

Данная композиция может быть предоставлена как косметическая или фармакологическая композиция.This composition may be provided as a cosmetic or pharmacological composition.

Косметическая композиция согласно настоящему изобретению для улучшения состояний кожи может быть составлена в более широком разнообразии форм, включая, например, раствор, суспензию, эмульсию, пасту, мазь, гель, крем, лосьон, порошок, мыло, содержащий поверхностно-активное вещество очиститель, масло, порошковая основа, эмульсионная основа, восковая основа и распыляемый раствор.The cosmetic composition according to the present invention for improving skin conditions can be formulated in a wider variety of forms, including, for example, solution, suspension, emulsion, paste, ointment, gel, cream, lotion, powder, soap, surfactant-containing cleanser, oil , powder base, emulsion base, wax base and sprayable solution.

Содержащийся в данной косметической композиции косметически приемлемый носитель может меняться в зависимости от типа рецептуры. Например, рецептура мази, паст, кремов или гелей может содержать животные или растительные жиры, воски, парафины, крахмал, трагакант, производные целлюлозы, полиэтиленгликоли, силиконы, бентониты, двуокись кремния, тальк, окись цинка или смеси этих веществ. Рецептура порошка или распыляемого раствора может включать лактозу, тальк, двуокись кремния, гидроокись алюминия, силикат кальция, порошок полиамида и смеси этих веществ. Распыляемый раствор может дополнительно содержать обычные распылители, например хлорфтор-углеводороды, пропан/бутан или диметиловый эфир.The cosmetically acceptable carrier contained in the cosmetic composition may vary depending on the type of formulation. For example, the formulation of ointments, pastes, creams or gels may contain animal or vegetable fats, waxes, paraffins, starch, tragacanth, cellulose derivatives, polyethylene glycols, silicones, bentonites, silicon dioxide, talc, zinc oxide or mixtures of these substances. The formulation of the powder or spray solution may include lactose, talc, silicon dioxide, aluminum hydroxide, calcium silicate, polyamide powder, and mixtures thereof. The sprayed solution may further comprise conventional nebulizers, for example chlorofluorocarbons, propane / butane or dimethyl ether.

Рецептура раствора и эмульсии может включать растворитель, солюбилизатор и эмульгатор, например воду, этанол, изопропанол, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензил-бензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутилгликоль, масла, в частности масло семян хлопка, масло земляного ореха, масло проростков маиса, оливковое масло, касторовое масло и масло семян кунжута, глицериновые эфиры жирных кислот, полиэтиленгликоль, сорбитановые эфиры жирных кислот или смеси этих веществ. Рецептура суспензии может включать жидкие разбавители, например воду, этанол или пропиленгликоль, суспендирующие агенты, например этоксилированные изостеариновые спирты, полиоксиэтиленовые эфиры сорбитола и полиоксиэтиленовые эфиры сорбитана, микрокристаллическую целлюлозу, метагидроксид алюминия, бентонит, агар, трагакант или смеси этих веществ.The formulation of the solution and emulsion may include a solvent, a solubilizer and an emulsifier, for example water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1,3-butyl glycol, oils, in particular cottonseed oil, peanut oil, maize seedling oil, olive oil, castor oil and sesame seed oil, glycerol esters of fatty acids, polyethylene glycol, sorbitan esters of fatty acids or mixtures of these substances. The suspension formulation may include liquid diluents, for example water, ethanol or propylene glycol, suspending agents, for example ethoxylated isostearic alcohols, polyoxyethylene sorbitol esters and polyoxyethylene sorbitan esters, microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar, mixtures of these substances.

Рецептура мыла может включать соли щелочных металлов и жирных кислот, соли полуэфиров жирных кислот, белковые гидролизаты жирных кислот, изотионаты, ланолин, жирный спирт, растительное масло, глицерин, сахара или смеси этих веществ.Soap formulations may include alkali metal salts of fatty acids, salts of half-esters of fatty acids, protein hydrolysates of fatty acids, isothionates, lanolin, fatty alcohol, vegetable oil, glycerin, sugars, or mixtures thereof.

Кроме того, косметические композиции согласно настоящему изобретению могут содержать вспомогательные вещества, а также носитель. Неограничивающие примеры вспомогательных веществ включают консерванты, антиоксиданты, стабилизаторы, солюбилизаторы, витамины, красители, улучшающие запах агенты или смеси этих веществ.In addition, cosmetic compositions according to the present invention may contain excipients, as well as a carrier. Non-limiting examples of excipients include preservatives, antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, colorants, odor improvers, or mixtures of these substances.

Если данная композиция составлена так, чтобы предоставить фармацевтическую композицию, она может включать фармацевтически приемлемый носитель, в том числе углеводы (например, лактозу, амилозу, декстрозу, сахарозу, сорбитол, маннитол, крахмал, целлюлозу), камедь акации, фосфат кальция, альгинат, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, солевые растворы, спирты, гуммиарабик, сироп, растительные масла (например, кукурузное масло, масло семян хлопка, масло арахиса, оливковое масло, масло кокосовых орехов), полиэтиленгликоли, метилцеллюлозу, метилоксибензоат, пропилоксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло, без ограничения этим перечислением. Фармацевтическая композиция согласно данному изобретению может дополнительно содержать увлажняющий агент, подслащивающий агент, эмульгатор, буфер, суспендирующий агент, консерванты, вкусовые добавки, ароматизаторы, смазку, стабилизатор или смеси этих веществ. Подробные сведения о подходящих фармацевтически приемлемых носителях и рецептурах приведены в справочнике Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995), включенном сюда ссылкой.If the composition is formulated to provide a pharmaceutical composition, it may include a pharmaceutically acceptable carrier, including carbohydrates (e.g. lactose, amylose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, cellulose), acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, saline solutions, alcohols, gum arabic, syrup, vegetable oils (e.g. corn oil, cotton seed oil, peanut oil, olive oil, coconut oil Hove), polyethylene glycols, methylcellulose, metiloksibenzoat, propylhydroxybenzoates, talc, magnesium stearate and mineral oil, but not limited to enumeration. The pharmaceutical composition according to this invention may further comprise a moisturizing agent, a sweetening agent, an emulsifier, a buffer, a suspending agent, preservatives, flavoring agents, flavoring agents, a lubricant, a stabilizer or mixtures of these substances. Details of suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are provided in the Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook (19th ed., 1995), incorporated herein by reference.

Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению составлена для поверхностного нанесения на кожу.The pharmaceutical composition according to the present invention is formulated for surface application to the skin.

Точная дозировка фармакологических композиций согласно настоящему изобретению будет меняться в зависимости от конкретной рецептуры, способа нанесения, возраста, веса тела и пола пациента, диеты, времени введения, состояния пациента, комбинирования лекарств, чувствительности к воздействию и остроты заболевания. Понятно, что врач с обычным опытом легко определит и пропишет точную дозировку этих фармацевтических композиций. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения подходящая дозировочная единица подлежит введению один раз в день и составляет 0,001-100 нг/см² (на единицу площади поверхности кожи), наиболее предпочтительно 0,1-2 нг/см².The exact dosage of the pharmacological compositions according to the present invention will vary depending on the specific formulation, method of application, age, body weight and gender of the patient, diet, time of administration, condition of the patient, combination of drugs, sensitivity to the effects and severity of the disease. It is understood that a physician with ordinary experience will easily determine and prescribe the exact dosage of these pharmaceutical compositions. According to a preferred embodiment of the present invention, a suitable dosage unit is to be administered once a day and is 0.001-100 ng / cm ² (per unit surface area of the skin), most preferably 0.1-2 ng / cm ² .

Согласно известной специалистам в данной области обычной технике фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут быть составлены с включением фармацевтически приемлемого носителя и/или наполнителя, как описано выше, и в итоге предоставляют различные формы, в том числе форму единичной дозировки. Наиболее предпочтительно, чтобы фармацевтическая композиция представляла собой раствор, содержащий нанолипосомы.According to art known to those skilled in the art, the pharmaceutical compositions of the present invention can be formulated to include a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient as described above, and ultimately provide various forms, including unit dosage forms. Most preferably, the pharmaceutical composition is a solution containing nanoliposomes.

Данная композиция действует на стволовые клетки эпидермиса, что увеличивает число волосяных фолликул и тем самым стимулирует рост волос, вызывает пролиферацию кератиноцитов эпидермального слоя, значительно подавляя старение кожи, залечивает повреждения кожи и морщины, вызванные УФ-облучением, преобразует соединительную ткань дермального слоя, повышая упругость кожи и разглаживая морщины, и проявляет способность к лечению угрей и удалению темных пятен. Все это вместе показывает, что композиция согласно настоящему изобретению может значительно улучшать состояния кожи. Кроме того, настоящее изобретение в высокой степени безопасно для организма человека и при осуществлении в форме нанолипосом имеет высокую стабильность.This composition acts on the stem cells of the epidermis, which increases the number of hair follicles and thereby stimulates hair growth, causes the proliferation of keratinocytes in the epidermal layer, significantly suppresses skin aging, heals skin and wrinkles caused by UV radiation, transforms the connective tissue of the dermal layer, increasing elasticity skin and smoothing wrinkles, and shows the ability to treat blackheads and remove dark spots. All this together shows that the composition according to the present invention can significantly improve skin conditions. In addition, the present invention is highly safe for the human body and when carried out in the form of nanoliposomes has high stability.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

Фиг.1 - электронно-микроскопическая фотография препарата крема из липосом, содержащих гормон роста человека (ГРЧ) (рецептура А), полученной в примере 1.Figure 1 - electron microscopic photograph of a cream of liposome cream containing human growth hormone (hGH) (formulation A) obtained in example 1.

Фиг.2 - гель-проникающая хроматограмма содержащих ГРЧ липосом (липо-ГРЧ) в рецептуре Б, полученной в примере 1.Figure 2 - gel permeation chromatogram containing hGH liposomes (lipo-hGH) in the formulation B obtained in example 1.

Фиг.3 - показывает результаты электрофореза в полиакриламидном геле с SDS ГРЧ, инкапсулированного в виде липо-ГРЧ в рецептуре Б, полученной в примере 1.Figure 3 - shows the results of polyacrylamide gel electrophoresis with SDS hGH encapsulated as lipo-hGH in formulation B obtained in Example 1.

Фиг.4 - высокоэффективная обратно-фазная жидкостная хроматограмма ГРЧ, инкапсулированного в виде липо-ГРЧ в рецептуре Б, полученной в примере 1.Figure 4 is a high performance reverse phase liquid chromatogram of hGH encapsulated as lipo-hGH in formulation B obtained in Example 1.

Фиг.5 - высокоэффективная обратно-фазная жидкостная хроматограмма фосфолипида в составе липо-ГРЧ в рецептуре Б, полученной в примере 1.Figure 5 - high-performance reverse phase liquid chromatogram of a phospholipid in the composition of lipo-hGH in the formulation B obtained in example 1.

Фиг.6 - графическая диаграмма, показывающая результаты испытаний на безопасность липо-ГРЧ в рецептуре Б, полученной в примере 1.6 is a graphical diagram showing the results of tests for the safety of lipo-hGH in the formulation B obtained in example 1.

Фиг.7 - графическая диаграмма, показывающая результаты испытаний на безопасность содержащих ГРЧ липосом в соответствии с настоящим изобретением.7 is a graphical diagram showing the results of safety tests for hGH-containing liposomes in accordance with the present invention.

Фиг.8 показывает результаты теста на снижающее количество морщин действие данных липосом с инкапсулированным ГРЧ у мышей «nude» с индуцированными УФ морщинами.Fig. 8 shows the results of a wrinkle-reducing test of the data of encapsulated hGH liposomes in nude mice with UV-induced wrinkles.

Фиг.9 показывает результаты анализа активности гормона роста человека, инкапсулированного в содержащие ГРЧ липосомы согласно настоящему изобретению.Fig.9 shows the results of the analysis of the activity of human growth hormone encapsulated in hGH-containing liposomes according to the present invention.

Фиг.10а - фотография, показывающая локализацию гормона роста человека в результате введения данных нанолипосом с инкапсулированным ГРЧ в кожу крыс Sprague Dawley через волосяные фолликулы.Fig. 10a is a photograph showing the localization of human growth hormone as a result of the introduction of these nano-liposomes with encapsulated hGH into the skin of Sprague Dawley rats through hair follicles.

Фиг.10б - фотография, показывающая действие данных нанолипосом с инкапсулированным ГРЧ на дермальный слой и волосяные фолликулы кожи крыс Sprague Dawley.Figb is a photograph showing the effect of these nano-liposomes with encapsulated hGH on the dermal layer and hair follicles of the skin of Sprague Dawley rats.

Фиг.11а - фотография, показывающая действие данных нанолипосом с инкапсулированным ГРЧ на эпидермис и дермальный слой кожи мышей ICR.11a is a photograph showing the effect of these encapsulated hGH nanoliposomes on the epidermis and dermal layer of the skin of ICR mice.

Фиг.11б - фотография, показывающая, что данные нанолипосомы с инкапсулированным ГРЧ индуцируют преобразование соединительной ткани дермального слоя мышей ICR.11b is a photograph showing that these nano liposomes with encapsulated hGH induce transformation of the connective tissue of the dermal layer of ICR mice.

Фиг.12 - фотография, показывающая действие данных нанолипосом с инкапсулированным ГРЧ на искусственную кожу человека.12 is a photograph showing the effect of these nano-liposomes with encapsulated hGH on artificial human skin.

Фиг.13 показывает результаты анализа распределения частиц по размерам у нанолипосом с инкапсулированным ГРЧ согласно настоящему изобретению.13 shows the results of particle size distribution analysis of encapsulated hGH nanoliposomes according to the present invention.

Фиг.14 - графическая диаграмма, показывающая эффект снижения количества морщин, оказываемый данными нанолипосомами с инкапсулированным ГРЧ.Fig is a graphical diagram showing the effect of reducing the number of wrinkles exerted by these encapsulated hGH nanoliposomes.

Следующие далее конкретные примеры предназначены для иллюстрации изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие область охвата изобретения, определенную прилагаемой формулой изобретения.The following specific examples are intended to illustrate the invention and should not be construed as limiting the scope of the invention defined by the appended claims.

ПримерыExamples

Пример I. Приготовление различных рецептур, содержащих гормон роста человека (липо-ГРЧ)Example I. Preparation of various formulations containing human growth hormone (lipo-hGH)

Рецептура А (препарат крема): содержащая гормон роста человека рецептура кремаFormulation A (cream preparation): Human Growth Hormone-containing cream formulation

В рецептуре А использовали следующие фосфолипиды: lipoid S100 (Lipoid GmbH, Germany) или lipoid S75 (Lipoid GmbH, Germany).The following phospholipids were used in Formulation A: lipoid S100 (Lipoid GmbH, Germany) or lipoid S75 (Lipoid GmbH, Germany).

Теплообменник гомогенизатора высокого давления (максимальный выход 5 л/ч, наивысшее давление 1200 бар, модель HS-1002; производство фирмы Hwasung Machinery Co., Ltd., South Korea) помещали в ледяную воду так, что температура выхода гомогенизатора не превышала 30°С, затем внутренность гомогенизатора промывали для готовности дистиллированной водой. После этого к 100 мл раствора гормона роста человека (LG Life Sciences, Ltd), растворенного в буферном растворе (20 мМ NaH₂PO₄, рН 6,5-7,5, 1 мМ EDTA) при концентрации 1 мг/мл, добавляли фосфолипид в количестве 5% (вес к объему) и в достаточной степени увлажняли и перемешивали. Перемешанный раствор пропускали три раза или больше через гомогенизатор при комнатной температуре и низком давлении (0 бар). К пропущенному через гомогенизатор раствору добавляли фосфолипид в количестве 6% (вес к объему) и достаточно увлажняли и перемешивали. Перемешанный раствор пропускали три раза или больше через гомогенизатор при давлении 100 бар. Затем к пропущенному через гомогенизатор при давлении 100 бар раствору добавляли фосфолипид в количестве 7% (вес к объему), в достаточной степени увлажняли и перемешивали и пропускали три раза или больше через гомогенизатор при давлении 200 бар. Затем к пропущенному через гомогенизатор при давлении 200 бар раствору добавляли фосфолипид в количестве 8% (вес к объему), в достаточной степени увлажняли и перемешивали, и пропускали три раза или больше через гомогенизатор при давлении 300 бар. К пропущенному через гомогенизатор при давлении 300 бар раствору добавляли фосфолипид в количестве 9% (вес к объему), в достаточной степени увлажняли и перемешивали, и пропускали три раза или больше через гомогенизатор при давлении 400 бар. Затем к пропущенному через гомогенизатор при давлении 400 бар раствору добавляли фосфолипид в количестве 10% (вес к объему), в достаточной степени увлажняли и перемешивали, и пропускали три раза или больше через гомогенизатор при давлении 500 бар. Затем к пропущенному через гомогенизатор при давлении 500 бар раствору добавляли фосфолипид в количестве 11% (вес к объему), в достаточной степени увлажняли и перемешивали, и пропускали три раза или больше через гомогенизатор при давлении 600 бар. Затем к пропущенному через гомогенизатор при давлении 600 бар раствору добавляли фосфолипид в количестве 12% (вес к объему), в достаточной степени увлажняли и перемешивали, и пропускали три раза или больше через гомогенизатор при давлении 800 бар. Таким путем получали рецептуру крема с липосомами, содержащими гормон роста человека (липо-ГРЧ).The high-pressure homogenizer heat exchanger (maximum output 5 l / h, highest pressure 1200 bar, model HS-1002; manufactured by Hwasung Machinery Co., Ltd., South Korea) was placed in ice water so that the outlet temperature of the homogenizer did not exceed 30 ° С , then the inside of the homogenizer was washed to readiness with distilled water. After that, to 100 ml of a solution of human growth hormone (LG Life Sciences, Ltd), dissolved in a buffer solution (20 mm NaH ₂ PO ₄ , pH 6.5-7.5, 1 mm EDTA) at a concentration of 1 mg / ml, was added phospholipid in an amount of 5% (weight to volume) and sufficiently moistened and mixed. The mixed solution was passed three times or more through the homogenizer at room temperature and low pressure (0 bar). To the solution passed through the homogenizer was added phospholipid in an amount of 6% (weight to volume) and sufficiently moistened and mixed. The mixed solution was passed three times or more through a homogenizer at a pressure of 100 bar. Then, a phospholipid in an amount of 7% (weight to volume) was added to the solution passed through the homogenizer at a pressure of 100 bar, it was sufficiently moistened and mixed, and three times or more was passed through the homogenizer at a pressure of 200 bar. Then, to the solution passed through the homogenizer at a pressure of 200 bar was added phospholipid in an amount of 8% (weight to volume), sufficiently moistened and mixed, and passed three times or more through the homogenizer at a pressure of 300 bar. To the solution passed through the homogenizer at a pressure of 300 bar was added phospholipid in an amount of 9% (weight to volume), sufficiently moistened and mixed, and passed three times or more through the homogenizer at a pressure of 400 bar. Then, to the solution passed through the homogenizer at a pressure of 400 bar was added phospholipid in an amount of 10% (weight to volume), sufficiently moistened and mixed, and passed three times or more through the homogenizer at a pressure of 500 bar. Then, to the solution passed through the homogenizer at a pressure of 500 bar was added phospholipid in an amount of 11% (weight to volume), sufficiently moistened and mixed, and passed three times or more through the homogenizer at a pressure of 600 bar. Then, to the solution passed through the homogenizer at a pressure of 600 bar was added phospholipid in an amount of 12% (weight to volume), sufficiently moistened and mixed, and passed three times or more through the homogenizer at a pressure of 800 bar. In this way, a cream formulation with liposomes containing human growth hormone (lipo-hGH) was obtained.

На фиг.1 представлена электронно-микроскопическая фотография приготовленной в этом примере рецептуры крема с липосомами, содержащими гормон роста человека. Приготовленную в этом примере рецептуру с липосомами покрывали золотом и обследовали с помощью сканирующего электронного микроскопа (HITACHI S 2500). В результате наблюдения сочтено установленным, что сходящий на нет край и прилегающий фон представляют собой гель, а небольшие сферические зерна являются липосомами наноразмера (0,02-0,3 мкм).Figure 1 presents an electron microscopic photograph of a cream formulation prepared in this example with liposomes containing human growth hormone. The liposome formulation prepared in this example was coated with gold and examined using a scanning electron microscope (HITACHI S 2500). As a result of the observation, it was found to be established that the descending edge and the adjacent background are gel, and small spherical grains are nanosized liposomes (0.02-0.3 μm).

Рецептура Б (препарат липосом): содержащая гормон роста человека (ГРЧ) липосомная рецептураFormulation B (liposome preparation): containing human growth hormone (hGH) liposome formulation

В приготовлении рецептуры Б использовали следующие фосфолипиды: лецитин соевых бобов (ShinDongBang Corp., South Korea), Metarin P (Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH & Co. KG), Nutripur S (Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH & Co. KG) или Emultop (Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH & Co. KG).The following phospholipids were used in formulation B: soybean lecithin (ShinDongBang Corp., South Korea), Metarin P (Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH & Co. KG), Nutripur S (Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH & Co. KG) or Emultop ( Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH & Co. KG).

Теплообменник гомогенизатора высокого давления (максимальный выход 5 л/ч, наивысшее давление 1200 бар, модель HS-1002; производство фирмы Hwasung Machinery Co., Ltd., South Korea) помещали в ледяную воду так, что температура выхода гомогенизатора не превышала 30°С, внутренность гомогенизатора промывали для готовности дистиллированной водой. После этого к 100 мл раствора гормона роста человека (LG Life Sciences, Ltd) в буферном растворе (20 мМ NaH₂PO₄, рН 6,5-7,5, 1 мМ EDTA) с концентрацией 1 мг/мл добавляли фосфолипид в количестве 10% (вес к объему) и в достаточной степени увлажняли и перемешивали. Перемешанный раствор пропускали три раза или больше через гомогенизатор при комнатной температуре и низком давлении (0 бар). Затем к пропущенному через гомогенизатор раствору добавляли фосфолипид в количестве 14% (вес к объему), достаточно увлажняли и перемешивали, и пропускали три раза или больше через гомогенизатор при давлении 100 бар. Затем к пропущенному через гомогенизатор раствору добавляли фосфолипид в количестве 18% (вес к объему), в достаточной степени увлажняли и перемешивали, и пропускали три раза или больше через гомогенизатор при давлении 200 бар. Затем к пропущенному через гомогенизатор раствору добавляли фосфолипид в количестве 20% (вес к объему), в достаточной степени увлажняли и перемешивали, и пропускали три раза или больше через гомогенизатор при давлении 300 бар. Затем к пропущенному через гомогенизатор раствору добавляли фосфолипид в количестве 22% (вес к объему), в достаточной степени увлажняли и перемешивали, и пропускали три раза или больше через гомогенизатор при давлении 400 бар. Затем к пропущенному через гомогенизатор раствору добавляли фосфолипид в количестве 24% (вес к объему), в достаточной степени увлажняли и перемешивали, и пропускали три раза или больше через гомогенизатор при давлении 500 бар. Затем к пропущенному через гомогенизатор раствору добавляли фосфолипид в количестве 26% (вес к объему), в достаточной степени увлажняли и перемешивали, и пропускали три раза или больше через гомогенизатор при давлении 600 бар. Затем к пропущенному через гомогенизатор раствору добавляли фосфолипид в количестве 28% (вес к объему), в достаточной степени увлажняли и перемешивали, и пропускали три раза или больше через гомогенизатор при давлении 700 бар. Затем пропущенный через гомогенизатор при давлении 700 бар раствор пропускали три раза или больше через гомогенизатор при давлении 800 бар и удаляли из гомогенизатора. Удаленный раствор подвергали высокоскоростному центрифугированию при 15000 g в течении 30 мин и отделяли надосадочную жидкость. Теперь гормон роста человека, который остался неинкапсулированным в липосомы, удаляли с помощью гель-проникающей хроматографии (GE Healthcare, USA), получая таким образом липосомы в жидкой фазе (см. фиг.2).A high-pressure homogenizer heat exchanger (maximum output 5 l / h, highest pressure 1200 bar, model HS-1002; manufactured by Hwasung Machinery Co., Ltd., South Korea) was placed in ice water so that the outlet temperature of the homogenizer did not exceed 30 ° С , the inside of the homogenizer was rinsed for readiness with distilled water. After that, to a 100 ml solution of human growth hormone (LG Life Sciences, Ltd) in a buffer solution (20 mm NaH ₂ PO ₄ , pH 6.5-7.5, 1 mm EDTA) with a concentration of 1 mg / ml was added phospholipid in an amount 10% (weight to volume) and sufficiently moistened and mixed. The mixed solution was passed three times or more through the homogenizer at room temperature and low pressure (0 bar). Then, a phospholipid was added to the solution passed through the homogenizer in an amount of 14% (weight to volume), sufficiently moistened and mixed, and passed three times or more through the homogenizer at a pressure of 100 bar. Then, a phospholipid was added to the solution passed through the homogenizer in an amount of 18% (weight to volume), sufficiently moistened and mixed, and passed three times or more through the homogenizer at a pressure of 200 bar. Then, a phospholipid was added to the solution passed through the homogenizer in an amount of 20% (weight to volume), sufficiently moistened and mixed, and passed three times or more through the homogenizer at a pressure of 300 bar. Then, a phospholipid was added to the solution passed through the homogenizer in an amount of 22% (weight to volume), sufficiently moistened and mixed, and passed three times or more through the homogenizer at a pressure of 400 bar. Then, a phospholipid was added to the solution passed through the homogenizer in an amount of 24% (weight to volume), sufficiently moistened and mixed, and passed three times or more through the homogenizer at a pressure of 500 bar. Then, to the solution passed through the homogenizer was added phospholipid in an amount of 26% (weight to volume), sufficiently moistened and mixed, and passed three times or more through the homogenizer at a pressure of 600 bar. Then, to the solution passed through the homogenizer was added phospholipid in an amount of 28% (weight to volume), sufficiently moistened and mixed, and passed three times or more through the homogenizer at a pressure of 700 bar. Then, the solution passed through the homogenizer at a pressure of 700 bar was passed three times or more through the homogenizer at a pressure of 800 bar and was removed from the homogenizer. The removed solution was subjected to high speed centrifugation at 15,000 g for 30 minutes and the supernatant was separated. Now, the human growth hormone that remained unencapsulated in the liposomes was removed by gel permeation chromatography (GE Healthcare, USA), thereby obtaining liposomes in the liquid phase (see FIG. 2).

Рецептура Б, полученная с использованием раствора в дистиллированной воде и буферного раствора (20 мМ NaH₂PO₄, 1 мМ EDTA, рН 6,0-7,5), не отличалась по физическим свойствам и стабильности липосом. Однако в результате хранения полученной рецептуры при концентрации лецитина более 10% (вес к объему) в течение длительного времени при 15-30°С происходило разделение фаз на слой липида (нижний слой) и водный раствор (верхний слой). Но при концентрации лецитина менее 10% (вес к объему) рецептура имела прекрасную стабильность без разделения фаз.Formulation B obtained using a solution in distilled water and a buffer solution (20 mM NaH ₂ PO ₄ , 1 mM EDTA, pH 6.0-7.5) did not differ in the physical properties and stability of liposomes. However, as a result of storage of the obtained formulation at a lecithin concentration of more than 10% (weight to volume) for a long time at 15-30 ° С, the phases were separated into a lipid layer (lower layer) and an aqueous solution (upper layer). But at a lecithin concentration of less than 10% (weight to volume), the formulation had excellent stability without phase separation.

Пример II. Разделение методом FPLC и анализ с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с SDSExample II FPLC separation and SDS polyacrylamide gel electrophoresis analysis

Для анализа содержащих гормон роста человека липосом рецептуры Б, полученной в примере I, установку FPLC (Acta explorer, Amersham Bioscience) снабжали колонкой superdex 200 HR/30, при комнатной температуре колонку уравновешивали двукратным по отношению к объему колонки объемом буферного раствора (20 мМ NaH₂PO₄, 1 мМ EDTA, 150 мМ NaCl). Затем фракционировали содержащие гормон роста человека липосомы, фракции собирали и анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с SDS. Как показано на фиг.3, зону гормона роста человека можно было наблюдать в положении, соответствующем приблизительно 22 кДа.For the analysis of human growth hormone containing liposomes of formulation B obtained in Example I, the FPLC apparatus (Acta explorer, Amersham Bioscience) was equipped with a superdex 200 HR / 30 column, at room temperature the column was balanced twice with the volume of the buffer solution (20 mM NaH) ₂ PO ₄ , 1 mM EDTA, 150 mM NaCl). Then liposomes containing human growth hormone were fractionated, fractions were collected and analyzed by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. As shown in FIG. 3, the zone of human growth hormone could be observed at a position corresponding to approximately 22 kDa.

Пример III. Количественное определение гормона роста человека в липосомахExample III Quantification of human growth hormone in liposomes

Установку ВЭЖХ (HPLC, Shimadzu) снабжали колонкой С₁₈ Delta pack (Waters, USA)An HPLC unit (HPLC, Shimadzu) was equipped with a C ₁₈ Delta pack column (Waters, USA)

и проводили обратно-фазную ВЭЖХ в градиенте концентрации (раствор В 60-10%: 0-25 мин, раствор В 60%: 25,01-30 мин) при скорости протока 1 мл/мин, используя в качестве раствора А 0,1% раствор трифторуксусной кислоты (ТФУ) в ацетонитриле, а в качестве раствора В 0,1% ТФУ в H₂O. Стандартный образец (international standard human growth hormone NIBSC code 98/574) количественно определяли с флуоресцентным детектором (возбуждение при 295 нм, диапазон длин волн 270-300 нм, эмиссия при 350 нм, диапазон длин волн 300-400 нм) при температуре термостата 55°С и времени протока 30 мин. Затем обрабатывали образец, разрушая раствор содержащих гормон роста человека липосом в ультразвуковом дезинтеграторе и добавляя к нему такой же объем буферного раствора (50 мМ трис-HCl рН 8,0, 1 мМ EDTA, 8 М мочевина, 2% твин-20), после чего отбирали смесь пипеткой и анализировали методом ВЭЖХ с флуоресцентным детектором (см. фиг.4).and reverse phase HPLC was performed in a concentration gradient (solution B 60-10%: 0-25 min, solution B 60%: 25.01-30 min) at a flow rate of 1 ml / min, using 0.1 as a solution % solution of trifluoroacetic acid (TFA) in acetonitrile, and as a solution of 0.1% TFA in H ₂ O. A standard sample (international standard human growth hormone NIBSC code 98/574) was quantified with a fluorescent detector (excitation at 295 nm, wavelength range 270-300 nm, emission at 350 nm, wavelength range 300-400 nm) at a thermostat temperature of 55 ° C and a flow time of 30 minutes. Then the sample was processed, destroying the solution of human growth hormone liposomes in an ultrasonic disintegrator and adding the same volume of buffer solution (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 8 M urea, 2% tween-20), after whereupon the mixture was taken with a pipette and analyzed by HPLC with a fluorescent detector (see figure 4).

Результаты количественного определения показывают, что полученные в примере I липо-ГРЧ рецептуры Б содержат приблизительно 3,69 мкг/мл гормона роста человека.Quantitative results show that the lipo-hGH formulations B obtained in Example I contain approximately 3.69 μg / ml human growth hormone.

Пример IV. Анализ содержания фосфолипидаExample IV Phospholipid Analysis

Установку ВЭЖХ (HPLC, Shimadzu) снабжали колонкой Spherisorb S5 NH₂ (Waters), ВЭЖХ проводили с изократическим градиентом при скорости протока 1 мл/мин, используя смешанный раствор 60% ацетонитрила, 30% метанола и 5% Н₂O. Фосфолипид полностью растворяли в смеси метанол:хлороформ (90%:10%) и определяли количественно с использованием УФ-детектора (длина волны 215 нм) при температуре термостата 35°С и времени протока 20 мин. Таким же самым образом раствор липосом, содержащих гормон роста человека, полностью растворяли в смеси метанол:хлороформ (90%:10%) и определяли количественно методом ВЭЖХ (см. фиг.5).An HPLC installation (HPLC, Shimadzu) was equipped with a Spherisorb S5 NH ₂ column (Waters), HPLC was performed with an isocratic gradient at a flow rate of 1 ml / min using a mixed solution of 60% acetonitrile, 30% methanol and 5% H ₂ O. Phospholipid was completely dissolved in a mixture of methanol: chloroform (90%: 10%) and was quantified using a UV detector (wavelength 215 nm) at a thermostat temperature of 35 ° C and a flow time of 20 minutes. In the same way, a solution of liposomes containing human growth hormone was completely dissolved in a mixture of methanol: chloroform (90%: 10%) and quantified by HPLC (see FIG. 5).

Результаты количественного определения показывают, что полученные в примере I липо-ГРЧ рецептуры Б содержат приблизительно 3,26 мг/мл фосфолипида.Quantification results show that the lipo-hGH formulations B obtained in Example I contain approximately 3.26 mg / ml phospholipid.

Пример V. Испытание стабильностиExample V. Stability Test

Стабильность содержащих гормон роста человека липосом рецептуры Б, полученной в примере I, анализировали следующим образом. Данные липо-ГРЧ, содержащие 0,1% метил-парабен, помещали в сосуды коричневого стекла, выдерживали сосуды при температурах 4°С и 15-30°С и с интервалами в 1 неделю определяли количественно содержание ГРЧ методом ВЭЖХ. Как можно видеть на фиг.6, данные липо-ГРЧ после хранения в течение 10 месяцев сохраняли 87,5% от исходного содержания ГРЧ при 4°С и 75% при комнатной температуре. Это позволяет заключить, что данные липо-ГРЧ имеют прекрасную стабильность.The stability of the human growth hormone-containing liposomes of formulation B obtained in Example I was analyzed as follows. These lipo-hGH containing 0.1% methyl paraben were placed in brown glass vessels, the vessels were kept at 4 ° C and 15-30 ° C, and the hGH content was quantified by HPLC at intervals of 1 week. As can be seen in Fig.6, the lipo-hGH data after storage for 10 months retained 87.5% of the initial hGH content at 4 ° C and 75% at room temperature. This allows us to conclude that these lipo-hGH have excellent stability.

Пример VI. Испытание безопасностиExample VI Safety test

Чтобы оценить безопасность данных содержащих гормон роста человека липосом (рецептура Б, полученная в примере I), исследовали цитотоксичность для линии клеток НаСаТ кератиноцитов человека (DKFZ, Germany) и клеток фибробластов HEF эмбриона человека (любезно предоставлены профессором Lee Jaeyong, Department of Biochemistry, School of Medicine, Hallym University).In order to evaluate the safety of data containing human growth hormone liposomes (formulation B obtained in Example I), cytotoxicity was studied for the HaCaT cell line of human keratinocytes (DKFZ, Germany) and human embryo HEF fibroblast cells (kindly provided by Professor Lee Jaeyong, Department of Biochemistry, School of Medicine, Hallym University).

Клетки НаСаТ и HEF суспендировали в 10% FBS/DMEM (среда FD) при концентрациях соответственно 1×10⁵ клеток/мл и 5×10⁴ клеток/мл. По 1 мл каждой суспензии вносили в планшет с 24 ячейками и инкубировали в термостате с 5% CO₂ при 37°С в течение суток. После этого аккуратно удаляли покрывающую слой клеток среду, в ячейки планшета вносили необходимое количество среды 10% FD с различными концентрациями проб и инкубировали в течение суток в термостате с 5% CO₂ при 37°С. Использовали следующие пробы: буферный раствор (содержал 20 мМ фосфат Na, рН 7,0, 1 мМ EDTA и 0,1% метил-парабен) липосомы, гормон роста человека и липо-ГРЧ рецептуры Б, полученной в примере I. После проведения реакции измеряли выживаемость клеток с помощью красителя 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ: Sigma, USA) (Shearman и др. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1994. Т. 91, №4. С.1470-1474; Shearman и др. // J. Neurochem. 1995. Т. 65, №1. С.218-227 и Kaneko и др. // J. Neurochem. 1995. Т. 65, №6. С.2585-2593). Поглощение продуктов реакции с МТТ при 570 нм измеряли с помощью сканера ELISA (Molecular Devices, USA). Выживаемость клеток для каждой из проб выражали величиной отношения измеренного поглощения к принятому за 100% поглощению в ячейке, не содержавшей проб (фиг.7).HaCaT and HEF cells were suspended in 10% FBS / DMEM (FD medium) at concentrations of 1 × 10 ⁵ cells / ml and 5 × 10 ⁴ cells / ml, respectively. 1 ml of each suspension was added to a 24-well plate and incubated in an incubator with 5% CO ₂ at 37 ° C for one day. After that, the medium covering the cell layer was carefully removed, the required amount of 10% FD medium with various sample concentrations was added to the plate cells and incubated for 24 hours in an incubator with 5% CO ₂ at 37 ° C. The following samples were used: a buffer solution (containing 20 mM Na phosphate, pH 7.0, 1 mM EDTA and 0.1% methyl paraben) liposomes, human growth hormone and lipo-hGH formulation B obtained in Example I. After the reaction cell survival was measured using the dye 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT: Sigma, USA) (Shearman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1994. T 91, No. 4. P.1470-1474; Shearman et al., J. Neurochem. 1995. T. 65, No. 1. P.218-227 and Kaneko et al. // J. Neurochem. 1995. T . 65, No. 6. S.2585-2593). The absorption of the reaction products with MTT at 570 nm was measured using an ELISA scanner (Molecular Devices, USA). Cell survival for each of the samples was expressed by the ratio of the measured absorption to the absorption taken as 100% in a cell that did not contain samples (Fig. 7).

Как видно из фиг.7, данные нанолипосомы, содержащие ГРЧ, не влияли на выживаемость клеток НаСаТ и HEF, что указывает на высокую степень безопасности рецептуры для организма.As can be seen from Fig. 7, these nanoliposomes containing hGH did not affect the survival of HaCaT and HEF cells, which indicates a high degree of safety of the formulation for the body.

Пример VII. Анализ пролиферации клеток Nb₂ при действии нанолипосомной рецептуры липо-ГРЧExample VII Analysis of Nb ₂ cell proliferation under the action of nanoliposome lipo-hGH formulation

В ячейки планшета с 96 ячейками, содержащие 50 мкл линии клеток Nb₂ лимфомы крыс линии «noble» (NIBSC ЕСАСС #97041101) при концентрации 1×10⁵ клеток/мл, добавляли S-ГРЧ (стандартный гормон роста человека, NIBSC code 98/574), образец, содержащий 1000-кратное разбавление предобработанного раствора (полученного разрушением ультразвуком раствора липосом, не содержащих гормона роста человека, добавлением к нему равного объему образца объема раствора (содержащего 50 мМ трис-HCl рН 8,0, 1 мМ EDTA, 8 М мочевину, 2% твин-20) и затем пипетированием раствора), или образец, содержащий 1000-кратное разбавление липо-ГРЧ (N-ГРЧ; полученная в примере I рецептура Б), подвергнутых процессу предобработки образца (включающего разрушение ультразвуком раствора липосом, содержащих гормон роста человека, добавлением к нему равного объему образца объема раствора (содержащего 50 мМ трис-HCl рН 8,0, 1 мМ EDTA, 8 М мочевину, 2% твин-20) и пипетированием раствора). Все образцы инкубировали в термостате с 5% CO₂ при 37°С в течение 5 дней, количество пролиферирующих клеток измеряли с помощью МТТ. Среднее поглощение в группе проб, содержащих ГРЧ, рассчитывали как отношение поглощения к принятому за 100% поглощению в контрольной группе проб, не содержащих ГРЧ.S-hGH (standard human growth hormone, NIBSC code 98 /) was added to a 96-well plate cell containing 50 μl of the noble rat rat Nb ₂ cell line noble (NIBSC ECACC # 97041101) at a concentration of 1 × 10 ⁵ cells / ml 574), a sample containing 1000-fold dilution of the pre-treated solution (obtained by ultrasonic disruption of a liposome solution containing no human growth hormone, adding to it equal to the sample volume of the solution volume (containing 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 8 M urea, 2% tween-20) and then pipetting the solution), or a sample containing 1000-k Atomic dilution of lipo-hGH (N-hGH; Formulation B obtained in Example I) subjected to a sample pretreatment process (including ultrasonic disruption of a liposome solution containing human growth hormone by adding an equal volume of a solution volume (containing 50 mM Tris-HCl pH to it) 8.0, 1 mM EDTA, 8 M urea, 2% tween-20) and pipetting solution). All samples were incubated in an incubator with 5% CO ₂ at 37 ° C for 5 days, the number of proliferating cells was measured using MTT. The average absorption in the group of samples containing hGH was calculated as the ratio of absorption to the absorption taken as 100% in the control group of samples not containing hGH.

Как показано на фиг.9, инкапсулированный гормон роста человека в препарате липо-ГРЧ сохраняет свою исходную активность.As shown in FIG. 9, the encapsulated human growth hormone in the lipo-hGH preparation retains its original activity.

Пример VIII. Анализ распределения частиц по размерамExample VIII Particle size distribution analysis

Распределение частиц по размерам для липо-ГРЧ в рецептуре Б после гель-проникающей хроматографии в приведенном выше примере анализировали с помощью анализатора размера частиц (Mastersizer 2000/Malvern Instruments Ltd.) при показателе преломления 1,52 (см. фиг.13). Как показывает распределение на фиг.13, у данных липо-ГРЧ максимальный размер частиц составлял 0,193 мкм, это показывает, что липо-ГРЧ рецептуры Б имеют нанометровый размер.The particle size distribution for lipo-hGH in formulation B after gel permeation chromatography in the above example was analyzed using a particle size analyzer (Mastersizer 2000 / Malvern Instruments Ltd.) at a refractive index of 1.52 (see FIG. 13). As shown by the distribution in FIG. 13, for these lipo-hGH, the maximum particle size was 0.193 μm, this indicates that the lipo-hGH of formulation B is nanometer in size.

Пример IX. Анализ эффекта уменьшения числа морщинExample IX Wrinkle Reduction Analysis

Мышей «nude» в возрасте 4 недель (полученных от Korea Research Institute of Chemical Technology) испытывали с применением липо-ГРЧ (N-ГРЧ). В камере для животных поддерживали температуру 22±2°С, влажность 55-60% и световой цикл: 12 ч света и 12 ч темноты. Животных подвергали акклиматизации в течение приблизительно 2 недель и обеспечивали им свободный доступ к твердой пище (Central Lab. Animal Inc., Seoul, Korea) и воде, стерилизованной облучением. Чтобы индуцировать образование морщин на спине этих мышей, «nude» мышей облучали трижды в неделю в течение 8 недель УФ-В с дозой 20 мДж. Затем на облученные УФ-В спины наносили в течение 8 недель с помощью косметической щеточки растворы каждого из образцов и контрольный раствор. После этого эффект снижения числа морщин оценивали по методу Donald (Hyun-Seok Kim и др. // Mech. Ageing Dev., 2005. Т. 8, №16, в печати).4 weeks old nude mice (obtained from Korea Research Institute of Chemical Technology) were tested using lipo-hGH (N-hGH). In the chamber for animals the temperature was maintained at 22 ± 2 ° C, humidity 55-60% and the light cycle: 12 hours of light and 12 hours of darkness. The animals were acclimatized for approximately 2 weeks and allowed them free access to solid food (Central Lab. Animal Inc., Seoul, Korea) and irradiated sterilized water. To induce the formation of wrinkles on the back of these mice, nude mice were irradiated three times a week for 8 weeks with UV-B at a dose of 20 mJ. Then, solutions of each of the samples and a control solution were applied onto the irradiated UV-B backs for 8 weeks using a cosmetic brush. After that, the effect of reducing the number of wrinkles was evaluated according to the Donald method (Hyun-Seok Kim et al. // Mech. Ageing Dev., 2005. T. 8, No. 16, in press).

Результаты испытаний представлены на фиг.8 и 14. На фиг.8 контрольную группу (n=3) не обрабатывали ничем, контрольную группу UVB (n=3) обрабатывали облучением 20 мДж УФ-, чтобы только индуцировать морщины, группу «липосомы» (n=3) обрабатывали 20 мДж УФ-В для индукции морщин и липосомами, а группу «липо-ГРЧ» (n=3) обрабатывали 20 мДж УФ-В для индукции морщин и данными липо-ГРЧ. Как показано на фиг.8 и 14, данные липо-ГРЧ эффективно удаляют индуцированные УФ морщины, этот эффект отчетливо проявляется, начиная с 2 недель после поверхностного нанесения данных липо-ГРЧ.The test results are presented in Figs. 8 and 14. In Fig. 8, the control group (n = 3) was not treated with anything, the control group UVB (n = 3) was treated with irradiation of 20 mJ UV- to only induce wrinkles, the liposome group ( n = 3) was treated with 20 mJ UV-B for the induction of wrinkles and liposomes, and the lipo-hGH group (n = 3) was treated with 20 mJ UV-B for the induction of wrinkles and lipo-hGH data. As shown in FIGS. 8 and 14, lipo-hGH data effectively removes induced UV wrinkles, this effect is clearly evident starting from 2 weeks after surface application of lipo-hGH data.

Пример X. Анализ эффекта лечения угрейExample X. Analysis of the effect of acne treatment

Анализ лечебного действия данных, содержащих гормон роста человека липосом на угри, проводили следующим образом.The analysis of the therapeutic effect of data containing human growth hormone liposomes for acne was carried out as follows.

Шестьдесят женщин в возрасте 15-40 лет разделяли случайным образом на 3 группы. Каждая из групп применяла рецептуру Б с содержащими ГРЧ липосомами из примера I (рецептура 1), сравниваемый раствор, содержащий только липосомы (рецептура 2), и сравниваемый раствор буфера (рецептура 3). Растворы применялись сразу после умывания лица дважды в день (утром и вечером) в течение 3 недель. Кроме этого не было специальных ограничений в использовании обычной косметики. Затем степень излечения угрей оценивалась на основании мнений пользователей по следующим критериям. Полученные результаты представлены ниже в таблице 1. Критерии оценки были следующими: +++ (очень хорошее улучшение состояния); ++ (заметное улучшение); + (слабое улучшение); ± (нет улучшения, но отсутствует ухудшение); и - (ухудшение).Sixty women aged 15-40 years were randomly divided into 3 groups. Each of the groups used formulation B with hGH-containing liposomes from Example I (formulation 1), a comparison solution containing only liposomes (formulation 2), and a comparison buffer solution (formulation 3). The solutions were applied immediately after washing the face twice a day (morning and evening) for 3 weeks. In addition, there were no special restrictions on the use of conventional cosmetics. Then the degree of cure of acne was evaluated based on the opinions of users according to the following criteria. The results are presented below in table 1. Evaluation criteria were as follows: +++ (very good improvement); ++ (noticeable improvement); + (slight improvement); ± (no improvement, but no deterioration); and - (worsening).

Таблица 1Table 1 ПериодPeriod Рецептура 1Recipe 1 Рецептура 2Recipe 2 Рецептура 3Recipe 3 1-я неделя1st week ++ ±± ±± 2-я неделя2nd week ++++ ++ ±± 3-я неделя3rd week ++++++ ++ ±±

Как видно из таблицы 1, данная рецептура оказывает очень хорошее действие по излечению угрей, которое начинает явственно быть видным через 2 недели после нанесения рецептуры. Кроме того, данная композиция не вызывает заметного раздражения кожи, например покраснения или чесотки.As can be seen from table 1, this formulation has a very good effect on the cure of acne, which begins to be clearly visible 2 weeks after applying the recipe. In addition, this composition does not cause noticeable skin irritation, such as redness or scabies.

Пример XI. Анализ эффекта удаления темных пятенExample XI Dark Spot Removal Analysis

Эффект удаления темных пятен данными липосомами, содержащими гормон роста человека, тестировали следующим способом.The effect of removing dark spots with these liposomes containing human growth hormone was tested in the following way.

Шестьдесят женщин в возрасте 40-60 лет разделяли случайным образом на 3 группы. Каждая из групп применяла рецептуру Б с содержащими ГРЧ липосомами из примера I (рецептура 1), сравниваемый раствор, содержащий только липосомы (рецептура 2), и сравниваемый раствор буфера (рецептура 3). Растворы применялись сразу после умывания лица дважды в день (утром и вечером) в течение 8 недель. Кроме этого не было специальных ограничений в использовании обычной косметики. Степень удаления темных пятен оценивалась на основании мнений пользователей по следующим критериям. Полученные результаты представлены ниже в таблице 2. Критерии оценки были следующими: +++ (очень хорошее улучшение состояния); ++ (заметное улучшение); + (слабое улучшение); ± (нет улучшения, но отсутствует ухудшение); и - (ухудшение).Sixty women aged 40-60 years were randomly divided into 3 groups. Each of the groups used formulation B with hGH-containing liposomes from Example I (formulation 1), a comparison solution containing only liposomes (formulation 2), and a comparison buffer solution (formulation 3). The solutions were applied immediately after washing the face twice a day (morning and evening) for 8 weeks. In addition, there were no special restrictions on the use of conventional cosmetics. The degree of removal of dark spots was evaluated based on the opinions of users according to the following criteria. The results are presented below in table 2. Evaluation criteria were as follows: +++ (very good improvement); ++ (noticeable improvement); + (slight improvement); ± (no improvement, but no deterioration); and - (worsening).

Как можно видеть в таблице 2, данная рецептура оказывает достоверное очень хорошее действие по удалению темных пятен, которое начинает быть отчетливо видным приблизительно через 3-5 недель после нанесения рецептуры. Кроме того, данная композиция не вызывает заметного раздражения кожи, например покраснения или чесотки.As can be seen in table 2, this formulation has a reliable very good effect on the removal of dark spots, which begins to be clearly visible approximately 3-5 weeks after application of the formulation. In addition, this composition does not cause noticeable skin irritation, such as redness or scabies.

Таблица 2table 2 ПериодPeriod Рецептура 1Recipe 1 Рецептура 2Recipe 2 Рецептура 3Recipe 3 1-я неделя1st week ±± ±± ±± 2-я неделя2nd week ±± ±± ±± 3-я неделя3rd week ++ ±± ±± 4-я неделя4th week ++ ±± ±± 5-я неделя5th week ++++ ++ ±± 6-я неделя6th week ++++ ++ ±± 7-я неделя7th week ++++ ++ ±± 8-я неделя8th week ++++ ++ ±±

Пример XII. Анализ локализации нанолипосомной рецептуры липо-ГРЧ и ее действия на кожуExample XII. Analysis of the localization of nanoliposome lipo-hGH formulation and its effect on the skin

Брюшную область крысы Sprague Dawley делили на 6 зон (окружностями с радиусом каждой 1 см) и обрабатывали следующими пробами: буферный раствор с 0,1% метил-парабеном, 0,1% липосомы, 0,001 ед. ГРЧ, 0,0001 ед. ГРЧ, 0,001 ед. липо-ГРЧ и 0,0001 ед. липо-ГРЧ.The abdominal region of Sprague Dawley rats was divided into 6 zones (circles with a radius of 1 cm each) and treated with the following samples: buffer solution with 0.1% methyl paraben, 0.1% liposome, 0.001 units. HGH, 0.0001 units HGH, 0.001 units lipo-hGH and 0.0001 units lipo-hGH.

Животное обрабатывали дважды по 50 мкл каждой из проб с интервалом 24 ч, всего 7 раз. Через 24 ч после последней обработки ткань у животного удаляли. Удаленную ткань разрезали на слои толщиной 40 мкм и обрабатывали в качестве первичных антител поликлональными кроличьими антителами к гормону роста человека (DAKO, USA), а затем конъюгированными с биотином вторичными антителами к кроличьим антителам (VECTASTAIN ABC kit (RABBIT IgG), VECTOR, USA) при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем нарезанную на слои ткань обрабатывали реагентом VECTASTAIN ABC reagent (VECTOR, USA) при комнатной температуре в течение 30 мин и подвергали реакции окрашивания с субстратом DAB (диаминобензидин, Diaminobenzidine, Sigma, USA). Слои ткани обезвоживали поочередно 78% этанолом, 85% этанолом и 95% этанолом, затем обрабатывали ксилолом в течение 5 мин. Ткань фиксировали на предметных стеклах и определяли локализацию содержащегося в липо-ГРЧ гормона роста человека.The animal was treated twice with 50 μl of each of the samples with an interval of 24 hours, a total of 7 times. 24 hours after the last treatment, the tissue in the animal was removed. The removed tissue was cut into 40 μm layers and treated as primary antibodies with polyclonal rabbit antibodies to human growth hormone (DAKO, USA), and then biotin-conjugated secondary antibodies to rabbit antibodies (VECTASTAIN ABC kit (RABBIT IgG), VECTOR, USA) at room temperature for 30 minutes Then, the tissue cut into layers was treated with VECTASTAIN ABC reagent reagent (VECTOR, USA) at room temperature for 30 min and stained with a DAB substrate (diaminobenzidine, Diaminobenzidine, Sigma, USA). The tissue layers were dehydrated alternately with 78% ethanol, 85% ethanol and 95% ethanol, then treated with xylene for 5 minutes. The tissue was fixed on slides and the localization of the human growth hormone contained in lipo-hGH was determined.

Как показано на фиг.10а, инкапсулированный в данных липо-ГРЧ гормон роста человека или гормон роста крысы, исходно имеющийся у крысы, обнаруживаются в областях, которые считаются стволовыми клетками расширения в волосяных фолликулах.As shown in FIG. 10a, the human growth hormone encapsulated in the lipo-hGH data or rat growth hormone originally present in the rat is found in areas that are considered expansion stem cells in the hair follicles.

Кроме того, как показано на фиг.10б, дермальный слой кожи крысы, на которую нанесены данные липо-ГРЧ (содержащие 0,0001 ед. ГРЧ) расширился, а число волосяных фолликул в дермальном слое увеличилось. Более того, на фиг.12 можно видеть, что даже если на кожу был нанесен водный раствор ГРЧ, ГРЧ достиг расположения стволовых клеток расширения в волосяных фолликулах, и это крайне неожиданно, учитывая технический уровень и общее состояние в данной области. Это приводит к улучшению состояний кожи, даже если на кожу наносят не только ГРЧ, инкапсулированный в липосомы, но даже и водный раствор самого ГРЧ.In addition, as shown in figb, the dermal layer of the skin of the rat, on which the data lipo-hGH (containing 0.0001 units of hGH) is applied) expanded, and the number of hair follicles in the dermal layer increased. Moreover, in Fig. 12 it can be seen that even if an aqueous solution of hGH was applied to the skin, hGH reached the location of the expansion stem cells in the hair follicles, and this is extremely unexpected, given the technical level and general condition in this area. This leads to an improvement in skin conditions, even if not only hGH encapsulated in liposomes is applied to the skin, but even an aqueous solution of hGH itself.

Пример XIII. Анализ действия нанолипосомной рецептуры липо-ГРЧ на кожу мышейExample XIII Analysis of the effect of nanoliposome lipo-hGH formulation on mouse skin

Действие данной нанолипосомной рецептуры липо-ГРЧ (полученной в примере I) на кожу мышей ICR анализировали путем окрашивания гематоксилином и эозином. Для этой цели после удаления волос со спины мышей ICR спинную область, разделенную на участки относительно позвоночника, обрабатывали контролем и препаратами данных липо-ГРЧ с интервалами 4 ч в течение 2 недель. Группы мышей обрабатывали следующим образом: группа 1 (n=3) - без обработки; группа 2 (n=3) - обработка липосомами (0,1 ед. данных липо-ГРЧ); группа 3 (n=3) - обработка липосомами (0,01 ед. данных липо-ГРЧ); группа 4 (n=3) - обработка липосомами (0,001 ед. данных липо-ГРЧ). После 2 недель обработки у мышей выделяли ткани. Выделенные ткани заливали парафином, нарезали на слои толщиной 4 мкм и слои помещали на предметные стекла. Затем из слоев удаляли парафин и обрабатывали их раствором гематоксилена при комнатной температуре в течение 10 мин и раствором эозина при комнатной температуре в течение 1 мин. Наконец слои обезвоживали последовательно 78% этанолом, 85% этанолом, 95% этанолом и 100% этанолом и после этого обрабатывали ксилолом в течение 5 мин. Ткани иммобилизовали, после чего окрашенные ткани анализировали под микроскопом.The effect of this nanoliposome lipo-hGH formulation (obtained in Example I) on the skin of mice ICR was analyzed by hematoxylin and eosin staining. For this purpose, after removing hair from the back of ICR mice, the dorsal region, divided into sections relative to the spine, was treated with control and preparations of lipo-hGH data at 4-hour intervals for 2 weeks. Groups of mice were treated as follows: group 1 (n = 3) - without treatment; group 2 (n = 3) - liposome processing (0.1 units of lipo-hGH data); group 3 (n = 3) - liposome processing (0.01 units of lipo-hGH data); group 4 (n = 3) - liposome processing (0.001 units of lipo-hGH data). After 2 weeks of treatment, tissues were isolated from mice. The selected tissue was embedded in paraffin, cut into layers with a thickness of 4 μm and the layers were placed on a glass slide. Then paraffin was removed from the layers and treated with a hematoxylene solution at room temperature for 10 minutes and an eosin solution at room temperature for 1 minute. Finally, the layers were dehydrated sequentially with 78% ethanol, 85% ethanol, 95% ethanol and 100% ethanol, and then treated with xylene for 5 minutes. Tissues were immobilized, after which the stained tissues were analyzed under a microscope.

Как показано на фиг.11а, пролиферация клеток в эпидермальном слое кожи, обработанной данной нанолипосомной рецептурой липо-ГРЧ, значительно усилилась, и произошло преобразование соединительных тканей в дермальном слое с повышением компактности соединительных тканей. Фиг.11б - фотография с увеличением 400×, ясно показывающая, что происходит преобразование соединительных тканей в дермальном слое.As shown in FIG. 11 a, cell proliferation in the epidermal layer of the skin treated with this nanoliposome lipo-hGH formulation was significantly enhanced, and connective tissue was transformed in the dermal layer with an increase in the compactness of the connective tissues. 11b is a photograph with a magnification of 400 ×, clearly showing that there is a conversion of connective tissue in the dermal layer.

Пример XIV. Анализ действия нанолипосомной рецептуры липо-ГРЧ на искусственную кожуExample XIV. Analysis of the effect of nanoliposome lipo-hGH formulation on artificial skin

Для анализа действия данной нанолипосомной рецептуры липо-ГРЧ на искусственную кожу использовали Neoderm-ED™ (Tego Science, South Korea). Neoderm-ED™ - это модель кожи человека для тестов in vitro, которая состоит из эпидермального и дермального матрикса. Испытуемые группы были следующими: группа 1 - без обработки; группа 2 - обработка только буферным раствором; группы 3 и 4 - обработка липосомами; группы 5 и 6 - обработка соответственно 0,001 ед. и 0,01 ед. данными липо-ГРЧ. Заливку парафином и окрашивание гематоксилином и эозином выполняли так же, как и в предыдущем примере. После всех процедур окрашенные ткани наблюдали под микроскопом.Neoderm-ED ™ (Tego Science, South Korea) was used to analyze the effect of this nanoliposome lipo-hGH formulation on artificial skin. Neoderm-ED ™ is a human skin model for in vitro tests, which consists of an epidermal and dermal matrix. The test groups were as follows: group 1 - without treatment; group 2 - treatment only with buffer solution; groups 3 and 4 - treatment with liposomes; groups 5 and 6 - treatment, respectively, 0.001 units. and 0.01 units lipo-hGH data. Paraffin filling and hematoxylin and eosin staining were performed in the same manner as in the previous example. After all procedures, stained tissues were observed under a microscope.

Как показано на фиг.12, активно происходила пролиферация клеток в слое кератиноцитов Neoderm-ED™, обработанной данной нанолипосомной рецептурой липо-ГРЧ.As shown in FIG. 12, cell proliferation actively occurred in the Neoderm-ED ™ keratinocyte layer treated with this nano liposome lipo-hGH formulation.

После описания конкретных примеров настоящего изобретения должно быть понятно, что такие примеры являются лишь предпочтительными вариантами осуществления изобретения и не должны считаться ограничивающими область охвата настоящего изобретения. Таким образом, действительная область охвата настоящего изобретения может быть определена прилагаемыми пунктами формулы и их эквивалентами.After describing specific examples of the present invention, it should be understood that such examples are only preferred embodiments of the invention and should not be construed as limiting the scope of the present invention. Thus, the actual scope of the present invention can be determined by the attached claims and their equivalents.

Claims

1. A composition formulated for surface application to the skin to improve skin conditions, which contains human growth hormone in the range of application from 0.001 to 100 ng per cm ^{2 of} skin and a cosmetically acceptable carrier.

2. The composition of claim 1, wherein the cosmetically acceptable carrier comprises a liposome.

3. The composition according to claim 2, where the liposome is a nanoliposome and this nanoliposome has a size of from 20 to 1000 nm.

4. The composition according to claim 1, where this composition is in the form of a cream, lotion, tonic, serum, gel, solution, dried powder or mask.

5. The composition according to claim 1, where the condition of the skin are acne, wrinkles, dark spots, skin elasticity, hair growth, skin aging, skin moisture or proliferation of dermal stem cells.

6. The composition according to claim 1, where the composition is a cosmetic or pharmaceutical composition.

7. A method for improving human skin conditions, which comprises superficially applying to the human skin a composition according to any one of claims 1-6.