RU2392973C2 - Способ получения трехмерного хондротрансплантата - Google Patents
Способ получения трехмерного хондротрансплантата Download PDFInfo
- Publication number
- RU2392973C2 RU2392973C2 RU2008103109/15A RU2008103109A RU2392973C2 RU 2392973 C2 RU2392973 C2 RU 2392973C2 RU 2008103109/15 A RU2008103109/15 A RU 2008103109/15A RU 2008103109 A RU2008103109 A RU 2008103109A RU 2392973 C2 RU2392973 C2 RU 2392973C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fbs
- rpmi
- minutes
- centrifuged
- rpm
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, и может быть использовано для коррекции дистрофических и травматических изменений хрящевой ткани, а также для коррекции процессов роста при идиопатическом сколиозе на ранних стадиях развития патологии. Способ характеризуется тем, что пластинки роста новорожденных мини-свиней помещают в раствор Хенкса с канномицином 1 г/л на 5 минут, затем пластинки роста промывают, измельчают, переносят в пробирки со средой RPMI-1640 с добавлением 20% FBS и раствора 1.5% коллагеназы с активностью 240 ЕД/мл, инкубируют, суспензию центрифугируют при 2000 об/мин 10 минут, изолированные хондробласты культивируют по достижению концентрации 50-60 млн, проводят пассирование клеток с помощью смеси растворов 0,25% трипсина и 0,02% раствора ЭДТА, далее клетки центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 минут, затем клеточный агрегат перемещают в планшет с питательной средой RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, культивируют 4-6 недель до получения хондротрансплантата размером 2×2×2±мм3. Изобретение обеспечивает предотвращение прогрессирования деформации позвоночника на ранних стадиях процесса, предупреждение развития остеоартроза и остехондроза, сокращение послеоперационного периода, резкое сокращение количества послеоперационных койко-дней и исключение многоэтапных, дорогостоящих операций на позвоночнике и суставах. 5 ил.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, и может быть использовано для коррекции дистрофических и травматических изменений хрящевой ткани, а также для коррекции процессов роста при идиопатическом сколиозе на ранних стадиях развития патологии.
Известны способы получения трехмерного хондротрансплантата на основе синтетического коллагена с микропорами (Guoping Chen, Takashi Sato, Takashi Ushido et. al. Tissiue engineering of cartilage using a hybrid scaffold of synthetic polymer end collagen. // Tissue Engineering. 2004. Vol.10. N.3. P.323-330). Культивировали артикулярные хондроциты взрослых бычков в альгинатном геле до начала синтеза протеогликанов, затем помещали на пористую мембрану, содержащую протеогликаны. Хондроциты сохраняли свой фенотип и синтезировали коллаген II типа и матрикс.
Трехмерный трансплантат получали из хондроцитов носовой перегородки молодых бычков (Koichi Masuda, Robert L., San Michael J., et. al. A novel tow-step method for the formation of tissue-engineered cartilage by muture bovine chondrocyte (ABC-method) // J. of Orthopeadic Research. 2003. Vol.21. N.1. P.139-148). Хондроциты извлекали из носовой перегородки молодых бычков, культивировали до получения монослоя, затем помещали на подложку из биодеградирующего материала - олигополиэтиленгликоля, на которой формировался хондротрансплантат.
Хондроциты суставного хряща человека культивировали в виде суспензии и затем помещали в круговой биореактор, в котором клетки подвергались вращению в течение 12 недель (Marlovits S., Tichy В., Truppe М., et. al. Collagen expression in tissue engineered cartilage of aged human articular chondrocytes in a rotating bioreactor. // Jnt. J. Artif. Organ. 2003. Apr., Vol.26. N.4. P.319-330). Клетки спонтанно агрегировались и формировали экстрацеллюлярный матрикс.
Основными недостатками данных методов получения хондротрансплантата являются: использование высокодифференцированных хондробластов артикулярного хряща, чьи потенции пролиферации и формирования матрикса ограничены, что может привести к апоптозу хондроцитов и несовместимости трансплантата; применение матриц - носителей, представляющих собой слабо резорбируемые материалы, являющиеся инородными телами, препятствующими адаптации и метаболической кооперации трансплантируемых и материнских хондробластов.
Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения хрящевых трансплантатов из хондроцитов лошади без применения матриц-носителей (Ponomarev I., Nilke J. Verfahren zur herstellung deidimensionaler tragrfreier gewebestrukturen und naeh diesen verfahren herges tellte gewebestrukturen. // Deutschen Patent und Markenamtes. Patent N. 2004001225. 2004). Биотрасплантаты хряща из коленных суставов лошади извлекаются в стерильных условиях и помещаются в пробирки с 0.9% NaCl. В условиях ламинарного шкафа двукратно промытый в чашке Петри стерильным раствором фосфатного буфера биоптат измельчается скальпелем на кусочки размером 1×1 мм2, которые затем переносятся в пробирку объемом 50 мл со средой DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Sigma) с добавлением 10% телячьей сыворотки, антибиотиков, а также коллагеназы (240 ед.актив./ мл Fa. Worthington, NJ) и гиалуронидазой (600 ед.актив./мл, Sigma). Пробирки с пробами помещаются в термостат и инкубируются в течение ночи при 37°С. На следующий день полученная из биоптата суспензия процеживается через стерильное сито (размер пор 70 мкм) и центрифугируется 10 мин при 4000 оборотах в мин. Осадок ресуспензируется в PBS, и проводится подсчет витальных хондроцитов. Жизнеспособность клеток оценивалась с помощью красителя в счетной камере Горяева. Культивирование хондроцитов проводится в инкубаторе при 37°С, 90% влажности и 5% СО2 в культуральных плоскодонных флаконах в среде DMEM, с добавлением 10% FBS, гентамицина 1 г/л и 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты. Смена среды проводится каждые 3 дня. По достижении оптимальной концентрации (60 млн) производится пассирование с использованием 0.25% раствора трипсин-ЭДТА, клетки центрифугируются при 4000 оборотах в мин в течение 10 минут, в результате чего образуется плотный агрегат, который помещается в 6-луночную планшетку в среду DMEM с добавление 20% FBS. В условиях термостата агрегат подвергается мануальной механической стимуляции при помощи стеклянной палочки путем давления. В зависимости от размера агрегата частота механический стимуляции варьируется от ежедневной до 1-2 раз в неделю. Интенсивность «давления» на агрегат контролируется визуально.
Основными недостатками данного метода являются: использование высокодифференцированных хондроцитов артикулярного хряща, у которых потенции пролиферации и дифференцировки и последующего формирования матрикса ограничены; механическое воздействие скорее усиливает процесс диффузии к хондроцитам, чем стимулирует синтетические процессы; кроме того, метод может быть применен только для лечения патологий суставов лошадей.
Задача изобретения - разработать способ получения хондротрансплантата, обладающего способностью к органоспецифической хондрогенной дифференцировке.
Поставленная задача решается за счет того, что культивируют низкодифференцированные хондроциты позвоночника новорожденных мини-свиней в среде RPMI-1640 с добавлением 20% FBS и раствора 1.5% коллагеназы с активностью 240 ЕД/мл; центрифугируют при 2 тыс об/мин, полученный клеточный агрегат культивируют в среде RPMI-1640 с добавлением 10% FBS без мануальной механической стимуляции.
Техническим результатом использования способа получения хондротрансплантата для коррекции процессов роста и дегенеративно-деструктивных изменений хрящевой ткани является предотвращение прогрессирования деформации позвоночника на ранних стадиях процесса; предупреждение развития остеоартроза и остехондроза; сокращение послеоперационного периода, резкое сокращение количества послеоперационных койко-дней и исключение многоэтапных, дорогостоящих операций на позвоночнике и суставах. Замещение дефекта хрящевой ткани органспецифическим трансплантатом позволит купировать развитие остеоартроза, асимметрию роста и остеохондроза на ранних стадиях патологии, что улучшит качество жизни больного.
Технический результат достигается за счет того, что используют пластинки роста тел позвонков новорожденных мини-свиней, которые содержат низкодифференцированные хондробласты с высокой потенцией к органоспецифической дифференцировке; подбирают время инкубирования и концентрацию антибиотика так, чтобы сохранить жизнеспособность выделяемых клеток; используют среду, которая содержит оптимальное количество метаболитов для поддержания жизнеспособности выделяемых клеток; подбирают условия центрифугирования, способствующие максимальному сохранению жизнеспособности выделяемых клеток.
Способ осуществляется следующим образом. Стерильно выделенные пластинки роста тел позвонков новорожденных мини-свиней помещают в раствор Хенкса с канномицином 1 г/л на 5 минут. В условиях ламинарного шкафа, после двукратного промывания в чашке Петри стерильным раствором фосфатного буфера пластинки роста измельчают скальпелем на кусочки 1×1 мм2, которые переносят в пробирки со средой RPMI-1640 с добавлением 20% FBS и раствором 1.5% коллагеназы с активностью 240 ЕД/мл, инкубируют при 37°С в течение 8 часов, объем раствора превышает в 10 раз объем обрабатываемой ткани. Далее, суспензию пропускают через стерильное сито (70 мкм) и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 минут. Клетки ресуспензируют в среде PBS, производят подсчет витальных хондробластов при помощи красителя трипанового синего в счетной камере Горяева. Культивирование изолированных хондробластов производят в инкубаторе при 37°С, при 90% влажности и 5% СО2 в культуральных плоскодонных флаконах в среде RPMI-1640 с добавлением 20% FBS и гентамицином 1 г/л, и аскорбиновой кислотой 50 мг/мл. Среда сменяется через каждые 3 дня. По достижении необходимой концентрации (50-60 млн) производят пассирование клеток с помощью смеси растворов 0,25% трипсина и 0,02% раствора ЭДТА, далее, клетки центрифугируют при 2000 оборотов в мин в течение 10 минут. Клеточный агрегат перемещают в 6-луночный планшет с питательной средой RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, культивируют 4-6 недель. Смену среды осуществляют 2 раза в неделю, с интервалом 2-3 дня до получения хондротрансплантата размером 2×2×2±мм3.
Пример конкретного выполнения способа получения трехмерного хондротрансплантата. Стерильно выделенные пластинки роста тел позвонков из всего позвоночника 7-дневных мини-свиней помещают в раствор Хенкса с канномицином 1 г/л на 5 минут. В условиях ламинарного шкафа, после двукратного промывания в чашке Петри стерильным раствором фосфатного буфера пластинки роста измельчают скальпелем на кусочки 1×1 мм2, которые переносят в пробирки со средой RPMI-1640 с добавлением 20% FBS и раствором 1.5% коллагеназы с активностью 240 ЕД/мл, инкубируют при 37°С в течение 8 часов. Если объем выделенной ткани составляет 5 мл, приливают 50 мл реакционной смеси. Далее, суспензию пропускают через стерильное сито (70 мкм) и центрифугируют при 2000 оборотов в мин в течение 10 минут. Клетки ресуспензируют в среде PBS, выделяют 2 млн витальных хондробластов при помощи красителя трипанового синего в счетной камере Горяева. Культивирование изолированных хондробластов производят в инкубаторе при 37°С, при 90% влажности и 5% СО2 в культуральных плоскодонных флаконах в среде RPMI-1640 с добавлением 20% FBS и гентамицином 1 г/л, и аскорбиновой кислотой 50 мг/мл. Среду сменяют через каждые 3 дня. По достижении необходимой концентрации в 50 млн производят пассирование клеток с помощью смеси растворов 0,25% трипсина и 0,02% раствора ЭДТА, далее, клетки центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 минут. Клеточный агрегат перемещают в 6-луночный планшет с питательной средой RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, культивируют 5 недель. Смену среды осуществляют с интервалом в 3 дня до получения хондротрансплантата размером 2×2×2±мм3.
На чертежах представлено:
Фиг.1 трехмерный хондротрансплантат. Гематоксилин-эозин. 20×40.
Фиг.2 трехмерный хондротрансплантат. Альциановый синий. 20×40.
Фиг.3 трехмерный хондротрансплантат. Иммунохимическая реакция на коллаген 2 типа. 10×20.
Фиг.4. Экспрессия гена агрекана хондроцитами трехмерного хондротрансплантата. Результат мультиплексной ПЦР с праймерами для гена GAPDH (нижняя полоса) и гена агрекана (верхняя полоса). 1 - маркер; 2, 3, 4, - хондроциты трехмерного трансплантата.
Фиг 5. Комплекс Гольджи с развитым ламеллярным и вакуолярным компонентами хондроцитах трехмерного хондротрансплантата; х17000
Полученный трехмерный хондротрансплантат представлен клетками, имеющими фенотип хондроцитов и межклеточным матриксом (Фиг.1) Тканеспецифичность полученного хондротрансплантата характеризует синтез коллагена II типа, сульфатированных гликозаминогликанов, экспрессию гена агрекана и ультраструктурную организацию полученных хондроцитов. Исследование тканеспецифичности трансплантата проводили следующими методиками:
1) окрашивания клеток гистологического среза трехмерного трансплантата альциановым синим (Фиг.2),
2) исследованием типа синтезируемого коллагена - иммуногистохимическая реакция с антителами на коллаген II типа (Фиг.3),
3) исследованием экспрессии гена агрекана хондроцитов трехмерного хондротрансплантата (Фиг.4),
4) методом ультраструктурного анализа (Фиг.5).
Claims (1)
- Способ получения трехмерного хондротрансплантата путем культивирования хондроцитов в питательной среде, отличающийся тем, что пластинки роста новорожденных мини-свиней помещают в раствор Хенкса с канномицином 1 г/л на 5 мин, затем пластинки роста промывают, измельчают, переносят в пробирки со средой RPMI-1640 с добавлением 20% FBS и раствора 1,5% коллагеназы с активностью 240 ЕД/мл, инкубируют при 37°С в течение 8 ч, суспензию центрифугируют при 2000 об/мин 10 мин, изолированные хондробласты культивируют при 37°С, при 90% влажности и 5% СO2 в среде RPMI-1640 с добавлением 20% FBS и гентамицином 1 г/л, и аскорбиновой кислотой 50 мг/мл, по достижению концентрации 50-60 млн проводят пассирование клеток с помощью смеси растворов 0,25% трипсина и 0,02% раствора ЭДТА, далее клетки центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин, затем клеточный агрегат перемещают в планшет с питательной средой RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, культивируют 4-6 недель до получения хондротрансплантата размером 2×2×2±мм3.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2008103109/15A RU2392973C2 (ru) | 2008-01-28 | 2008-01-28 | Способ получения трехмерного хондротрансплантата |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2008103109/15A RU2392973C2 (ru) | 2008-01-28 | 2008-01-28 | Способ получения трехмерного хондротрансплантата |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2008103109A RU2008103109A (ru) | 2009-08-10 |
RU2392973C2 true RU2392973C2 (ru) | 2010-06-27 |
Family
ID=41048933
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2008103109/15A RU2392973C2 (ru) | 2008-01-28 | 2008-01-28 | Способ получения трехмерного хондротрансплантата |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2392973C2 (ru) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2494469C1 (ru) * | 2012-04-02 | 2013-09-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГБУ "ННИИТО" Минздравсоцразвития России) | Способ коррекции дефекта межпозвонкового диска в эксперименте |
RU2574942C1 (ru) * | 2014-11-11 | 2016-02-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. Я.Л. Цивьяна" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ННИИТО им. Я.Л. Цивьяна" Минздрава России) | Способ получения трехмерного остеотрансплантата |
RU2580754C1 (ru) * | 2015-02-25 | 2016-04-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. Я.Л. Цивьяна" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ННИИТО им. Я.Л. Цивьяна" Минздрава России) | Способ восстановления дефекта костной ткани |
-
2008
- 2008-01-28 RU RU2008103109/15A patent/RU2392973C2/ru not_active IP Right Cessation
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2494469C1 (ru) * | 2012-04-02 | 2013-09-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГБУ "ННИИТО" Минздравсоцразвития России) | Способ коррекции дефекта межпозвонкового диска в эксперименте |
RU2574942C1 (ru) * | 2014-11-11 | 2016-02-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. Я.Л. Цивьяна" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ННИИТО им. Я.Л. Цивьяна" Минздрава России) | Способ получения трехмерного остеотрансплантата |
RU2580754C1 (ru) * | 2015-02-25 | 2016-04-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. Я.Л. Цивьяна" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ННИИТО им. Я.Л. Цивьяна" Минздрава России) | Способ восстановления дефекта костной ткани |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2008103109A (ru) | 2009-08-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Bunpetch et al. | Strategies for MSC expansion and MSC-based microtissue for bone regeneration | |
Yin et al. | Induction of mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and functional cartilage microtissue formation for in vivo cartilage regeneration by cartilage extracellular matrix-derived particles | |
US6886568B2 (en) | Method for fabricating cell-containing implants | |
Mauck et al. | Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture | |
Guasti et al. | Chondrogenic differentiation of adipose tissue-derived stem cells within nanocaged POSS-PCU scaffolds: a new tool for nanomedicine | |
US20080318315A1 (en) | Reverse-Flow Perfusion of Three-Dimensional Scaffolds | |
JP6434014B2 (ja) | 球状軟骨細胞治療剤の製造方法 | |
Jorgenson et al. | Production of adult human synovial fluid‐derived mesenchymal stem cells in stirred‐suspension culture | |
Pound et al. | Strategies to promote chondrogenesis and osteogenesis from human bone marrow cells and articular chondrocytes encapsulated in polysaccharide templates | |
CN106834223B (zh) | 诱导脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的方法 | |
RU2392973C2 (ru) | Способ получения трехмерного хондротрансплантата | |
Pulkkinen et al. | Cellulose sponge as a scaffold for cartilage tissue engineering | |
Yuan et al. | Cartilage tissue engineering using combination of chitosan hydrogel and mesenchymal stem cells | |
JP2006314759A (ja) | 移植用軟骨組成物 | |
Cabraja et al. | A 3D environment for anulus fibrosus regeneration | |
Zhang et al. | Microcarrier bioreactor culture system promotes propagation of human intervertebral disc cells | |
RU2006127271A (ru) | Трансплантат для восстановления дефектов соединительной ткани и способ его получения | |
Ghiasi et al. | Use of mesenchymal adult stem cell for cartilage regeneration by hydrogel | |
CN103874763A (zh) | 从胎儿组织制备亲代细胞库 | |
CN216169072U (zh) | 一种分步组装式软骨-骨多孔仿生支架 | |
JP2012000262A (ja) | ヒト軟骨細胞と新規足場材料を用いた軟骨組織の製法 | |
KR20230025801A (ko) | 활막 유래 간엽계 줄기 세포의 제조 방법 및 관절 치료용 세포 제제의 제조 방법 | |
Watson | Tissue engineering for rhinoplasty | |
RU2574942C1 (ru) | Способ получения трехмерного остеотрансплантата | |
WO2023160588A1 (zh) | 一种组织工程软骨颗粒移植物及其制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200129 |