RU2389024C1 - Method of study of cells by means of immunological biochip - Google Patents
Method of study of cells by means of immunological biochip Download PDFInfo
- Publication number
- RU2389024C1 RU2389024C1 RU2008147279/15A RU2008147279A RU2389024C1 RU 2389024 C1 RU2389024 C1 RU 2389024C1 RU 2008147279/15 A RU2008147279/15 A RU 2008147279/15A RU 2008147279 A RU2008147279 A RU 2008147279A RU 2389024 C1 RU2389024 C1 RU 2389024C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- biochip
- bound
- antibodies
- area
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для диагностических целей в гематологии, онкологии и других отраслях медицины, а также в ветеринарии и биологии.The invention relates to medicine and can be used for diagnostic purposes in hematology, oncology and other branches of medicine, as well as in veterinary medicine and biology.
Известен способ исследования клеток с помощью иммунологических биочипов (см. А.В.Шишкин, И.И.Шмырев, С.А.Кузнецова, Н.Г.Овчинина, А.А.Бутылин, Ф.И.Атауллаханов, А.И.Воробьев «Иммунологические биочипы для параллельного определения поверхностных антигенов и морфологического исследования клеток». Биологические мембраны, 2008, том 25, №4, с 277-284), заключающийся в том, что биочип, содержащий иммобилизированные антитела, инкубируют с суспензией клеток. Клетки, имеющие на своей поверхности соответствующие антигены, связываются с антителами, иммобилизированными в строго определенных участках подложки. Затем биочип отмывают от клеток, не связавшихся с иммобилизированными антителами. Отмывка осуществляется путем ополаскивания биочипа буферным раствором. В результате на поверхности биочипа остаются только клетки, связавшиеся с антителами. Затем окрашивают препарат по Романовскому-Гимзе и проводят морфологическое исследование связавшихся клеток. Осуществляют определение плотности связывания клеток в области пятен биочипа. Исходя из ее значений, полученных для каждого пятна, рассчитывают содержание в суспензии клеток, экспрессирующих соответствующие поверхностные антигены. Способ позволяет проводить морфологическое исследование клеток параллельно с определением их поверхностных антигенов и устанавливать содержание в исследуемой суспензии клеток, экспрессирующих определяемые антигены.A known method for the study of cells using immunological biochips (see A.V. Shishkin, I.I. Shmyrev, S.A. Kuznetsova, N.G. Ovchinina, A.A. Butylin, F.I. Ataullakhanov, A.I. . Vorobyov “Immunological biochips for the parallel determination of surface antigens and morphological studies of cells. Biological membranes, 2008, volume 25, No. 4, 277-284), which consists in the fact that the biochip containing immobilized antibodies is incubated with a suspension of cells. Cells having corresponding antigens on their surface bind to antibodies immobilized in strictly defined regions of the substrate. Then the biochip is washed from cells that did not bind to immobilized antibodies. Washing is carried out by rinsing the biochip with a buffer solution. As a result, only cells bound to antibodies remain on the biochip surface. Then the drug is stained according to Romanovsky-Giemsa and a morphological study of the bound cells is carried out. The density of cell binding in the area of the biochip spots is determined. Based on its values obtained for each spot, the content in the suspension of cells expressing the corresponding surface antigens is calculated. The method allows for morphological study of cells in parallel with the determination of their surface antigens and to establish the content in the test suspension of cells expressing the determined antigens.
Недостатком известного способа является недостаточная чувствительность, обусловленная тем, что скорости потока жидкости, возникающие при отмывке биочипа, не регулируются. При слишком высоких скоростях потока возможен отрыв клеток недостаточно прочно, связавшихся с антителами (из-за низкой аффинности антител или низкой экспрессии антигенов на поверхности клетки), что может искажать получаемые результаты. При манипуляциях, выполняемых после завершения отмывки, при смене растворов также возможен отрыв недостаточно прочно связанных клеток. Кроме того, известный способ не предусматривает возможность длительного хранения биочипа со связавшимися клетками и его повторного микроскопического исследования с использованием иммерсионных объективов.The disadvantage of this method is the lack of sensitivity due to the fact that the flow rate of the liquid that occurs when washing the biochip is not regulated. At too high flow rates, the separation of cells that are not strong enough to bind to antibodies is possible (due to the low affinity of antibodies or low expression of antigens on the cell surface), which may distort the results. When manipulations are performed after washing, when changing solutions, it is also possible to detach insufficiently firmly bound cells. In addition, the known method does not provide for the possibility of long-term storage of the biochip with bound cells and its repeated microscopic examination using immersion lenses.
Известен способ исследования клеток с помощью иммунологических биочипов (см. А.В.Шишкин, И.И.Шмырев, С.А.Кузнецова, Н.Г.Овчинина, А.А.Бутылин, Ф.И.Атауллаханов, А.И.Воробьев «Иммунологические биочипы для исследования эритроцитов человека». Биологические мембраны, 2008, том 25, №4, с 267-276), взятый в качестве прототипа, заключающийся в том, что биочип, содержащий иммобилизированные антитела, помещают в проточную камеру и инкубируют с суспензией клеток. Клетки, имеющие на своей поверхности соответствующие антигены, связываются с антителами, иммобилизированными в строго определенных участках подложки. Затем биочип отмывают от не связавшихся с антителами клеток потоком жидкости с заданной скоростью. Скорость потока жидкости может быть подобрана такой, что происходит отрыв только тех клеток, которые не связались с антителами, а клетки, даже слабо связавшиеся с антителами, остаются на поверхности биочипа. Наличие связавшихся клеток устанавливается путем просмотра пятен биочипа с помощью микроскопа.A known method for the study of cells using immunological biochips (see A.V. Shishkin, I.I. Shmyrev, S.A. Kuznetsova, N.G. Ovchinina, A.A. Butylin, F.I. Ataullakhanov, A.I. . Vorobyov “Immunological biochips for the study of human red blood cells. Biological membranes, 2008, volume 25, No. 4, 267-276), taken as a prototype, which consists in the fact that the biochip containing immobilized antibodies is placed in a flow chamber and incubated with a suspension of cells. Cells having corresponding antigens on their surface bind to antibodies immobilized in strictly defined regions of the substrate. Then, the biochip is washed from cells that do not bind to antibodies with a fluid flow at a given speed. The fluid flow rate can be selected such that only those cells that do not bind to antibodies are detached, and cells that even bind weakly to antibodies remain on the surface of the biochip. The presence of bound cells is established by viewing the biochip spots with a microscope.
Недостатком известного способа является отрыв клеток (всех или части) с поверхности биочипа при заполнении капилляра проточной камеры воздухом, необходимом для извлечения биочипа. Отрыв клеток происходит на границе между воздухом и жидкостью. Это делает невозможным окрашивание связавшихся с биочипом клеток способами, используемыми для дальнейшего морфологического исследования и требующими предварительного высушивания биочипа и проведения фиксации (например, по Романовскому-Гимзе). По этой же причине считывание результата и осуществление микроскопического исследования связавшихся клеток может осуществляться только при нахождении биочипа в проточной камере. Окрашивание связавшихся с биочипом клеток другими способами, пригодными только для их ориентировочного исследования (например, путем инкубации с раствором метиленового синего) непосредственно в проточной камере приводит к адсорбции красителя (или иных веществ, используемых в процессе окраски), что нарушает ее прозрачность. Это исключает или, по меньшей мере, затрудняет ее повторное использование. Кроме того, известный способ не позволяет осуществлять хранение биочипа, находящегося в заполненной жидкостью проточной камере, более нескольких часов после проведения анализа. При более длительном хранении происходит гибель клеток и их разрушение, что исключает повторное исследование в спорных случаях.The disadvantage of this method is the separation of cells (all or parts) from the surface of the biochip when filling the capillary of the flow chamber with the air necessary to extract the biochip. Detachment of cells occurs at the boundary between air and liquid. This makes it impossible to stain cells bound to the biochip by methods used for further morphological studies and requiring preliminary drying of the biochip and fixation (for example, according to Romanovsky-Giemsa). For the same reason, reading the result and performing microscopic examination of the bound cells can only be carried out when the biochip is in the flow chamber. Staining of cells bound to the biochip by other methods suitable only for their approximate study (for example, by incubation with a solution of methylene blue) directly in the flow chamber leads to the adsorption of dye (or other substances used in the staining process), which violates its transparency. This eliminates or at least complicates its reuse. In addition, the known method does not allow storage of a biochip located in a fluid-filled flow chamber for more than several hours after analysis. With longer storage, cell death and destruction occurs, which precludes re-examination in controversial cases.
Все вышеперечисленное не позволяет проводить исследование биочипа вне проточной камеры, не позволяет проводить морфологическое исследование и идентифицировать клетки, связавшихся в области пятен биочипа (что в ряде случаев приводит к ошибкам при интерпретации результата), не позволяет длительно сохранять биочип после проведения анализа для его повторного исследования в спорных случаях.All of the above does not allow the biochip to be studied outside the flow chamber, does not allow morphological studies and identifies cells that have contacted in the area of the biochip spots (which in some cases leads to errors in the interpretation of the result), does not allow the biochip to be stored for a long time after analysis for repeated research in controversial cases.
Задачей заявленного изобретения является повышение надежности и точности способа, повышение информативности получаемых результатов, при сохранении чувствительности анализа.The objective of the claimed invention is to increase the reliability and accuracy of the method, increase the information content of the results, while maintaining the sensitivity of the analysis.
Поставленная задача решается за счет того, что согласно способа исследования клеток с помощью иммунологического биочипа, включающего инкубирование биочипа, содержащего иммобилизированные антитела, с суспензией клеток, отмывку биочипа от не связавшихся клеток, считывание и анализ полученного результата, после завершения отмывки биочипа от не связавшихся с антителами клеток, биочип обрабатывают одним или несколькими растворами, содержащими одно или несколько веществ, вызывающих повышение прочности связывания клеток с поверхностью биочипа, окрашивают связавшиеся клетки, из биочипа приготовляют долговременный препарат для микроскопических исследований, проводят исследование связанных с биочипом клеток.The problem is solved due to the fact that according to the method of researching cells using an immunological biochip, including incubating a biochip containing immobilized antibodies with a suspension of cells, washing the biochip from unbound cells, reading and analyzing the result after washing the biochip from unrelated cell antibodies, the biochip is treated with one or more solutions containing one or more substances that increase the binding strength of cells to the surface of the bi chip, stain the bound cells from the biochip prepared a long-term preparation for microscopic studies, carry out research related to the biochip cells.
Осуществляют морфологическое исследование связавшихся клеток.A morphological study of the bound cells is carried out.
Осуществляют морфометрическое исследование связавшихся клеток.A morphometric study of the bound cells is carried out.
Дополнительно обрабатывают связавшиеся клетки меченными антителами или смесью антител, меченных различными метками, биочип подвергают исследованию, позволяющему установить наличие метки (одной или нескольких) у той или иной связавшейся клетки и (или) оценить накопление метки в различных участках поверхности биочипа.Additionally, the bound cells are treated with labeled antibodies or a mixture of antibodies labeled with various labels, the biochip is subjected to a study, which allows to establish the presence of a label (one or several) in one or another associated cell and (or) to evaluate the accumulation of the label in different parts of the surface of the biochip.
Клетки, связавшиеся с биочипом, обрабатывают растворами одного или нескольких веществ, молекулы которых включают метку, либо сами обладают свойствами метки, не являющихся антителами, но способных связываться с определенными молекулами, присутствующими внутри клетки или на ее поверхности.Cells bound to the biochip are treated with solutions of one or more substances, the molecules of which include a label, or they themselves have label properties that are not antibodies, but are able to bind to certain molecules present inside the cell or on its surface.
Определяют плотность связывания клеток в области пятен биочипа, исходя из чего устанавливают содержание в исследуемой суспензии клеток, имеющих определяемые поверхностные антигены.The density of cell binding in the area of the biochip spots is determined, on the basis of which the content in the test suspension of cells having detectable surface antigens is determined.
Осуществляют мечение клеток и определяют плотность их связывания в области тех или иных участков поверхности биочипа по степени накопления метки.Label cells and determine the density of their binding in the region of certain parts of the biochip surface by the degree of label accumulation.
В исследуемых участках поверхности биочипа определяют число клеток, имеющих какой-либо отличительный признак или совокупность признаков, и определяют долю таких клеток от числа клеток, связавшихся в данном участке поверхности биочипа или от максимально возможного числа клеток, способного связаться при данных условиях на участке поверхности с данной площадью, или от числа клеток, характеризуемых по иному критерию.In the studied areas of the surface of the biochip, the number of cells having any distinguishing feature or set of features is determined, and the fraction of such cells from the number of cells that bind in a given area of the surface of the biochip or from the maximum possible number of cells capable of contacting, under given conditions, on the surface given area, or the number of cells characterized by a different criterion.
При проведении эксперимента используют дополнительные контрольные биочипы (один или несколько), на которых иммобилизированы антитела, имеющие специфичность к другим эпитопам антигенов, выявляемых с помощью первого биочипа.During the experiment, additional control biochips (one or several) are used, on which antibodies immobilized having specificity for other epitopes of antigens detected by the first biochip are immobilized.
Для анализа одного и того же образца клеточной суспензии используют комплекс из нескольких биочипов, которые окрашивают различными способами, пригодными для проведения морфологического исследования связавшихся клеток.To analyze the same sample of a cell suspension, a complex of several biochips is used, which are stained in various ways, suitable for morphological studies of bound cells.
Проводят дополнительные отмывки биочипа.Spend additional washing biochip.
Перед проведением окрашивания осуществляют фиксацию связавшихся клеток.Before staining, fixation of bound cells is carried out.
На биочип или изготовленный из него долговременный препарат наносят разметку, облегчающую нахождение нужных пятен.A biochip or a long-term preparation made from it is marked, making it easier to find the right spots.
При считывании результата осуществляют сканирование поверхности биочипа с определением локализации каждой связавшейся клетки в двухмерной системе координат для установления принадлежности определяемых морфологических и (или) морфометрических и (или) иных признаков каждой конкретной клетке, связавшейся с биочипом.When reading the result, the surface of the biochip is scanned to determine the localization of each associated cell in a two-dimensional coordinate system to establish the belonging of the determined morphological and (or) morphometric and (or) other signs to each specific cell associated with the biochip.
Использование заявленного способа позволяет предотвратить отрыв клеток при извлечении биочипа из проточной камеры. Это позволяет осуществлять окрашивание связанных с биочипом клеток при сохранении высокой чувствительности анализа. При этом окрашивание связанных с биочипом клеток может осуществляться вне проточной камеры, что исключает химическое повреждение последней и адсорбцию на ее внутренней поверхности красителей и других используемых веществ. Приготовление из биочипа долговременного препарата позволяет многократно осуществлять морфологическое исследование связанных клеток с использованием иммерсионных объективов без загрязнения последних и без повреждения поверхности биочипа и связанных на ней клеток. Такой подход является весьма полезным, например, в тех случаях, когда для верной интерпретации результата может потребоваться просмотр препарата несколькими специалистами. Кроме того, этот подход позволяет проводить сравнительное морфологическое исследование клеток одного и того же больного подвергнутых анализу с помощью биочипов в разное время. Это может оказаться весьма полезным, например, для оценки динамики развития заболевания или для оценки результатов лечения. Приготовление долговременного препарата позволяет хранить биочип неограниченное время и делает его намного более устойчивым к различным повреждениям.Using the claimed method allows to prevent separation of cells when removing the biochip from the flow chamber. This allows staining of cells associated with the biochip while maintaining high sensitivity analysis. Moreover, staining of cells associated with the biochip can be carried out outside the flow chamber, which eliminates the chemical damage of the latter and adsorption of dyes and other substances used on its inner surface. The preparation of a long-term preparation from a biochip allows a morphological study of coupled cells to be carried out repeatedly using immersion lenses without contaminating the latter and without damaging the surface of the biochip and cells connected to it. This approach is very useful, for example, in cases where for the correct interpretation of the result it may be necessary to view the drug by several specialists. In addition, this approach allows a comparative morphological study of the cells of the same patient to be analyzed using biochips at different times. This can be very useful, for example, for assessing the dynamics of a disease or for evaluating treatment outcomes. Preparation of a long-term preparation allows storing the biochip for an unlimited time and makes it much more resistant to various damages.
Параллельно с определением поверхностных антигенов клеток может осуществляться не только морфологическое, но и морфометрическое исследование связавшихся клеток, что существенно повышает ценность информации получаемой при использовании данного способа в исследовательских целях.In parallel with the determination of surface cell antigens, not only morphological, but also morphometric studies of bound cells can be carried out, which significantly increases the value of the information obtained when using this method for research purposes.
Для выявления коэкспрессии антигенов может осуществляться дополнительное исследование связавшихся клеток с помощью меченных антител. При этом за счет связывания клеток в области пятен биочипа при проведении такого исследования на каждой клетке определяется на 1 антиген больше. При использовании нескольких видов антител, меченных различными метками возможно определение большего числа антигенов на каждой клетке. Обработка биочипа со связавшимися клетками меченными антителами может осуществляться непосредственно в проточной камере, либо вне ее. При использовании проточных камер с малым внутренним объемом расходование меченных антител осуществляется более экономно. В том случае, если обработка биочипа раствором меченных антител (с последующей отмывкой) производится после обработки биочипа раствором веществ, повышающих прочность связывания клеток с подложкой, потери чувствительности анализа не происходит. Это достигается за счет того, что предотвращается отрыв клеток с поверхности биочипа при выполнении различных манипуляций.To detect coexpression of antigens, an additional study of bound cells using labeled antibodies can be carried out. Moreover, due to the binding of cells in the area of the biochip spots during such a study, 1 more antigen is determined on each cell. When using several types of antibodies labeled with different labels, it is possible to determine a larger number of antigens on each cell. The processing of the biochip with bound cells with labeled antibodies can be carried out directly in the flow chamber or outside it. When using flow chambers with a small internal volume, the consumption of labeled antibodies is more economical. If the biochip is treated with a solution of labeled antibodies (followed by washing) after processing the biochip with a solution of substances that increase the binding strength of cells to the substrate, the analysis does not lose sensitivity. This is achieved due to the fact that the separation of cells from the surface of the biochip is prevented when performing various manipulations.
Помимо меченных антител могут использоваться другие меченные вещества (одно или несколько), способные связываться с молекулами присутствующими внутри клетки или на ее поверхности (например, могут быть использованы меченные молекулы различных лигандов для определения способных связываться с ними рецепторов). Могут использоваться вещества, обладающие свойствами метки и способные связываться с определенными веществами, молекулы которых присутствуют внутри клетки, либо на ее поверхности (например, флюоресцентный краситель акридиновый оранжевый, способный связываться с ДНК). Это открывает широкие возможности для использования предлагаемого способа в исследовательских целях.In addition to labeled antibodies, other labeled substances (one or more) can be used that are able to bind to the molecules present inside the cell or on its surface (for example, labeled molecules of various ligands can be used to determine the receptors that can bind to them). Substances with labeling properties and capable of binding to certain substances whose molecules are present inside the cell or on its surface (for example, acridine orange fluorescent dye capable of binding to DNA) can be used. This opens up wide possibilities for using the proposed method for research purposes.
Исходя из величины плотности связывания клеток в области пятен биочипа, может осуществляться определение содержания в исследуемой суспензии клеток, экспрессирующих определяемые антигены. В зависимости от целей анализа и используемого способа определения и оценки плотности связывания клеток в области пятен биочипа может проводиться качественное, полуколичественное или количественное определение содержания в исследуемой суспензии клеток экспрессирующих данные антигены. Возможно использование любых способов определения плотности связывания клеток в области пятен биочипа. Могут быть применены способы, использующие прямой подсчет клеток в области заданных участков поверхности биочипа. Могут быть использованы непрямые способы, при которых осуществляется оценка изменения тех или иных свойств данных участков поверхности биочипа, зависящих от плотности связывания клеток. Может быть использовано мечение клеток (до инкубации с биочипом или после ее завершения) каким-либо способом и проведена оценка плотности связывания клеток по степени накопления метки в исследуемых участках биочипа. Любой из этапов проведения анализа, считывания и обработки его результатов может быть автоматизирован.Based on the value of the cell binding density in the area of the biochip spots, the content of cells expressing the determined antigens in the test suspension can be determined. Depending on the purpose of the analysis and the method used to determine and evaluate the density of cell binding in the area of the biochip spots, a qualitative, semi-quantitative or quantitative determination of the content of expressing these antigens in the test suspension of cells can be carried out. Any method for determining the density of cell binding in the area of the biochip spots can be used. Methods using direct cell counting in the region of predetermined sections of the surface of the biochip can be applied. Indirect methods can be used in which the change in certain properties of these sections of the surface of the biochip is evaluated, depending on the density of cell binding. Cell labeling can be used (before incubation with the biochip or after its completion) in any way and the density of cell binding is estimated by the degree of label accumulation in the studied areas of the biochip. Any of the stages of analysis, reading and processing of its results can be automated.
Проведение морфологического, морфометрического, иммунофлюоресцентного (иммуноцитохимического) или иного дополнительного исследования связавшихся клеток и подсчет клеток, имеющих те или иные признаки, позволяют определять их долю от числа клеток связавшихся на участках с заданной площадью или от максимально возможного числа клеток, способного связаться на участке поверхности пятна заданной площади или от числа клеток, характеризуемых по какому-либо иному критерию. Это делает предлагаемый способ весьма полезным при исследовании клеточных субпопуляций, различающихся по иммунологическим, морфологическим, морфометрическим или иным признакам. При этом возможно определение содержания в исследуемой суспензии клеток, относящихся к различным субпопуляциям.Conducting morphological, morphometric, immunofluorescence (immunocytochemical) or other additional studies of bound cells and counting cells having certain signs allow one to determine their fraction from the number of cells bound in areas with a given area or from the maximum possible number of cells capable of contacting on a surface area spots of a given area or the number of cells characterized by any other criterion. This makes the proposed method very useful in the study of cell subpopulations that differ in immunological, morphological, morphometric or other characteristics. In this case, it is possible to determine the content in the test suspension of cells belonging to various subpopulations.
При проведении анализа одного и того же образца могут быть использованы дополнительные контрольные биочипы (один или несколько), содержащие антитела, специфичные к другим эпитопам антигенов, выявляемых с помощью первого биочипа. Сравнение результатов, получаемых с помощью основного и контрольных биочипов, позволяют исключить ошибки, связанные с перекрестной реактивностью антител, а также ошибки, связанные с потерей активности используемых антител.When analyzing the same sample, additional control biochips (one or several) containing antibodies specific to other epitopes of antigens detected by the first biochip can be used. Comparison of the results obtained using the main and control biochips allows us to exclude errors associated with the cross-reactivity of antibodies, as well as errors associated with the loss of activity of the antibodies used.
Для анализа одного и того же образца клеточной суспензии может быть использован комплекс из нескольких биочипов, которые окрашивают различными способами, пригодными для последующего проведения морфологического исследования связавшихся клеток. Это позволяет добиться большей точности и информативности анализа. В спорных случаях это поможет исключить возможные ошибки результатов морфологического исследования.For analysis of the same sample of cell suspension, a complex of several biochips can be used, which are stained with various methods suitable for subsequent morphological studies of bound cells. This allows you to achieve greater accuracy and informative analysis. In disputed cases, this will help to eliminate possible errors in the results of morphological studies.
Для получения адекватных результатов исследования после выполнения определенных этапов анализа, например после выполнения обработки меченными антителами или после обработки красителем необходимо выполнение отмывок биочипа.To obtain adequate research results after performing certain stages of the analysis, for example, after processing with labeled antibodies or after dyeing, it is necessary to wash the biochip.
При использовании для окрашивания связавшихся клеток некоторых методик, например при проведении окраски по Романовскому-Гимзе, для достижения наилучших результатов необходимо проведение фиксации, которая осуществляется путем обработки биочипа определенными веществами, например метанолом.When using certain techniques for staining bound cells, for example, when performing Romanovsky-Giemsa staining, for best results, fixation is necessary, which is carried out by treating the biochip with certain substances, for example methanol.
На биочип или изготовленный из него долговременный препарат может быть нанесена разметка, облегчающая нахождение и идентификацию пятен, и позволяющая избежать возможных ошибок, например, при неавтоматизированном считывании результата.A marking can be applied to the biochip or a long-term preparation made from it, making it easier to find and identify spots, and to avoid possible errors, for example, with the automatic reading of the result.
При считывании результата может осуществляться сканирование поверхности биочипа с определением локализации каждой связавшейся клетки в двухмерной системе координат. Это позволяет установить принадлежность определяемых морфологических и (или) морфометрических и (или) иных признаков каждой конкретной клетке, связавшейся с биочипом, и провести ее идентификацию. При компьютерной обработке полученных данных и проведении статистического анализа значительно повышается точность исследования и его информативность.When reading the result, the biochip surface can be scanned to determine the localization of each associated cell in a two-dimensional coordinate system. This allows you to establish the affiliation of the determined morphological and (or) morphometric and (or) other characters to each specific cell associated with the biochip, and to carry out its identification. When computer processing the data and conducting statistical analysis, the accuracy of the study and its information content are significantly increased.
Предлагаемый способ может использоваться в различных модификациях, пригодных как для клинических скрининговых исследований, так и для решения научно-исследовательских задач различного уровня сложности.The proposed method can be used in various modifications, suitable for clinical screening studies, as well as for solving research problems of various levels of complexity.
Заявленный способ поясняется микрофотографиями (фиг.1-3).The claimed method is illustrated by microphotographs (Fig.1-3).
На фиг.1 представлены микрофотографии пятна биочипа с антителами анти-CD45. Биочип находится в проточной камере. Проведена инкубация с раствором антител анти-CD16, меченными флюоресцеина изотиоцианатом (FITC). а) Микрофотография выполнена при обычном освещении. б) Микрофотография выполнена при ультрафиолетовом освещении. 8% клеток флюоресцируют, следовательно, они экспрессируют не только антигены CD45, но и антигены CD16.1 shows micrographs of a biochip stain with anti-CD45 antibodies. The biochip is located in the flow chamber. Incubation was performed with an anti-CD16 antibody solution labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC). a) A microphotograph was taken under ordinary lighting. b) The microphotograph was taken under ultraviolet light. 8% of the cells fluoresce, therefore, they express not only CD45 antigens, but also CD16 antigens.
На фиг.2 представлены микрофотографии, демонстрирующие разную плотность связывания клеток в области пятен биочипа с различными антителами. Приводятся примеры определения в исследуемой суспензии процентного содержания клеток, экспрессирующих определяемые антигены, исходя из значений плотности связывания. Инкубация биочипа осуществлялась с суспензией лейкоцитов здорового человека без подачи потока жидкости и перемешивания. После отмывки от несвязавшихся клеток и последующей инкубации с раствором, содержащим соли кальция, и отмывки от него биочип извлечен из проточной камеры и окрашен по Романовскому-Гимзе. Для большей точности плотность связывания клеток определена путем прямого подсчета клеток на участках поверхности пятна заданной площади. Увеличение в 50 раз а) пятно с антителами анти-С045 (плотность связывания клеток 12000 кл/мм2, принимается за 100%, так как антиген CD45 экспрессируют все лейкоциты), б) пятно с антителами анти-CD8 (плотность связывания 2100 кл/мм2. Содержание CD8+ клеток в суспензии =2100/12000×100%=17,5%).Figure 2 presents microphotographs showing different cell binding densities in the area of the biochip stains with various antibodies. Examples are given of determining the percentage of cells expressing detectable antigens in a suspension under study based on binding densities. The biochip was incubated with a suspension of white blood cells from a healthy person without a fluid stream and stirring. After washing from unbound cells and subsequent incubation with a solution containing calcium salts, and washing from it, the biochip was removed from the flow chamber and stained according to Romanovsky-Giemsa. For greater accuracy, the density of cell binding was determined by direct counting of cells in areas of the spot surface of a given area. A 50-fold increase in a) a spot with anti-C045 antibodies (cell binding density of 12,000 cells / mm 2 is taken as 100%, since all leukocytes express CD45 antigen), b) a spot with anti-CD8 antibodies (binding density of 2100 cells / mm 2. The content of CD8 + cells in suspension = 2100/12000 × 100% = 17.5%).
На фиг.3 представлены микрофотографии, демонстрирующие возможность выполнения морфологического исследования клеток, связавшихся в области пятен биочипов. Представленные микрофотографии пятен получены при исследовании трех разных образцов клинического материала. Окраска по Романовскому-Гимзе, увеличение в 1000 раз, а) бласты больного острым В-лимфобластным лейкозом (В-ОЛЛ), связавшиеся в области пятна с антителами анти-CD19, б) лимфоциты больного хроническим В-лимфолейкозом (В-ХЛЛ), связавшиеся в области пятна с антителами анти-CD5, в) различные лейкоциты здорового человека, связавшиеся в области пятна с антителами анти-CD45.Figure 3 presents microphotographs demonstrating the ability to perform morphological studies of cells bound in the area of biochip spots. The presented micrographs of the spots were obtained by examining three different samples of clinical material. Romanovsky-Giemsa staining, a 1000-fold increase, a) blasts of the patient with acute B-lymphoblastic leukemia (B-ALL), bound in the spot region with anti-CD19 antibodies, b) lymphocytes of the patient with chronic B-lymphocytic leukemia (B-CLL), bound in the spot region with anti-CD5 antibodies, c) various white blood cells of a healthy person, bound in the spot region with anti-CD45 antibodies.
На фиг.4 представлена микрофотография участка поверхности биочипа, выполненная при ультрафиолетовом освещении (флюоресцентная микроскопия), увеличение в 25 раз. Биочип инкубировался с лейкоцитами, выделенными из крови больного хроническим В-лимфолейкозом (преобладают В-лимфоциты опухоли, в значительно меньшем количестве содержатся нормальные Т- и В-лимфоциты и миелоидные клетки). В различных пятнах биочипа содержатся те или иные из перечисленных клеток. Биочип обработан антителами анти-CD19, меченными флюоресцеина изотиоционатом (FITC). Антиген CD19 присутствует на поверхности нормальных и опухолевых В-лимфоцитов. Хорошо видна флюоресценция тех пятен биочипа, где связались В-лимфоциты. Разная яркость пятен свидетельствует о разной плотности связывания В-лимфоцитов в различных пятнах биочипа.Figure 4 presents a micrograph of the surface area of the biochip, performed under ultraviolet light (fluorescence microscopy), an increase of 25 times. The biochip was incubated with leukocytes isolated from the patient’s blood with chronic B-lymphocytic leukemia (tumor B-lymphocytes predominate, normal T- and B-lymphocytes and myeloid cells are much smaller). Various spots of the biochip contain one or another of the listed cells. The biochip is treated with anti-CD19 antibodies labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC). The CD19 antigen is present on the surface of normal and tumor B-lymphocytes. The fluorescence of those biochip spots where B-lymphocytes bind is clearly visible. The different brightness of the spots indicates a different density of B-lymphocyte binding in different spots of the biochip.
На фиг.5 представлены результаты определения с помощью биочипа процентного содержания клеток, экспрессирующих различные антигены. Клетки больного К., 70 лет. Диагноз хронический В-лимфолейкоз (В-ХЛЛ).Figure 5 presents the results of determination using a biochip of the percentage of cells expressing various antigens. Cells of patient K., 70 years old. The diagnosis of chronic B-lymphocytic leukemia (B-CLL).
На фиг.6 представлены результаты определения с помощью биочипа процентного содержания клеток, экспрессирующих различные антигены. Клетки больной Б., 21 год. Диагноз острый В-лимфобластный лейкоз (В-ОЛЛ).Figure 6 presents the results of determining with a biochip the percentage of cells expressing various antigens. Cells of patient B., 21 years old. The diagnosis of acute B-lymphoblastic leukemia (B-ALL).
Заявленный способ осуществляется следующим образом. Биочип инкубируют с исследуемой клеточной суспензией. Клетки оседают на его поверхность и приходят в контакт с антителами, иммобилизированными в строго определенных участках. Если клетки имеют соответствующие поверхностные антигены, происходит их связывание в данных участках (пятнах) поверхности биочипа. Затем осуществляют отмывку биочипа для устранения клеток, не связавшихся с антителами. Отмывка биочипа может осуществляться в проточной камере (см. А.В.Шишкин, И.И.Шмырев, С.А.Кузнецова, Н.Г.Овчинина, А.А.Бутылин, Ф.И.Атауллаханов, А.И.Воробьев «Иммунологические биочипы для исследования эритроцитов человека». Биологические мембраны, 2008, том 25, №4, с 267-276). При этом биочип закрепляется в проточной камере до начала осуществления анализа, а предшествующая отмывке инкубация биочипа с клеточной суспензией осуществляется непосредственно в ней. После завершения отмывки в области пятен биочипа остаются связанными только те клетки, которые имеют соответствующие поверхностные антигены (фиг.1а, фиг.2).The claimed method is as follows. The biochip is incubated with the test cell suspension. Cells settle on its surface and come into contact with antibodies immobilized in strictly defined areas. If the cells have corresponding surface antigens, they bind in these areas (spots) of the biochip surface. Then, the biochip is washed to eliminate cells that are not bound to antibodies. The biochip can be washed in a flow chamber (see A.V. Shishkin, I.I. Shmyrev, S.A. Kuznetsova, N.G. Ovchinina, A.A. Butylin, F.I. Ataullakhanov, A.I. Vorobiev, “Immunological biochips for the study of human red blood cells.” Biological membranes, 2008, Volume 25, No. 4, pp. 267-276). In this case, the biochip is fixed in the flow chamber before the start of the analysis, and the incubation of the biochip with the cell suspension preceding the washing is carried out directly in it. After washing in the area of the biochip spots, only those cells that have the corresponding surface antigens (Fig. 1a, Fig. 2) remain bound.
После завершения отмывки от не вязавшихся с антителами клеток осуществляется обработка биочипа растворами веществ, повышающими прочность связывания оставшихся клеток с его поверхностью. Для этого может быть использована, например, питательная среда RPMI-1640, содержащая соли кальция и магния (ионы кальция и магния участвуют в процессах адгезии клеток к твердым поверхностям). Использование данного подхода способствует также лучшему распластыванию клеток по поверхности подложки, что в дальнейшем положительно влияет на качество краски клеток.After washing is completed from cells that do not adhere to antibodies, the biochip is treated with solutions of substances that increase the binding strength of the remaining cells to its surface. For this, RPMI-1640 nutrient medium containing calcium and magnesium salts can be used, for example (calcium and magnesium ions are involved in cell adhesion to solid surfaces). Using this approach also contributes to better spreading of cells on the surface of the substrate, which subsequently positively affects the quality of cell paint.
По факту связывания в области того или иного пятна биочипа на каждой отдельно взятой клетке определяется экспрессия одного антигена. В случае, если на каждой клетке необходимо определение экспрессии 2 антигенов, биочип инкубируют с флюоресцентно-меченными антителами, специфичными к дополнительно определяемому антигену. Этот этап удобнее проводить при нахождении биочипа в проточной камере. Раствор меченных антител вводится непосредственно в капилляр. Если на каждой клетке необходимо определить коэкспрессию большего числа антигенов используется раствор, содержащий несколько видов антител с разной специфичностью, меченных разными флюорохромами. Биочип инкубируют с меченными антителами в течение заданного времени (которое зависит от концентрации антител и подбирается экспериментально, обычно находится в пределах 10-60 минут), после чего производят его отмывку для устранения антител, не пришедших во взаимодействие с антигенами клеток. Затем в различных участках биочипа (в пятнах и фоновых участках) определяют наличие клеток, флюоресцирующих в заданной части спектра, и определяют их количество на участках заданной площади (фиг.1б). (Биочип при этом находится в проточной камере или может быть извлечен из нее). Данная задача может быть решена различными способами, например биочип может быть просмотрен под флюоресцентным микроскопом с использованием светофильтров, позволяющих обнаружить флюоресценцию использованных флюорохромных меток. При этом может быть проведено определение количества клеток, имеющих флюоресцентную метку и оценена выраженность экспрессии определяемых антигенов на каждой клетке по интенсивности флюоресценции метки. Также могут быть получены микрофотографии пятен биочипа и фоновых участков или фотографии всей поверхности биочипа (фиг.4). В каждом из участков поверхности может быть определено количество клеток, имеющих флюоресценцию в заданной части спектра. При этом при обработке изображения, по яркости соответствующих участков фотографии может быть оценена интенсивность флюоресценции отдельных клеток или целых участков биочипа, содержащих большое количество клеток. При анализе изображения клеток по расположению флюоресцирующих участков может осуществляться определение локализации дополнительно выявляемых антигенов (например, поверхностная, цитоплазматическая, ядерная локализация). Использование иммунофлюоресцентного мечения связавшихся с биочипом клеток может быть использовано также для оценки специфичности связывания, что требуется в некоторых случаях. По сравнению с иммунофлюоресцентными методами при окраске флюоресцентно-меченными антителами клеток, связавшихся на биочипе, на любой из клеток можно определять на один антиген больше за счет ее связывания в области того или иного пятна биочипа.Upon the fact of binding in the region of one or another spot of the biochip, the expression of one antigen is determined on each individual cell. If it is necessary to determine the expression of 2 antigens on each cell, the biochip is incubated with fluorescently-labeled antibodies specific for the additionally determined antigen. This stage is more convenient to carry out when the biochip is in the flow chamber. A solution of labeled antibodies is introduced directly into the capillary. If it is necessary to determine coexpression of a larger number of antigens on each cell, a solution containing several types of antibodies with different specificity labeled with different fluorochromes is used. The biochip is incubated with labeled antibodies for a predetermined time (which depends on the concentration of antibodies and is selected experimentally, usually within 10-60 minutes), after which it is washed to eliminate antibodies that did not come into contact with cell antigens. Then, in various parts of the biochip (in spots and background areas), the presence of cells fluorescent in a given part of the spectrum is determined, and their number in areas of a given area is determined (Fig. 1b). (The biochip is in this case in the flow chamber or can be removed from it). This problem can be solved in various ways, for example, a biochip can be viewed under a fluorescence microscope using light filters that detect the fluorescence of the used fluorochrome labels. In this case, the number of cells having a fluorescent label can be determined and the expression of the determined antigens on each cell expressed by the intensity of the fluorescence of the label. Microphotographs of biochip spots and background areas or photographs of the entire surface of the biochip can also be obtained (Fig. 4). In each of the surface sections, the number of cells having fluorescence in a given part of the spectrum can be determined. Moreover, when processing the image, the brightness of the corresponding sections of the photograph can be estimated fluorescence intensity of individual cells or entire sections of the biochip containing a large number of cells. When analyzing the image of cells by the location of the fluorescent sites, the localization of additionally detected antigens can be determined (for example, surface, cytoplasmic, nuclear localization). The use of immunofluorescence labeling of cells bound to the biochip can also be used to assess the specificity of binding, which is required in some cases. Compared with immunofluorescence methods, when fluorescently-labeled antibodies are stained with cells bound on the biochip, one of the cells can be determined by one more antigen due to its binding in the region of one or another spot of the biochip.
Помимо описанного выше варианта определения коэкспрессии антигенов на связавшихся с биочипом клетках путем прямого окрашивания меченными антителами может быть использовано непрямое иммунофлюоресцентное окрашивание (см. «Микроскопическая техника. Руководство для врачей и лаборантов». Под редакцией Д.С.Саркисова и Ю.Л.Петрова. М.: «Медицина», 1996 г., с.125-179). Может также быть использована обработка связавшихся клеток антителами с радиоизотопной меткой (см. «Микроскопическая техника. Руководство для врачей и лаборантов». Под редакцией Д.С.Саркисова и Ю.Л.Петрова. М.: «Медицина», 1996 г., с.253-271). При этом регистрацию результата осуществляют с помощью радиоавтографии (для чего, например, помещают биочип на фотопластинку, выдерживают необходимое время, после чего пластинку проявляют и исследуют). В указанных случаях на каждой из связавшихся с биочипом клеток дополнительно может быть выявлена экспрессия только одного антигена. Может быть использовано прямое или непрямое иммуноцитохимическое окрашивание связавшихся с биочипом клеток (см. «Микроскопическая техника. Руководство для врачей и лаборантов». Под редакцией Д.С.Саркисова и Ю.Л.Петрова. М.: «Медицина», 1996 г., с.125-179).In addition to the option described above for determining coexpression of antigens on biochip-bound cells by direct staining with labeled antibodies, indirect immunofluorescence staining can be used (see “Microscopic technique. Guide for doctors and laboratory assistants.” Edited by D. S. Sarkisov and Yu. L. Petrova M.: “Medicine”, 1996, p.125-179). Can also be used to treat bound cells with antibodies with a radioisotope tag (see. "Microscopic technique. A guide for doctors and laboratory assistants." Edited by D. S. Sarkisov and Yu. L. Petrova. M .: "Medicine", 1996, p. 253-271). In this case, the result is recorded using radioautography (for which, for example, a biochip is placed on a photographic plate, the required time is maintained, after which the plate is developed and examined). In these cases, on each of the cells bound to the biochip, the expression of only one antigen can be additionally detected. Direct or indirect immunocytochemical staining of cells bound to the biochip can be used (see. "Microscopic technique. Manual for doctors and laboratory assistants." Edited by D.S. Sarkisov and Yu.L. Petrov. M.: "Medicine", 1996. p. 125-179).
В некоторых случаях определение коэкспрессии антигенов может не требоваться. При этом описанный выше этап проведения анализа опускают.In some cases, coexpression of antigens may not be required. At the same time, the analysis step described above is omitted.
Затем биочип извлекают из проточной камеры (если он не был извлечен из нее на предыдущем этапе) и высушивают. Высушивание биочипа может осуществляться, например, за счет испарения воды или, что более предпочтительно, с помощью устройства, использующего удаление капель с поверхности за счет центробежной силы (например, центрифуги, на роторе которой закрепляется биочип). Перед окрашиванием может быть осуществлено фиксирование препарата, например метанолом. Далее осуществляют обработку биочипа красителем (одним или несколькими) для окрашивания связавшихся клеток (например, по Романовскому-Гимзе), позволяющего в дальнейшем проводить их морфологическое исследование. Затем биочип отмывают от оставшегося красителя и высушивают.Then the biochip is removed from the flow chamber (if it was not removed from it in the previous step) and dried. Drying of the biochip can be carried out, for example, by evaporation of water or, more preferably, by means of a device using the removal of droplets from the surface due to centrifugal force (for example, a centrifuge, on the rotor of which the biochip is fixed). Before staining, the preparation can be fixed, for example with methanol. Next, the biochip is treated with dye (one or several) to stain the bound cells (for example, according to Romanovsky-Giemsa), which allows them to be further studied morphologically. Then the biochip is washed from the remaining dye and dried.
Затем осуществляют приготовление долговременного препарата. Для этого на поверхность предметного стекла (или прозрачной пластины из иного материала, например, из поливинилхлорида) наносится капля канадского бальзама (или иного вещества с подобными свойствами, например жидкости для приготовления гистологических препаратов «Shandon-Mount»; производитель - «Thermo-electron corporation», США, Pitsburg). Сверху накладывают биочип (стороной со связавшимися клетками вверх) и прижимают таким образом, чтобы между ним и стеклом не оставалось пузырей воздуха. Затем на поверхность биочипа наносят еще одну каплю канадского бальзама (или иного вещества с подобными свойствами). Сверху накладывают и таким же образом прижимают покровное стекло (или тонкую прозрачную пластину из иного материала, например из поливинилхлорида). Препарат помещают под груз или пресс до затвердевания канадского бальзама (или заменяющего его вещества). В некоторых случаях более предпочтительным является изготовление постоянного препарата без использования предметного стекла. В этом случае на поверхность биочипа со связавшимися клетками наносят каплю канадского бальзама (или заменяющего его вещества), а сверху накладывают и прижимают покровное стекло (или прозрачную пластину из иного материала, например из поливинилхлорида) таким же образом, как было описано выше. На биочип или изготовленный из него долговременный препарат может наноситься разметка, облегчающая нахождение нужных пятен при не автоматизированном считывании (оценке) результата.Then carry out the preparation of a long-term drug. To do this, a drop of Canadian balsam (or other substance with similar properties, for example, Shandon-Mount histological preparation fluid; manufacturer - Thermo-electron corporation, is applied to the surface of a glass slide (or a transparent plate of another material, for example, polyvinyl chloride) ", USA, Pitsburg). A biochip is placed on top (with the side of the bound cells up) and pressed so that there are no air bubbles between it and the glass. Then, another drop of Canadian balsam (or other substance with similar properties) is applied to the surface of the biochip. A cover glass (or a thin transparent plate of another material, for example, polyvinyl chloride) is applied on top and pressed in the same way. The drug is placed under a load or press until the Canadian balsam (or its substitute substance) hardens. In some cases, it is more preferable to manufacture a permanent preparation without the use of a glass slide. In this case, a drop of Canadian balsam (or a substitute substance) is applied to the surface of the biochip with bound cells, and a glass cover (or a transparent plate made of another material, for example, polyvinyl chloride) is applied and pressed on top in the same manner as described above. A marking can be applied to the biochip or a long-term preparation made from it, which makes it easier to find the right spots with an unauthorized reading (evaluation) of the result.
Осуществляют считывание результата, для этого получают изображение пятен и фоновых участков биочипа (например, путем фотографирования через микроскоп) и определяют плотность связывания клеток (количество клеток, связавшихся на участке поверхности биочипа заданной площади) в области пятен биочипа (фиг.2) и фоновых участков. Процесс может быть автоматизирован.The result is read, for this, an image of the spots and background sections of the biochip is obtained (for example, by photographing through a microscope) and the density of cell binding (the number of cells bound on the surface area of the biochip of a given area) is determined in the area of the spots of the biochip (figure 2) and background sections . The process can be automated.
Осуществляют морфологическое исследование клеток, связавшихся в области каждого пятна биочипа (фиг.3). Его проведение возможно при использовании микроскопии как с применением объективов, не приходящих в контакт с поверхностью препарата, так и с применением иммерсионных объективов. При этом возможно многократное микроскопическое исследование препарата с использованием иммерсионных объективов без каких-либо повреждений препарата и загрязнения объективов. Изображение пятен биочипа и связавшихся в них клеток может быть также получено с помощью проекционной аппаратуры, что в некоторых случаях является более предпочтительным. При проведении морфологического исследования клеток, связавшихся с биочипом, определяют признаки, необходимые для их идентификации (форму и размеры клеток и их ядер, ядерно-цитоплазматическое соотношение, структуру хроматина, наличие или отсутствие ядрышек, наличие перинуклеарного просветления, цвет ядра и цитоплазмы, наличие вакуолей, гранул и других цитоплазматических структур, а также другие признаки). На основании этого определяют, какие именно клетки связались в области того или иного пятна биочипа. При необходимости может осуществляться морфометрическое исследование связавшихся клеток. Морфологическое или морфометрическое исследование связавшихся клеток может осуществляться как без автоматизации (например, путем просмотра каждого пятна биочипа под микроскопом или путем изучения микрофотографий участков соответствующих пятен), так и с помощью компьютерных программ, распознающих изображение и проводящих его анализ. При проведении микроскопического исследования связавшихся на поверхности биочипа клеток могут быть использованы любые виды световой микроскопии.A morphological study of cells bound in the area of each biochip spot is carried out (Fig. 3). Its implementation is possible using microscopy with the use of lenses that do not come into contact with the surface of the drug, and with the use of immersion lenses. In this case, multiple microscopic examination of the drug using immersion lenses without any damage to the drug and contamination of the lenses is possible. The image of biochip spots and cells bound in them can also be obtained using projection equipment, which in some cases is more preferable. When conducting a morphological study of cells associated with the biochip, the signs necessary for their identification (shape and size of cells and their nuclei, nuclear-cytoplasmic ratio, chromatin structure, presence or absence of nucleoli, presence of perinuclear clearing, color of the nucleus and cytoplasm, presence of vacuoles are determined granules and other cytoplasmic structures, as well as other signs). Based on this, it is determined which cells are bound in the area of a particular biochip spot. If necessary, a morphometric study of the bound cells can be carried out. A morphological or morphometric study of bound cells can be carried out both without automation (for example, by viewing each biochip spot under a microscope or by studying microphotographs of areas of the corresponding spots), and using computer programs that recognize the image and analyze it. When conducting microscopic studies of cells bound on the surface of the biochip, any kind of light microscopy can be used.
В случае, если инкубация биочипа с клеточной суспензией осуществлялась без какого-либо перемешивания или подачи потока жидкости, после проведения отмывки, возможно определение содержания в суспензии клеток, экспрессирующих определяемые поверхностные антигены. Для этого определяют плотность связывания клеток в области пятен биочипа (количество клеток связавшихся в области пятна биочипа на участке заданной площади). Плотность связывания клеток в области пятна биочипа пропорциональна содержанию в суспензии клеток, экспрессирующих соответствующий поверхностный антиген. Возможно выражение содержания клеток, экспрессирующих определяемые антигены, в виде доли от общего числа клеток или от числа клеток определенного типа по формуле N=A/B, где N - доля клеток, экспрессирующих данный антиген. А - плотность связывания клеток в области пятна с антителами, специфичными к данному антигену, В - плотность связывания клеток в области пятна с антителами, специфичными к антигену (антигенам), присутствующему на всех исследуемых клетках (например, антигену CD45 или антигену CD44 при исследовании лейкоцитарных суспензий), либо плотность связывания клеток в области пятна с антителами, присутствующими на всех клетках определенного типа, либо максимально возможная плотность связывания клеток, определенная экспериментально иным способом, или расчетным путем.If the biochip was incubated with a cell suspension without any stirring or liquid flow, after washing, it is possible to determine the content in the suspension of cells expressing detectable surface antigens. To do this, determine the density of cell binding in the area of the biochip spots (the number of cells bound in the area of the biochip spot in the area of a given area). The binding density of cells in the area of the biochip spot is proportional to the content in the suspension of cells expressing the corresponding surface antigen. It is possible to express the content of cells expressing the determined antigens as a fraction of the total number of cells or of the number of cells of a certain type according to the formula N = A / B, where N is the proportion of cells expressing this antigen. A is the density of cell binding in the spot region with antibodies specific for a given antigen; B is the density of cell binding in the spot region with antibodies specific for an antigen (antigens) present on all studied cells (for example, CD45 antigen or CD44 antigen in the study of leukocyte suspensions), either the density of cell binding in the stain area with antibodies present on all cells of a certain type, or the maximum possible cell binding density determined experimentally by another method, or even manner.
Доля клеток, экспрессирующих данный антиген, может быть выражена в процентах (фиг.2). Если известна общая концентрация клеток в суспензии, может быть определена концентрация клеток, экспрессирующих каждый определяемый антиген.The proportion of cells expressing this antigen can be expressed as a percentage (figure 2). If the total concentration of cells in the suspension is known, the concentration of cells expressing each detectable antigen can be determined.
Помимо количественного определения плотности связывания клеток в некоторых случаях может быть использовано ее качественное или полуколичественное определение. При этом качественно или полуколичественно может быть оценено содержание в суспензии клеток, экспрессирующих определяемые поверхностные антигены.In addition to quantifying the density of cell binding, in some cases, its qualitative or semi-quantitative determination can be used. At the same time, the content in suspension of cells expressing detectable surface antigens can be evaluated qualitatively or semi-quantitatively.
При проведении морфологического и (или) морфометрического исследования осуществляется идентификация клеток или определяются какие-либо дополнительные отличительные признаки связавшихся клеток. В каждом пятне биочипа на участках заданной площади подсчитываются связавшиеся клетки, имеющие эти признаки (или совокупность признаков), выявленные при морфологическом исследовании. Может быть определена их доля, от числа клеток, экспрессирующих данный антиген и связавшихся в данном пятне на участке заданной площади или от максимального числа клеток, способного связаться на участке заданной площади или от иной величины. Исходя из этого, может быть определено содержание в суспензии клеток, относящихся к данной субпопуляции, выделяемой на основании одного или нескольких морфологических (морфометрических) признаков.During morphological and (or) morphometric studies, cell identification is carried out or any additional distinguishing features of the bound cells are determined. In each spot of the biochip in areas of a given area, bound cells having these signs (or a set of signs) detected by morphological examination are counted. Their proportion can be determined from the number of cells expressing a given antigen and bound in a given spot on a site of a given area or from the maximum number of cells capable of contacting a site of a given area or from a different size. Based on this, the content in the suspension of cells belonging to this subpopulation, selected on the basis of one or more morphological (morphometric) characters, can be determined.
Любой из этапов проведения исследования может быть автоматизирован для снижения трудоемкости проведения анализа и повышения производительности.Any of the stages of the study can be automated to reduce the complexity of the analysis and increase productivity.
Способ проведения анализа предусматривает контроль получаемых результатов. При проведении эксперимента в некоторых случаях при необходимости могут использоваться дополнительные контрольные биочипы (один или несколько), на которых иммобилизированы антитела, имеющие специфичность к другим эпитопам антигенов, выявляемых с помощью первого биочипа. Могут также использоваться биочипы, содержащие несколько моноклональных антител (нанесенных в разных участках биочипа), специфичным к различным эпитопам каждого определяемого антигена. В этом случае сопоставляются значения плотности связывания клеток в пятнах с антителами, специфичными к разным эпитопам одних и тех же антигенов. Если эти значения оказываются близкими, полученные результаты считаются достоверными, если значения существенно отличаются (при близкой аффинности антител и близкой концентрации их растворов, наносимых на подложку при изготовлении биочипа), результаты признаются спорными и подлежат проверке.The method of analysis involves monitoring the results. During the experiment, in some cases, if necessary, additional control biochips (one or several) can be used on which antibodies immobilized having specificity for other epitopes of antigens detected by the first biochip can be immobilized. Biochips containing several monoclonal antibodies (applied in different parts of the biochip) specific to different epitopes of each antigen being determined can also be used. In this case, the values of cell binding density in spots are compared with antibodies specific for different epitopes of the same antigens. If these values turn out to be close, the results are considered reliable, if the values differ significantly (with a close affinity of the antibodies and a close concentration of their solutions applied to the substrate during the manufacture of the biochip), the results are considered controversial and should be checked.
Для анализа одного и того же образца клеточной суспензии может использоваться комплекс из нескольких биочипов (одинаковых или имеющих какие-либо отличия), которые подвергаются окрашиванию различными способами для проведения более детального морфологического исследования клеток, связавшихся в области пятен.To analyze the same sample of a cell suspension, a complex of several biochips (identical or having any differences) can be used, which are stained by various methods to conduct a more detailed morphological study of cells bound in the stain region.
При считывании результата может осуществляться сканирование всей поверхности биочипа с определением локализации каждой связавшейся клетки в двухмерной системе координат. Такой подход позволяет, например, более точно сопоставлять результаты иммунофлюоресцентного, морфологического и морфометрического исследования. Это позволяет четко определять принадлежность дополнительно определяемых морфологических морфометрических и иммунологических признаков каждой конкретной клетке.When reading the result, a scan of the entire surface of the biochip can be carried out with the determination of the localization of each associated cell in a two-dimensional coordinate system. This approach allows, for example, to more accurately compare the results of immunofluorescence, morphological and morphometric studies. This allows you to clearly determine the membership of additionally determined morphological morphometric and immunological characteristics of each particular cell.
В некоторых случаях на любом из этапов проведения анализа может дополнительно осуществляться мечение клеток флюоресцирующим красителем (например, акридиновым оранжевым), позволяющее осуществлять определение количества связавшихся клеток в области заданных участков поверхности биочипа по степени накопления метки. Процесс может быть автоматизирован. Использование дополнительной окраски акридиновым оранжевым не ухудшает качество окрашивания клеток основным способом (например, по Романовскому-Гимзе) и не препятствует проведению морфологического исследования.In some cases, at any stage of the analysis, the cells can additionally be labeled with a fluorescent dye (for example, acridine orange), which allows determining the number of bound cells in the area of specified sections of the biochip surface by the degree of label accumulation. The process can be automated. The use of additional staining with acridine orange does not impair the quality of staining cells in the main way (for example, according to Romanovsky-Giemsa) and does not interfere with the morphological study.
Заявленное изобретение направлено на повышение точности, надежности, информативности и диагностической ценности результатов анализа, а также на достижение возможности проверки ранее полученных результатов.The claimed invention is aimed at improving the accuracy, reliability, information content and diagnostic value of the analysis results, as well as at achieving the ability to verify previously obtained results.
Примеры использования метода.Examples of using the method.
Пример 1Example 1
Использовался биочип с антителами (IgG), специфичными к антигенам: CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD27, CD29, CD31, CD36, CD38, CD41, CD44, CD45, CD45RA, CD56, CD71, CD72, CD95, CD98, HLA-DR, IgM.A biochip with antibodies (IgG) specific for antigens was used: CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD27, CD29, CD31, CD36, CD38, CD41, CD44, CD45, CD45RA, CD56, CD71, CD72, CD95, CD98, HLA-DR, IgM.
С помощью биочипа исследовались клетки больного К., 70 лет, с диагнозом хронический В-лимфолейкоз (В-ХЛЛ). Лейкоцитарная фракция клеток была выделена на градиенте плотности («Ficoll paque», производитель «Pharmacia», Упсала, Швеция) с плотностью 1077 г/л. Выделенные клетки были ресуспензированы в изоосматическом фосфатном буферном растворе, к которому были добавлены ЭДТА (до концентрации 0,5 мг/мл) и инактивированная нагреванием человеческая сыворотка (20% по объему). Биочип закрепляли в проточной камере. Заполняли проточную камеру, а также приводящую и отводящую трубки буферным раствором, таким образом, чтобы в них отсутствовали пузыри воздуха. В капилляр проточной камеры добавляли 100 мкл клеточной суспензии, концентрация клеток в которой являлась достаточной для того, чтобы осевшими клетками могла быть заполнена вся поверхность биочипа. Инкубацию биочипа с клеточной суспензией осуществляли в течение времени, достаточного для оседания клеток на поверхность биочипа. В данном случае инкубация продолжалась в течение 30 минут. Инкубация осуществлялась без подачи потока жидкости и без какого-либо перемешивания. Затем биочип отмывали от не связавшихся с антителами клеток путем пропускания потока буферного раствора с заданной скоростью (в данном случае 5000 мкл/мин) в течение заданного времени (в данном случае 3 минуты). Качество отмывки контролировали с помощью микроскопии. (Отмывка считалась выполненной, если не оставалось связанных клеток в тех участках поверхности биочипа, где отсутствовали иммобилизованные антитела). Затем в проточную камеру подавали закрепляющий раствор, с которым в течение 15 минут осуществляли инкубацию биочипа (в данном случае использовалась питательная среда RPMI-1640, в состав которой входят соли Са2+ и Mg2+). Это было необходимо для увеличения прочности связывания с поверхностью биочипа, оставшихся после отмывки клеток. Затем биочип отмывали от закрепляющего раствора, пропуская в течение 1 минуты изоосмотический буферный раствор (в данном случае со скоростью 5000 мкл/мин, но скорость потока жидкости могла быть увеличена до 40000 мкл/мин и более без какого-либо риска отрыва клеток). Затем биочип в течение 30 минут инкубировали с раствором антител анти-CD19, меченных флюоресцеина изотиоционатом (FITC). Раствор меченных антител вводился непосредственно в капилляр проточной камеры через трубку для дополнительного введения растворов. После завершения инкубации биочип отмывали от не связавшихся меченных антител, пропуская буферный раствор в течение 3 минут со скоростью потока 5000 мкл/мин. После этого биочип (остающийся в проточной камере заполненной жидкостью) исследовали под флюоресцентным микроскопом. Была установлена флюоресценция клеток, связавшихся в области пятен с антителами, специфичными к антигенам CD5, CD19, CD23, CD27, CD29, CD31, CD44, CD45, HLA-DR. Микрофотография фрагмента поверхности биочипа с флюоресцирующими пятнами представлена на фиг.4. Коэкспрессия антигенов CD5/CD19/CD23, типичная для хронического В-лимфолейкоза, в рассматриваемом случае определялась как коэкспрессия CD19/CD5 и CD19/CD23. При выполняемых манипуляциях отрыва клеток не происходило.Using a biochip, cells of a patient K., 70 years old, were diagnosed with a diagnosis of chronic B-lymphocytic leukemia (B-CLL). The leukocyte fraction of the cells was isolated on a density gradient (Ficoll paque, manufacturer Pharmacia, Uppsala, Sweden) with a density of 1077 g / l. The isolated cells were resuspended in iso-osmotic phosphate buffered saline to which EDTA (to a concentration of 0.5 mg / ml) and heat-inactivated human serum (20% by volume) were added. The biochip was fixed in a flow chamber. The flow chamber was filled, as well as the lead-in and outlet tubes, with a buffer solution, so that there were no air bubbles in them. 100 μl of cell suspension was added to the capillary of the flow chamber, the cell concentration in which was sufficient so that the settled surface of the biochip could be filled with settled cells. Incubation of the biochip with a cell suspension was carried out for a time sufficient for sedimentation of cells on the surface of the biochip. In this case, the incubation continued for 30 minutes. Incubation was carried out without supplying a fluid stream and without any mixing. Then, the biochip was washed from cells that did not bind to antibodies by passing a stream of buffer solution at a given speed (in this case, 5000 μl / min) for a given time (in this case, 3 minutes). The quality of the wash was monitored by microscopy. (Washing was considered performed if no bound cells remained in those parts of the biochip surface where there were no immobilized antibodies). Then, a fixing solution was introduced into the flow chamber, with which the biochip was incubated for 15 minutes (in this case RPMI-1640 nutrient medium was used, which included Ca 2+ and Mg 2+ salts). This was necessary to increase the binding strength to the biochip surface remaining after washing the cells. Then the biochip was washed from the fixing solution, passing an iso-osmotic buffer solution for 1 minute (in this case, at a speed of 5000 μl / min, but the fluid flow rate could be increased to 40,000 μl / min or more without any risk of cell detachment). Then the biochip was incubated for 30 minutes with a solution of anti-CD19 antibodies labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC). A solution of labeled antibodies was injected directly into the capillary of the flow chamber through a tube for additional administration of solutions. After completion of the incubation, the biochip was washed from unbound labeled antibodies, passing a buffer solution for 3 minutes at a flow rate of 5000 μl / min. After that, the biochip (remaining in the flow chamber filled with liquid) was examined under a fluorescence microscope. The fluorescence of cells bound in the spot region with antibodies specific for the antigens CD5, CD19, CD23, CD27, CD29, CD31, CD44, CD45, HLA-DR was established. A micrograph of a fragment of the surface of the biochip with fluorescent spots is presented in figure 4. Coexpression of CD5 / CD19 / CD23 antigens, typical of chronic B-lymphocytic leukemia, was defined in this case as coexpression of CD19 / CD5 and CD19 / CD23. During the performed manipulations, the separation of cells did not occur.
Затем биочип извлекали из проточной камеры, высушивали, фиксировали метанолом (15 минут) и окрашивали по Романовскому-Гимзе. После этого биочип ополаскивали дистиллированной водой и высушивали. Затем биочип помещали на предметное стекло, куда предварительно наносили каплю канадского бальзама. Слегка придавливали биочип, сверху наносили на него еще одну каплю канадского бальзама, накрывали покровным стеклом и помещали под пресс до затвердевания канадского бальзама. После этого проводили морфологическое исследование связавшихся клеток. Приготовление из биочипа долговременного препарата позволяло использовать иммерсионные объективы без повреждения связанных клеток и их механического отделения от поверхности биочипа. Было установлено, что плотность связывания клеток в области пятен с антителами анти-CD19, анти-CD23, анти-CD5, анти-CD27, анти-CD29, анти-CD31, анти-HLA-DR была высокой, при этом почти все клетки, связавшиеся в пятнах с антителами, являлись зрелыми лимфоцитами (фиг.3б). Экспрессия антигенов CD5, CD19, CD23 типична для клеток хронического В-лимфолейкоза. Экспрессия антигенов CD27, CD29, CD31, HLA-DR также встречается при В-ХЛЛ. Морфологически клетки В-ХЛЛ являются зрелыми лимфоцитами.Then the biochip was removed from the flow chamber, dried, fixed with methanol (15 minutes) and stained according to Romanovsky-Giemsa. After that, the biochip was rinsed with distilled water and dried. Then the biochip was placed on a glass slide, where a drop of Canadian balsam was previously applied. The biochip was lightly pressed down, another drop of Canadian balsam was applied on top of it, covered with a coverslip and placed under a press until the Canadian balsam hardened. After this, a morphological study of the bound cells was performed. The preparation of a long-term preparation from the biochip allowed the use of immersion lenses without damaging the bound cells and their mechanical separation from the biochip surface. It was found that the density of cell binding in the stain with antibodies anti-CD19, anti-CD23, anti-CD5, anti-CD27, anti-CD29, anti-CD31, anti-HLA-DR was high, with almost all cells bound in spots with antibodies were mature lymphocytes (figb). The expression of antigens CD5, CD19, CD23 is typical for cells of chronic b-lymphocytic leukemia. Expression of antigens CD27, CD29, CD31, HLA-DR is also found in B-CLL. Morphologically, B-CLL cells are mature lymphocytes.
Ранее проведенная окраска меченными антителами не ухудшала качества окраски клеток по Романовскому-Гимзе.Previously stained with labeled antibodies did not impair the quality of staining of cells according to Romanovsky-Giemsa.
Определяли плотность связывания клеток путем прямого подсчета. Для этого в каждом пятне биочипа подсчитывали число клеток, связавшихся на участках заданной площади. Подсчет проводили не менее, чем на 3 участках 100×100 мкм, полученные значения усредняли. Плотность связывания клеток в каждом пятне выражали в процентах. За 100% принимали плотность связывания клеток в области пятна с антителами анти-CD45.The cell binding density was determined by direct counting. For this, the number of cells bound in areas of a given area was counted in each spot of the biochip. Counting was performed in no less than 3 sections of 100 × 100 μm, the obtained values were averaged. The cell binding density in each spot was expressed as a percentage. For 100%, the density of cell binding in the spot region with anti-CD45 antibodies was taken.
Плотность связывания клеток в области того или иного пятна прямо пропорциональна содержанию в суспензии клеток, имеющих соответствующий антиген. Выраженная в процентах плотность связывания клеток в области того или иного пятна численно равна выраженному в процентах содержанию клеток, экспрессирующих соответствующий антиген. На фиг.5 представлены результаты определения процентного содержания клеток с помощью биочипа.The density of cell binding in the region of a spot is directly proportional to the content in the suspension of cells having the corresponding antigen. The percentage binding of cells in the area of a spot is expressed numerically equal to the percentage of cells expressing the corresponding antigen. Figure 5 presents the results of determining the percentage of cells using a biochip.
Пример 2Example 2
Использовался биочип с антителами (IgG), специфичными к антигенам: CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD27, CD29, CD31, CD36, CD38, CD41, CD44, CD45, CD45RA, CD56, CD71, CD72, CD95, CD98, HLA-DR, IgM.A biochip with antibodies (IgG) specific for antigens was used: CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD27, CD29, CD31, CD36, CD38, CD41, CD44, CD45, CD45RA, CD56, CD71, CD72, CD95, CD98, HLA-DR, IgM.
С помощью биочипа исследовались клетки больной Б. (21 год) с диагнозом острый В-лимфобластный лейкоз (В-ОЛЛ). Лейкоцитарная фракция клеток была выделена на градиенте плотности («Ficoll paque», производитель «Pharmacia», Упсала, Швеция) с плотностью 1077 г/л. Выделенные клетки были ресуспензированы в изоосматическом фосфатном буферном растворе, к которому были добавлены ЭДТА (до концентрации 0,5 мг/мл) и инактивированная нагреванием человеческая сыворотка (20% по объему). Биочип закрепляли в проточной камере. Заполняли проточную камеру, а также приводящую и отводящую трубки буферным раствором, таким образом, чтобы в них отсутствовали пузыри воздуха. В капилляр проточной камеры добавляли 100 мкл клеточной суспензии, концентрация клеток в которой являлась достаточной для того, чтобы осевшими клетками могла быть заполнена вся поверхность биочипа. Инкубацию биочипа с клеточной суспензией осуществляли в течение времени достаточного для оседания клеток на поверхность биочипа. В данном случае инкубация продолжалась в течение 30 минут. Инкубация осуществлялась без подачи потока жидкости и без какого-либо перемешивания. Затем биочип отмывали от несвязавшихся с антителами клеток путем пропускания потока буферного раствора с заданной скоростью (в данном случае 5000 мкл/мин) в течение заданного времени (в данном случае 3 минуты). Качество отмывки контролировали с помощью микроскопии. (Отмывка считалась выполненной, если не оставалось связанных клеток в тех участках поверхности биочипа, где отсутствовали иммобилизованные антитела). Затем в проточную камеру подавали закрепляющий раствор, с которым в течение 15 минут осуществляли инкубацию биочипа (в данном случае использовалась питательная среда RPMI-1640, в состав которой входят соли Са2+ и Mg2+). Это было необходимо для увеличения прочности связывания с поверхностью биочипа оставшихся после отмывки клеток. Затем биочип отмывали от закрепляющего раствора, пропуская в течение 1 минуты буферный раствор (в данном случае со скоростью 5000 мкл/мин, но скорость могла быть увеличена до 40000 мкл/мин и более без какого-либо риска отрыва клеток). Затем биочип извлекали из проточной камеры. Отрыва клеток при этом не происходило. Биочип высушивали, фиксировали метанолом 15 минут и окрашивали по Романовскому-Гимзе. Затем биочип ополаскивали дистиллированной водой и высушивали. Затем биочип помещали на предметное стекло, куда предварительно наносили каплю жидкости для приготовления долговременных гистологических препаратов («Shandon-Mount»;Using a biochip, cells of patient B. (21 years old) were examined with a diagnosis of acute B-lymphoblastic leukemia (B-ALL). The leukocyte fraction of the cells was isolated on a density gradient (Ficoll paque, manufacturer Pharmacia, Uppsala, Sweden) with a density of 1077 g / l. The isolated cells were resuspended in iso-osmotic phosphate buffered saline to which EDTA (to a concentration of 0.5 mg / ml) and heat-inactivated human serum (20% by volume) were added. The biochip was fixed in a flow chamber. The flow chamber was filled, as well as the lead-in and outlet tubes, with a buffer solution, so that there were no air bubbles in them. 100 μl of cell suspension was added to the capillary of the flow chamber, the cell concentration in which was sufficient so that the settled surface of the biochip could be filled with settled cells. Incubation of the biochip with the cell suspension was carried out for a time sufficient for the cells to settle on the surface of the biochip. In this case, the incubation continued for 30 minutes. Incubation was carried out without supplying a fluid stream and without any mixing. Then, the biochip was washed from cells that did not bind to antibodies by passing a stream of buffer solution at a given speed (in this case, 5000 μl / min) for a given time (in this case, 3 minutes). The quality of the wash was monitored by microscopy. (Washing was considered performed if no bound cells remained in those parts of the biochip surface where there were no immobilized antibodies). Then, a fixing solution was introduced into the flow chamber, with which the biochip was incubated for 15 minutes (in this case RPMI-1640 nutrient medium was used, which included Ca 2+ and Mg 2+ salts). This was necessary to increase the binding strength to the biochip surface of the cells remaining after washing. Then the biochip was washed from the fixing solution, passing a buffer solution for 1 minute (in this case, at a speed of 5000 μl / min, but the speed could be increased to 40,000 μl / min or more without any risk of cell detachment). Then the biochip was removed from the flow chamber. Cell separation did not occur. The biochip was dried, fixed with methanol for 15 minutes and stained according to Romanovsky-Giemsa. Then the biochip was rinsed with distilled water and dried. Then the biochip was placed on a glass slide, where a drop of liquid was previously applied to prepare long-term histological preparations (“Shandon-Mount”;
производитель - «Thermo-electron corporation», Питсбург, США). Слегка придавливали биочип, сверху наносили на него еще одну каплю данной жидкости, накрывали покровным стеклом и помещали под пресс до ее затвердевания. После этого проводили морфологическое исследование связавшихся клеток. Приготовление из биочипа долговременного препарата позволяло использовать иммерсионные объективы без повреждения связанных клеток и их механического отделения от поверхности биочипа.manufacturer - Thermo-electron corporation, Pittsburgh, USA). The biochip was lightly pressed down, another drop of this liquid was applied on top of it, covered with a coverslip and placed under a press until it hardened. After this, a morphological study of the bound cells was performed. The preparation of a long-term preparation from the biochip allowed the use of immersion lenses without damaging the bound cells and their mechanical separation from the biochip surface.
Было установлено, что почти все клетки, связавшиеся в пятнах с антителами анти-CD19, анти-CD29, анти-CD38, анти-CD22, анти-HLA-DR являлись бластами. В пятнах с антителами анти-CD44 и анти-CD45 большая часть клеток (около 80%) являлась бластами, клетки других типов составляли менее 20%. В пятнах с антителами анти-CD2, анти-CD3, анти-CD4, анти-CD5, анти-CD8 и анти-CD16 связывались зрелые лимфоциты.It was found that almost all cells bound in spots with antibodies anti-CD19, anti-CD29, anti-CD38, anti-CD22, anti-HLA-DR were blasts. In spots with anti-CD44 and anti-CD45 antibodies, most of the cells (about 80%) were blasts, other types of cells were less than 20%. Mature anti-CD2, anti-CD3, anti-CD5, anti-CD5, anti-CD8 and anti-CD16 antibodies stained with anti-CD2 antibody stains.
Наличие бластов, имеющих антигены CD19 (фиг.3а) типично для острого В-лимфобластного лейкоза. Экспрессия антигенов CD38, CD29, CD29 также характерна для клеток данной опухоли.The presence of blasts having CD19 antigens (Fig. 3a) is typical for acute B-lymphoblastic leukemia. The expression of antigens CD38, CD29, CD29 is also characteristic of the cells of this tumor.
Определяли плотность связывания клеток путем прямого подсчета. Для этого в каждом пятне биочипа подсчитывали число клеток, связавшихся на участках заданной площади. Подсчет проводили не менее, чем на 3 участках 100×100 мкм, полученные значения усредняли. Плотность связывания клеток в каждом пятне выражали в процентах. За 100% принимали плотность связывания клеток в области пятна с антителами анти-CD45. На фиг.6 представлены результаты определения с помощью биочипа процентного содержания клеток, экспрессирующих различные поверхностные антигены.The cell binding density was determined by direct counting. For this, the number of cells bound in areas of a given area was counted in each spot of the biochip. Counting was performed in no less than 3 sections of 100 × 100 μm, the obtained values were averaged. The cell binding density in each spot was expressed as a percentage. For 100%, the density of cell binding in the spot region with anti-CD45 antibodies was taken. Figure 6 presents the results of determining using a biochip the percentage of cells expressing various surface antigens.
Claims (13)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008147279/15A RU2389024C1 (en) | 2008-12-02 | 2008-12-02 | Method of study of cells by means of immunological biochip |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008147279/15A RU2389024C1 (en) | 2008-12-02 | 2008-12-02 | Method of study of cells by means of immunological biochip |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2389024C1 true RU2389024C1 (en) | 2010-05-10 |
Family
ID=42674023
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008147279/15A RU2389024C1 (en) | 2008-12-02 | 2008-12-02 | Method of study of cells by means of immunological biochip |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2389024C1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2584598C1 (en) * | 2015-03-27 | 2016-05-20 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-технический центр "БиоКлиникум" | Microfluid chip for creation of mammalian organ cell models |
| RU2614965C2 (en) * | 2015-07-30 | 2017-03-31 | Эдуард Петрович Зинкевич | Storage of animals and man odorous secretion samples for subsequent analysis of smell |
| RU171690U1 (en) * | 2016-03-24 | 2017-06-09 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-технический центр "БиоКлиникум" | Microfluidic Chip for the Creation of Cellular Models of Mammalian Organs |
-
2008
- 2008-12-02 RU RU2008147279/15A patent/RU2389024C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ШИШКИН А.В. и др. «Иммунологические биочипы для исследования эритроцитов человека», Биологические мембраны, 2008, т. 25, №4, с.267-276. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2584598C1 (en) * | 2015-03-27 | 2016-05-20 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-технический центр "БиоКлиникум" | Microfluid chip for creation of mammalian organ cell models |
| RU2614965C2 (en) * | 2015-07-30 | 2017-03-31 | Эдуард Петрович Зинкевич | Storage of animals and man odorous secretion samples for subsequent analysis of smell |
| RU171690U1 (en) * | 2016-03-24 | 2017-06-09 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-технический центр "БиоКлиникум" | Microfluidic Chip for the Creation of Cellular Models of Mammalian Organs |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9506927B2 (en) | Method for detecting low concentrations of specific cell from high concentrations of cell populations, and method for collecting and analyzing detected cell | |
| JP5507092B2 (en) | Method and apparatus for imaging a target component in a biological sample using a permanent magnet | |
| US7537907B2 (en) | Products and methods for single parameter and multiparameter phenotyping of cells | |
| US8110101B2 (en) | Method and apparatus for imaging target components in a biological sample using permanent magnets | |
| KR20170094523A (en) | A high sensitivity multiparameter method for rare event analysis in a biological sample | |
| CN105518464A (en) | Methods, compositions and systems for microfluidic assays | |
| JP6639906B2 (en) | Biological sample detection method | |
| US8318445B2 (en) | Immunomagnetic capture and imaging of biological targets | |
| JP6198717B2 (en) | Method for detecting malignancy of peripheral circulating tumor cell unit and kit thereof | |
| CN114127562A (en) | Detection method of tumor cell surface marker molecule PD-L1 | |
| RU2389024C1 (en) | Method of study of cells by means of immunological biochip | |
| JPWO2008041594A1 (en) | Antibody drug sensitivity test method | |
| JP4590109B2 (en) | Products and methods for single-parameter and multi-parameter phenotyping of cells | |
| RU2393216C1 (en) | Method for combined immunobiological analysis of cells using biochip | |
| KR101424720B1 (en) | A Novel Method for Measuring Platelet Activation and Apparatus Using It | |
| TWI825881B (en) | Cell identification method | |
| EP4249889A1 (en) | Methods for preparing and analyzing biopsies and biological samples | |
| JP7153365B2 (en) | Isolated cell specimen, method for producing isolated cell specimen, and method for detecting target cells | |
| RU2433175C2 (en) | Method of cell analysis by means of biochip | |
| JP2004184103A (en) | Examination method for myelodysplastic syndrome | |
| TW202405405A (en) | Cell identification method | |
| US20180074046A1 (en) | Composition, method and kit for pathology | |
| JP2007322378A (en) | Blood type determination method |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20151203 |