RU2351649C1 - Способ получения культур мезенхимальных стромальных клеток человека, выделенных из липоаспирата - Google Patents
Способ получения культур мезенхимальных стромальных клеток человека, выделенных из липоаспирата Download PDFInfo
- Publication number
- RU2351649C1 RU2351649C1 RU2007148026/13A RU2007148026A RU2351649C1 RU 2351649 C1 RU2351649 C1 RU 2351649C1 RU 2007148026/13 A RU2007148026/13 A RU 2007148026/13A RU 2007148026 A RU2007148026 A RU 2007148026A RU 2351649 C1 RU2351649 C1 RU 2351649C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- cell
- hla
- mesenchymal stromal
- lipoaspirate
- Prior art date
Links
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 89
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 32
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 claims abstract description 27
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 claims abstract description 25
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims abstract description 21
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 101000835093 Homo sapiens Transferrin receptor protein 1 Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102100026144 Transferrin receptor protein 1 Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 102000013127 Vimentin Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102100023471 E-selectin Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 101000622123 Homo sapiens E-selectin Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 101001008874 Homo sapiens Mast/stem cell growth factor receptor Kit Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 101000622137 Homo sapiens P-selectin Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 102100027754 Mast/stem cell growth factor receptor Kit Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 102100023472 P-selectin Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 101000599852 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 1 Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108010014608 Proto-Oncogene Proteins c-kit Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000016971 Proto-Oncogene Proteins c-kit Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 6
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 11
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000000822 sequential centrifugation Methods 0.000 abstract 2
- 230000007959 normoxia Effects 0.000 description 21
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 18
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 14
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 14
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 8
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 7
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 238000013394 immunophenotyping Methods 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 4
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 238000007443 liposuction Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 210000004460 N cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- TVEXGJYMHHTVKP-UHFFFAOYSA-N 6-oxabicyclo[3.2.1]oct-3-en-7-one Chemical compound C1C2C(=O)OC1C=CC2 TVEXGJYMHHTVKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 2
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 101000622304 Homo sapiens Vascular cell adhesion protein 1 Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100023543 Vascular cell adhesion protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 2-(diethylamino)ethyl 4-aminobenzoate;(2s,5r,6r)-3,3-dimethyl-7-oxo-6-[(2-phenylacetyl)amino]-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid;hydrate Chemical compound O.CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1.N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 1
- 102000000412 Annexin Human genes 0.000 description 1
- 108050008874 Annexin Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010040476 FITC-annexin A5 Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241000906034 Orthops Species 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000007773 growth pattern Effects 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 101150091813 shfl gene Proteins 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000732 tissue residue Toxicity 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении культур стволовых клеток для различных целей. Проводят выделение клеток-предшественников, дополнительную отмывку буфером с помощью двух последовательных центрифугирований, ферментативную обработку ткани коллагеназой, несколько последовательных отмывок центрифугированием, адгезию полученного клеточного материала на пластике и последующее культивирование от 4 до 10 дней в условиях гипоксии с содержанием кислорода не менее 5% до получения целевой клеточной культуры. Используют клетки от 1-го до 2-го пассажей. Определяют количество живых, некротических и апоптотических клеток и проводят анализ фенотипа мезенхимальных стромальных клеток путем их идентификации с помощью набора моноклональных антител гематопоэтическим и эндотелиальным маркерам CD31, CD34, CD62L, CD62E, CD62P, CD117(c-kit), HLA-DR, а также к маркерам, характерным для мезенхимальных стромальных клеток-предшественников CD9, CD54, CD71, CD90, CD105, HLA-ABC, виментин. Изобретение позволяет получить мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки при повышении их выхода с сохранением их фенотипа и высокой жизнеспособности. 2 ил., 11 табл.
Description
Изобретение относится к медицине и может быть использовано при получении культур стволовых клеток для различных целей.
С учетом возрастания области применения стволовых клеток перед цитологами достаточно остро стоит проблема получения в короткий временной период требуемого количества мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток с низкой гетерогенностью и высокой жизнеспособностью, поскольку именно такие клетки необходимы для решения практических задач.
Стромальные костно-мозговые клетки-предшественники, называемые также мезенхимальными стволовыми клетками (МСК), могут быть выделены из различных тканей. Они представляют собой малочисленную популяцию клеток, характеризующихся большим пролиферативным потенциалом, способных к самоподдержанию с сохранением недифференцированного состояния, а также обладающих возможностью дифференцироваться в различные клеточные типы под действием определенных стимулов. Способность МСК дифференцироваться, по крайней мере, в клетки тканей мезенхимального происхождения лежит в основе их репаративного потенциала.
До настоящего времени костный мозг рассматривался как главный источник стволовых клеток взрослого организма. Костный мозг содержит гемопоэтические стволовые клетки и их более коммитированные потомки, строму, а также так называемые мезенхимальные стромальные клетки или клетки-предшественники взрослого организма (МСК) (Caplan AI. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 1991 #9 Vol.5, p.641-650; Friedenstein AJ. Precursor cells of mechanocytes. Int. Rev. Cytol. 1976 #47, p.327-359).
Известно, что МСК - это малочисленная популяция клеток, которые обладают способностью к самоподдержанию, могут длительно пролиферировать вне организма и обладают способностью к дифференцировке в различные клеточные типы, такие как адипо- и хондроциты, остеобласты, миоциты, нейроны. Сейчас доказано существование МСК не только в костном мозге, но и практически во всех тканях организма, например в коже, жировой ткани, эпителии тонкого кишечника и др. (Zuk, P.A., Zhu, M., Mizuno H., et al., Multiliniage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. // Tissue Eng. - 2001-Vol.7 - P. 211-226; Zuk PA, Zhu, M., Mizuno H. et al Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. // Molecular biology of the cell - 2002 - Vol.13 - P.4279-4295 и др.).
Известен, например, способ выращивания человеческих мезенхимальных стволовых клеток, взятых из крови, в котором одним из условий является повышенное количество СО2 (патент US 7060494 от 13.06.2006, класс 435/366, C12N 5/00).
Жировая ткань рассматривается как одна из альтернатив костному мозгу для получения МСК и последующего их применения в терапевтических целях. Подкожная жировая клетчатка, как и костный мозг, является производным мезенхимы и содержит строму, которая может быть легко изолирована. К тому же процедура взятия жировой ткани является значительно менее травматичной и переносится пациентами значительно легче, чем пункция костного мозга. Многими исследователями, независимо друг от друга показано, что клетки, выделяемые при ферментативной обработке жировой ткани и последующем культивировании in vitro, способны дифференцироваться в различные клеточные типы под воздействием химических стимулов (Zuk PA, Zhu, M., Mizuno H. et al Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. // Molecular biology of the cell - 2002 - Vol.13 - P. 4279-4295; Katz AJ, Tholpady A, Tholpady SS, Shang H, Ogle RC. Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells. Stem Cells. 2005 # 23 Vol.3, p.412-423). Полученные данные свидетельствуют о том, что МСК, выделенные из жировой ткани и культивируемые in vitro, могут быть использованы в регенеративной медицине. В то же время методы выделения МСК во многих лабораториях различаются. Большинство исследователей для выделения МСК из жировой ткани используют методику, предложенную в работе Ryden (Rydén M, Dicker A, Götherström C, Aström G, Tammik C, Amer P, Le Blanc K. Functional characterization of human mesenchymal stem cell-derived adipocytes. Biochem Biophys Res Commun. 2003 #311 Vol.2. p391-397), которая заключается в измельчении ткани, обработке ее коллагеназой, нескольких последовательных центрифугированиях и адгезии полученного клеточного осадка на пластике. Получаемые при выделении из жира клетки называют мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками-предшественниками, выделенными из липоаспирата или жировой ткани (далее - лМСК). Возможное использование лМСК в регенеративной медицине ставит перед исследователями некоторые проблемы - как за меньший период времени культивирования МСК вне организма человека нарастить достаточную для использования клеточную массу.
Авторами данного изобретения была решена задача получения лМСК в условиях действия пониженного (до 5%) содержания кислорода на пролиферацию, жизнеспособность и экспрессию маркеров клеток-предшественников, выделенных из липоаспирата человека, при постоянном культивировании.
Техническим результатом является создание нового способа, расширяющего арсенал средств получения мезенхимальных стромальных клеток при повышении их выхода с сохранением их фенотипа и высокой жизнеспособности.
Поставленная задача решена с помощью способа получения культур мезенхимальных стромальных клеток человека, выделенных из липоаспирата, включающего выделение клеток-предшественников путем измельчения ткани, обработки ее коллагеназой, нескольких последовательных центрифугирований и адгезии полученного клеточного осадка на пластике и последующее культивирование до получения целевой клеточной культуры, культивирование от 4 до 10 дней в условиях гипоксии с содержанием кислорода не менее 5%, при этом используют клетки от 1-го до 2-го пассажей, после чего определяют количество живых, некротических и апоптотических клеток и проводят анализ фенотипа мезенхимальных стромальных клеток путем их идентификации с помощью набора моноклональных гематопоэтических и эндотелиальных антител CD31, CD34, CD62L, CD62E, CD62P, CD117(c-kit), HLA-DR, CD9, CD54, CD71, CD90, CD 105, HLA-ABC, виментин, которые являются маркерами, характерными для мезенхимальных стромальных клеток-предшественников.
В процессе проведенных исследований авторами было установлено, что на ранних этапах культивирования МСК, выделенных из липоаспирата, также как и из костного мозга, в условиях пониженного содержания кислорода (5% O2) происходит значительная стимуляция пролиферации клеток-предшественников.
Кроме того, неожиданно авторами было обнаружено, что культивирование стромальных клеток-предшественников, выделенных из липоаспирата, от 4 до 10 суток при использовании 1-2 пассажей в условиях гипоксии не только ускоряет пролиферацию клеток, но и приводит к снижению гетерогенности культуры, уменьшению количества апоптотических и некротических клеток при повышении ее пролиферативной активности и жизнеспособности клеток и при сохранении фенотипа и дифференцировочного потенциала, т.е. по сути нами была решена проблема ускоренного получения культур лМСК с низкой гетерогенностью и высокой жизнеспособностью.
Способ осуществляют следующим образом.
Липоаспират получали после процедуры липосакции у пациентов, обратившихся в специализированную клинику. Материал до выделения хранили в холодильнике при 4°С.
Выделение лМСК из липоаспирата и получение первичной культуры проводили с помощью следующих средств.
Материалы:
Пробирки стерильные, 50 мл (Nunc, Дания)
Пипетки стерильные, 10 и 25 мл (Nunc, Дания)
Клеточный фильтр, стерильный, 100 нм (Nunc, Дания)
Чашки Петри, 60 и 90 мм, стерильные, (Nunc, Дания)
Флаконы культуральные, 25 см2 и 75 см2, (Nunc, Дания)
Пробирки нестерильные для проточного цитофлуориметра
Наконечники стерильные на 200-1000 мкл (Eppendorf, Германия)
Ростовая среда: DMEM с низким содержанием глюкозы, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл
Амфотерицин В 50 мкг/мл, L-глютамин 2 мМ, натрия бикарбонат 1 г/л
Сыворотка фетальная телячья (FBS) (Hyclone, США)
Трипсин-EDTA 0,25-0,04% (Gibco, UK)
D-PBS (Gibco, UK)
Коллагеназа IА (Sigma-Aldrich, США)
Полная среда: ростовая среда+10% FBS
Оборудование
Центрифуга Eppendorf 5804R
Ламинарный шкаф (Сампо, Россия)
Водяная баня (Elmi, Латвия)
Весы (Ohaus, Германия)
Электрическая пипетка
Пипетки автоматические, набор (Eppendorf, Германия)
Микроскоп инвертированный, фазово-контрастный (Leica, Германия)
Проточный цитофлуориметр BeckmanCoulter Epix XL (BeckmanCoulter, США)
CO2-инкубатор (Sanyo, Япония)
Стандартные условия культивирования: 5% CO2 + 95% воздуха, 37°С, 100% влажность.
В 50 мл пробирку помещали липоаспират (примерно 1/3 от объема пробирки) и долить до 50 мл D-PBS, аккуратно встряхивали 5 раз.
Центрифугировали 5 минут при 1500 оборотов в минуту, при 18°С. На дне пробирки находится осадок из эритроцитов, над осадком - слой буфера и затем липоаспират. Липоаспират сверху покрыт слоем жира из разрушенных адипоцитов.
Осторожно перенесли липоаспират в чистую стерильную пробирку (50 мл) и повторно отмыли ткань при следующих условиях - 10 минут, 1000 об/мин, 18°С.
Осторожно перенесли липоаспират в предварительно взвешенную стерильную пробирку (50 мл), взвесили и добавили раствор коллагеназы IA. Приготовили 0,15% раствор коллагеназы.
В пробирку с предварительно взвешенным липоаспиратом добавили раствор фермента до конечной концентрации 0,075%.
Инкубировали на водяной бане при 37°С, 30 минут, периодически встряхивали - 1 раз в 5 минут.
Инактивировали коллагеназу IA добавлением полной среды до 50 мл.
Центрифугировали 5 минут, 1500 об/мин, 18°С.
Супернатант слили и осадок ресуспендировали в 10 мл полной среды, довести до 50 мл ростовой средой
Центрифугировали 5 минут, 1500 об/мин, 18°С.
Супернатант слили и осадок ресуспендировали в 10 мл полной среды.
Клеточный фильтр поместили на 50 мл пробирку и суспензию клеток и остатков ткани пропустили через него. В пробирку добавили ростовую среду до 50 мл.
Центрифугировали 10 минут, 1000 об/мин, 18°С.
Супернатант слили, осадок ресуспендировали в 10 мл ростовой среды.
Отобрали аликвоту среды с клетками и подсчитали количество ядросодержащих клеток в гемацитометре.
Развели клеточную суспензию из расчета, чтобы плотность посадки составляла 2×105-300×105 см2.
Посадили клетки в культуральные флаконы, оставили в СО2-инкубаторе на 24 часа.
Отобрали надосадочную жидкость с неприкрепившимися клетками и 2 раза промыть D-PBS.
Добавили нужное количество полной среды.
Меняли среду через 2 дня на 3.
Контролировали рост клеток под микроскопом.
Пассировали клетки при достижении 70-80% конфлуентности.
Моделирование гипоксии in vitro проводили следующим образом. Часть клеток сразу после выделения помещали в мультигазовый инкубатор Sanyo (Япония), где поддерживалась концентрация кислорода 5%. Культура клеток постоянно находилась в условиях пониженного содержания кислорода, и период нормоксии составлял не более 30 минут при замене среды.
После чего была изучена пролиферативная активность лМСК, выделенных из липоаспирата человека.
Для анализа пролиферации клеток в культуре использовали метод видеомикроскопии. С помощью микроскопа Leica DM IL (Leica, Германия), снабженного цветной видеокамерой, изображение передавалось на компьютер и впоследствии анализировалось. Оцифровка лМСК, культивируемых в газовой среде при стандартном (21% O2) и пониженном (5% O2) содержании кислорода, проводили через каждые 24 часа, начиная с первого дня после посадки и до момента следующего пассирования и используя объектив ×10. На дно каждого флакона снаружи были нанесены маркерные точки, для того чтобы проводить фотографирование одних и тех же полей зрения на разных сроках культивирования. В каждом флаконе фотографировали по 10 стационарных полей зрения, площадью 1,0 мм2. На полученных изображениях клетки подсчитывали с помощью программы анализа изображения SigmaScan Pro 5.0 Image Analysis Software (SPSS Inc, США).
Оценку эффективности прикрепления культивируемых клеток проводили следующим образом: при пассировании клеток плотность посадки составляла в среднем 3000 клеток на см2. Эффективность прикрепления оценивали по количеству прикрепленных клеток на 1 см2 через 24 часа после посадки.
Была проведена оценка жизнеспособности лМСК человека.
Жизнеспособность лМСК оценивали с помощью набора ANNEXIN V-FITC-PI (Immunotech, Франция) - по стандартной методике на проточном цитофлуориметре. Метод основан на одновременном использовании пропидия йодида (PI), проникающего в поврежденные клетки и взаимодействующего с ДНК, и аннексина V (Annexin V меченый FITC), аффинного к фосфатидилсерину, который в процессе апоптоза локализуется на клеточной поверхности и формирует один из специфичных сигналов для распознавания апоптотических клеток. Использование пары AnnexinV-FITC - PI позволяет идентифицировать живые, некротические и апоптотические клетки.
Для анализа отбирали 2×105 клеток, ресуспендировали в фосфатном буфере и повторно центрифугировали при 1000 оборотов в минуту, в течение 5 минут. Полученный клеточный осадок ресуспендировали в ледяном связывающем буфере, добавляли растворы Annexin V-FITC и PI, и инкубировали в течение 10 минут при t=+4°С, после чего объем пробы доводили до 500 мкл связывающим буфером и проводили анализ на проточном цитофлуориметре Epics XL (Beckman Coulter, США). Анализировали не менее 10000 событий.
Жизнеспособность клеток оценивали в конце пассажа в суспензии клеток, приготовленных для субкультивирования.
Анализ фенотипа культивируемых лМСК проведен следующим образом.
Для идентификации выделенных и культивируемых клеток, подтверждения статуса лМСК использовали набор моноклональных антител фирмы Beckman Coulter - гематопоэтические и эндотелиальные (CD31, CD34, CD62L, CD62E, CD62P, CD117(c-kit), HLA-DR) и также антитела к CD9, CD54, CD71, CD90, CD105, HLA-ABC, виментину, которые являются маркерами, характерными для мезенхимальных стромальных клеток-предшественников. В качестве изотипического контроля к антителам использовались FITC- и РЕ-меченые IgG соответствующего класса. Для анализа выбранных маркеров клетки после отбора среды культивирования промывали фосфатным буфером, снимали раствором трипсин-ЭДТА и ингибировали фермент избытком DMEM с 10% FBS. Полученную суспензию центрифугировали (1000 об/мин, 5 минут), после чего супернатант сливали, ресуспендировали в 1 мл фосфатного буфера с 1% FBS, после чего проводили подсчет клеток в гемацитометре и готовили пробы с концентрацией клеток не менее 105 в пробе. Клетки перемешивали и инкубировали с антиген-специфичными антителами или изотипического контроля в течение 20 минут при t=+4°C. После чего объем пробы доводили до 800 мкл фосфатным буфером и проводили фенотипирование на проточном цитофлуориметре EPIX XL (Beckman Coulter, США). При двойном окрашивании первичными антителами окрашивали по приведенной ранее схеме, затем отмывали от несвязавшейся метки (центрифугирование в избытке фосфатного буфера с 1% FBS, 1000 rpm, 5 минут), добавляли вторичные FITC- или РЕ-антитела и инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре, после чего доводили объем пробы до 800 мкл и проводили фенотипирование. Иммунофенотипирование проводили в нескольких повторах, для каждого маркера анализировали не менее 10000 клеток.
Таблицы 1-11 поясняют предлагаемое изобретение
Пример 1.
Выделение и культивирование лМСК
Вес липоаспирата - 49 г.
Время после липосакции - 72 часа.
Количество ядросодержащих клеток - 4,2х106.
Сразу после выделения все клетки были разделены на 2 части и помещены в условия нормоксии (95% воздуха, 5% СО2, N-клетки) или гипоксии (5% О2, 5% CO2, 90% N2, Нур-клетки).
Время до первой отмывки - 24 часа.
Первое пассирование - через 4 дня.
Количество пассажей - 2.
Пролиферативная активность лМСК.
Определение плотности посадки на 1 пассаже было затруднено в связи с тем, что при пересевании клеток из первичной культуры образуется большое количество клеточных агрегатов и трудно получить равномерное распределение клеток на подложке. Эффективность прикрепления на 2 пассаже составляла 80-90% от плотности посадки и практически не различалась в N- и Нур-клетках.
На втором пассаже проводили определение пролиферативной активности лМСК, как описано выше. На основании полученных данных были построены кривые пролиферации, характеризующие рост лМСК в течение всего пассажа.
В табл. 1 приведены данные по клеточному приросту за все время культивирования во 2 пассаже. Мы не обнаружили увеличения количества клеток, культивируемых в условиях нормоксии, в то время как в условиях гипоксии прирост количества клеток был весьма значительным (табл. 1).
Характер роста клеток в Нур-культурах описывался типичной кривой пролиферации: лаг-фаза в течение 48-72 часов, которая сменялась фазой роста (фиг.1).
Количество удвоений популяции Нур-клеток значительно превышало аналогичные показатели N-клеток, а время удвоения Нур-клеток было существенно меньше (табл.2).
Пример 2.
Вес липоаспирата - 77 г.
Время после липосакции - 20 часов.
Количество ядросодержащих клеток - 18,8×106.
Время до первой отмывки - 24 часа.
Первое пассирование - через 7 дней.
После трипсинизации клеток первичной культуры в суспензии образовывалось большое количество клеточных конгломератов, которые трудно поддавались ресуспендированию, в связи с этим плотность посева 1 пассажа была выше, чем при последующем субкультивировании. Эффективность прикрепления N- и Нур-клеток достоверно не отличалась и составляла около 70%.
В 1-3 день культивирования как в N-, так и Нур-культурах не обнаружено достоверного увеличения количества клеток. После 3 дней культивирования мы наблюдали увеличение количества клеток в обеих культурах, причем количество клеток в гипоксии было значительно больше, чем в нормоксии. Прирост N-клеток составил 540% за 8 дней культивирования, а Нур-клеток - 1290% за то же время (табл.3).
Характер кривой клеточной пролиферации был сходным в N- и Нур-культурах. Лаг-фаза наблюдалась в течение 72-96 часов, после чего начиналась фаза роста (фиг.2).
Оценка жизнеспособности лМСК, культивируемых в условиях гипоксии (5% O2) и нормоксии (20% O2), показала, что различия в содержании O2 не влияют на жизнеспособность клеток, которая остается высокой (90+3%) вне зависимости от выбранной модели культивирования (табл.5).
Пример 3.
Вес липоаспирата - 30 г.
Время после липосакции - 24 часа.
Количество ядросодержащих клеток - 4,0×106.
Время до первой отмывки - 24 часа.
Первое пассирование - через 7 дней.
Пролиферативную активность и жизнеспособность лМСК оценивали на 2 пассаже. Показано, что культивирование клеток в условиях гипоксии стимулировало их пролиферативную активность (табл.6). Количество клеточных удвоений в культуре, постоянно находившейся в условиях пониженного содержания кислорода, было в 2 раза выше, а время удвоения - в 2 раза меньше по сравнению с лМСК в стандартных условиях культивирования (табл.7).
Культивирование в условиях пониженного содержания кислорода (5% Oz) не влияло на жизнеспособность лМСК и составляло 95±0,1% как в нормоксических, так и в гипоксических условиях (табл.8).
Приведенные результаты позволяют сделать вывод о том, что во всех исследованных культурах лМСК снижение содержания кислорода в среде приводило к увеличению пролиферативной активности. Время удвоения клеток в Нур-культурах было значительно ниже, а количество клеточных удвоений за то же время больше, чем в N-культурах во всех трех выделениях.
Кривая клеточной пролиферации как для N-, так и для Нур-клеток имела стандартный вид: лаг-фаза в течение 1-4 дней, которая сменялась фазой роста.
Жизнеспособность N- и Нур-клеток не отличалась в трех независимых сериях и составляла около 90%. Следует отметить, что пролиферативная активность культивируемых в стандартных условиях лМСК, выделенных из липоаспиратов различных доноров, варьирует в очень широких пределах.
Таким образом, культивируемые в газовой среде с пониженным содержанием кислорода (5% O2) лМСК имеют более высокую пролиферативную активность по сравнению с лМСК, находящимися в стандартных условиях (95% воздуха + 5% СО2). Характер роста N- и Нур-клеток не отличается и описывается стандартной кривой пролиферации. Различия в значениях клеточного прироста могут быть связаны с индивидуальными особенностями доноров лМСК. Изменение содержания кислорода в газовой среде не снижает жизнеспособность культивируемых клеток.
Результаты иммунофенотипирования в выделениях лМСК на втором пассаже приведены в табл. 9-11.
Во всех трех экспериментах, как в N-, так и в Нур-культурах не было обнаружено клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндотелия и гематопоэтических клеток-предшественников (CD31, CD34, CD62L, CD62E, CD62P, CD117(c-kit), HLA-DR). Наличие таких антигенов как CD9, CD54, CD71, CD90, CD105, CD106, HLA-ABC, виментин свидетельствовало о том, что исследуемые клетки можно охарактеризовать как лМСК. Количество клеток, несущих исследуемые маркеры - CD9, CD54, CD71, CD105, CD106, HLA-ABC, виментин не отличалось в N- и в Нур-культурах во всех трех сериях исследований. Доля CD90-положительных клеток варьировала от 75 до 96%. Проведенный иммунофенотипический анализ позволил подтвердить, что клетки, выделенные согласно используемому протоколу, являются стромальными мезенхимальными клетками-предшественниками. Культивирование в условиях пониженного содержания кислорода не влияет на экспрессию антигенов, характерных для МСК, и сохраняет их высокую жизнеспособность клеток в культуре и способность к направленной дифференцировке.
Таким образом, было показано, что культивирование клеток в условиях пониженного (5%) содержания кислорода не влияет на фенотип и жизнеспособность культивируемых клеток и оказывает стимулирующее действие на пролиферативную активность лМСК, что позволяет получить большую клеточную массу за тот же период культивирования по сравнению со стандартными условиями.
| Таблица 1 | |||
| Влияние постоянного культивирования в условиях пониженного содержания кислорода (5%) на пролиферативную активность лМСК | |||
| Пассаж | Прирост клеток за время культивирования, % от 1 суток | Нур/N, кратность различий | |
| Нормоксия | Гипоксия | ||
| 1 | 14 | 42 | 3 |
| 2 | 2 | 66 | 33 |
| Таблица 2 | ||||
| Количество удвоений и время удвоений лМСК при постоянном культивировании в условиях пониженного содержания кислорода (5%) и в стандартных условиях (20%) | ||||
| Пассаж | Количество удвоений | Время удвоения, часы | ||
| Нормоксия | Гипоксия | Нормоксия | Гипоксия | |
| 1 | 0,19 | 0,5 | 380 | 144 |
| 2 | 0,03 | 0,73 | 5600 | 93 |
| Таблица 3 | |||
| Влияние постоянного культивирования в условиях пониженного содержания кислорода (5%) на пролиферативную активность лМСК | |||
| Пассаж | Прирост клеток за время культивирования, % | Нур/N, кратность различий | |
| Нормоксия | Гипоксия | ||
| 2 | 445 | 1196 | 2,7 |
| Таблица 4 | ||||
| Количество удвоений и время удвоений лМСК при постоянном культивировании клеток в условиях пониженного содержания кислорода (5%) и в стандартных условиях | ||||
| Пассаж | Количество удвоений | Время удвоения, часы | ||
| Нормоксия | Гипоксия | Нормоксия | Гипоксия | |
| 2 | 8,8 | 10,2 | 21,9 | 18,9 |
| Таблица 5 | ||||||||
| Жизнеспособность лМСК человека при культивировании в нормоксии (20% О2) и гипоксии (5% О2) | ||||||||
| Пассаж | Нормоксия | Гипоксия | ||||||
| живые, % | An+, % | PI+, % | An-PI+, % | живые, % | An+, % | PI+, % | An-PI+, % | |
| р2 | 87,98 | 8,91 | 1,02 | 2 | 88,9 | 7,93 | 0,88 | 2,29 |
| Таблица 6 | |||
| Влияние постоянного культивирования клеток в условиях пониженного содержания кислорода (5%) на пролиферативную активность лМСК | |||
| Пассаж | Прирост клеток за время культивирования, % | Нур/N, кратность различий | |
| Нормоксия | Гипоксия | ||
| 2 | 148 | 475 | 2,5 |
| Таблица 7 | ||||
| Количество удвоений и время удвоений лМСК при постоянном культивировании клеток в условиях пониженного содержания кислорода (5%) и в стандартных условиях | ||||
| Пассаж | Количество удвоений | Время удвоения, часы | ||
| Нормоксия | Гипоксия | Нормоксия | Гипоксия | |
| 2 | 1.31 | 2,52 | 55 | 29 |
| Таблица 8 | ||||||||
| Жизнеспособность лМСК человека при культивировании в нормоксии (21% O2) и гипоксии (5% O2) | ||||||||
| Пассаж | Нормоксия | Гипоксия | ||||||
| живые, % | An+, % | PI+, % | An-PI+, % | живые, % | An+, % | PI+, % | An-PI+, % | |
| р2 | 94,9 | 0,29 | 2,43 | 2,38 | 95,0 | 0,88 | 1,83 | 2,29 |
| Таблица 9 | ||||||||||||||
| Иммунофенотипирование культивируемых лМСК (2 пассаж, выделение А). Экспрессия маркера в % | ||||||||||||||
| Показатель | CD31 | CD34 | CD62L | CD62E | CD62P | CD117 (c-kit) | HLA-DR | CD9 | CD54 | CD71 | CD90 | CD105 | HLA-ABC | виментин |
| Нормоксия | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 40+5 | 71+8 | 95+3 | 75+4,5 | 100 | 100 | 100 |
| Гипоксия | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 42+4 | 75+7 | 100 | 76+3,5 | 100 | 100 | 100 |
| Таблица 10 | ||||||||||||||
| Иммунофенотипирование культивируемых лМСК (2 пассаж, выделение Б). Экспрессия маркера в % | ||||||||||||||
| Показатель | CD31 | CD34 | CD62L | CD62E | CD62P | CD117 (c-krt) | HLA-DR | CD9 | CD54 | CD71 | CD90 | CD105 | HLA-ABC | виментин |
| Нормоксия | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 45+5 | 60+5 | 100 | 95+4,5 | 100 | 100 | 100 |
| Гипоксия | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 44+4 | 60+7 | 100 | 96+3,5 | 100 | 100 | 100 |
| Таблица 11 | ||||||||||||||
| Иммунофенотипирование культивируемых лМСК (2 пассаж, выделение В). Экспрессия маркера в % | ||||||||||||||
| Показатель | CD31 | CD34 | CD62L | CD62E | CD62P | CD117 (c-krt) | HLA-DR | CD9 | CD54 | CD71 | CD90 | CD105 | HLA-ABC | виментин |
| Нормоксия | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 20+2,3 | 76+4,5 | н/о | 94+4,5 | н/о | 100 | 100 |
| Гипоксия | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 18+3,4 | 78+7 | н/о | 95+3,5 | н/о | 100 | 100 |
| Примечание: н/о - не определяли. | ||||||||||||||
Claims (1)
- Способ получения культур мезенхимальных стромальных клеток человека, выделенных из липоаспирата, включающий выделение клеток-предшественников, дополнительную отмывку буфером с помощью двух последовательных центрифугирований, обработку ткани коллагеназой, несколько последовательных отмывок центрифугированием, адгезию полученного клеточного осадка на пластике и последующее культивирование до получения целевой клеточной культуры, отличающийся тем, что культивирование ведут от 4 до 10 дней в условиях гипоксии с содержанием кислорода не менее 5%, при этом используют клетки от 1-го до 2-го пассажей, после чего определяют количество живых, некротических и апоптотических клеток и проводят анализ фенотипа мезенхимальных стромальных клеток путем их идентификации с помощью набора моноклональных гематопоэтических и эндотелиальных антител CD31, CD34, CD62L, CD62E, CD62P, CD117(c-kit), а также к маркерам, характерным для мезенхимальных стромальных клеток-предшественников: HLA-DR, CD9, CD54, CD71, CD90, CD105, HLA-ABC, виментин.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007148026/13A RU2351649C1 (ru) | 2007-12-25 | 2007-12-25 | Способ получения культур мезенхимальных стромальных клеток человека, выделенных из липоаспирата |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007148026/13A RU2351649C1 (ru) | 2007-12-25 | 2007-12-25 | Способ получения культур мезенхимальных стромальных клеток человека, выделенных из липоаспирата |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2351649C1 true RU2351649C1 (ru) | 2009-04-10 |
Family
ID=41014908
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2007148026/13A RU2351649C1 (ru) | 2007-12-25 | 2007-12-25 | Способ получения культур мезенхимальных стромальных клеток человека, выделенных из липоаспирата |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2351649C1 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012164008A1 (en) | 2011-06-01 | 2012-12-06 | Closed Stock Company "Institute Of Applied Nanotechnology" | Method of evaluation of the effect of nanoparticles on cell cultures |
| WO2013053502A1 (en) | 2011-10-11 | 2013-04-18 | Closed Stock Company "Institute Of Applied Nanotechnology" | Method for cultivation of stem cells |
| RU2627606C1 (ru) * | 2016-05-05 | 2017-08-09 | Константин Валентинович Котенко | Способ обработки липоаспирата |
-
2007
- 2007-12-25 RU RU2007148026/13A patent/RU2351649C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| WANG Q.et.al. In vitro hypoxic culture of human marrow mesenchymal stem cells and their biological features in adults. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi, 2007. ЖАМБАЛОВА А.П., ГРИНАКОВСКАЯ O.C. Изучение влияния гипоксии на культивируемые мезенхимальные стволовые клетки человека. ГНЦ РФ Институт медико-биологических проблем РАН. Тезисы работ молодых ученых 2006. RYDEN М. et.al. Functional characterization of human mesenchymal stem cell-derived adipocytes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003 Nov. 14, реферат. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012164008A1 (en) | 2011-06-01 | 2012-12-06 | Closed Stock Company "Institute Of Applied Nanotechnology" | Method of evaluation of the effect of nanoparticles on cell cultures |
| WO2013053502A1 (en) | 2011-10-11 | 2013-04-18 | Closed Stock Company "Institute Of Applied Nanotechnology" | Method for cultivation of stem cells |
| RU2627606C1 (ru) * | 2016-05-05 | 2017-08-09 | Константин Валентинович Котенко | Способ обработки липоаспирата |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhu et al. | A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone | |
| Araña et al. | Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells: isolation, expansion, and characterization | |
| Markarian et al. | Isolation of adipose-derived stem cells: a comparison among different methods | |
| Stute et al. | Autologous serum for isolation and expansion of human mesenchymal stem cells for clinical use | |
| Chong et al. | Human peripheral blood derived mesenchymal stem cells demonstrate similar characteristics and chondrogenic differentiation potential to bone marrow derived mesenchymal stem cells | |
| KR100489248B1 (ko) | 제대혈 유래 간엽줄기세포ㆍ전구세포의 분리배양방법 및간엽조직으로의 분화유도방법 | |
| Titorencu et al. | Proliferation, differentiation and characterization of osteoblasts from human BM mesenchymal cells | |
| JP5785394B2 (ja) | ヒト臍帯から前駆細胞を単離及び保存するための最適化され、定義された方法 | |
| Ayatollahi et al. | Conditions to improve expansion of human mesenchymal stem cells based on rat samples | |
| CN111454893A (zh) | 一种无血清、无异源成分的间充质干细胞培养基及其应用 | |
| CN102965335A (zh) | 用于间充质干细胞培养的试剂盒及其应用 | |
| EP3578641A1 (en) | Method for preparing dental pulp stem cells from cells derived from dental pulp tissue | |
| Lisini et al. | Adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells for clinical application: An efficient isolation approach | |
| Pilbauerova et al. | Enzymatic Isolation, Amplification and Characterization of Dental Pulp Stem Cells. | |
| Schäck et al. | Analysis of surface protein expression in human bone marrow stromal cells: new aspects of culture-induced changes, inter-donor differences and intracellular expression | |
| Roman et al. | In vitro characterization of multipotent mesenchymal stromal cells isolated from palatal subepithelial tissue grafts | |
| Liu et al. | Isolating and characterizing adipose-derived stem cells | |
| RU2351649C1 (ru) | Способ получения культур мезенхимальных стромальных клеток человека, выделенных из липоаспирата | |
| Kadkhoda et al. | Assessment of surface markers derived from human periodontal ligament stem cells: an in vitro study | |
| Boquest et al. | Obtaining freshly isolated and cultured mesenchymal stem cells from human adipose tissue | |
| EP2615166A2 (en) | Equine amniotic fluid derived multipotent stem cells and a production method therefor | |
| CN105886462A (zh) | 用于ADSCs培养的组合物及ADSCs培养方法 | |
| Thiel et al. | Efficient transfection of primary cells relevant for cardiovascular research by nucleofection® | |
| Neagu et al. | Human mesenchymal stem cells as basic tools for tissue engineering: isolation and culture | |
| CN111094550A (zh) | 来源于幼猪的干细胞及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20171226 |