RU2337921C2 - Биологически активный пептид, состоящий из трипептида l-тирозил-l-серил-l-валина - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к иммунологии. Описан трипептид L-Тирозил-L-Серил-L-Валин и его применение в фармацевтической композиции и в производстве пищевой добавки. Раскрыт способ ослабления состояния заболевания человека, где заболевание выбрано из группы, состоящей из состояний, которые могут быть ослаблены путем стимуляции трансформации Т-лимфоцитов, и нарушения клеточной пролиферации, включающий введение описанной фармацевтической композиции. Данное изобретение предоставляет короткие пептиды, обладающие биологической активностью. 4 н. и 4 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл.

Description

Основы изобретения

Область изобретения

Настоящее изобретение связано с короткими пептидами и их применением. В частности, настоящее изобретение связано с иммуномодифицирующими и противоопухолевыми свойствами коротких пептидов.

Описание предшествующего уровня техники

Пептиды известны и в области лечения болезней, и в качестве фармацевтических композиций. Например, в патенте США № 6191113 описан пептид, который обладает ингибирующей активностью в отношении роста клеток гладкой мускулатуры и, следовательно, используется для предотвращения и лечения патологических состояний, ассоциированных с ростом клеток гладкой мускулатуры, таких как атеросклероз, рестеноз после ангиопластики, люминальный стеноз после трансплантации сосудов и саркома гладкой мускулатуры. В Патенте США 6184208 описан другой пептид, в отношении которого было обнаружено, что он модулирует физиологические процессы, такие как увеличение зоны активного эпителиального роста и роста волос. Более того, в публикации РСТ № WO 03/006492 и заявке на патент США № 10/237405 предполагается, что определенные пептиды и их фармацевтические композиции биологически активны и способны модулировать иммунный ответ. Ссылки, которые цитируются, в настоящем описании не обязательно относятся к предшествующему уровню техники, и, следовательно, их цитирование юридически не означает, что эти ссылки в любом случае относятся к предшествующему уровню техники.

Следовательно, задачей настоящего изобретения является предоставление коротких пептидов, обладающих биологической активностью.

Краткое содержание изобретения

Один из аспектов данного изобретения связан с трипептидом тирозил-серил-валином (YSV), который, как было обнаружено, обладает биологической активностью. Чтобы проверить это предположение, использовали пептид L-тирозил-L-серил-L-валин. Следующие аспекты настоящего изобретения включают в себя выделенные или очищенные пептиды, включающие в себя состоящие в основном из или состоящие из тирозил-серил-валина. Другой аспект связан с по существу чистыми YSV-пептидами.

Дополнительный аспект настоящего изобретения включает в себя выделение или очистку пептида, содержащего в основном YSV, где пептид имеет активность, выбранную из группы, состоящей из модуляций иммунного ответа, стимулирования трансформации Т-лимфоцитов, модуляции нарушения клеточной пролиферации, модуляции роста злокачественной опухоли печени, модуляции роста лейкемии, модуляции роста цервикального рака, модуляции роста злокачественной опухоли легких, модуляции роста меланомы.

Дополнительный аспект настоящего изобретения включает в себя фармацевтические композиции, содержащие пептид, включающий в себя состоящий в основном из или состоящий из пептида YSV. Другие аспекты настоящего изобретения связаны с фармацевтическими композициями, которые содержат пептид, который включает в себя, состоит в основном из или состоит из функционального производного YSV-пептида. Дополнительные аспекты включают в себя фармацевтические композиции, включающие в себя, в основном состоящие или состоящие из трипептида L-тирозил-L-серил-L-валин.

Другие аспекты настоящего изобретения связаны со способом получения фармацевтической композиции, включающей в себя пептид тирозил-серил-валин и смесь указанного трипептида с фармацевтически приемлемым носителем.

Другие аспекты настоящего изобретения связаны со способом уменьшения проявления заболевания человека путем введения человеку фармацевтически эффективной дозы трипептида тирозил-серил-валин. В дополнительных аспектах настоящего изобретения заболевание человека выбрано из группы, состоящей из состояния, признаки которого могут быть сглажены путем стимулирования трансформации Т-лимфоцитов, и из нарушения клеточной пролиферации. В дополнительных аспектах изобретения нарушением клеточной пролиферации является злокачественная опухоль, включающая в себя, не ограничиваясь перечисленным, злокачественную опухоль печени, лейкемию, цервикальный рак, злокачественную опухоль легких и меланому.

Другой аспект настоящего изобретения связан с использованием трипептида тирозил-серил-валин в качестве фармацевтической композиции. Более того, трипептид может использоваться как модулятор иммунной системы и может также использоваться для лечения нарушения клеточной пролиферации. В частных аспектах изобретения, нарушением клеточной пролиферации является злокачественная опухоль. В частных аспектах изобретения лечению подвергается злокачественная опухоль печени, лейкемия, цервикальный рак, злокачественная опухоль легких и/или меланома.

Следующий аспект настоящего изобретения направлен на пищевую композицию, содержащую тирозил-серил-валин, и применение ее для производства пищевой добавки. Конкретные аспекты изобретения связаны с пищевыми добавками, содержащими пептиды, которые включают в себя, состоят в основном из или состоят из трипептида тирозил-серил-валина.

В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрены улучшенные производные YSV или их функциональные производные. Улучшенное производное трипептида тирозил-серил-валин включает в себя улучшенную молекулу, функционально связанную с трипептидом тирозил-серил-валин таким образом, что улучшает и усиливает терапевтическую эффективность трипептида. Усиливающий эффект может быть пролонгированным эффектом, укороченным эффектом, эффектом с более поздним проявлением, эффектом с повышенной интенсивностью проявления, эффектом с пониженной интенсивностью, с меньшими побочными эффектами и такими, при которых создается один или более эффектов, с более поздним наступлением, с более ранним наступлением эффекта и нацеливающим пептид на отдельные области внутри организма. Примеры таких усиливающих молекул и улучшенных производных описаны ниже. В некоторых аспектах изобретения, усиливающие молекулы могут модулировать, не ограничиваясь, однако, модуляцией, иммунную активность и/или рост злокачественной опухоли, где указанная злокачественная опухоль включает в себя, не ограничиваясь ими, цервикальную карциному, злокачественную опухолью печени и лейкемию. Дополнительные аспекты настоящего изобретения включают в себя способы усиления терапевтического эффекта пептида, включающего в себя, состоящего в основном из или состоящего из YSV или его производных, содержащих указанный пептид, функционально связанный с молекулой, которая усиливает терапевтический эффект. В некоторых аспектах изобретения способ не состоит из включения пептида, который является сопредельным с YSV-пептидом или его производным в природном пептиде. Дополнительный аспект настоящего изобретения включает в себя фармацевтические композиции, включающие в себя, состоящие в основном из или состоящие из улучшенных производных YSV или их функциональных производных.

Один аспект настоящего изобретения связан по существу с чистым пептидом YSV или его функциональными производными, как описано выше, функционально связанными с молекулой, которая усиливает их терапевтическую эффективность и которая упоминается в настоящем описании как "усиливающая молекула". Такие молекулы могут быть получены и использованы несколькими способами, описанными в Предварительной патентной заявке США № 60/435796, описание которой во всей ее полноте включено в настоящий документ посредством ссылки. Молекулы-кандидаты для функциональной связи с пептидами и способы реализации таких связей знакомы специалистам в данной области. Некоторые молекулы, которые могут быть функционально связаны с YSV-пептидом и его функциональными производными, включают в себя, но не ограничиваются ими, органическое соединение, углеводород, сахар, полисахарид, аминокислоту, аминокислотный полимер, пептид, стероид, белок, выделенный домен белка, гаптен, антиген, липидную молекулу, жирную кислоту, полиамин, ингибитор протеазы, силикат и комбинацию любых из перечисленных выше молекул. Изобретение также связано с по существу чистым пептидом, описанным выше, и его функциональными производными, функционально связанными в молекулу, которая усиливает его терапевтическую эффективность, где указанная функционально связанная молекула не является пептидом, который в природном пептиде является сопредельным с выше указанным пептидом. В другом аспекте изобретения по существу чистый YSV пептид или его функциональные производные могут модулировать, не ограничиваясь, однако, модуляцией, иммунную активность и/или нарушение клеточной пролиферации, такой как злокачественная опухоль, где указанная злокачественная опухоль включает в себя, не ограничиваямь ими, цервикальную карциному, злокачественную опухоль печени, лейкемию, злокачественную опухоль легких и меланому. Молекула может быть функционально связана с пептидом согласно изобретению ковалентной связью или нековалентным взаимодействием.

В специфических воплощениях, биологически эффективные молекулы, когда функционально связываются с YSV или его функциональными производными, могут изменять фармакокинетику пептида, наделяя пептиды свойствами как часть связанной молекулы. Некоторые свойства, которыми эти функционально связанные молекулы могут наделять содержащийся в них пептид, включают в себя, не ограничиваясь ими, доставку пептида в определенную область организма, концентрирование активности пептида в желаемой области организма и уменьшение его действия в других областях организма, уменьшение побочного эффекта при лечении пептидом, изменение проницаемости пептида, изменение биологической значимости или скорости доставки пептида в организме, изменение продолжительности лечения пептидом, изменение стабильности пептида, изменение скорости проявления и угасания действия пептида, обеспечение пермиссивного действия, путем предоставления пептиду возможности проявить эффект.

Другой аспект настоящего изобретения связан с по существу чистым пептидом, включающим в себя, состоящим в основном из или состоящим из YSV или его функциональных производных, функционально связанных с молекулой, которая усиливает их терапевтическую эффективность, где указанная функционально связанная молекула не является пептидом, сопредельным с YSV или одной из его функциональных производных в природном пептиде. Некоторые молекулы, которые могут быть функционально связаны с YSV и его функциональными производными, включают в себя, не ограничиваясь ими, органическое соединение, углеводород, сахар, полисахарид, аминокислоту, аминокислотный полимер, пептид, стероид, белок, изолированный домен белка, гаптен, антиген, липидную молекулу, жирную кислоту, желчную кислоту, полиамид, ингибитор протеазы, силикат и комбинацию нескольких перечисленных молекул. Дополнительные аспекты изобретения включают в себя по существу чистый пептид, включающий в себя, состоящий в основном из или состоящий из YSV или из его функциональных производных, функционально связанных в молекулу, которая усиливает его терапевтическую эффективность, которая может модулировать, но не ограничивается модуляцией, иммунную активность и/или нарушение клеточной пролиферации, такой как злокачественная опухоль, где указанная злокачественная опухоль включает в себя, не ограничиваясь ими, цервикальную карциному, злокачественную опухоль печени, лейкемию, злокачественную опухоль легких и меланому. Молекула может функционально связываться с пептидом согласно изобретению ковалентной связью или не ковалентным взаимодействием. Эффект функциональной связи между по существу чистыми пептидами и молекулой, которая усиливает их терапевтическую эффективность, может состоять, не ограничиваясь этим, из доставки пептида в определенную область в пределах организма, концентрирования активности пептида в желаемой области организма и уменьшения их действия в другом месте, уменьшения побочного эффекта от лечения пептидом, изменения проницаемости пептида, изменения биологической значимости или скорости доставки пептида в организме, изменения продолжительности действия лечения пептидом, изменения стабильности пептида, изменения скорости проявления и угасания действия пептида; обеспечения пермиссивного действия путем предоставления пептиду возможности проявить эффект.

Другой аспект настоящего изобретения связан с гибридными пептидами, содержащими пептид, включающий в себя YSV или одну из его функциональных производных, с присоединенной дополнительной пептидной последовательностью, где указанная присоединенная дополнительная последовательность не является последовательностью, примыкающей к пептиду, описанному выше в природном пептиде. В специфических воплощениях указанные гибридные пептиды могут модулировать, не ограничиваясь модуляцией, иммунную активность и/или нарушение клеточной пролиферации, такой как злокачественная опухоль, где указанная злокачественная опухоль включает в себя, не ограничиваясь перечисленным, цервикальную карциному, злокачественную опухоль печени, лейкемию, злокачественную опухоль легких и меланому. В специфических воплощениях данные присоединенные пептидные последовательности, не примыкающие к YSV или его функциональным производным в природном пептиде, могут изменять фармакокинетику пептидов указанных воплощений согласно изобретению, наделяя пептид свойствами как части гибридной молекулы. Некоторые из свойств, которыми функционально связанные молекулы могут наделять YSV или его функциональные производные, включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, доставку пептида в определенную область в пределах организма, концентрирование активности пептида в желаемой области организма и уменьшение его действия в других областях, уменьшение побочного действия при лечении пептидом, изменение проницаемости пептида, изменение биологической ценности или скорости доставки пептида в организме, изменение продолжительности действия обработки пептидом, изменение стабильности пептида, изменение скорости проявления и угасания действия пептида, обеспечение пермиссивного действия, давая пептиду проявить эффект.

Другой аспект настоящего изобретения связан с генетическим вектором, включающим в себя состоящую в основном из или состоящую из первичной нуклеотидной последовательности, кодирующей пептид YSV или одну из его функциональных производных, слитых в рамке считывания со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей пептид, который увеличивает терапевтическую эффективность вышеупомянутого пептида и который не является сопредельным с указанным пептидом YSV или одной из его функциональных производных в природном пептиде. Данный аспект изобретения также связан с генетическим вектором, включающим в себя состоящую в основном из или состоящую из первичной нуклеотидной последовательности, кодирующей пептид, содержащий в основном пептид YSV или одну из его функциональных производных, слитых в рамке считывания со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей пептид, который увеличивает терапевтическую эффективность вышеуказанного пептида и который не является сопредельным с указанным пептидом YSV или с указанной одной из его функциональных производных в природном пептиде. Следующий аспект связан с генетическим вектором, включающим в себя состоящую в основном из или состоящего из первичной нуклеотидной последовательности, кодирующей пептид, состоящий из аминокислотной последовательности пептида YSV или одной из его функциональных производных, слитых в рамке считывания со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей пептид, усиливающий терапевтическую эффективность указанного пептида и который не является сопредельным с указанным пептидом YSV или указанной одной из его функциональных производных в природном пептиде. В специфических воплощениях, указанный YSV-пептид или указанная одна из его функциональных производных может модулировать, не ограничиваясь, однако, модуляцией, иммунную активность и/или нарушать клеточную пролиферацию, такую как злокачественная опухоль, где указанная злокачественная опухоль включает в себя, не ограничиваясь перечисленным, цервикальную карциному, злокачественную опухоль печени, лейкемию, злокачественную опухоль легких и меланому. Некоторые из свойств, которыми функционально связанная молекула может наделять указанный YSV-пептид или указанную одну из его функциональных производных, включают в себя, не ограничиваясь ими, свойства доставки пептида к определенной области организма, концентрирование активности пептида в определенной области организма и уменьшение его действия в остальных частях организма, уменьшение побочного эффекта лечения пептидом, изменение проницаемости пептида, изменение биологической ценности или скорости доставки пептида в организме, изменение продолжительности действия лечения пептидом, изменение стабильности пептида, изменение скорости проявления и угасания действия пептида, обеспечение пермиссивного действия путем предоставления пептиду возможности проявить эффект. Другой аспект изобретения связан с микроорганизмами, которые включают в себя последовательности нуклеиновой кислоты, выбранные из перечня, состоящего из нуклеотидных последовательностей описанного выше вектора; и нуклеотидную последовательность, включающую в себя первую нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид, содержающий аминокислотную последовательность указанного YSV-пептида или указанной одной из его функциональных производных, слитых в рамке считывания со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей пептид, который не является сопредельным указанному YSV-пептиду или указанной одной из его функциональных производных в природном пептиде.

Что касается некоторых описанных выше нуклеиновых последовательностей, пептиды и/или гибриды пептидов, выраженные через эти последовательности нуклеиновой кислоты, могут модулировать, не ограничиваясь, однако, модуляцией, иммунную активность и/или нарушение клеточной пролиферации, такой как злокачественная опухоль, где указанная злокачественная опухоль включает в себя, без ограничения, цервикальную карциному, злокачественную опухоль печени, лейкемию, злокачественную опухоль легких и меланому.

Следующий аспект настоящего изобретения связан со способом создания фармацевтической композиции, включающей в себя полученный YSV-пептид или одну из его функциональных производных, функционально связанных с молекулой, которая усиливает их терапевтический эффект, и разработкой рецептуры функциональной связи указанного пептида и указанной молекулы с фармацевтически приемлемым носителем. Изобретение также связано с указанным способом, при котором указанный пептид может модулировать, не ограничиваясь только модуляцией, иммунную активность, нарушение клеточной пролиферации, такой как злокачественная опухоль, где злокачественная опухоль включает в себя, без ограничения, цервикальную карциному, злокачественную опухоль печени, лейкемию, злокачественную опухоль легких и меланому. Некоторые примеры биологически активных молекул, которые могут прикрепляться к указанному YSV-пептиду или указанной одной из его функциональных производных, включают в себя, без ограничения перечисленным, органическое соединение, углеводород, сахар, полисахарид, аминокислоту, полимер аминокислот, пептид, стероид, белок, изолированный домен белка, гаптен, антиген, липидную молекулу, жирные кислоты, желчь, полиамид, ингибитор протеазы, силикат и комбинацию нескольких из предшествующих молекул. Изобретение также связано со способом создания фармацевтической композиции, включающей в себя пептид, содержащий указанный YSV-пептид или одну из указанных его функциональных производных, включающих в себя функционально связанный указанный пептид с молекулой, которая усиливает указанный терапевтический эффект, где указанная молекула не является пептидом, сопредельным указанному YSV-пептиду или указанной одной из его функциональных производных в природном пептиде. Молекула может быть функционально связана с пептидом согласно изобретению ковалентной связью или нековалентным взаимодействием. В специфическом воплощении указанная функционально связанная молекула может наделять указанные пептиды свойствами усиливать их терапевтический эффект, включая, но не ограничиваясь перечисленным, свойства доставки пептида в определенную область организма, концентрирование активности пептида в определенной области организма и уменьшение побочного эффекта лечения пептидом, изменение проницаемости пептида, изменение биологической значимости или скорости доставки пептида в организме, изменение продолжительности действия лечения пептидом, изменение стабильности пептида, изменение скорости проявления и угасания действия пептида, обеспечение пермиссивного действия путем предоставления пептиду возможности проявить эффект. Изобретение также связано со способом получения фармацевтической композиции, включающей по существу очищенный пептид, состоящий в основном из аминокислотной последовательности YSV-пептида или одной из его функциональных производных, функционально связанных с молекулой, которая усиливает их терапевтический эффект, и разработкой рецептуры функционального связывания указанного пептида и указанной молекулы с фармацевтически приемлемым носителем. Далее, изобретение связано со способом получения фармацевтической композиции, включающей в себя по существу очищенный пептид, состоящий из YSV-пептида или одной из его функциональных производных, функционально связанных с молекулой, усиливающей их терапевтический эффект, и разработкой рецептуры функционального связывания указанного пептида и указанной молекулы с фармацевтически приемлемым носителем.

Еще один аспект настоящего изобретения связан со способом лечения человека посредством введения фармацевтически эффективной дозы по существу очищенного пептида, включающего в себя YSV-пептид или одну из его функциональных производных, где указанный пептид функционально связан с молекулой, которая усиливает его терапевтическую эффективность. Некоторые примеры биологически эффективных молекул, которые могут быть функционально связаны с указанным YSV-пептидом или указанной одной из его функциональных производных, включают в себя, без ограничения перечисленным, органическое соединение, углеводород, сахар, полисахарид, аминокислоту, аминокислотный полимер, пептид, стероид, белок, изолированный домен белка, гаптен, антиген, липидную молекулу, жирные кислоты, желчь, полиамид, ингибитор протеазы, силикат или комбинацию перечисленных молекул. В некоторых воплощениях свойства, которыми указанная функционально связанная молекула может наделять указанные пептиды, усиливая их терапевтический эффект, включают, но не ограничиваются ими, свойства доставлять пептид в определенную область организма, концентрировать активность пептида в определенной области организма и уменьшать его действие в остальных областях организма, уменьшать побочное действие лечения пептидом, изменять проницаемость пептида, изменять биологическую ценность или скорость доставки пептида в организме, изменять продолжительность действия лечения пептидом, изменять стабильность пептида, изменять скорость проявления и угасания действия пептида, обеспечивать пермиссивное действие путем предоставления пептиду возможности проявить эффект.

В частных воплощениях пептиды, использованные для лечения человека, как описано выше, могут также использоваться для модуляции, не ограничиваясь, однако, модуляцией, иммунной активности и/или нарушения клеточной пролиферации, такой как злокачественная опухоль, где указанная злокачественная опухоль включает в себя, без ограничения перечисленным, цервикальную карциному, злокачественную опухоль печени, лейкемию, злокачественную опухоль легких и меланому.

Следующий аспект изобретения включает в себя фармацевтическую композицию, состоящую в основном из или состоящую из YSV-пептида или его функциональных производных, функционально связанных в молекулу, которая усиливает его терапевтический эффект, и фармацевтически приемлемый носитель. Изобретение также связано с указанным усиленным YSV-пептидом или его производными, где пептид может модулировать, не ограничиваясь модуляцией, иммунную активность и/или нарушение клеточной пролиферации, такой как злокачественная опухоль, где указанная злокачественная опухоль включает в себя цервикальную карциному, злокачественную опухоль печени, лейкемию, злокачественную опухоль легких и меланому, не ограничиваясь, однако, перечисленным. Некоторые примеры биологически активных молекул, которые могут быть функционально связаны с указанным YSV-пептидом или указанной одной из его функциональных производных, включают в себя, без ограничения, органическое соединение, углеводород, сахар, полисахарид, аминокислоту, аминокислотный полимер, пептид, белок, изолированный домен белка, гаптен, антиген, липидную молекулу, жирную кислоту, желчь, полиамид, ингибитор протеазы, силикат или комбинацию нескольких из перечисленных молекул. В некоторых воплощениях, свойства, которыми указанная функционально связанная молекула может наделять указанный пептид, усиливая его терапевтическую эффективность, включают в себя, но не ограничиваются ими, доставку пептида в определенную область организма, концентрирование активности пептида в определенной области организма и уменьшение его действия в остальных областях организма, уменьшение побочного эффекта от лечения пептидом, изменение проницаемости пептида, изменение биологической значимости или скорости доставки пептида в организме, изменение продолжительности действия лечения пептидом, изменение стабильности пептида, изменение скорости проявления и угасания действия пептида, обеспечение пермиссивного действия путем предоставления пептиду возможности проявить эффект.

Краткое описание чертежей

На каждой из пяти фигур продемонстрированы примеры химических реакций связывания пептидов с молекулами стероида.

На фиг.1 показан ряд химических реакций связывания пептида с молекулой эстрона посредством ковалентной связи.

На фиг.2 показана вторая, альтернативная серия реакций создания таких же связей, как на фиг.1.

На фиг.3 представлена серия химических реакций, предназначенных для связывания пептида с молекулой эстрадиола ковалентной связью.

Фиг.4 содержит вторую серию химических реакций для создания таких же связей, как на фиг.3.

На фиг.5 показан способ связывания пептида с молекулой гидрокортизона посредством ковалентной связи.

Подробное описание предпочтительного воплощения

В изучении молекул коротких пептидов, которые могут использоваться как фармацевтический, иммунологический модификатор, действующий против нарушения клеточной пролиферации, против злокачественной опухоли и/или против саркомы человека, авторы настоящего изобретения обнаружили, что молекула L-тирозил-L-серил-L-валин (YSV) обладает иммунологически модифицирующим и противораковым свойствами in vitro. Эти данные позволяют предположить, что молекула YSV, большие молекулы, содержащие эту молекулу, включая большие пептиды и пептиды, которые содержат в своей последовательности YSV-последовательность и функциональные производные YSV, могут использоваться как иммунологические модификаторы и/или фармацевтические средства против нарушения клеточной пролиферации или как пищевая добавка.

Понятно, что можно добавлять дополнительные аминокислоты к амино- или карбокси-концу YSV-пептида в качестве еще одного способа практического применения настоящего изобретения. В таких воплощениях YSN-пептид поддерживает одно или более описанных здесь терапевтических или функциональных свойств. Например, в некоторых воплощениях одну или две аминокислоты можно добавлять к данному пептиду без изменения его биологической функции. В других воплощениях также возможно добавлять три или четыре аминокислоты и поддерживать функцию YSN-пептида. Это все - варианты одного и того же пептида. Более того, производные пептида, такие как консервативная замена одной аминокислоты на другую в пределах одного функционального класса, могут использоваться для осуществления другого аспекта настоящего изобретения. Например, у пептидов, имеющих неполярные или гидрофобные боковые цепи, возможно замещение одной боковой группы на другую без уменьшения их биологической активности. Следующим примером может служить линкер/спейсер, который можно вставить в пептид, формируя варианты, но в вариантах всегда сохраняется активный фрагмент, как и в исходном пептиде, используемом в данном исследовании. Рассматривались также и варианты пептидов. Используемые здесь аналоги пептида включают в себя пептиды, которые имеют аминокислотные молекулы, имитирующие структуру природной аминокислоты, то есть аналог с разной структурой остова или D-аминокислотной заменой. Следующий пример: хотя аминокислоты, использованные для синтезирования пептидов, находились в форме оптического L-изомера, пептиды с последовательностью в одну или более аминокислот замещались на D-форму и имели схожую биологическую активность. Термин "функциональная производная", который использован в формуле изобретения, означает включение фрагментов, вариантов, аналогов или химических производных пептида.

"По существу чистый пептид" относится к пептидам, которые имеют по меньшей мере 10% в/в чистоты, более предпочтительно 20%, еще более предпочтительно 40% и намного предпочтительней 60% и значительно более предпочтительно 90% чистоты. В наиболее предпочтительных воплощениях степень чистоты составляет более чем 99%. По существу чистый пептид может использоваться для фармацевтических и пищевых смесей, которые могут быть сложными смесями, как описано ниже.

Применение YSV или его функциональных производных в фармацевтических композициях может быть использовано для возможного лечения иммунологических нарушений или болезней, имеющих вторичное влияние на иммунитет, то есть нарушение клеточной полиферации, такое как злокачественная опухоль или инфекции. В фармацевтической композиции можно смешивать YSV или его функциональные производные с другими активными или неактивными составляющими, включая другие пептиды, то есть от двух до нескольких (то есть 3-5) пептидов можно добавлять в одну и ту же композицию с другими ингредиентами или без них. Альтернативно, YSV или его функциональные производные могут быть использованы для приготовления композиции совместно с пептидами, не указанными в данной заявке. Они могут быть введены внутривенно, внутримышечно, внутрикожно, подкожно или внутридермально. Способом введения может быть также и внутриартериальная инъекция, ведущая непосредственно к проблемному органу. Другими способами введения являются трансдермальный, ингаляция в виде пудры или спрея и другие формы доставки, известные в этой области. Композиция может быть введена также перорально и содержать носитель, чтобы предотвратить желудочное расщепление пептида после перорального приема; используется любой другой носитель, известный в этой области (для трансдермального - такой как липосома).

Используемый здесь термин "гибридный пептид" используется для указания пептидов, которые содержат дополнительные пептиды, встроенные в первоначальный биологически активный пептид, имеющий последовательность, обозначенную выше, или его функциональные производные, но все еще сохраняющий по существу сходную активность. Дополнительные пептиды включают в себя лидерные пептиды, которые содержат, например, аминокислотную последовательность, распознаваемую одной или более прокариотическими или эукариотическими клетками, как сигнал для секреции гибридного белка наружу или внутрь клетки. Секреция может быть прямой секрецией или непрямой, опосредованной секреторными везикулами.

Используемые в настоящем описании и в формуле изобретения термины "содержат", "содержит" и "содержащий" означают "включая, но не обязательно этим ограничиваясь". Например, способ, устройство, молекула или другой элемент, который содержит А, В, и С может в точности указывать на содержание А и В. Таким же образом способ, устройство, молекула или другой элемент, которые "включают в себя А и В", могут включать в себя также и некоторые дополнительные стадии, компоненты, атомы или другие элементы.

Используемая здесь терминология "состоящий по существу из" относится к пептиду или полипептиду, который включает в себя аминокислотную последовательность YSV-пептида или одной из его функциональных производных, параллельно с дополнительными аминокислотами на углеводородных и/или амино-концах, и которые поддерживают активность указанных пептидов. Таким образом, в качестве неограничивающих примеров, когда активность YSV-пептида или одной из его функциональных производных есть модулирование иммунной активности и/или нарушение клеточной пролиферации, такой как злокачественная опухоль, пептид или полипептид, "состоящий по существу" из YSV-пептида или одной из его функциональных производных, будет обладать активностью, связанной с модуляцией иммунной активности и/или нарушением клеточной пролиферации, такой как злокачественная опухоль, как представлено здесь в отношении такого пептида, и не будет обладать какими-либо особенностями сам по себе (то есть модификацией связывания с одной или более биологически активными молекулами), что существенно уменьшает способность пептида или полипептида модулировать иммунную активность и/или нарушение клеточной пролиферации, такой как злокачественная опухоль, и что составляет материал для изменения основных или новых особенностей пептида как модулятора иммунной активности. Таким образом, в вышеупомянутом примере полноразмерный природный полипептид, который имеет исходную активность, отличную от модулирующей иммунной активности, и/или нарушения клеточной пролиферации, такой как злокачественная опухоль, и содержащий аминокислотную последовательность YSV-пептида или одной из его функциональных производных где-то внутри него, не составляет пептид или полипептид, "состоящий в основном из" YSV-пептида или одной из его функциональных производных. Сходным образом в вышеуказанном примере генетически сконструированный пептид или полипептид, который имеет исходную активность, отличную от модулирующей иммунной активности, и/или нарушения клеточной пролиферации, такой как злокачественная опухоль, но включает в себя аминокислотную последовательность YSV-пептида или одной из его функциональных производных внутри него, не будет представлять собой пептид или полипептид, "состоящий в основном из" YSV-пептида или одной из его функциональных производных.

Специалисты в этой области легко определят, состоит ли пептид или полипептид по существу из YSV-пептида или одной из его функциональных производных при вышеупомянутом определении, измерив активность пептида или полипептида с использованием теста, который проводится в отношении YSV-пептида для модуляции иммунной активности и/или модуляции нарушения клеточной пролиферации, такой как злокачественная опухоль, включая, но не ограничиваясь ими, цервикальную карциному, злокачественную опухоль печени и лейкемию. Специалисты в этой области легко определяют, состоит ли пептид или полипептид по существу из YSV-пептида или одной из его функциональных производных при вышеупомянутом определении, измерив активность пептида или полипептида, с использованием теста, который проводится в отношении YSV-пептида для модуляции роста или проявления нарушения клеточной пролиферации, включая, но не ограничиваясь ими, злокачественную опухоль, где указанная злокачественная опухоль включает в себя, но не ограничиваясь ими, меланому, злокачественную опухоль легких и злокачественную опухоль, действующую на легочную ткань.

В предпочтительном воплощении термин "состоящий по существу из" может также относиться к пептидам или полипептидам, которые имеют менее 20 аминокислотных остатков, присоединенных к YSV-пептиду, или одной из их функциональным производным. В более предпочтительном воплощении подобная терминология относится к пептидам с менее чем 15 аминокислотными остатками, присоединенными к YSV-пептиду или одной из их функциональных производных. В еще более предпочтительном воплощении подобная терминология относится к пептидам с менее чем 10 аминокислотными остатками, присоединенными к YSV-пептиду, или одной из их функциональных производных. В других предпочтительных воплощениях подобная терминология относится к пептидам или полипептидам с менее чем 6 аминокислотными остатками, присоединенными к YSV-пептиду, или одной из их функциональных производных. В других предпочтительных воплощениях подобная терминология относится к пептидам или полипептидам с менее чем 4 аминокислотными остатками, присоединенными к YSV-пептиду, или одной из их функциональных производных. В наиболее предпочтительных воплощениях подобная терминология относится к пептидам или полипептидам с менее чем 2 аминокислотными остатками, присоединенными к YSV-пептиду, или одной из их функциональных производных.

Фармацевтическая композиция может включать в себя любой из известных фармацевтических носителей. Примеры подходящих носителей включают в себя несколько стандартных фармацевтически приемлемых носителей известных специалистам в этой области. Эти носители включают в себя, не ограничиваясь ими, физиологический солевой раствор, воду, эмульсии, содержащие смеси масла и воды, или эмульсии триглицерида и других типов агентов, наполнителей, покрывающих таблетки оболочкой и капсулы. Выбор соответствующего носителя основан на способе введения фармацевтической композиции.

YSV-пептид и его функциональные производные могут вводиться путем внутривенной инъекции, внутримышечной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, подкожной инъекции или подкожной имплантации. Пептид также может быть введен в любой форме для орального введения, такой как таблетка, суспензия, раствор и другие, обычным способом, без модификации, в облегченной форме, в присутствии или в отсутствие защиты от желудочного переваривания. Пептид также можно использовать для любого местного введения в виде мази, крема, геля и др., в присутствии или в отсутствие устройства, облегчающего чрескожное проникновение. Пептид также может рассматриваться на уровне его генетической последовательности и может быть клонирован в экспрессирующую систему либо как таковой, либо в комбинации с другими пептидными последовательностями, для синтезирования результатирующей пептидной молекулы, для использования активности пептида, как здесь описано.

Доза каждого пептида может составлять от 1 нг до 10 г на кг веса тела. Предпочтительная доза составляет 10 нг - 10 мг на кг, и более предпочтительно - 1 мкг - 1 мг на кг при инъекционном методе введения. Однако эффективная доза может составлять 1 нг на кг веса тела, так как один или более пептидов могут воздействовать через рецепторы, вызывая каскад нормального физиологического ответа. В ином случае один или более пептидов могут только быть инициаторами целого каскада реакций. Для орального приема количество может составлять 1 нг - 10 г в день на кг веса тела, более предпочтительно - 0,1 мкг - 1 г в день на кг веса тела и еще более предпочтительно - 1 мкг - 1 мг в день.

1. Эксперименты, связанные с действием YSV-пептида

1.1.Материалы для 2.1.-2.4.

Мыши BALB/c весом 18-22 г предоставлены Центром Экспериментальных Животных Китайского института научной медицины.

Обычно использовали YSV производства CS Bio, США.

Использовали эмбриональную бычью сыворотку (ЭБС) и среду для культивирования клеток RPMI-1640, Gibco, США МТТ and ConA, Sigma, США

Клетки злокачественной гепатомы человека предоставлены Департаментом Исследования Рака Китайского института научной медицины.

Клетки цервикальной карциномы человека Hela предоставлены Департаментом Иммунологии Медицинского университета Тианджин.

2.1. Действие YSV на трансформацию Т-лимфоцитов in vitro.

2.1.1. Способ (как описано в ссылках 1, и включено в настоящее описание во всей ее полноте)

Здоровых мышей забивали путем дислокации шейных позвонков. Селезенку выделяли и асептически измельчали. Суспензию лимфоцитов селезенки промывали и подгоняли до плотности клеток 5х10⁶ /мл при помощи культуральной среды RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональную бычью сыворотку. YSV разводили культуральной средой PRMI-1640 в различных концентрациях: 2 мкг/мл, 0,4 мкг/мл, 0,08 мкг/мл, 0,016 мкг/мл. Рабочий раствор ConA подгоняли до 1 мг/мл культуральной средой RPMI-1640.

Реагенты помещали в 96-луночный планшет для культивирования клеток в следующем соотношении: 100 мкл/лунку суспензии лимфоцитов, 20 мкл/лунку ConA и 100 мкл/лунку раствора YSV в различных концентрациях, 6 параллельных лунок для каждой концентрации; 100 мкл/лунку суспензии лимфоцитов и 120 мкл/лунку культуральной среды RPMI-1640 (содержащей 10% ЭБС) добавляли в 12 параллельных лунок в качесте отрицательного контроля; 100 мкл/лунку суспензии лимфоцитов, 100 мкл/лунку культуральной среды RPMI-1640 (10% ЭБС) и 20 мкл/лунку ConA добавляли в 12 параллельных лунок в качестве отрицательного контроля.

Клетки инкубировали в течение 68 часов при температуре 37^оС в 5% СО_2, затем осаждали центифугированием при 150 g в течение 10 минут. Супернатант затем удаляли, к клеточному осадку добавляли 50 мкл/лунку МТТ в 1 мг/мл RPMI-1640, и клетки ресуспендировали путем встряхивания в течение 2 минут. Инкубацию продолжали в течение 4 часов. Супернатант удаляли после центрифугирования в течение 10 минут при 150 g. После промокания досуха бумажным фильтром клетки смешивали с 120 мкл 40 мМ HCL-2-пропанолом и встряхивали в течение 3 минут. Оптическую плотность в каждой ячейке измеряли при 570 нм, OD₅₇₀нм, соотносили с таковой при 630 нм, посредством ELISA ридера.

2.1.2 Результаты.

Таблица 1
Действие YSV на трансформацию лимфоцитов
Группа	Концентрация YSV	N	X±SD (OD)
YSV	2 мг/мл	6	0,18±0,00*
YSV	0,4 мг/мл	6	0,18±0,01*
YSV	0,08 мг/мл	6	0,23±0,00*
YSV	0,016 мг/мл	6	0,21±0,01*
Отрицательный контроль	-	12	0,11±0,01*
Положительный контроль	-	12	0,14±0,00
*Относительно группы положительного контроля

2.1.3 Заключение.

Было обнаружено, что при концентрации от 0,01 мкг/мл до 2 мкг/мл YSV способен проявлять активность в стимулировании трансформации Т-лимфоцитов in vitro, со статистической значимостью (р<0,001).

2.2 Действие YSV на пролиферацию клеток культуры злокачественной опухоли печени человека BEL7402 in vitro

2.2.1 Способ (как описано в ссылке 2 и включено здесь во всей ее полноте)

Клетки злокачественной опухоли печени человека BEL7402 в логарифмической фазе роста разделяли путем инкубации от 2 до 3 минут в забуференном фосфатом физиологическом растворе рН 7,4 (ФБС), содержащем 0,05% трипсин и 0,02% ЭДТА. Клетки анализировали путем инверсионно-фазово-контрастной микроскопии. Супернатант удаляли после цитоплазматического пикноза и наблюдали дилатацию клеточного компартмента. Для окончания обработки добавляли несколько миллилитров культуральной среды RPMI-1640 с 10% ЭБС. Клетки осторожно собирали с помощью пипетки. Суспензию клеток собирали центрифугированием при 150 g в течение 10 минут и дважды промывали холодным раствором Д-Хенкса, с последующим повторным суспендированием и центрифугированием. Промытые клетки ресуспендировали в среде RPMI-1640 с 10% ЭБС и доводили до плотности 5х10⁴/мл. Обработанные клетки BEL7402 помещали в 96-луночный планшет для культивирования клеток, по 100 мкл на лунку. Клетки инкубировали 24 часа при температуре 37°С в 5% СО₂ для реактивации и прикрепления.

Эксперимент включал в себя три группы тестирования с различными концентрациями YSV и отрицательный контроль. Конечная концентрация YSV в культуральной среде составляла 20 мкг/мл, 10 мкг/мл и 5 мкг/мл. В группе отрицательного контроля раствор YSV заменяли культуральной средой RPMI-1640 с 10% ЭБС. Каждая группа содержала пять параллельных лунок. Клетки инкубировали в течение 48 часов при температуре 37^оС, 5% СО₂.

Затем клетки осаждали центрифугированием при 150 g в течение 10 минут. Супернатант далее удаляли, добавляли к клеточному осадку 100 мкл/лунку МТТ в 0,5 мг/мл в RPMI-1640, и клетки ресуспендировали встряхиванием в течение 2 минут. Инкубацию продолжали в течение 4 часов. Супернатант удаляли после центрифугирования при 150 g в течении 10 минут. После высушивания бумажным фильтром добавляли к клеточному осадку 100 мкл/лунку 40 мМ HCl-2-пропанол и встряхивали в течение 3 минут. Оптическую плотность, измеренную при 570 нм в каждой лунке, соотносили к таковой при 630 нм, посредством ELISA-ридера.

Результаты

Таблица 2
Ингибирование роста клеток злокачественной опухоли печени BEL7402 in vitro посредством YSV
Концентрация YSV	N	Величина оптической плотности	% ингибирования
20 мг/мл	5	0,27±0,01*	23,7
10 мг/мл	5	0,22±0,01*	38,0
5 мг/мл	5	0,31±0,01*	9,8
Отрицательный контроль	5	0,36±0,01
*Сравнение с отрицательным контролем, р<0,05

2.2.3. Заключение

При концентрации от 5 мкг/мл до 20 мкг/мл, была обнаружена способность YSV ингибировать рост клеток злокачественной генатомы BEL7402 in vitro со статистической значимостью (p<0,05).

2.3. Действие YSV на пролиферацию клеток культуры лейкемии человека K562 in vitro

2.3.1. Способы (как описано в ссылке 2 и включено здесь во всей ее полноте)

Клетки лейкемии человека К562 в логарифмической фазе роста доводили до плотности 5x10⁴/мл культуральной средой RPMI-1640, содержащей 10% ЭВС. Клетки размещали в 96-луночный культуральный планшет, по 100 мкл/лунку. Клетки икубировали в течение 24 часов при 37°С в 5% СО₂. Эксперимент включал пять групп тестирования с различными концентрациями YSV в культуральной среде и отрицательную контрольную группу только с культуральной средой. Конечные концентрации YSV составляли 40 мкг/мл, 20 мкг/мл, 10 мкг/мл и 5 мкг/мл. Каждая группа содержала пять параллельных лунок. К обрабатываемым клеткам добавляли 100 мкл/лунку тестируемого раствора. Клетки икубировали в течение 48 часов при температуре 37°С, в 5% СО₂.

Затем клетки осаждали центрифугированием при 150 g в течение 10 минут. Супернатант удаляли, и в клеточный осадок добавляли 100 мкл/лунку раствора МТТ в 0,5 мг/мл RPMI-1640, и клетки ресуспендировали встряхиванием в течение 2 минут. Инкубацию продолжали в течение 4 часов. После центрифугирования при 150 g в течение 10 минут супернатант удаляли. После просушивания бумажным фильтром к клеточному осадку добавляли 100 мкл/лунку 40 мМ HCl-2-пропанол и встряхивали в течение 3 минут. Оптическую плотность, измеренную при 570 нм в каждой ячейки соотносили к таковой при 630 нм, посредством ELISA-ридера.

2.3.2. Результаты

Таблица 3
Ингибирующее действие YSV на клетки лейкемии человека К562 in vitro
Концентрация	N	Величина оптической плотности	% ингибирования
40 мг/мл	5	0,38±0,00*	10,8
20 мг/мл	5	0,38±0,00*	11,3
10 мг/мл	5	0,39±0,01*	9,3
5 мг/мл	5	0,39±0,01*	9,7
Отрицательный контроль	5	0,43±0,01
*Сравнение с отрицательным контролем, р<0,05

2.3.3 Заключение

При концентрации от 5 мкг/мл до 40 мкг/мл была обнаружена способность YSV ингибировать рост клеток лейкемии человека К562 in vitro, со статистической значимостью (p<0,05).

2.4. Ингибирование роста клеток цервикальной карциномы человека Hela in vitro

2.4.1 Способ (как описано в ссылке 2 и включено здесь во всей ее полноте)

Клетки Hela цервикальной карциномы человека в логарифмической фазе роста отделяли путем инкубации от 2 до 3 минут с ФБС, содержащим 0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА. Клетки анализировали путем инверсионно-фазово-контрастной микроскопии. Супернатант удаляли после пикноза цитоплазмы и наблюдали дилатацию клеточного компартмента. Для завершения расщепления добавляли несколько миллилитров среды RPMI-1640 с 10% ЭБС. Клетки осторожно собирали с помощью пипетки. Клетки собирали центрифугированием при 150g в течение 10 минут и дважды промывали холодным раствором Хенкса, с последующим повторным суспендированием и центрифугированием. Клеточный осадок ресуспендировали в среде RPMI-1640 с 10% ЭБС и доводили до плотности 5х10⁴/мл. Обработанные клетки помещали в 96-луночный культуральный планшет, по 100 мкл/лунку. Клетки инкубировали в течение 24 часов при температуре 37°С, с 5% СО₂ для реактивации и прикрепления.

Эксперимент состоял из двух групп тестирования с различными концентрациями YSV в культуральной среде и отрицательным контролем только с культуральной средой. Конечная концентрация YSV составляла 10 мкг/мл и 5 мкг/мл. Каждая группа содержала пять параллельных лунок. К обрабатываемым клеткам добавляли 100 мкл/лунку тестируемого раствора. Клетки инкубировали в течение 48 часов при температуре 37°С в 5% СО₂.

Клетки осаждали центрифугированием при 150g в течение 10 минут. Супернатант отбрасывали, а к клеточному осадку добавляли 100 мкл/лунку МТТ 0,5 мг/мл в RPMI-1640, клетки ресуспензировали встряхиванием в течение 2 минут. Инкубацию продолжали в течение 4 часов. Супернатант отбрасывали после центифугирования при 150g в течение 10 минут. После высушивания бумажным фильтром к клеточному осадку добавляли 100 мкл/лунку 40 мМ HCl-2-пропанола и встряхивали в течение 3 минут. Оптическую плотность, измеренную при 570 нм в каждой ячейке, соотносили с таковой при 630 нм, посредством ELISA-ридера.

2.4.2 Результат

Таблица 4
Эффект ингибирования роста клеток цервикальной карциномы человека Hela посредством YSV in vitro
Концентрация YSV	N	ОП570нм	% ингибирования
10 мг/мл	5	0,22±0,01*	19,6
5 мг/мл	5	0,22±0,00*	18,4
Отрицательный контроль	5	0,24±0,01	-
*Сравнение с отрицательным контролем, р<0,05

2.4.3 Заключение

При концентрации от 5 мкг/мл до 10 мкг/мл была найдена способность YSV ингибировать рост клеток цервикальной карциномы человека Hela in vitro, со статистической значимостью (p<0,05).

2.5 Действие YSV на рост лейкемии клеток К562 человека, трансплантированных голым мышам

2.5.1 Материалы

YSL: обычно использовали YSL, синтезированный в Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co., Ltd

Физиологический раствор: Китай OTSUKA Pharmaceutical Co., Ltd.

Культуральная среда RPMI-1640: GIBCO, USA.

Эмбриональная бычья сыворотка (ЭБС): HYCLONE, USA.

Линия клеток К562 лейкемии человека: Hematological Disease Research Department, China Medical Science Institute.

Здоровые голые мыши (BALB/C (nu/nu) SPF, самцы возраста 4-5 недель, весом 18-22 г): Shanghai Tumor Research Department, China Medical Academy of Science.

2.5.2 Методы

2.5.2.1 Культуральная среда

Клетки К-562 содержали в среде RPMI-1640 с 10% ЭБС при температуре 37°С в 5% СО_2.

2.5.2.2 Подготовка мышиной модели лейкемии ^[3]

Клетки К-562 в логарифмической фазе роста доводили до 1,6x10⁸/мл средой RPMI-1640. 0,1 мл этого раствора подкожно вводили в правый бок здоровым голым мышам для формирования мышиной модели лейкемии.

2.5.2.3 Создание групп животных и введение дозы

Мышей-носителей клеток лейкемии человека К-562 наугад распределяли по группам: контрольная с физиологическим раствором (0,2 мл/день) и с YSV (160 мкг/кг/день). Тестируемое вещество разводили в 0,2 мл физиологического раствора, введение тестируемого вещества путем внутрибрюшинной инъекции начинали на следующий день после прививки К-562, один раз в день в течение 30 последовательных дней.

2.5.2.4 Параметры мониторинга

Общее состояние мышей проверяли ежедневно, размер опухоли измеряли каждые 3-4 дня. Объем опухоли (мм³) V=(1/6)πXYZ, где X, Y, и Z - размеры опухоли в трех измерениях.

На следующий день после введения тестируемого вещества, опухоль удаляли, вес опухоли записывали. Индекс ингибирования роста опухоли (%)=(средний вес опухоли контрольной группы минус средний вес опухоли пролеченной группы/средний вес опухоли контрольной группы x 100).

2.5.2.5 Статистический метод

Все данные приведены в виде среднего арифметического ± SD. Данные анализировали, используя ANOVA-тест компьютерной программы SPSS. Значение р<0,05 считали статистически значимым.

2.5.3 Результаты

Таблица 1
Действие YSV на рост клеток К-562 лейкемии человека, трансплантированных голым мышам
Группы	Дозировка	N	Вес опухоли (г)	Объем опухоли (см3)	Степень ингибирования (%)
YSV	160 мг/кг/день	10	2,95±1,58*	3,15±1,75*	37,9
Физиологический раствор	0,2 мл/день	14	4,75±2,21	5,08±2,15	-
* по сравнению с группой физиологического раствора, P<0,05

2.5.4 Заключение

YSV при соответствующей дозировке способен значительно ингибировать рост клеток лейкемии человека К-562, трансплантированных голым мышам, со статистической значимостью по сравнению с контрольной группой физиологического раствора (P<0,05).

2.6 Ингибирование посредством YSV роста меланомы В16 у мышей-реципиентов C57BL/6

2.6.1 Материалы

2.6.1.1 Пептид

YSV обычно синтезировали на фирме Kangzhe Pharmaceutical Co., Ltd, PR China.

2.6.1.2. Контрольные вещества и другие реагенты

Циклофосфамид (Су): Shanghai Hualian Pharmaceutical Co., Ltd.

Физиологический раствор: China Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.

Культуральная среда RPMI-1640: GIBCO, USA.

Эмбриональная бычья сыворотка: HYCLONE, USA.

Раствор Хенкса: Dingtian Co., Ltd.

2.6.1.3 Линия клеток

Клетки линии В16 меланомы мыши: получены из Института Биохимии и Клеточной Биологии, China Medical.

2.6.1.4 Животные

Здоровые мыши С57 BL/6 (SPF, самцы, возраст 4-5 недель, весом 14-18 недель): получены от Academy of Military Medical Sciences.

2.6.2 Способ

2.6.2.1 Культура клеток

Клетки В16 выдерживали в среде RPMI-1640 с 10% ЭБС при температуре 37°С и 5% СО_2.

2.6.2.2 Подготовка мышиной модели меланомы ^[4]

Культуру мышиной меланомы В16 в логарифмической фазе роста доводили до 2,5x10⁶ /мл раствора Хенкса. 0,2 мл указанного разведения вводили подкожно в правую подмышечную впадину здоровым мышам линии C57 BL/6 для формирования модели мышиной меланомы.

2.6.2.3 Группы животных и введение тестируемого вещества

Мышей-носителей меланомы В16 наугад формировали в следующие группы: физиологический раствор (0,2 мл/день), циклофосфоамид (Су) (20 мг/кг/день), и YSV (640 мкг/кг/день и 320 мкг/кг/день), тестируемые вещества разводили в 0,2 мл физиологического раствора и вводили внутрибрюшинно один раз в день в течение 20 последовательных дней, для начала формирования мышиной модели меланомы, со следующего дня после трансплантации опухоли.

2.6.2.4 Параметры мониторинга

Со следующего дня после трансплантации опухоли ежедневно наблюдали общее состояние мышей и рост опухоли.

На следующий день после последнего введения тестируемого вещества опухоли удаляли, и проводили измерение веса опухоли.

Скорость ингибирования опухоли (%)=(1-средний вес опухоли в тестируемой группе/средний вес группы в контрольной группе) x 100%)

2.6.2.5 Статистический анализ

Результаты представлены как среднее арифметическое ± SD. Статистический анализ проводили, используя ANOVA-тест компьютерной программы SPSS. Величины P<0,05 взяты как статистические значимые.

2.6.3 Результаты

Таблица 1
Ингибирование роста меланомы В16 у мышей линии C57BL/6 посредством YSV
Группы	Дозировка	N	Вес опухоли (г)	Степень ингибирования (%)
YSV	640 мг/кг/день	9	1,47±0,92*	44,6
YSV	320 мг/кг/день	8	1,60±1,21*	39,6
Циклофосфамид	20 мг/кг/день	9	0,49±0,68*	81,5
Физиологический раствор	0,2 мл/день	10	2,64±0,68
* p<0,05 по сравнение с группой физиологического раствора

2.6.4 Заключение

Было обнаружено, что YSV при соответствующей дозировке способен значительно ингибировать рост В16 меланомы у мышей линии C57BL/6, со статистической значимостью по сравнению с физиологической контрольной группой (p<0,05).

2.7 Ингибирующее действие YSV на ксенотрансплантат легочной карциномы человека А549 у голых мышей

2.7.1 Материалы

2.7.1.1 Пептиды

YSV синтезирован по контракту на фирме CS Bio Co., США.

2.7.1.2 Контрольные вещества и другие реагенты

Циклофосфамид (Су): Shanghai Hualian Pharmaceutical Co., Ltd.

Физиологический раствор: ChinaOTSUKA Pharmaceutical Co., Ltd.

Эмбриональная бычья сыворотка (ЭБС): HYCLONE, США.

2.7.1.3 Животные

Здоровых бестимусных голых мышей линии BALB/c (nu/nu) (SPF, в возрасте 4-5 недель, весом 18-22 г) покупали в Шанхайской Академии Опухолей Китайской Медицинской академии наук. В первом эксперименте использовали самок. Во втором эксперименте использовали самцов.

Голых мышей-носителей легочной карциномы человека А549 получали в Шанхайской Академии Опухолей Китайской Медицинской академии наук.

2.7.2 Методы

2.7.2.1 Подготовка мышиной модели легочной карциномы у голых мышей ^.[5]

Отбирали голых мышей с ксенотрансплантатом легочной карциномой человека А549 диаметром более 1 см, с хорошим ростом. Асептически вырезали опухолевую массу, дробили на куски 2-4 мм³ и погружали в RPMI1640. Модель легочной карциномы голых мышей получали путем трансплантации опухолевой массы подкожно на спину здоровых голых мышей около шеи посредством надреза на уровне вентрально-грудного отдела.

2.7.2.2 Создание групп и способы введения лекарства

Голых мышей-носителей ксенотрансплантатов А549, наугад делили на группы: контроль физиологического раствора (0,2 мл/день), YSV в различных дозировках и контроль Су (0,2 мг/кг/день). Тестируемое вещество разводили в 0,2 мл физиологического раствора и вводили внутрибрюшинно мышам, начиная со следующего дня после трансплантации, по одному разу в день в течение 40 последующих дней.

2.7.2.3 Мониторинг параметров

Общее состояние мышей наблюдали ежедневно. Мышей взвешивали каждые 3-4 дня и измеряли объем опухоли V=(1/6)πXYZ, где X,Y и Z-размеры опухоли в 3 измерениях.

Опухоль удаляли на следующий день после последней инъекции, опухоль взвешивали и измеряли ее объем. Опухоль проверяли на признаки некроза. Индекс ингибирования опухоли = (средний вес опухоли из физиологической группы - средний вес опухоли тестируемой группы)/средний вес опухоли физиологической группы х 100%).

Выбирали участки опухоли с хорошим состоянием роста и крепкой текстурой, без изъязвлений или некрозов, отделяли и фиксировали в 10% формальдегиде для патологического исследования.

2.7.2.4 Статистический анализ

Статистический анализ проводили при помощи компьютерной программы SPSS, используя одномерный ANOVA-анализ.

2.7.3 Результаты

Таблица 1
Действие YSV на рост трансплантатов легочной карциномы человека А549 у самок голых мышей - эксперимент 1
Группы	Дозировка	N	Вес опухоли (г)	Объем опухоли (см3)	Степень ингибирования опухоли (%)
YSV	640 мг/кг/день	11	1,56±1,08*	1,17±0,84	37,4
YSV	320 мг/кг/день	11	1,69±0,70*	0,84±0,45*	32,2
YSV	160 мг/кг/день	12	1,67±0,97*	0,92±0,79*	32,8
Cy	20 мг/кг/день	12	1,50±0,75*	1,02±0,47*	39,8
Физиологический раствор	0,2 мл/день	14	2,49±1,02	1,87±1,10	-
* P<0,05 контроль физиологического раствора

Таблица 2
Действие YSV на рост трансплантатов легочной карциномы человека у самцов голых мышей - эксперимент 2
Группы	Дозировка	N	Вес опухоли (г)	Объем опухоли (см3)	Степень ингибирования (%)
YSV	160 мг/кг/день	8	0,74±0,31*	0,78±0,41	50,8
Cy	20 мг/кг/день	10	0,73±0,42*	0,49±0,34*	51,9
Физиологический раствор	0,2 мл/день	10	1,51±0,79	1,348±0,69	-
* P<0,05 контроль физиологического раствора

2.7.4 Заключение

Было обнаружено, что YSV при соответствующих дозировках способен ингибировать рост трансплантатов легочной карциномы человека А549 у голых мышей, со статистической значимостью по сравнению с контролем физиологического раствора (р<0,05).

3. Основное заключение

Обнаружено, что YSV способен стимулировать трансформацию Т-лимфоцитов, и, следовательно, показано, что YSV может быть использован в качестве иммуномодулятора в применении к человеку.

Обнаружено, что YSV способен ингибировать рост клеток злокачественной гепатомы BEL7402, клеток лейкемии человека К562 и клеток цервикальной карциномы Hela in vivo, также как и клеток лейкемии человека К562, клеток мышиной меланомы В 16 и клеток легочной карциномы человека А549 in vitro. Это указывает на то, что YSV может быть использован в лечении нарушений клеточной пролиферации у человека.

Ссылки

1. Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen.

Methodology of pharmacological experiment (3rd edition).

People's Health Publishing House. 2002, p 1427.

2. Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen. Methodology of pharmacological experiment (3rd edition). People's Health Publishing House. 2002, pl785-1786.

3.Potter G K, Shen R N, Chiao J W et al. Nude mice as models for human leukemia studies. Am J Pathol, 1984, 114: 360.

4. Zhunjiang Xie, Wenqing Liu, Yechun He et al. The inhibition of ginseng glycan and IL-2 on mice melanoma cells in vivo. ACTA ANATOMICA SINICA, 2002,33 (5):538-540.

5. Hanyue, The research and experiment techniques of anticarcinoma drugs. (lst edition). Beijing medical university and China Xiehe medical university united Publishing House. (1997)299.

II. ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ

Генная терапия на основе пептидных последовательностей связана с созданием последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует один из этих пептидов. Нуклеиновая кислота может быть синтезирована химически и оперативно лигирована с промотором и клонирована в вектор экспрессии. Как форма генной терапии вектор экспрессии затем вводится в организм человека для его экспрессии в клетке человека. Применяемый здесь термин "генетические векторы" включает в себя эти векторы экспрессии. Векторы, которые могут быть использованы для генной терапии, включают в себя аденоассоциированный вирус (Mizuno, M. et al. (1998). Jpn J Cancer Res 89,76-80), LNSX vectors (Miller, A. D. et al. (1993) Methods Enzymol 217,581-599) and lentivirus (Goldman, M. J. et al. (1997) Hum Gene Ther 8,2261-2268).

Другие носители для доставки пептида включают в себя векторы экспрессии, кодирующие желаемый пептид, который может быть перенесен в организм и который может реплицироваться в организме хозяина, которому желательно вводить пептид без значительного вреда для здоровья организма хозяина. Например, векторы экспрессии могут быть перенесены в организм, который не является патогенным по отношению к организму хозяина, которому желательно ввести пептид. В некоторых воплощениях, вектор экспрессии продуцирует желаемый пептид в бактериальном или грибковом организме, который не оказывает значительных вредных эффектов на здоровье организма хозяина, которому предстоит вводить пептид. Например, вектор экспрессии, кодирующий желаемый пептид может быть вектором экспрессии, который продуцирует желаемый пептид в организме, таком как лактобактерия, E. Coli или дрожжи. В одном воплощении вектор экспрессии продуцирует желаемый пептид в микробе, в норме содержащемся в кишечнике млекопитающих, или в микробе, к которому толерантен желудочно-кишечный тракт млекопитающего. Некоторые разновидности микробов, в которых желаемый пептид может экспрессироваться, включают в себя, не ограничиваясь ими, виды лактобактерий, такие как L. acidophilus, L.amylovorus, L. casei, L. crispatus, L.gallinarum, L. gasseri, L.johnsonii, L.paracasei, L. plantarum, L.reuteri, L. rlaamnosus или иные; виды бифидобактерий, такие как B.adolescentis, B.animales, B.bifiduin, B.breve, B.infantis, B.lactis, B.loragum или другие; Enterococcus faecalis или Ent. facium; Sporolactobacillus inulinus; Bacillus subtilis или Bacillus cereus; Escherichia coli; Propionibacterium freudenreichii; или Saccharomyces cerevisiae или Saccharomyces boulardii.

Последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют любой из пептидов согласно изобретению, синтезировали химическим способом или получали другими способами, включая, но не ограничиваясь ими, реверсионную транскрипцию мРНК в ДНК-молекулы, вводили в векторы экспрессии для генного переноса в желаемый организм методом генной инженерии, известным специалистам в данной области. Векторами экспрессии могут быть ДНК-векторы или РНК-векторы. Например, вектор экспрессии может быть создан на основе плазмиды, или генетических элементов вируса. Векторы экспрессии могут быть векторами, которые реплицируются экстра-хромосомно или векторами, которые интегрируются в хромосому.

Векторы экспрессии включают в себя промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей пептид согласно изобретению. Промотор может быть регулируемым промотором, таким как индуцибельный промотор, или конститутивным промотором. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота, кодирующая пептид согласно изобретению функционально связана с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая направляет секрецию пептида. Например, нуклеиновая кислота, кодирующая пептид согласно изобретению, может быть функционально связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей сигнальный пептид.

В некоторых воплощениях, векторы экспрессии, которые сконструированы для кодирования пептидов согласно изобретению, могут быть векторами экспрессии, которые адаптированы для экспрессии пептидов согласно изобретению в видах бактерий, которые составляют нормальную клеточную флору кишечника млекопитающих, таких как виды Lactobacillus и Bacillus subtilis. Примеры таких векторов экспрессии могут быть найдены в Патенте США № 6100388 Casas и № 5728571 Bellini соответственно. Эти документы включены в настоящее описание посредством ссылки во всей ее полноте. Нужно заметить, что может быть использован любой вектор экспрессии, который облегчает экспрессию пептида согласно изобретению в организме, безвредном для здоровья организма хозяина, для введения которому он предназначен.

В некоторых воплощениях векторы экспрессии, которые созданы для кодирования пептидов согласно изобретению, могут быть векторами экспрессии, которые адаптированы для экспрессии пептида согласно изобретению в разновидность дрожжей, к которым толерантен кишечник млекопитающих, таким как Saccharomyces cerevisiae или, более предпочтительно, Saccharomyces boulardii, которые могут колонизировать кишечник человека и используются для лечения определенных видов диареи. Могут быть использованы векторы экспрессии дрожжей, которые конструктивно экспрессируют гетерологичные белки и пептиды, являются высокостабильными и, следовательно, хорошо передаются потомственным клеткам в процессе митозов и мейозов и могут содержать кодирующую последовательность сигнального пептида или пептидов, которые осуществляют направленную секрецию высоких уровней рекомбинантного белка. Пример такого дрожжевого вектора приведен в Патенте США № 631585 Jang и др., который включен в настоящее описание посредством ссылки во всей ее полноте.

Векторы экспрессии, кодирующие пептиды согласно изобретению, могут быть внедрены в организм, в котором предполагается экспрессировать эти пептиды посредством технологий, известных в данной области. Такие технологии включают в себя традиционные методы трансформации бактерий, дрожжей или других микробов путем использования химически конпетентных бактериальных клеток, путем электропорации или литий-ацетатной трансформации (для дрожжей), например, а также с использованием недавних успехов в трансплантации бактериальных видов, не поддающихся указанным процедурам. В некоторых воплощениях векторы экспрессии вводят в молочнокислые бактерии, известные как не поддающиеся трансплантации, используя метод, открытый Leer и др., (WO 95/35389), описание которого включено здесь посредством ссылки во всей ее полноте. Вводимые последовательности могут быть внедрены в микробную хромосомную ДНК или могут оставаться в виде экстрахромосомных элементов ДНК.

Этот генно-инженерный микроб, содержащий вектор экспрессии, может затем быть инокулирован в пищевод, вагину, трахею и т.д. для выполнения поддерживающей иммунотерапии. В некоторых воплощениях организмы, экспрессирующие пептиды согласно изобретению, поглощаются в неактивной форме или, предпочтительнее, в живой форме. В кишечнике эти микроорганизмы вырабатывают указанные пептиды, высвобождают их в просвет посредством секреции или в результате лизиса микроорганизма или иначе преподносят пептиды хозяину, посредством чего и осуществляется джействие пептидов на организм хозяина. В других воплощениях пептиды доставляются хозяину на мембране слизистой носового прохода, вагины или тонкой кишки.

Другой способ лечения - использование липосом как способ доставки специфической нуклеиновой кислоты к клеткам в организме человека. Нуклеиновую кислоту (такую как вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую последовательность, которая кодирует пептиды последовательностей от ID N.I до ID N.30) доставляли в среду, которая поддерживает клеточное поглощение и внедрение в хромосомы, как описано Gao, X. и Huang, L. (1995) Gene Ther 2,710-722, и в Патенте США 6207456. С другой стороны, пептид сам по себе может быть инкапсулирован в липосому и доставлен напрямую, с использованием метода, описанного в Патенте США №6245427. Все научные публикации и патенты, указанные выше, включены здесь посредством ссылки во всей ее полноте.

Последовательности нуклеиновых кислот, используемые для вышеуказанных генной терапии и способа лечения, включают в себя последовательности, которые кодируют эти пептиды и их функциональные производные. Любая одна из многочисленных последовательностей нуклеиновых кислот может быть использована для кодирования этих пептидов и их производных, на основе на вырожденности кода. Следующие документы включены здесь посредством ссылок во всей их полноте.

1. Principles of Pre-clinical Research of New Drugs, People's Republic of China. 1993, 7: 134-135 Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen. Methodology of pharmacological experiment. People's Health Publishing House. 1991,1221-1234.

2. Principle of new drug research in pre-clinic issued by Ministry of Health, People's Republic of China. 1993, 7: 140.

3. Jinsheng He, Ruizhu Li, Tingyi Zong. The study on MTT reduction method of testing NK cell activity. China Immunology Journal. 1996, 1 (6): 356-358.

4. QianWang. Modern medical experiment method. People's Health Publishing House. 1998, 482-483.

5. Principle of new drug research in pre-clinic issued by Ministry of Health, People's Republic of China. 1993, 7: 141.

6. Principle of new drug research in pre-clinic issued by Ministry of Health, People's Republic of China. 1993, 7: 132-133.

7. Principle of new drug research in pre-clinic issued by Ministry of Health, People's Republic of China. 1993, 7: 128-129.

8. Yuanpei Zhang, Huaide Su. Phamalogical experiment (second edition). People's Health Publishing House. 1998, 137-138.

9. Jiatai Li, clinical pharmacology (second edition). People's Health Publishing House. 1998, 1338-1339.

III ПЕПТИДНЫЕ КОНЪЮГАТЫ И РЕЦЕПТУРНЫЙ СОСТАВ С YSV И ЕГО ПРОИЗВОДНЫМИ, А ТАКЖЕ КОМПОЗИЦИИ С YSV И ЕГО ПРОИЗВОДНЫМИ

Биологически активные пептиды согласно изобретению могут быть конъюгированы с другими биологически эффективными или полезными молекулами, с получением дополнительного эффекта или применения или для усиления их терапевтической эффективности. В данной области известно много потенциальных конъюгирующих молекул, их биологические эффекты и способы конъюгации молекул с пептидами. Для других кандидатов в партнеры конъюгации химические реакции для конъюгирования с ними указанных пептидов могут быть определены специалистами без избыточного экспериментирования. Эффективные молекулы описаны ниже. Описаны специфические примеры того, как различные пептиды согласно настоящему изобретению могут быть конъюгированы с их эффективными молекулами, а также описаны биологические свойства полученного в результате продукта конъюгации. Понятно, что другие пептиды согласно изобретению также могут быть конъюгированы при подобных реакциях.

YSV и его производные имеют отчетливый терапевтический эффект в отношении определенной клетки или вида ткани. Есть одна важная цель конъюгации молекул в пептидные лекарства - это нацеливание пептида на особый локус или компартмент в пределах организма индивидуума, подлежащего лечению. Пептидное лекарство, которое вводят, чтобы вызвать изменение в определенном типе клеток или ткани, может воздействовать также и на другие части организма, иногда с отрицательными результатами. При такой концентрации пептид имеет более сильное действие, чем сходное молярное количество подобных, неконъюгированных пептидов. С другой стороны, доза конъюгированного пептидного лекарства, нацеленного на участок его терапевтической активности, может быть значительно ниже, чем доза, необходимая для получения такого же терапевтического эффекта от свободной, неконъюгированной формы лекарства.

Другим, полезным эффектом пептидного лекарства, нацеленного в область, где его активность наиболее желаема, является сокращение его нежелательного побочного эффекта. Пептидное лекарство, которое вводится для того, чтобы изменить определенную клетку или определенную ткань, может также производить свое действие и в другой области в пределах индивидуума, и иногда с нежелательными результатами. Нацеливая активность пептида на желаемую область посредством конъюгации с нацеливающей молекулой, можно уменьшать концентрацию пептида в других частях организма, а следовательно, уменьшать побочный эффект.

Пептиды, включающие в себя, состоящие в основном из или состоящие из одного из YSV или его функциональных производных, могут быть конъюгированы с различными молекулами для нацеливания в различные области человеческого организма. Некоторые технологии конъюгации, описанные ниже, для нацеливания пептида на желаемую область, так же, как и другие технологии конъюгаций, известные специалистам в данной области, могут быть использованы для любого из пептидов согласно изобретению. Например, была продемонстрирована селективная доставка лекарства против гепатита В к клеткам печени (Fiumeetal., Ital J Gastroenterol Hepatol, 29(3):275,1997, которая включена здесь посредством ссылки во всей ее полноте). В этом исследовании конъюгировали аденинарабинозидмонофосфат (ара-АМФ), фосфорилированный нуклеозидный аналог, активный против вируса гепатита В, с лактозоаминированным альбумином человека, макромолекулой, оканчивающейся галактозилом. Печеночные клетки экспрессируют рецепторный белок, который взаимодействует с терминальными галактозильными остатками с высокой степенью сродства. Благодаря связыванию с этим рецептором конъюгированное лекарственное средство будет селективно поглощаться клетками печени. После абсорбции конъюгированное лекарственное средство доставляется в лизосомы, где связь между двумя компонентами конъюгированного лекарственного средства разрывается, высвобождая ара-АМФ в его активной форме. В вышеназванном исследовании конъюгированное лекарственное средство было так же эффективно, как и свободный ара-АМФ при лечении пациентов с инфекцией хронического гепатита В, но не приводило к клиническому побочному эффекту, такому как нейроинтоксикация, которая проявляется при введении свободного ара-АМФ. Такой подход может быть использован с любыми из пептидов согласно изобретению.

В исследовании, сходном с одним из вышеназванных исследований, той же исследовательской командой (Di Stefanoet al., Biochem. Pharmacol., 61 (4): 459, 2001) был конъюгирован противоопухолевый химиотерапевтический агент 5-флуоро-2-дезоксиуридин (FUdR) с лактозоаминированным поли-L-лизином, с тем, чтобы нацелить соединение на печень и лечить микрометастазы печени. Лекарство селективно поглощалось клетками печени, которые расщепляли связь между FUdR и нацеливающей молекулой. Часть свободного FUdR затем покидает клетки печени и создается локализованная терапевтическая концентрация противоопухолевого агента. Эта концентрация достаточна для фармакологической активности на метастазирующие клетки, которые инфильтрировали печень. Так как лекарство селективно концентрируется в печени, доза конъюгированного лекарства может быть значительно ниже, чем наименьшая фармакологически активная доза свободного, неконъюгированного состава. Эта стратегия может быть реализована с любым из пептидов согласно изобретению. Например, конъюгация лактозоаминированного поли-L-лизина с YSV может значительно уменьшить дозу, необходимую для лечения инфекции гепатита В и злокачественной опухоли печени индивидуума.

Нацеливание соединений на определенный тип ткани или клеток в пределах организма достигнуто для целого ряда различных типа тканей и клеток. Например, опухолевые клетки часто экспрессируют на своих поверхностях аномально высокие уровни рецепторов пептидных гормонов, таких как бомбезин, лютенизирующий гормон-рилизинг-гормон и соматостатин. В одном исследовании противоопухолевое соединение паклитаксел (таксол) селективно нацеливали на гормон-секретирующие клетки опухоли, которые экспрессируют рецепторы соматостатина с высокой плотностью, посредством конъюгации лекарства с остреотидом, аналогом соматостатина. Остреотид, конъюгированный с таксолом, так же эффективен, как и свободный таксол, но с уменьшенной токсичностью по отношению к нормальным клеткам. (Huang et al., Chem. Biol., 7(7):453, 2000). Несколько пептидов согласно изобретению, таких как CMS024 и CMS034, показали сильную противоопухолевую активность при исследованиях на животных. Используя технику Huang et al. для создания конъюгатов этих пептидов с остреотидом, можно получить потенциально противораковое лечение, нацеленное на клетки опухоли, экспрессирующие высокие уровни соматостатина. Этот подход может быть приспособлен для нацеливания на клетки опухоли, избыточно экспрессирующие любое количество рецепторов пептидных гормонов. В другом примере нацеливания лекарства на специфический вид ткани использовали поли(L-аспарагиновую кислоту) как молекулу-переносчик для адресной доставки лекарственного средства специфически в толстый кишечник (Leopold et al., J.Pharmacokinet. Biopharm., 23(4):397, 1995).

Помимо вышеуказанного нацеливания пептидного лекарственного средства на определенные клетки или типы тканей, конъюгация пептидов, включающих в себя, состоящих в основном из или состоящих из YSV или его функциональных производных, с молекулами-носителями может предоставить другие способы усиления доставки пептидного лекарственного средства, и, следовательно, увеличить или улучшить их терапевтический эффект. Любая из описанных ниже конъюгационных технологий может быть использована с любым из пептидов согласно изобретению, так же, как и другие технологии, известные специалистам в данной области. Эффективность любого лекарства будет снижена, если соединение не будет доставлено к цели его действия. Лекарство должно быть транспортировано быстро к месту его активности без существенной потери активности вследствие метаболических процессов или деградации. Пептидные лекарственные средства являются объектом для действия пептидаз и, будучи высокозаряженными молекулами, они с трудом транспортируются через липидные клеточные мембраны и через эндотелиальные клеточные мембраны, такие как гематоэнцефалический барьер. Конъюгация с другими молекулами обеспечивает способ защиты пептидов от деградации и усиления абсорбции пептидных лекарственных средств в клетки или анатомические компартменты, из которых в норме композиции были бы исключены.

Предоставляя пептиду доступ к определенной области человеческого организма, из которой он в норме был бы исключен, техника конъюгирования открывает новые пути для введения лекарственных средств. В публикации Patel et al., Bioconjugate Chem., 8(3):434, 1997, химия которой подробно описана в Примере 5 ниже и которая включена здесь путем ссылки во всей ее полноте, исследователи конъюгировали пептидное лекарство, известное как сильный анальгетик, гептапептид дельторфин, с органической молекулой, которая специально предназначена для того, чтобы провести пептид через гематоэнцефалический барьер. Это позволяет вводить лекарство внутривенно, вместо интрацеребро-вентрикулярного введения.

Молекула-носитель у Patel et al., в дополнение к тому, что проводила пептид через барьер, была сконструирована для специфической доставки к тем эндотелиальным клеткам, которые содержат гематоэнцефалический барьер. Мембраны эндотелиальных клеток повсюду в организме, включая гематоэнцефалический барьер, гетерогенны в отношении специфичности последовательности и концентрации мембраносвязанных эндопептидаз, которые распределены на их поверхности. В конструкции молекулы использовано это свойство для доставки молекулы-носителя и ее груза. Молекула содержит три цепи жирных кислот, свободные концы которых блокированы дипептидом Arg-Pro, который будет взаимодействовать преимущественно с эндопептидазами гематоэнцефалического барьера. Транспорт заряженной молекулы пептидного лекарственного средства становится возможным благодаря липофильным цепям жирных кислот. Таким образом, оканчивающаяся дипептидом молекула триглицерида способствует и нацеливанию, и транспорту через гематоэнцефалический барьер.

Способы конъюгации могут также увеличить кинетику активности пептидного лекарственного средства. Некоторые из технологий конъюгации, описанные ниже, увеличивающие кинетику пептидной активности, так же, как и другие технологии конъюгации, известные специалистам в этой области, могут быть применены к пептидам, включающим в себя, состоящим в основном из или состоящим из YSV-пептида или его функционального производного. Patel et al. обнаружили, что конъюгированные формы пептидов-анальгетиков способны не только входить в мозг из кровотока, но и поддерживать активность по сравнению со свободными пептидами. Внутривенно введенное лекарственное средство дает продолжительный терапевтический эффект, но эффект продолжается длиннее и уменьшается более медленнее, чем эффект от свободных пептидов, введенных интракраниально. Исследователи нашли, что коъюгированная пептидная молекула довольно устойчива в сыворотке, однако не имеет эффекта, когда вводится интрацеребро-вентрикулярно, что указывает на то, что несущая молекула, вероятно, подвергается деградации и исчезает в процессе транспортировки из кровотока в мозг. Исследователи допускают, что время, необходимое для транспортировки конъюгата, и время деградации несущей молекулы являются причиной изменения кинетики. Несмотря на механизм запаздывания в клинических условиях, интравенозная стабильность конъюгированных пептидных молекул и пролонгированность проявления и активности действия лекарственного средства может означать, что введение лекарственного средства можно производить реже. Меньшая частота и, следовательно, более удобная схема дозирования, увеличивает практическую ценность лекарственного средства, при выборе лечения.

Как должно быть очевидно специалисту в данной области, технические средства и процедуры Patel et al. полностью приспособлены к доставке пептидов, которые входят в область настоящего изобретения, включая любой из пептидов согласно изобретению. Например, пептид согласно изобретению YSV, который проявляет противоопухолевый эффект, может быть конъюгирован с такой же самой молекулой, какую использовал Patel et al.. При лечении индивидуума со злокачественной опухолью мозга конъюгированная молекула будет предоставлять YSV доступ к мозгу из кровотока и предоставлять возможность проявить действие в отношении ткани опухоли в мозге. Модификация, направленная на изменение нацеливания несущей молекулы, также должна быть очевидна специалисту. Нацеливающая особенность несущей молекулы является функцией идентичности двух аминокислот, которые включают в себя дипептид на конце цепей жирной кислоты. Дипептид Arg-Pro взаимодействует преимущественно с комплексом мембраносвязанных эндопептидаз, находящихся на поверхности эндотелиальных мембран гематоэнцефалического барьера. Другие эндотелиальные клетки и мембраны могут потенциально быть целью других дипептидных комбинаций.

Конъюгация также использовалась исследователями для создания пептидных лекарственных средств, которые могут эффективно абсорбироваться через желудочно-кишечный тракт или трансдермально. Некоторые из конъюгационных технологий, описанных ниже, используемых для усиления абсорбции, а также и другие конъюгационные технологии, известные специалистам в этой области, могут быть использованы для усиления абсорбции пептида, включающего в себя, состоящего в основном из или состоящего из одного YSV или его функциональной производной. Kramer et al. описал процедуру для присоединения пептидных лекарственных средств к желчным кислотам. Скорость абсорбции для конъюгированной молекулы, осуществляющей оральную доставку смеси, значительно сильнее по сравнению с одиночным пептидом. (J.Biol. Chem., 269(14): 10621, 1994). Toth et al.(J. Med. Chem., 42(19): 4010,1999) описали конъюгацию пептидного лекарственного средства с противоопухолевыми свойствами с липоаминокислотами (ЛАК) или липосахаридами (ЛС), с тем, чтобы увеличить скорость абсорбции и улучшить доставку противоракового пептида к области проявления его активности. В их исследовании производное соматостатина, который проявляет сильные антипролиферативные свойства, но имеет сниженную фармакокинетику, конъюгировали с каждым из ЛАК или ЛС. Результирующее конъюгированное лекарственное средство улучшает профиль абсорбции через стенки эпителия кишечника и увеличивает сопротивляемость деградации, в то же время сохраняя активность против клеток опухоли. Эти технологии могут быть очень полезны в связи с любыми из пептидов согласно изобретению. Посредством увеличения скорости абсорбции молекулы через желудочно-кишечный эпителий можно обеспечить большую доставку пептида в кровоток, и действие на подвергаемого лечению индивидуума будет более выражено.

Конъюгация также может быть использована для получения устойчивого высвобождения пептидного лекарственного средства. Некоторые из технологий конъюгирования, используемые для получения устойчивого высвобождения, так же, как и другие технологии, известные специалистам в данной области, могут использоваться для получения устойчивого высвобождения пептида, включающего в себя, состоящего в основном из или состоящего из YSV или его функционального производного. Как видно из публикации Patel et al., устойчивая доставка пептидного лекарственного средства может быть достигнута методом конъюгации. Другой пример - это публикация Kim et al. (Biomaterials, 23:2311, 2002), где рекомбинантный эпидермальный фактор роста человека (rhEGF) конъюгировали с полиэтиленгликолем (ПЭГ) перед микроинкапсулированием в биодеградируемые микросферфы сополимера молочной и гликолевой кислоты (PLGA). Микроинкапсулирование в PLGA использовали несколько групп исследователей для доставки различных факторов роста и морфогенетических белков (Veineletal., J. Controlled Rel., 70:193, 2001). При конъюгации с ПЭГ rhEGF становился устойчивым к формированию водонерастворимых агрегатов и к адсорбции на поверхности раздела водноорганической фазы во время формирования мицеллы с PLGA по сравнению с неконъюгированным, свободным rhEGF. Фармакокинетика композиции с конъюгированным гормоном улучшилась, с учетом длительности действия и в целом большей активности лекарственного средства по сравнению со свободным гормоном, что, как предполагают исследователи, происходит благодаря увеличению физической стабильности гормона, конъюгированного с ПЭГ. Подобная методика может быть использована для создания устойчивого высвобождения из лекарственной формы пептида согласно изобретению. Например, YSV оказывает сильное стимулирующее воздействие на клетки иммунной системы. Посредством конъюгации ПЭГ с этим пептидом и инкорпорирования конъюгата в PLGA-микросферы, стимулирующий эффект YSV на индивида может быть более продолжительным и более стабильным, так как дозированное высвобождение лекарственного средства из конъюгата с ПЭГ обеспечивает более стабильную доставку пептидного лекарственного средства к иммунной системе.

Пролонгированное высвобождение пептидного лекарственного средства может значительно увеличить его активность. Некоторые из технологий конъюгации для получения пролонгированного высвобождения пептида, описанные ниже, так же, как и другие технологии конъюгирования, известные специалистам в данной области, могут быть использованы для получения пролонгированного высвобождения пептида, включающего в себя, состоящего в основном из или состоящего из YSV, или его функционального производного. Oldham et al. (Int. J. Oncology, 16:125, 2000) сравнивали противораковый агент паклитаксел с новой формой лекарственного средства - паксилитакселом, конъюгированным с поли(L-глутаминовой кислотой) (PG-TXL). PG-TXL проявил более высокую противоопухолевую активность по сравнению со свободным паклитакселом, что дает основание предположить, что лекарственное средство имеет более высокие фармакокинетические свойства или, может быть, даже лучший механизм действия. Однако исследователи показали, что PG-TXL имеет такой же механизм действия, что и свободное лекарственное средство, индуцируя угнетение клеточного цикла, нарушая полимеризацию субъединиц микротрубочек. Очевидно, что высокая противоопухолевая активность конъюгированного лекарственного средства возрастает при более длительном и стабильном высвобождении лекарственного средства из конъюгата, поддерживая его терапевтическую концентрацию более длительный период по сравнению с введением свободного пептида. Добавление концевой поли(L-глутаминовой кислоты) к пептиду согласно изобретению с противораковыми свойствами, такому как СМS008, может усиливать его способность уничтожать опухоль.

Энзиматическая деградация пептидов может в некоторых случаях уменьшать эффективность пептидов, как лекарственных средств. Некоторые описанные ниже технологии конъюгации для уменьшения энзиматической деградации пептида, так же, как и другие технологии конъюгации, известные специалистам в данной области, могут быть использованы для уменьшения энзиматической деградации пептида, включающего в себя, состоящего в основном из или состоящего из YSV-пептида, или его функционального производного. Исследователи развили несколько подходов для защиты пептидов от люминально секретируемых протеаз кишечника и от мембраносвязанных пептидаз. Последние обнаружены на поверхности слизистой всех тканей, в то время как проникновение через слизистую зачастую и является тем путем, через который лекарственные средства проникают в организм. Bernkop-Schurch et al. (J.Drug Target., 7:55, 1999) описали создание пептидного лекарственного средства, состав которого содержит ингибиторы пепсина. Аналог пепстатина был ковалентно присоединен к адгезивным в отношении слизистой полимерам. Этот новый ингибитор пепсина был заключен в таблетки, содержащие инсулин. После воспроизведения в лабораторных условиях модели расщепления, весь инсулин контрольных таблеток был метаболизирован, хотя около 50% инсулина из таблеток, содержащих ингибитор, было защищено от расщепления. В другом исследовании той же группой были использованы ингибиторы протеаз в дозах, при которых в норме наблюдается токсический побочный эффект, для ингибирования расщепления биологически активных пептидов (Bernkop-Schurch et al.,Adv. Drug Del.Rev., 52:127, 2001). В этом подходе использовали хитозан, аминополисахарид, связанный с целлюлозой, выделенной из хитина, основного структурного полисахарида, найденного у ракообразных и других организмов. Посредством конъюгирования ингибиторов протеаз с хитозаном и включения этой конъюгированной молекулы в состав пептидного лекарственного средства наблюдали значительное ингибирование расщепления протеаз желудочно-кишечного тракта, увеличивая биологическую значимость пептида, без побочных эффектов, которых можно было бы ожидать при введении свободных ингибиторов протеаз. В исследовании использовали различные ингибиторы протеаз по одиночке и в комбинации для конъюгирования с хитозановым носителем. Конъюгат хитозан-ЭДТА ингибировал также и эндогенные протеазы путем связывания минеральных ко-факторов, которые необходимы для активности. Как должно быть ясно специалисту в данной области, может быть создано большое число возможных комбинаций между несущими молекулами и действующими частицами, с тем, чтобы улучшить лечебные свойства пептидных композиций, некоторые из которых могут быть легко адаптированы для использования с пептидами согласно изобретению. Создавая композицию для орального поступления пептида с использованием ингибиторов протеаз, связанных с хитозаном, вместо внутримышечных инъекций можно пользоваться оральным приемом YSV. Этот подход не исключает использование в этой композиции более абсорбируемого, конъюгированного варианта YSV (обсуждаемого в предыдущем обзаце) для обеспечения более высокого уровня биодоступности для пептида и его производных.

Помимо того, что они могут быть нацелены на определенную область с помощью другой молекулы, пептиды и сами могут служить направляющими молекулами. Любая из технологий конъюгации с использованием пептида для нацеливания молекулы в направлении определенной локализации, описанных ниже, так же, как и другие технологии конъюгирования, известные специалистам в данной области, могут применяться в отношении пептида, включающего в себя, состоящего в основном из или состоящего из одного из YSV, или его функционального производного. Например, исследователи взяли противораковое лекарственное средство дифлуорометилорнитин (DMFO) и конъюгировали его с нацеливающим пептидом. DMFO является высокоцитотоксичным агентом, который уничтожает клетки опухолей различного типа. Однако поскольку он быстро выводится из организма, его терапевтическое значение ограничено. В этом исследовании DMFO конъюгировали с конкретным фрагментом α-меланотропина и аналогом этого фрагмента, содержащим две аминокислотные замены, который, как было показано, преимущественно связывается с рецепторами меланотропина на клетках линии меланомы человека (Suli-Vargha et al., J.Pharm. Sci., 86: 997, 1997). Чтобы облегчить высвобождение выход DMFO из пептидных фрагментов посредством аминопептидаз, лекарственное средство конъюгировали с N-концами пептидов. Исследователи бнаружили, что конъюгированные лекарственные средства более эффективно уничтожают клетки меланомы, чем неконъюгированное лекарственное средство, действующее отдельно.

Действие пептидов согласно изобретению можно отчасти объяснить их способностью к нацеливанию, присущей пептидам. Например, наподобие фрагмента α-меланотропина, тот или иной пептид согласно настоящему изобретению может связываться с определенным рецептором на поверхности определенного типа клеток. Используя токой пептид в качестве конъюганта можно направить лекарственное средство на те же клетки в пределах организма индивида, которые подлежат лечению под действием лекарственного средства.

Пептиды в виде конъюгантов могут выполнять, помимо нацеливания, и иные функции. Некоторые из технологий конъюгирования, направленные на усиление терапевтической эффективности пептида, описанные ниже, а также и другие технологии конъюгирования, известные специалистам в данной области, могут применяться для усиления терапевтической эффективности пептида, включающего в себя, состоящего в основном из или состоящего из YSV, или его функционального производного. Fitzpatrick et al. улучшили противораковый агент путем конъюгации, с использованием пептидного спейсера между двумя молекулами (Anticancer Drug Design, 10: 1, 1995). Метотрексат уже был конъюгирован с человеческим сывороточным альбумином (ЧСА) для увеличения его поглощения и противоопухолевой активности. После поглощения клеткой метотрексат постепенно высвобождается из конъюгата под действием лизосомных ферментов и может оказывать свое цитотоксическое действие. Путем вставки линкерного пептида из четырех аминокислот между метотрексатом и ЧСА, который легко расщепляется лизосомными ферментами, увеличивали количество активного метотрексата, генерируемого внутри клетки из молекулы конъюганта. Пептиды согласно изобретению могут оказывать свое действие в результате специфического взаимодействия с особыми ферментами. Посредством включения пептида согласно изобретению в конъюгированную молекулу в качестве связующего сегмента между лекарственным средством и несущей молекулой или как дополнение к другому связующему сегменту можно изменить фармакокинетику. Таким образом, можно создать пролекарство, которое более устойчиво или более чувствительно к активности протеаз, и следовательно, увеличивает или уменьшает скорость высвобождения молекулы лекарственного средства из конъюгата. Как видно на приведенных выше примерах конъюгированных химотерапевтических агентов, изменение скорости доставки молекулы лекарственного средства может значительно усилить эффективность лекарственного средства.

Действие лекарственного средства на определенные клетки может быть изменено в зависимости от других факторов, таких как активация состояния клетки или наличие других молекулярных сигналов рядомс клеткой или внутри клетки. В некоторых случаях для того, чтобы лекарственное средство имело эффект, необходимо присутствие другой молекулы или сигнала. Damjancic et al. (Exp. Clin. Endocrin., 95:315, 1990) изучали действие натрийуретического пептида предсердия человека (hANP) на пациентов с дефицитом синтеза эндогенных глюкокортикоидов. Пептид давали пациенту во время отмены глюкокортикоидной терапии или в течение периода последующего возобновления терапии дексаметазоном. Пациенты реагировали на hANP увеличением диуреза и выделением натрия только тогда, когда пептидный гормон давали в течение сопутствующего лечения дексаметазоном. Лечение под действием hANP в период отмены глюкокортикоидной терапии эффекта не имело. Эффект конкурентного введения стероидного гормона также может усилить активность пептида. В соответствии с публикацией Zhu et al. (Acta Pharm. Sinica, 28: 166,1993), активность анальгезирующего пептида киоторфина (КТР) значительно усиливалась при конъюгации с гидрокортизоном посредством короткого линкерного сегмента, по сравнению с индивидуальным действием пептида. Эффекта не наблюдали и при индивидуальном введении гидрокортизона.

Результаты этих исследований иллюстрируют способность стероидных гормонов в качестве конъюгированных молекул или в качестве ингредиентов в композициях способствовать активности биологически активных пептидов или усиливать ее. Любой из пептидов согласно изобретению может также быть модулирован или активирован посредством конъюгации или совместного применения стероидных гормонов. Техника конъюгации Zhu et al. может быть легко адаптирована для конъюгации стероидных молекул с пептидом согласно изобретению. На Фиг.1-5 также представлены примеры поэтапных синтетических реакций для связывания стероидных гормонов с любым из пептидов согласно изобретению.

Примеры, приведенные выше, представляют пути усиления пригодности и активности некоторых пептидов настоящего изобретения. Дальнейшее развитие в этой области поможет преодолеть барьеры в создании эффективной клинической терапии на основе пептидов. Как должно быть очевидно специалисту в данной области, технические приемы, реагенты и методики, разработанные для использования в биохимии пептидов, фармацевтических исследованиях и клиническом тестировании, полностью применимы к любому из пептидов согласно изобретению.

ПРИМЕР 1

Доставка пептидов посредством генетически измененной разновидности бактерий Lactobacillus

Представленный ниже пример является одним из способов доставки пептидов согласно изобретению к месту назначения в организме хозяина, как описано выше. Последовательность ДНК, кодирующую YSV, синтезировали химическим способом, и эту последовательность ДНК встраивали в вектор экспрессии, используя стандартную технику генной инженерии, известную специалистам в данной области. Выбранный вектор экспрессии содержит конститутивный промотор, функциональный в Lactobacillus, множественный клонирующий сайт для внедрения последовательностей ДНК в специфической 5'-3'-ориентации, а также селективный маркерный ген, который придает резистентность к антибиотикам (в помощь процедурам клонирования) и может содержать в себе другие последовательности, такие как последовательности сигнальных пептидов, помогающие продуцировать и/или выделять пептиды. Пример такого вектора представлен в Патенте США № 5529908, Pavla, который включен здесь посредством ссылки во всей ее полноте. Коротко, в этом патенте обсуждается несколько известных промоторов, которые функционируют в Lactobacillus, а также способ обнаружения новых промоторов в вышеназванной бактерии, некоторые из которых могут функционально связываться с нуклеиновой кислотой, кодирующей пептид согласно изобретению для экспрессии пептида в Lactobacillus. Нуклеиновая кислота, кодирующая сигнальный пептид, такой как пептиды, включающие в себя от 16 до 35 наиболее гидрофобных аминокислот, активных в Lactobacillus lactis, описанная в указанном выше Патенте США №5529908, располагалась между промотором и нуклеиновой кислотой, кодирующей пептид согласно изобретению, таким образом, что нуклеиновая кислота, кодирующая сигнальный пептид, находится в одной рамке считывания с нуклеиновой кислотой, кодирующей пептид согласно изобретению. В дополнение к кодированию пептида, синтезированная последовательность ДНК может содержать последовательность, вспомогательную для лигирования и клонирования указанной ДНК в вектор экспрессии. Например, сайты указания рестрикционных ферментов, которые соответствуют сайтам, найденным во множественном клонирующем сайте вектора, могут быть включены в синтезируемую ДНК у 5'- и 3'-концов последовательности, таким образом, что последовательность может быть клонирована в правильной ориентации в пределах вектора. Как вектор, так и синтезированную ДНК расщепляли посредством особых рестрикционных ферментов, а затем очищали. Реакции лигирования с вектором и синтезированной ДНК сопровождались трансформацией в подходящем штамме E.Coli. Трансформированные бактерии помещали в среду, содержащую антибиотик, к которому вектор резистентен. Колонии трансформированных бактерий выбирали для роста культуры и процедуры выделения плазмид; подтверждали присутствие ДНК, синтезированной в правильной ориентации.

Затем вектор экспрессии трансформировали в бактериальную хозяйскую клетку Lactobacillus, такую как L. Acidophilus. Трансформированные клетки отбирали проверкой на селектируемый маркер, найденный в пределах последовательности вектора, а секрецию пептида можно было проверить методом Вестерн-блоттинга или гель-электрофореза пептидов, присутствующих в ростовой среде, или другими стандартными методами. Трансформированные колонии бактерий собирали и использовали для создания широкомасштабной культуры генетически измененнных бактерий. Культуру генетически измененных бактерий, экспрессирующих желаемый пептид, подращивали, и по меньшей мере часть этой культуры вводили в пищеварительный канал, вагину, трахею или другие области организма хозяина, в которых бактерии могли размножаться. По желанию, бактериальные культуры могут быть обработаны различными способами для удовлетворения дополнительных внутренних потребностей хозяина. Эти способы обработки включают в себя лиофилизацию или другие способы сохранения бактерий, в дополнение к комбинированию бактерии с агентами-носителями, такими как растворы, растворители, дисперсионные среды, задерживающие агенты, эмульсии и т.п. Использование таких агентов для приготовления добавок хорошо известно в данной области. Например, бактерии можно использовать для получения культуры молочных продуктов или других пищевых продуктов для потребления человеком, таким образом, чтобы организм, экспрессирующий пептид, колонизировал кишечник организма хозяина. Некоторые различные способы внедрения молочнокислых бактерий в пищевые продукты, такие как йогурт, кимчи, сыр и масло, раскрыты в Патенте США № 6036952, выданном на имя Oh, который включен здесь посредством ссылки во всей ее полноте. При любом способе введения бактерий модифицированный организм бактерий будет колонизировать кишечник, и будет происходить презентация и/или абсорбция пептидов согласно изобретению через слизистую оболочку кишечника.

ПРИМЕР 2

Доставка пептидов посредством генетически измененной формы бактерий Bacillus subtilis

Представленное ниже является другим способом доставки пептидов согласно изобретению в организм хозяина, как описано выше. Последовательность ДНК, кодирующая один из пептидов, перечисленных в таблице А выше, синтезировали химическим способом, и эту последовательность ДНК включали в вектор экспрессии посредством техники генной инженерии, причем все используемые технические приемы известны в данной области. Выбирали вектор экспрессии, включающий в себя "челночный" вектор, такой как pTZ18R (Pharmacia, Piscataway, NJ), способный к размножению и в Е.Coli, и в B.Subtilis и содержащий ген, резистентный к антибиотику, для отбора колоний трансформированных бактерий. Этот вектор может содержать конститутивную промоторную активность в B. Subtilis, такую как промотор, полученный из гена Sac B из B. Subtilis, так же, как и нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнальный пептид, активный в B. Subtilis, который направляет эффективный экспорт экспрессируемых гетерологичных белков из бактериальных клеток. Пример такого вектора описан в Патенте США № 6268169, Fahnestock, который включен в настоящее описание путем ссылки во всей его полноте. Коротко, как детализировано выше, ДНК, кодирующая пептид согласно изобретению, будет синтезироваться с сайтами рестрикционных энзимов и/или другими последовательностями для облегчения клонирования ДНК путем технологий, известных специалистам в данной области. После трансформации в E. Coli, посева, отбора и размножения плазмид для создания плазмидной биомассы плазмиду затем трансформировали в B. Subtilis, и трансформанты отбирали по их резистенции к антибиотику в посевной среде.

Выработку пептида и его секрецию из генетически модифицированного B.subtilis проверяли, используя технические приемы, известные специалистам в данной области, такие как радиоактивное мечение пептидов для авторадиографического определения после SDS-PAGE-анализа или Вестерн-блоттинга.

Культуру генетически модифицированных бактерий выращивали, и по меньшей мере часть ее вводили в пищеварительный канал, вагину, трахею или другие области организма хозяина, в которых бактерия сможет размножаться.

ПРИМЕР 3

Доставка пептидов посредством генетически модифицированных дрожжей Saccharomyces

Представленное ниже является другим способом доставки пептидов согласно изобретению в организм хозяина, как описано выше. Последовательность ДНК, кодирующая один из пептидов, перечисленных в таблице А выше, синтезировали химическим способом, и эту последовательность ДНК включали в вектор экспрессии посредством техники генной инженерии, причем все используемые технические приемы известны в данной области. Выбранный вектор экспрессии включает в себя устойчиво поддерживаемый вектор экспрессии дрожжевого белка, включающий в себя конститутивный дрожжевой промотор, такой как pADH1, сайты для репликации вектора как в дрожжах, так и в E.Coli, ген или гены, которые придают прототрофам свойства ауксотрофных дрожжевых мутантов в целях селекции, множественный клонирующий сайт (MKS) и, если необходимо, последовательности, которые кодируют сигнальный пептид. Векторы, такие как данный, коммерчески доступны и известны в данной области или могут быть быстро получены с использованием стандартной технологии. После включения синтезированной ДНК в дрожжевой вектор, трансформации в E. Coli, посева трансформированной E. Coli на селективной среде, селекции трансформированной бактериальной колонии и получения плазмидной ДНК из растущей культуры бактерий указанной колонии, вектор трансформировали в Saccharomyces cerevisiae при помощи хорошо известных технических приемов, таких как трансформация в ацетате лития или электропорация. Штамм Saccharomyces cerevisiae, выбранный для трансформации, является мутантным ауксотрофным штаммом, которому требуется наличие гена на плазмиде, чтобы расти на минимальной посевной среде. Колонии трансформированных дрожжей выделяли путем посева дрожжей в среде, дефицитной в отношении того продукта, ген которого предусмотрен в векторе. Только те дрожжи, которые включили вектор и его селективный ген и стали экспрессировать продукт указанного гена, могут образовывать колонии в минимальной среде. Проверить секрецию пептида можно посредством Вестерн-блоттинга, гель электрофореза пептидов, присутствующих в среде роста, или другими стандартными методиками.

Трансформированную колонию дрожжей собирали и использовали для создания широкомасштабной культуры. Культуру генетически модифицированных дрожжей, экспрессирующих желаемый пептид, после выращивания вводили в пищеварительный канал, вагину, трахею или другие области организма хозяина, где бактерия может реплицироваться. По желанию, культура дрожжей может быть обработана различными способами для удовлетворения дополнительных внутренних потребностей хозяина. Эти способы обработки включают в себя лиофилизацию или другие способы сохранения дрожжей, вдобавок к комбинированию бактерии с агентами-носителями, такими как растворы, растворители, дисперсионные среды, задерживающие агенты, эмульсии и т.п. Использование этих агентов для приготовления добавок хорошо известно в данной области. В других воплощениях трансформированные дрожжи использовали для создания пищевых продуктов, таких как ферментированное молоко, продуктов типа йогурта и кефира, посредством технологий, известных специалистам в данной области. Так же, как и с живой молочнокислой бактериальной культурой, в этих пищевых продуктах трансформированные дрожжи колонизируют кишечник по меньшей мере временно и служат для поставки пептидов в организм хозяина через полость кишечника.

ПРИМЕР 4

Нацеливание пептида на определенную область

Представленное ниже является способом селективной доставки пептида согласно изобретению в определенный компартмент, орган, тип клеток или область внутри организма. В данном случае нефрит лечили путем нацеливания YSV на ткани почки индивидуума. YSV связывали ковалентной связью посредством химической реакции, известной в данной области, с лизоцимом с низким молекулярным весом (LMW), коммерчески доступным белковым веществом, которое специфически концентрируется в тканях почки. Технологические приемы для получения конъюгации с молекулами LMW-лизоцима зарегистрированы (Folgert et al., Br. J.Pharmcology, 136: 1107, 2002). Общие технологические приемы для конъюгирования белков или пептидов с другими молекулами, также указаны в литературе (Fiscer et al.,Bioconj. Chem., 12: 825, 2001). Вновь полученный конъюгированный образец пептида затем очищали от химических реагентов, используя процесс связывания методами хроматографии, такими как катионообменная FPLC и/или градиентное центрифугирование. Очищенный конъюгированный пептид вводили индивидууму, нуждающемуся в лечении нефрита. Для противонефритной активности YSV предпочтительно нацеливали на почечную ткань при помощи связи между пептидом и LMW-лизоцимом, который селективно абсорбировался и катаболизировался клетками проксимальных канальцев почки. Эта избирательная доставка приводит к наибольшему эффекту против нефрита, сравнимому с тем, как если бы вводили молярное эквивалентное количество самого YSV. С другой стороны, можно уменьшать количество пептидного лекарственного средства, необходимого для достижения определенного уровня активности против нефрита.

ПРИМЕР 5

Усиление доставки пептида к области его активности

Представленное ниже является примером способа улучшения доставки нейроактивного пептида в мозг. Пептид согласно изобретению, который оказывает действие на рецепторы, экспрессируемые нейронами мозга, синтезировали химическим способом, известным в данной области. С другой стороны, пептиды могут быть экспрессированы путем создания микроорганизма и извлечения из культуры таких микроорганизмов, как описано в примерах выше. Полученные в чистом виде пептиды использовали в серии органических химических реакций для создания триглицерид-эфир-конъюгированного фрагмента, присоединенного к пептиду. Конъюгированная молекула состоит из четверичного замещенного углерода, соединенного с пептидом согласно изобретению посредством амидной связи с концевым карбоксильным углеродом пептида. Другие три группы присоединяли к центру четверичного углерода, состоящему из углеродного эфира, прикрепленного к 16 углеродным цепям жирной кислоты. Цепи жирной кислоты сами по себе заканчиваются терминальной дипептидной группой, известной как пептидная маска, которая делает цепи более гидрофильными и специфически нацеливает их на клетки эндотелиальной мембраны гематоэнцефалического барьера. Процедура этого синтеза объяснена у Patel et al., Bioconjugate Chem., 8(3):434, 1997, и в ней используются обычно используемые реагенты и оборудование, известные специалистам в данной области.

Введенная в периферийную область организма индивида смесь проходит через организм при помощи циркуляторной системы, взаимодействуя с эндотелиальной мембраной гематоэнцефалического барьера. Постепенная деградация пептидной маски и липидных цепей в течение транспортировки молекулы вдоль эпителиального слоя гематоэнцефалического барьера приводит к высвобождению пептида согласно изобретению в мозговой компартмент. Эти пептиды могут взаимодействовать с рецепторами на поверхности нейронов, действуя на функцию мозга. Время, необходимое для достижения лекарством гематоэнцефалического барьера и транспортировки в мозг с сопутствующей деградацией несущей молекулы, изменяет кинетику лекарственной активности, создавая более стабильный и продолжительный эффект по сравнению с интрацеребровентрикулярной инъекцией свободного пептида.

ПРИМЕР 6

Создание пептидных композиций, устойчивых к ферментативной деградации

Нижеследующее представляет пример способа создания лекарственного состава биологически активного пептида для орального введения, который устойчив к действию протеаз и пептидаз, обнаруживаемых на поверхности желудочно-кишечного тракта. В этом примере YSV использовали для создания фармацевтической композиции для орального введения пациенту. Как описано Larionova et al. (Int. J. Pharma., 189:171, 1999), пептид использовали в создании микрочастиц с растворимым крахмалом и ингибитором протеаз, апротинином, который является сильным ингибитором различных люминарносекретируемых и мембраносвязанных протеаз щеточной каемки. Коротко, растворимый крахмал, ингибитор протеаз апротинин и пептид согласно изобретению растворяли в водном буфере. Соотношение растворимого крахмала, апротининового пептида определяли экспериментальными способами, известными специалистам в данной области, например, Larionova et al. использовали in vitro модуляцию желудочно-кишечного тракта, пробуя определить дозу и условия препарации, наиболее эффективные для использования белка в этом исследовании. Из водного раствора готовили эмульсию при помощи механического размешивания в циклогексане (1:3, в/в), содержащем 5% Span-80, неионизированный сурфактант. В эмульсию добавляли раствор терефталоил хлорида в хлороформе и встряхивали в течение 30 минут, в течение которых молекулы крахмала перекрестно связывались с апротинином и пептидом. Микрочастицы, образующиеся в этом процессе, промывали последовательно циклогексаном, 95% раствором этанола с 2% в/в детергента Твин-85, 95% этанолом и водой. Микрочастицы ресуспендировали в воде и лиофилизировали. Лиофилизованный состав может быть помещен в желатиновую капсулу для орального употребления индивидуумом, нуждающимся в лечении. Проглоченный состав высвобождается по мере растворения желатиновой капсулы. Микрокапсулы разрушаются в тонком кишечнике под воздействием α-амилазы на молекулы крахмала, что приводит к плавному высвобождению апротинина и пептида согласно изобретению. Конкурентное высвобождение апротинина, сильного ингибитора протеазы, в то же самое время и в той же области, где и пептид, уменьшает ферментативную деградацию пептида и увеличивает долю исходного пептида, доступного для абсорбции через мембрану кишечника.

Несмотря на то, что настоящее изобретение описано с указанием конкретных вышеупомянутых способов и данных и специфического образца YSV, понятно, что это только пример, который не должен рассматриваться как ограничение настоящего изобретения. Также должно быть понятно, что YSV представляет собой одно из воплощений настоящего изобретения, и этот же принцип настоящего изобретения может быть применен к другим функционально эквивалентным пептидам, которые модифицированы без изменения биологической функции YSV. Например, равноценными YSV считаются те, которые имеют консервативную замену аминокислот (т.е. один из Y, S или V заменяется на другую аминокислоту такого биохимического типа, например, гидрофобный, гидрофильный, положительно или отрицательно заряженный). Другой пример пептида, эквивалентного YSV, - это слегка удлиненный пептид, на одну или две аминокислоты длиннее, который сохраняет биологическую активность.

Claims (8)

1. Изолированный и очищенный трипептид с аминокислотной последовательностью L-Тирозил-L-Серил-L-Валин (YSV) для лечения иммунологического или пролиферативного заболевания или ассоциированного с ним состояния.

2. Пептид по п.1, обладающий активностью, выбранной из группы, состоящей из модуляции иммунного ответа, стимуляции трансформации Т-лимфоцитов, модуляции нарушения клеточной пролиферации, модуляции роста злокачественной опухоли, модуляции роста злокачественной опухоли печени, модуляции роста клеток лейкемии, модуляции роста цервикального рака, модуляции роста злокачественной опухоли легких и модуляцию роста меланомы.

3. Фармацевтическая композиция для лечения иммунологического или пролиферативного заболевания или ассоциированного с ним состояния, содержащая трипептид с аминокислотной последовательностью L-Тирозил-L-Серил-L-Валин в эффективном количестве.

4. Способ ослабления состояния заболевания человека, включающий в себя введение человеку фармацевтически эффективной дозы полипептида, состоящего из трипептида с аминокислотной последовательностью L-Тирозил-L-Серил-L-Валин, где указанное заболевание выбрано из группы, состоящей из состояний, которые могут быть ослаблены путем стимуляции трансформации Т-лимфоцитов, и нарушения клеточной пролиферации.

5. Способ по п.4, где указанное нарушение клеточной пролиферации представляет собой злокачественную опухоль.

6. Способ по п.5, где указанная злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из злокачественной опухоли печени, лейкемии, злокачественной опухоли легких, меланомы и цервикального рака.

7. Способ по п.4, где указанное заболевание можно лечить путем модуляции иммунной системы.

8. Применение трипептида с аминокислотной последовательностью L-Тирозил-L-Серил-L-Валин в производстве пищевой добавки.

Images