JP2007527375A - チロシル−セリル−バリン(ysv)を含む、生物学的に活性なペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
ンを、ヒトに投与することを含む、ヒト疾患の効果を減少させる方法に関する。本発明の他の観点において、ヒト疾患は、Tリンパ球変換を刺激することによってその効果を減少されうる状態、および細胞増殖疾病からなる群より選択される。本発明のさらなる観点において、細胞増殖疾病は、肝臓がん、白血病、子宮頸がん、肺がんおよびメラノーマを限定はしないが含む、がんである。
ド内で、以上で開示したペプチドに近接するペプチドではない。本発明の他の観点において、本質的に純粋なYSVペプチドまたはその機能的誘導体は、限定はしないが、免疫活性および/またはがんのような細胞増殖疾病を調節可能であり、前記がんには、限定はしないが、子宮頸がん、肝臓がん、白血病、肺がんおよびメラノーマが含まれる。分子は、共有結合または非共有結合で、本発明のペプチドに動作可能に連結しうる。
アベイラビリティー、またはペプチドの体への伝達速度の変更、ペプチドでの処置の効果の長さの変更、ペプチドの安定性の変更、ペプチドの効果の開始および減衰の速度の変更、ペプチドに効果を持たせることによる、許容活性の提供、が含まれる。
ン、プロテアーゼ阻害剤、ケイ酸および以上の分子の任意の組み合わせが含まれる。本発明はまた、前記ペプチドを、前記治療効果を増強する分子に動作可能に連結し、そこで、前記分子が、天然に存在しているペプチド中で、前記YSVペプチドまたはその機能的誘導体の前記1つと隣接しているペプチドではない、ことを含む、前記YSVペプチドまたはその機能的誘導体の前記1つを含むペプチドを含む、薬理学の作製の方法にも関する。分子は、共有結合または非共有結合で、本発明のペプチドに動作可能に連結して良い。特定の実施形態において、前記結合分子が、前記ペプチドに、その治療的な効果を増強するために与えうる特徴には、限定はしないが、体内の離れた局所へのペプチドの伝達、ペプチドの活性の、体内の望む局所での濃縮と、他の場所でのその効果の減少、ペプチドでの処置の副作用の減少、ペプチドのパーミアビリティの変更、バイオアベイラビリティー、またはペプチドの体への伝達速度の変更、ペプチドでの処置の効果の長さの変更、ペプチドの安定性の変更、ペプチドの効果の開始および減衰の速度の変更、ペプチドに効果を持たせることによる許容活性の提供、が含まれる。また、その治療効果を増強する分子に、動作可能に連結した、YSVペプチドまたはその機能的誘導体の1つのアミノ酸から本質的になる、本質的に純粋なペプチドを提供すること、および前記分子に動作可能に連結した前記ペプチドを、薬理学的に許容可能な担体と処方すること、を含む、薬理学的組成物を作製する方法にも関する。さらに、その治療的効果を増強する分子と動作可能に連結した、YSVペプチドまたはその機能的誘導体の1つからなる、本質的に純粋なペプチドを提供すること、および前記分子に動作可能に連結した前記ペプチドを、薬理学的に許容可能な担体と処方すること、を含む、薬理学的組成物を作製する方法に関する。
リマー、ペプチド、ステロイド、タンパク質、タンパク質の単離ドメイン、ハプテン、抗原、脂肪分子、脂肪酸、胆汁酸、ポリアミン、プロテアーゼ阻害剤、ケイ酸および以上の分子の組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態において、前記動作可能に連結した分子が、その治療効果を増強するために、前記ペプチドに与えることが可能な特徴には、限定はしないが、体内の離れた局所へのペプチドの伝達、ペプチドの活性の、体内の望む局所での濃縮と、他の場所でのその効果の減少、ペプチドでの処置の副作用の減少、ペプチドのパーミアビリティの変更、バイオアベイラビリティー、またはペプチドの体への伝達速度の変更、ペプチドでの処置の効果の長さの変更、ペプチドの安定性の変更、ペプチドの効果の開始および減衰の速度の変更、ペプチドに効果を持たせることによる、許容活性の提供、が含まれる。
、そのいずれかの場所で、YSVペプチドまたはその機能的誘導体の1つのアミノ酸配列を含む、遺伝子組み換えされたペプチドまたはポリペプチドは、YSVペプチドまたはその機能的誘導体の1つ「から本質的になる」ペプチドまたはポリペプチドを構成しないであろう。
どでありうる。あるいは、1つまたはそれ以上のペプチドを、反応の全カスケードのための開始物とすることが可能である。経口摂取のためには、量は、1ng〜10g/日/kg体重であり、好ましくは0.1μg〜1g/日/kg体重であり、より好ましくは1μg〜10mg/日である。
1.1 2.1〜2.4のための物質
中国医療化学研究所(China Medical Science Institute)、実験動物センター(Experimental Animal Center)より供給された、18〜22g体重、BALB/cマウス。
MTTおよびConA、シグマ(Sigma)USA
ヒト肝細胞がんBEL7402細胞は、中国医療化学研究所、がん研究部門(Cancer Research Department)により供給された。
2.1 YSVの、in vitroでのTリンパ球形質転換における効果
2.1.1 方法(参考文献1にて記述されたよう、その全てが本明細書に組み込まれている)
健康なマウスを頸椎脱臼させて犠牲死させた。脾臓を単離し、無菌的に分解した。脾臓リンパ球懸濁液を洗浄し、10%ウシ胎児血清を含むRPMI−1640培養培地で、5×106/mLの細胞濃度に調節した。YSVを、RPMI−1640培養培地で、種々の濃度、2μg/mL、0.4μg/mL、0.08μg/mL、0.016μg/mLに希釈した。ConA動作溶液を、RPMI−1640培養培地で、1mg/mLに調節した。
0mM HCl−2−プロパノールと混合し、3分間撹拌した。630nmで参照した、各ウェルのOD570nmを、ELISAリーダーで得た。
2.1.2 結果
0.016μg/mL〜2μg/mLの濃度で、YSVが、統計学的に有意に(p<0.001)、in vitroで、Tリンパ球変換を刺激可能であることがわかった。
2.2 in vitroでの、培養ヒト肝臓がんBEL7402細胞の増殖におけるYSVの効果
2.2.1 方法(参考文献2にて記述されたよう、その全てが本明細書に組み込まれている)
対数増殖期での、ヒト肝臓がんBEL7402細胞を、0.05%トリプシンおよび0.02% EDTAを含むリン酸緩衝食塩水 pH7.4(PBS)とともに、2〜3分間インキュベートし、分離した。細胞を、逆相コントラスト顕微鏡によって検査した。上清を、細胞核濃縮後に除去し、細胞区画の拡張が観察された。10% FBSを含む数ミリリットルのRPMI−1640培養培地を加えて消化を終了させた。細胞を、ピペットで穏やかにブローイングすることによって回収した。懸濁細胞を、150gにて10分間の遠心によって回収し、冷D−Hankの溶液にて、再懸濁および遠心を伴って2回洗浄した。洗浄細胞を、10% FBSを含むRPMI−1640培地中に再懸濁し、5×104/mLの濃度に合わせた。処置BEL7402細胞を、96ウェル細胞培養プレート上に、100μL/ウェルでのせた。細胞を、24時間、37℃、5% CO2にてインキュベートして、再活性化および接着させた。
2.2.2 結果
5μg/mL〜20μg/mLの濃度で、YSVが、統計学的に有意に(p<0.05)、in vitroで、ヒト肝細胞がんBEL7402細胞の増殖を阻害可能であることがわかった。
2.3 in vitroでの、培養ヒト白血病K562細胞の増殖におけるYSVの効果
2.3.1 方法(参考文献2にて記述されたよう、その全てが本明細書に組み込まれている)
対数増殖期での、ヒト白血病K562細胞を、10% FBSを含むRPMI−1640培養培地で、5×104/mLの濃度に調節した。100μL/ウェルの細胞を、96ウェル細胞培養プレート上にのせた。細胞を、37℃、5% CO2にて24時間インキュベートした。実験には、培養培地中の異なる濃度のYSVの5つの試験群と、培養培地のみの陰性対照群が含まれた。YSVの最終濃度は、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mLおよび5μg/mLであった。各群には、5つの平行ウェルが含まれた。100μL/ウェルの試験液を、処置細胞に加えた。細胞を、37℃、5% CO2にて48時間インキュベートした。
2.3.2 結果
5μg/mL〜40μg/mLの濃度で、YSVが、統計学的に有意に(p<0.05)、in vitroで、ヒト白血病K562細胞の増殖を阻害可能であることがわかっ
た。
2.4 in vitroでの、ヒト子宮頸がんHela細胞の増殖の阻害
2.4.1 方法(参考文献2にて記述されたよう、その全てが本明細書に組み込まれている)
対数増殖期での、ヒト子宮頸がんHela細胞を、0.05%トリプシンおよび0.02% EDTAを含むPBSとともに、2〜3分間インキュベートし、分離した。細胞を、逆相コントラスト顕微鏡によって検査した。上清を、細胞核濃縮後に除去し、細胞区画の拡張が観察された。10% FBSを含む数ミリリットルのRPMI−1640培地を加えて消化を終了させた。細胞を、ピペットで穏やかにブローイングすることによって回収した。細胞を、150gにて10分間の遠心によって回収し、低温のHankの溶液にて、再懸濁および遠心を伴って2回洗浄した。細胞ペレットを、10% FBSを含むRPMI−1640培地中に再懸濁し、5×104/mLの濃度に合わせた。処置細胞を、96ウェル細胞培養プレート上に、100μL/ウェルでのせた。細胞を、24時間、37℃、5% CO2にてインキュベートして、再活性化および接着させた。
2.4.2 結果
5μg/mL〜10μg/mLの濃度で、YSVが、統計学的に有意に(p<0.05)、in vitroで、ヒト子宮頸がんHela細胞の増殖を阻害可能であることがわかった。
2.5 ヌードマウス−移植ヒト白血病K562細胞の増殖におけるYSVの効果
2.5.1 物質
YSL:深川カンゼ ファーマシューティカル社(Shenzhen Kangzhe
Pharmaceutical Co.,Ltd)によってカスタム合成した。
RPMI−1640細胞培養培地:ギブコ(GIBCO)、USA
ウシ胎児血清(FBS):ハイクローン(HYCLONE)、USA
ヒト白血病K562細胞株:中国医療化学研究所、血液疾患研究部門(Hematological Disease Research Department)
健康ヌードマウス(BALB/C(nu/nu)、SPF、オス、4〜5週齢、18〜22g体重):中国メディカル アカデミー オブ サイエンス(China Medical Academy of Science)、上海がん研究部門(Shanghai Tumor Research Department)
2.5.2 方法
2.5.2.1 細胞培養
K−562細胞を、37℃、5% CO2にて、10% FBSを含むRPMI−1640培地中で維持した。
2.5.2.2 白血病マウスモデルの調製[3]
対数増殖期のK562細胞を、RPMI−1640で、1.6×108/mLに調節した。この0.1mLを、健康なヌードマウスの右脇腹に皮下注射して、白血病マウスモデルを形成させた。
2.5.2.3 動物のグルーピングと投与
ヒト白血病K562細胞を持つマウスを、食塩水対照(0.2mL/日)およびYSV(160μg/kg/日)の群に無作為化した。試験物質を、0.2mL食塩水中に溶解させ、腹腔中注射によって、試験物質の投与を、K562接種の翌日に開始し、30連続日の間、1日一回行った。
2.5.2.4 パラメータのモニタリング
マウスの一般状態を、毎日試験し、腫瘍サイズを、3〜4日ごとに測定した。腫瘍容量(mm3)V=(1/6)πXYZ、式中X、YおよびZ、三平面上の腫瘍の直径であった。
2.5.2.5 統計学的方法
すべてのデータを、平均値±SDとして示した。データを、SPSSソフトウェアのANOVA試験を用いて解析した。P<0.05を、統計学的に有意であると受け付けた。2.5.3 結果
好適な用量でのYSVが、食塩水対照群と比較して、統計学的に有意に(p<0.05)、ヌードマウス−移植の、有意なヒト白血病K562の増殖を阻害可能であることがわかった。
2.6 C57BL/6マウス−移植メラノーマB16の増殖におけるYSVの阻害
2.6.1 物質
2.6.1.1 ペプチド
YSV:深川カンゼ ファーマシューティカル社(Shenzhen Kangzhe
Pharmaceutical Co.,Ltd)PR Chinaによってカスタム合成した。
2.6.1.2 対照物質および他の試薬
シクロホスファミド(Cy):上海フアリン ファーマシューティカル社(Shanghai Hualian Pharmaceutical Co.,Ltd)
食塩水:中国大塚薬品株式会社(China Otsuka Pharmaceutical Co.,Ltd)
RPMI−1640細胞培養培地:ギブコ(GIBCO)、USA
ウシ胎児血清(FBS):ハイクローン(HYCLONE)、USA
Hankの溶液:ディグチアン社(Dingtian Co.,Ltd)
2.6.1.3 細胞株
マウスB16メラノーマ細胞株:中国メディカル アカデミー オブ サイエンス(China Medical Academy of Science)、生化学および細胞生物学部門(Institute of Biochemistry and Cell Biology)
2.6.1.4 動物
健康C57 BL/6マウス(SPF、オス、4〜5週齢、14〜18g):軍事医療化学アカデミー(Academy of Military Medical Science)より
2.6.2 方法
2.6.2.1 細胞培養
B16細胞を、37℃、5% CO2にて、10% FBSを含むRPMI−1640培地中で維持した。
2.6.2.2 メラノーママウスモデルの調製[4]
対数増殖期のマウスB16メラノーマ培養を、Hanks溶液で、2.5×106/mLに調節した。この0.2mLを、健康なC57 BL/6マウスの右腋窩に皮下注射して、メラノーママウスモデルを形成させた。
2.6.2.3 動物のグルーピングと試験物質投与
メラノーマB16を持つマウスを、食塩水対照(0.2mL/日)、シクロホスファミド(Cy)(20mg/kg/日)およびYSV(640μg/kg/日および320μg/kg/日)の群に無作為化した。試験物質を、0.2mL食塩水中に溶解させ、腹腔に、1日1回、メラノーママウスモデルへの20連続日に、腫瘍移植の次の日から開始した。
2.6.2.4 パラメータのモニタリング
腫瘍移植の次の日より、マウスの一般状態、および腫瘍の増殖を毎日観察した。
2.6.2.5 統計学的方法
すべてのデータを、平均値±SDとして示した。データを、SPSSソフトウェアのANOVA試験を用いて解析した。P値<0.05を、統計学的に有意であると受け付けた。
2.6.3 結果
好適な用量で、YSVが、食塩水対照群と比較して、統計学的に有意に(p<0.05)、C57BL/6マウスにおける、B16メラノーマの増殖を阻害可能であることがわかった。
2.7 ヌードマウスでの、A549ヒト肺がん異種移植片におけるYSVの阻害効果
2.7.1 物質
2.7.1.1 ペプチド
YSV:CS Bio Co.,USAによって契約合成した。
2.7.1.2 対照物質および他の試薬
シクロホスファミド(Cy):上海フアリン ファーマシューティカル社(Shanghai Hualian Pharmaceutical Co.,Ltd)
食塩水:中国大塚薬品株式会社(China Otsuka Pharmaceutical Co.,Ltd)
ウシ胎児血清(FBS):ハイクローン(HYCLONE)、USA
RPMI−1640細胞培養培地:ギブコ(GIBCO)、USA
2.7.1.3 動物
健康なBALB/c(nu/nu)無胸腺ヌードマウス(SPF、4〜5週齢、体重18〜22g)を、中国メディカル アカデミー オブ サイエンスの上海腫瘍アカデミー(Shanghai Tumor Academe of China Medical
Academy of Science)より購入した。第一実験において、メスを使用した。第二の実験では、オスを使用した。
オブ サイエンスの上海腫瘍アカデミーからであった。
2.7.2 方法
2.7.2.1 肺がんヌードマウスモデルの調製[5]
ヌードマウス上で、よい増殖で、1cm以上の直径のA549肺がん細胞異種移植片を選択する。腫瘍塊を無菌切除し、2〜4mm3の切片に切断し、RPMI1640中に浸した。肺がんヌードマウスモデルを、腫瘍塊を、胸郭腹側における切開を介して、首の近くで健康なヌードマウスの背中の真皮に移植することによって調製した。
2.7.2.2 グルーピングと薬剤投与方法
A549異種移植片を持つヌードマウスを、食塩水対照(0.2mL/日)、異なる用量のYSV群、およびCy対照(0.2mg/kg/日)の群に無作為に分けた。試験物質を、0.2mL食塩水中に溶解させ、移植の次の日に開始して、40連続日間1日一回、腹腔内に投与した。
2.7.2.3 パラメータのモニタリング
マウスの一般状態を、毎日観察した。マウスを3〜4日ごとに体重測定し、腫瘍の容量を測定した。
V=(1/6)πXYZ、式中、X、YおよびZ、三平面上の腫瘍の直径であった。
腫瘍阻害指標=(食塩水群の平均腫瘍重量−処置群の平均腫瘍重量)/食塩水群の平均腫瘍重量×100)。
2.7.2.4 統計学的方法
統計解析を、一方向ANOVA解析を用いて、SPSSソフトウェアで実施した。
2.7.3 結果
好適な用量で、YSVが、食塩水対照群と比較して、統計学的に有意に(p<0.05)、ヌードマウス−移植A549ヒト肺がん異種移植片の増殖を阻害可能であることがわかった。
3.一般的結論
YSVが、Tリンパ球の変換を促進可能であることがわかり、このことはYSVが、ヒトの使用のために、免疫調節物として有用であり得る。
4.参考文献
1.Shuyun Xu,Rulian Bian,Xiu Chen.「薬理学的実験の方法論(第三版)(Methodology of pharmacological
experiment(3rd edition))」People’s Health Publishing House.2002,p1427
2.Shuyun Xu,Rulian Bian,Xiu Chen.「薬理学的実験の方法論(第三版)(Methodology of pharmacological
experiment(3rd edition))」People’s Health Publishing House.2002,p1785−1786
3. Potter G K,Shen R N,Chiao J W et al.「ヒト白血病研究のためのモデルとしてのヌードマウス(Nude mice as models for human leukemia studies.)」Am J Pathol,1984,114:360
4. Zhunjiang Xie,Wenqing Liu,Yechun He et al.「in vivoでの、マウスメラノーマ細胞における、朝鮮人参具罹患およびIL−2の阻害(The inhibition of ginseng glycan and IL−2 on mice melanoma cells in vivo.)」ACTA ANATOMICA SINICA,2002,33(5):538−540
5.Hanyue,「抗がんイヌの研究および実験技術(第一版)(The research and experiment techniques of anticarcinoma drugs.(1st Edition)」、Beijing medical university and China Xiehe medical university united Publishing House.(1997)299
II.遺伝子治療と処置の方法
以上のペプチド配列に基づく遺伝子治療を、これらのペプチドの1つをコードしている核酸配列を設計することによって実施する。核酸は、化学的に合成し、プロモーターに動作可能にライゲートし、発現ベクター内にクローン化しうる。ついで発現ベクターを、ヒト細胞内での発現のために、遺伝子治療の形態で、ヒト体内に投与する。本明細書で使用するところの、語句「遺伝的ベクター(genetic vector)」は、これらの発現ベクターを含む。遺伝子治療のために使用可能であるベクターには、アデノ関連ウイルス(Mizuno,M et al.(1998).Jpn J Cancer 89,76−80)、LNSXベクター(Miller,A.D.et al.(1993)Methods Enzymol 217,581−599)、およびレンチウイルス(Goldman,M.J.et al.(1997)Hum Gene Ther 8,2261−2268)が含まれる。
ターは、ペプチドを投与することが望ましい、宿主有機体に対して、病因性ではない、発現ベクターを、有機体内へ伝達しうる。いくつかの実施形態において、発現ベクターが、宿主生命体の健康に、明らかに有害な効果を持たない細菌または真菌有機体内で、望むペプチドを産出する。たとえば、望むペプチドをコードしている発現ベクターは、乳酸細菌、大腸菌(E.Coli)または酵母のような、有機体内で、望むペプチドを産出する発現ベクターでありうる。1つの実施形態において、発現ベクターは、哺乳動物の腸にて通常見られる細菌、または哺乳動物消化管によって許容された細菌にて、望むペプチドを産出する。望むペプチドを発現可能な、いくつかの細菌種には、限定はしないが、L.アシドフィラス(L.acidophilus)、L.アミロボルス(L.amylovorus)、L.カセイ(L.casei)、L.クリスーパツス(L.crispatus)、L.ガリナラム(L.gallinarum)、L.ガッセリ(L.gasseri)、L.ジョンソニ(L.johnsonii)、L.パラカセイ(L.paracasei)、L.プランタラム(L.plantarum)、L.レウテリ(L.reuteri)、L.ラムノサス(L.rhamnosus)またはその他のような、ラクトバシルス(Lactobacillus)種、B.アドレセンティス(B.adolescentis)、B.アニマルス(B.animalus)、B.ビフィダム(B.bifidum)、B.ブレーブ(B.breve)、B.インファンティス(B.infantis)、B.ラクティス(B.lactis)、B.ロンガム(B.longum)などのようなビフィドバクテリウム(Bifidebacterium)種、エンテロコッカス ファエカリス(Enterococcus faecalis)またはEnt.ファシウム(Ent.facium)、スポロラクトバシルス イヌリヌス(Sporolactobacillus inulinus)、バシルス サブチリス(Bacillus subtilis)またはバシルス セレウス(Bacillus cereus)、大腸菌(Escherichia coli)、プロピオニバクテリウム フレウデンレイチ(Propionibacterium freudenreichii)、またはサッカロマイセス セルビシエ(Saccharomyces cerevisiae)またはサッカロマイセス ボウラルジ(Saccharomyces boulardii)が含まれる。
、米国特許第6,100,388号、およびBelliniに付与された、米国特許第5,728,571号で見ることができる。これらの文献は、その全てが、参考文献によって、本明細書に組み込まれている。ペプチドが投与されるべき、宿主生命体の健康に、有害な効果ではない、有機体内で、本発明のペプチドの発現を促進する、任意の発現ベクターを使用しうることが好ましい。
つを、変性コドンシステムに基づき、これらのペプチドおよびその誘導体をコードするために使用しうる。
III.YSVおよびその誘導体へのペプチド共役物、および処方
本発明の生物学的活性ペプチドを、他の生物学的添加物または有用な物質に共役し、さらなる効果を提供するか、その治療効果を増強しうる。多くの可能性のある共役分子、その生物学的効果、およびペプチドに対する分子の共役のための方法は、本技術分野で公知である。他の候補共役パートナーに関して、そのパートナーに対する本来のペプチドの共役のための化学反応は、実験を行うことなく、当業者によって推定されうる。効果的な分子を以下に記述する。本発明の種々のペプチドを、どのようにその効果的な分子に共役させるかの特定の実施例と、得られた共役物産物の生物学的特性が記述される。本発明の他のペプチドをまた、同様の反応中で共役しうることが理解される。
et al.,Biohem.Pharmacol.,61(4):459,2001)、抗がん化学治療剤、5−フルオロ2−デオキシウリジン(FUdR)を、肝臓に化合
物を標的化し、肝臓微小転位を処置するために、ラクトサミン化ポリ−L−リシンに共役した。薬剤は選択的に肝臓細胞により取り上げられ、FUdRおよび標的化された分子間の結合を開裂した。ついで、遊離FUdRの一部分が肝臓細胞を出、抗がん剤の局在治療濃度が産出される。この濃度は、肝臓を浸潤した転位細胞における薬理学的活性に十分である。薬物が、選択的に肝臓内に濃縮されるため、共役薬剤の用量が、遊離、非共役化合物のもっとも小さな薬理学的に活性な用量よりも有意に小さい可能性がある。この戦略を、本発明の任意のペプチドで実施可能である。たとえば、ラクトサミン化ポリ−L−リシンの、ysvへの共役によって、個体内のB型肝炎感染および肝臓がんを処置するのに必要な用量を有意に減少可能である。
al.の技術を用いることによって、高レベルのソマトスタチンを発現している腫瘍細胞を、特異的に標的化する、強力な抗−がん処置が作製される。このアプローチは、任意の数のペプチドホルモンレセプターを過剰発現している腫瘍細胞を標的化するために適合可能である。薬物を、特的な組織型に標的化する他の実施例において、特異的に大腸がんに標的薬物を伝達するために、ポリ(L−アスパラギン酸)を、担体分子として使用した。(Leopold et al.,J.Pgarnacokinet.Biopharma.,23(4):397,1995)
特定の細胞または組織型へ、ペプチド薬剤を特異的に標的化することにおいて、YSVまたはその機能的誘導体を含む、から本質的になる、またはからなる、ペプチドの担体分子への共役が、ペプチド薬剤の伝達を促進するための他の方法を提供可能であり、それによって、その治療効果が増強されるか、さもなければ改善される。以下で記述した任意の共役技術を、本発明の任意のペプチドと共に、当業者に知られている他の技術でとして、使用しうる。任意の薬物の効果は、その化合物が、その標的に、効果的に伝達することが不可能である場合に、じゃまされる。薬物は、代謝処理または分解に基づく、活性の基本的な欠損なしに、その活性の部位まで、活性に、伝達されなければならない。ペプチド薬剤を、ペプチドの活性に対して影響を受けやすく、非常に荷電された分子として、血液脳関門のような、脂肪細胞膜および内皮細胞膜を介して伝達されることに耐性でありうる。他の分子への共役によって、分解からペプチドを保護するため、および通常化合物を排出しうる、細胞または解剖学的コンパートメント内への、ペプチド薬剤の吸収を促進するための方法が提供される。
−増殖特性を示すが、異常な薬物動態を持つ、ソマトスタチンの誘導体を、LAAまたはLSに共役する。得られた共役薬剤は、皮膚および腸内皮を通る吸収特性が改善され、分解に対する耐性が増加するが、一方で、腫瘍細胞に対して活性である。これらの技術は、本発明の任意のペプチドと共同で非常に有用であり得る。腸管内皮を介した分子の吸収の速度を増加させることによって、より多くのペプチドを、血流に伝達し、処置されている個体におけるその効果を及ぼすことが可能である。
本質的になる、またはからなるペプチドの酵素的分解を減少させるために使用しうる。研究者らは、腸内の内腔分泌プロテアーゼ、ならびに膜結合ペプチダーゼからペプチドを保護するための、多数のアプローチを発達させた。後者は、すべての粘膜組織の表面上に見られ、その通過が、しばしばペプチド薬剤に対する進入経路である。Bernkop−Schurch et al.(J.Drug Target.,7:55,1999)は、ペプシンの阻害剤を含む、ペプチド薬剤処方の産出を報告している。ペプスタチンの類似体は、粘膜接着ポリマー類に共有結合し、この新規のペプシン阻害剤は、インスリンを含む錠剤に含まれた。研究室状態刺激消化下のインキュベーションの後、対象錠剤からのすべてのインスリンが代謝され、一方で、およそ50%の、阻害剤を含む錠剤からのインスリンが、分解から保護された。他の研究において、同じグループ、通常、生物学的に活性なペプチドの分解を阻害するために、毒性の副作用を引き起こしうる用量で、プロテアーゼ阻害剤を使用した(Bernkop−Schnurch et al.Adv.Drug Del.Rev.,52:127,2001)。このアプローチは、キチンから抽出されたセルロースに関連するアミノポリサッカライドであり、甲殻類および他の有機体にて見られる主要な構造ポリサッカライドである、キトサンを用いる。プロテアーゼ阻害剤を、キトサンに共役し、この共役分子を、ペプチド薬剤の処方内に含めることによって、消化管プロテアーゼの有意な阻害が見られ、遊離プロテアーゼ阻害剤の投与で予測されうる副作用なしに、ペプチドのバイオアベイラビリティーが増加する。この研究で、種々のプロテアーゼ阻害剤のみ、および組み合わせで、キトサン担体への共役のために使用された。キトサン−EDTA共役物が、活性に関して、特定のプロテアーゼによって要求されるミネラルコーファクターに結合することによって、同様に内因性プロテアーゼを阻害した。当業者に簡単に理解されうるように、担体分子とエフェクター部位間のより多数の可能性のある組み合わせが、ペプチド処方に対して有益な特性を提供するために作製し得、その任意のものが、本発明のペプチドと一緒の使用のために、簡単に適合しうる。キトサンに結合した、プロテアーゼ阻害剤を用いて、ペプチドの経口伝達のための処方を作製することによって、YSVの経口伝達を、筋肉内注射に代わりに使用可能である。このアプローチは、このペプチドおよびその誘導体に関するバイオアベイラビリティーのより大きなレベルを作り出すために、この処方中で、(以上のパラグラフで議論した)より吸収性の、YSVの共役バージョンを用いては、除外されない。
の局所に対して、標的化されうる。
た、技術、試薬およびプロトコールはすべて、本発明の任意のペプチドに簡単に適用可能である。
[実施例1]
以下は、以上で記述したような、宿主に対して、本発明のペプチドを伝達するための、1つの例示方法を提供している。YSVをコードしているDNA配列を、化学的な方法によって合成し、このDNA配列を、当業者に知られている遺伝子組み換えの標準の技術を用いて、発現ベクター内に挿入する。選択された発現ベクターは、ラクトバシリ(Lactobacilli)内の構成プロモーター機能、特定の5’から3’方向での、DNA配列の導入のための多重クローニング部位、ならびに、(クローニング手順を補助するための)抗生物質に対する耐性を与える、選択可能マーカー遺伝子を含み、シグナルペプチド配列のような、ペプチドの産出および/または分泌を補助するための他の配列を含んで良い。そのようなベクターの実施例は、その全てが参考文献にて、本明細書に組み込まれた、Pavlaに付与された、米国特許第5,592,908号によって提供される。簡単に記すと、この特許は、ラクトバシルス種内で機能する、いくつかの公知のプロモーター、ならびに前記細菌内で、新規プロモーターを発見するための方法を議論しており、これらの任意が、ラクトバシリ内で、ペプチドを発現するために、本発明のペプチドをコードしている核酸に動作可能に連結してよい。以上で引用した、米国特許第5,529,908号にて記述された、ラクトバシルス ラクチス(Lactobacillus lactis)内で活性である、16〜35のほとんど疎水性アミノ酸からなるペプチドのような、シグナルペプチドをコードしている核酸を、シグナルペプチドをコードしている核酸が、本発明のペプチドをコードしている核酸とイン フレームであるように、プロモーターと、本発明のペプチドをコードしている核酸間に入れる。
るように、培養牛乳製品または他の食料品を作製するために使用可能である。乳酸細菌の特定の種を、ヨーグルト、キムチ、チーズおよびバターのような食料品内に組み込むための、多数の方法が、その全てが参考文献にて、本明細書に組み込まれている、Ohに付与された、米国特許第6.036,952号にて開示されている。任意の数の経路の1つを介して、細菌を消費することにおいて、遺伝子組み換えされた有機体が、腸でコロニー化し、腸の粘膜層を介して、本発明のペプチドの提示および/または吸収を可能にする。
[実施例2]
以下は、以上で記述したような宿主へ、本発明のペプチドを伝達する他の例示方法として提供される。以上の表Aにて列記されたペプチドの1つをコードしているDNA配列を、化学的方法によって合成し、このDNA配列を、遺伝子工学の技術、本技術分野で公知の全ての技術を介して、発現ベクターに挿入する。選択された発現ベクターには、pTZ18R(ファルマシア(Pharmacia)、Piscataway,NJ)のような、大腸菌およびB.サブチリス(B.Subtilis)両方で増殖可能であり、形質転換された細菌のコロニーを選択するための、抗生物質耐性遺伝子を含む、シャトルベクターが含まれる。このベクターは、B.サブチリスのSac B遺伝子から由来するプロモーターのような、B.サブチリス中で活性な構成プロモーター、ならびに、細菌細胞からの発現異種タンパク質の効率的な輸送を指向する、B.サブチリスにて活性なシグナルペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含みうる。そのようなベクターの実施例は、その全てが参考文献にて、本明細書に組み込まれている開示物である、Fahnestockに付与された、米国特許第6,268,169号にて開示されている。簡単に記すと、以上で詳述したように、本発明のペプチドをコードしているDNAを、当業者に知られている技術を介して、制限酵素部位、および/またはDNAのクローニングを促進するための他の配列を伴って合成しうる。大腸菌への形質導入、プレーティング、プラスミドストックを作製するためのプラスミドの選別と増殖の後、プラスミドを、B.サブチリスに形質転換して、トランスフォーマントを、プレーティング培地中で、抗生物質に対する耐性を利用して選別する。
[実施例3]
以下は、以上で記述したような宿主へ、本発明のペプチドを伝達する他の例示方法として提供される。以上の表Aにて列記されたペプチドの1つをコードしているDNA配列を、化学的方法によって合成し、このDNA配列を、遺伝子組み換えの技術、本技術分野で公知の全ての技術を介して、発現ベクターに挿入する。選択された発現ベクターには、pADH1のような、構成酵母プロモーターを含む、安定に維持された酵母タンパク質発現ベクター、酵母および大腸菌両方での、ベクターの複製のための部位、選別の目的のための、栄養要求生酵母変異体に、プロトトロフィーを与える遺伝子または遺伝子群、マルチクローニングサイト(MCS)、必要に応じて、シグナルペプチドをコードしている配列が含まれる。このようなベクターは、市販されており、本技術分野でよく知られており、標準の技術を用いて簡単に構築可能である。合成DNAの酵母ベクター内への挿入、大腸
菌への形質転換、形質転換された大腸菌の選択培地上へのプレーティング、形質転換された細菌コロニーの選別、および前記コロニーからの細菌の培養培地からのプラスミドDNAの調節の後、ベクターを、酢酸リチウム形質転換またはエレクトロポレーションのような、よく知られている技術を介して、サッカロマイセス セルビシエ(Saccharomyces cerevisiae)内に形質導入する。形質導入のために選択されたサッカロマイセス セルビシエの株は、最小培地プレート上で増殖するために、プラスミド上で遺伝子を要求しうる、変異体栄養要求株である。形質導入された酵母コロニーを、ベクター上で提供された遺伝子を欠いている増殖培地上に、酵母をプレートすることによって単離する。ベクターおよびその選別遺伝子を受け、遺伝子産物を発現しているような酵母のみが、最小培地上のコロニー内で増殖可能であり得る。ペプチド分泌の確認を、ウエスタンブロットを実施すること、増殖培地中に存在するペプチドのゲル電気泳動を実施すること、または他の標準の手順を実施することによって得ることができる。
[実施例4]
以下は、本発明のペプチドを、特定のコンパートメント、器官、細胞型または体内の局所へ選択的に伝達するための例示方法として提供される。この場合、腎炎が、個体の腎臓中の組織へ、YSVを標的化することによって処置される。YSVは、本技術分野で公知の化学反応を介して、共有結合にて、腎臓組織中で特に濃縮される、市販されるタンパク質部位である、低分子量(LMW)リソザイムに結合する。分子を、LMWリソザイムに共役することを達成するための技術は、記述されている(Folgert et al.,Br.J.Pharmcology,136:1107,2002)。タンパク質またはペプチドを他のものに共役する一般的な技術もまた、本技術分野の文献に述べられている(Fischer et al.,Bioconj.Chem.,12:825,2001)。新しく作製された共役ペプチド試料を、ついで、陽イオン交換FPLCおよび/または勾配遠心のような、クロマトグラフィー法によって、結合工程中で使用した化学薬剤から精製する。一旦精製したならば、共役ペプチドを、腎炎の治療を必要としている個体に投与する。抗腎炎活性に関して、YSVが、それ自身と、LMWリソザイム間の結合を用いて、腎臓組織を好ましく標的とし、腎臓の遠位細管の細胞によって、選択的に吸収され、異化される。この好ましい伝達によって、それ自身によるYSVのモル等量の効果と比較して、より大きな抗腎炎効果が可能となる。反対に、抗腎炎活性の特定のレベルを達成するために要求されるペプチド薬剤の量が減少する。
[実施例5]
以下は、神経活性ペプチドの脳への伝達を増加させるための例示方法として提示される。その効果を、脳のニューロンによって発現されたレセプター上で発揮する、本発明のペ
プチドを、当業者に公知の化学的方法によって合成する。あるいは、以上の実施例で詳述したように、遺伝子組み換えした微生物より発現され、そのような有機体の培養液より回収可能である。一旦精製形態で得たならば、ペプチドを、ペプチドに連結した、トリグリセリドエステル共役部位を作製するために、一連の有機化学反応で使用する。共役部位は、本発明のペプチドの、末端カルボキシル炭素とのアミド結合を介して、前記ペプチドに結合した、第四級置換炭素中心からなる。第四級炭素中心に結合した他の3つの群は、16炭素脂肪酸鎖に対する炭素エステル結合からなる。脂肪酸鎖それ自身は、鎖をより親水性にし、血液脳関門の内皮細胞膜を特異的に標的化にする、それ自身をペプチドマスクとして知られる、末端ジペプチド基が末端となる。この合成の手順は、Patel et al.,Bioconjugate Chem.,8(3):434,1997にて示されており、当業者に知られている共通の試薬および器具を使用している。
[実施例6]
以下は、消化管の表面内、および表面に沿って見られるプロテアーゼおよびペプチダーゼの活性に耐性である、経口投与のための、生物学的に活性なペプチドの処方を作製するための、例示的方法として提供される。この実施例において、YSVが、患者に対して経口投与するための、薬理学的処方の作製にて使用される。Larionova et al.(Int.J.Pharma.,189:171,1999)にて記述されたように、ペプチドが、可溶性デンプン、プロテアーゼ阻害剤、種々の内腔分泌、および刷子縁膜結合プロテアーゼの強力な阻害剤であるアポロチニンとの、微小粒子の作製で使用される。簡単に記すと、可溶性デンプン、プロテアーゼ阻害剤アプロチニン、および本発明のペプチドを、水性緩衝液中に溶解する。水溶性デンプン、アプロチニンペプチドの比を、当業者によって知られている実験方法によって決定し、たとえば、Larionova et al.は、彼らの研究にて使用したタンパク質に対して、もっとも効果的な比、および調製条件を決定するために、in vitro擬似消化アッセイを使用した。水性溶液を、5% Span−80、非イオン性界面活性剤を含むシクロヘキサン(1:3比、v/v)中での、機械的撹拌下で乳化させる。クロロホルム中の塩化テレフタロイル溶液を、前記エマルジョンに加え、撹拌を、30分間続け、その間に、デンプン分子が、アプロチニンおよびペプチドと架橋する。この工程で作製された微小粒子を、シクロ−ヘキサン、2% v/v Tween 85界面活性剤を含む95%エタノール溶液、95%エタノールおよび水で続けて洗浄する。微小粒子を、水中に再懸濁させ、凍結乾燥する。凍結乾燥した化合物を、処置が必要な個体への、経口伝達のために、ゼラチンカプセル中に入れることが可能である。
Claims (29)
- チロシル−セリル−バリンを含む、単離または精製ペプチド。
- トリペプチド、チロシル−セリル−バリンから本質的になる、請求項1に記載の単離または精製ペプチド。
- トリペプチド、チロシル−セリル−バリンからなる、請求項1に記載の単離または精製ペプチド。
- 前記ペプチドが、免疫応答の調節、Tリンパ球変換の刺激、細胞増殖疾病の調節、がんの増殖の調節、肝臓がんの増殖の調節、白血病細胞の増殖の調節、子宮頸がんの増殖の調節、肺がんの増殖の調節、およびメラノーマの増殖の調節、からなる群より選択される活性をもつ、請求項2のペプチド。
- 前記ペプチドが、トリペプチドL−チロシル−L−セリル−L−バリンである、請求項1〜4の任意に記載のペプチド。
- 前記ペプチドが、本質的に純粋な形態である、請求項1〜4の任意に記載のペプチド。
- トリペプチド、チロシル−セリル−バリンを含む、ポリペプチドを含む薬理学的組成物。
- トリペプチド、L−チロシル−L−セリル−L−バリンを含む、請求項7に記載の薬理学的組成物。
- トリペプチド、チロシル−セリル−バリンから本質的になるポリペプチドを含む、薬理学的組成物。
- トリペプチド、L−チロシル−L−セリル−L−バリンを含む、請求項9に記載の薬理学的組成物。
- トリペプチド、チロシル−セリル−バリンからなるポリペプチドを含む、薬理学的組成物。
- トリペプチド、L−チロシル−L−セリル−L−バリンを含む、請求項11に記載の薬理学的組成物。
- トリペプチド、チロシルセリル−バリンを提供すること、および前記トリペプチドを、薬理学的に許容可能な担体と混合すること、を含む、薬理学的組成物を作製する方法。
- 薬理学的に効果的な用量の、トリペプチド、チロシル−セリル−バリンを、ヒトに投与することを含む、ヒト疾患の効果を減少させる方法。
- 前記ヒトが、その効果を、Tリンパ球変換を刺激することによって減少可能である状態、および細胞増殖疾病からなる群より選択する疾患を患っている、請求項14に記載の方法。
- 前記細胞増殖疾病ががんである、請求項15に記載の方法。
- 前記がんが、肝臓がん、白血病、肺がん、メラノーマおよび子宮頸がんからなる群より選択される、請求項16に記載の方法。
- 薬理学的化合物として、チロシル−セリル−バリンを含む、トリペプチドの使用。
- 薬理学的化合物として、チロシル−セリル−バリンから本質的になるトリペプチドの使用。
- 薬理学的化合物として、チロシル−セリル−バリンからなるトリペプチドの使用。
- 前記化合物が、細胞増殖疾患の処置のために使用される、請求項18に記載の使用。
- 前記細胞増殖疾患が、がんである、請求項21に記載の使用。
- 前記がんが、肝臓がん、白血病、肺がん、メラノーマおよび子宮頸がんからなる群より選択される、請求項22に記載の使用。
- 前記化合物が、免疫系の調節のために使用される、請求項18に記載の使用。
- 栄養サプリメントとして、トリペプチド、チロシル−セリル−バリンを含む、ペプチドの使用。
- 栄養サプリメントとして、トリペプチド、チロシル−セリル−バリンから本質的になるペプチドの使用。
- 栄養サプリメントとして、トリペプチド、チロシル−セリル−バリンからなるペプチドの使用。
- トリペプチド、チロシル−セリル−バリンの増強誘導体を含む分子であり、前記増強誘導体が、トリペプチド、チロシル−セリル−バリンに動作可能に連結した増強分子を含み、前記増強分子が、前記トリペプチドの治療的効果を増強する、分子。
- チロシル−セリル−バリンから本質的になるペプチド。
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