RU2331437C1

RU2331437C1 - Method of producing house dust mite (dermatophagoides) allergen

Info

Publication number: RU2331437C1
Application number: RU2007100063/15A
Authority: RU
Inventors: Валентина Михайловна Бержец (RU); Валентина Михайловна Бержец; Нина Сергеевна Петрова (RU); Нина Сергеевна Петрова; н Светлана Вагинаковна Хлгат (RU); Светлана Вагинаковна Хлгатян; нова Ольга Юрьевна Емель (RU); Ольга Юрьевна Емельянова
Priority date: 2007-01-09
Filing date: 2007-01-09
Publication date: 2008-08-20

Abstract

FIELD: medicine, pharmacology.

SUBSTANCE: method comprise salt-water extraction from raw material using Evans-Cook extraction liquid, mites cultivation during from 3 to 4 months, at temperature 25±2°C and relative air humidity 73±3%, on house dust and bristle. As initial basis, the mix of house dust mites Dermatophagoides farina or Dermatophagoides pternissinus culture and culture medium, including excrements, cast off skins, and food debris, is used. Salt-water extraction from raw material is performed during three days, after mixing it and homogenization with glass powder; the maintained incubation temperature is 2° to 10°C; the extraction material being shaken for 30 minutes three times a day with 1.5 hour intervals. Extraction completed, the supernatant liquor is decanted and centrifuged at 5000 to 6000 rpm for 30-40 minutes, then it is filtered through paper filter; in consequence sterilization through filtering, 3 to 4 months mother solution stabilisation, and bottling are carried out; the finished preparation is produced.

EFFECT: invention provides producing high effective treatment allergen in simplified process technology.

2 ex

Description

Изобретение относится к фармакологии и медицине, конкретно к способу получения аллергена из клещей домашней пыли рода Дерматофагоидес - Дерматофагоидес фарина и Дерматофагоидес птерониссинус.The invention relates to pharmacology and medicine, specifically to a method for producing an allergen from house dust mites of the genus Dermatophagoides - Dermatophagoides farina and Dermatophagoides pteronissinus.

Известен способ получения аллергена из клещей домашней пыли рода Дерматофагоидес - Дерматофагоидес фарина и Дерматофагоидес птерониссинус, включающий водно-солевую экстракцию исходного сырья и обработку его формальдегидом, экстрагирование раствором гидрокарбоната аммония, центрифугирование в течение 45 мин, фильтрацию экстракта, проведение диализа в течение 52 ч при температуре 6±2°С, дважды по 24 ч против 0,002 М раствора гидрокарбоната аммония и один раз в течение 4 ч против дистиллированной воды, центрифугирование диализованного экстракта в течение 1 ч, фильтрацию его через бумажный фильтр, проведение лиофильного высушивания до остаточной влажности не более 4%, растворение сухого остатка в стерильных условиях в 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,5, добавление 1%-ного раствора формальдегида, проведение стерилизующей фильтрации, выдерживание формалинизированного аллергоида в течение 32 суток при температуре 32°С с последующим проведением диализа при температуре 6±2°С против 0,1 М фосфатного буферного раствора с рН 7,5 до получения готовой формы аллергена для диагностики (RU 2265450, А61К 39/00, 2005 г.).A known method of producing an allergen from ticks of house dust of the genus Dermatophagoides - Dermatophagoides farina and Dermatophagoides pteronissinus, including water-salt extraction of the feedstock and processing it with formaldehyde, extraction with ammonium bicarbonate solution, centrifugation for 45 minutes, filtering the extract to filter the extract at a temperature of 6 ± 2 ° C, twice for 24 hours against a 0.002 M solution of ammonium bicarbonate and once for 4 hours against distilled water, centrifuging the dialyzed extract for 1 h, filtering it through a paper filter, conducting freeze drying to a residual moisture content of not more than 4%, dissolving the dry residue under sterile conditions in 0.1 M phosphate buffer with a pH of 7.5, adding 1% formaldehyde solution, sterilizing filtration, maintaining a formalized allergoid for 32 days at a temperature of 32 ° C followed by dialysis at a temperature of 6 ± 2 ° C against 0.1 M phosphate buffer solution with a pH of 7.5 to obtain a ready-made form of an allergen for diagnosis (RU 2265450 , A61K 39/00, 2005).

Наиболее близким является способ получения аллергена из клещей домашней пыли рода Дерматофагоидес - Дерматофагоидес фарина и Дерматофагоидес птерониссинус, включающий водно-солевую экстракцию исходного сырья с использованием экстрагирующей жидкости Эванс-Кока, культивирование клещей в течение 3-4 месяцев при 25±2°С и относительной влажности 73±3% на субстрате из домашней пыли и щетине (Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 1987, №6, с.57-59).The closest is a method of producing an allergen from ticks of house dust of the genus Dermatophagoides - Dermatophagoides farina and Dermatophagoides pteronissinus, including water-salt extraction of feedstock using Evans-Coca extracting liquid, mite cultivation for 3-4 months at 25 ± 2 ° C and relative humidity 73 ± 3% on a substrate of house dust and bristles (Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology, 1987, No. 6, p. 57-59).

Недостатком известных способов является сложность и длительность технологического процесса.A disadvantage of the known methods is the complexity and duration of the process.

Техническим результатом изобретения является упрощение технологического процесса за счет исключения процесса обработки исходного сырья формальдегидом, экстрагирования гидрокарбонатом аммония, диализа, лиофильного высушивания и создание высокоэффективного лечебного аллергена.The technical result of the invention is to simplify the process by eliminating the processing of the feedstock with formaldehyde, extraction with ammonium bicarbonate, dialysis, freeze drying and the creation of a highly effective therapeutic allergen.

Для достижения указанного технического результата в способе получения аллергена из клещей домашней пыли рода Дерматофагоидес, включающем водно-солевую экстракцию исходного сырья с применением экстрагирующей жидкости Эванс-Кока, культивирование клещей в течение 3-4 месяцев при 25±2°С и относительной влажности 73±3% на субстрате из домашней пыли и щетине, согласно изобретению в качестве исходного сырья используют смесь культуры клещей домашней пыли Дерматофагоидес фарина или Дерматофагоидес птерниссинус и среды их культивирования, включающие экскременты, линочные шкурки клещей и оставшийся пищевой субстрат, водно-солевую экстракцию исходного сырья проводят после смешивания и гомогенизирования его со стеклянным порошком в течение трех суток, причем экстрагируемый материал ежедневно встряхивают трижды по 30 минут с интервалом 1,5 часа, в интервалах между встряхиваниями экстрагируемый материал поддерживают при температуре от 2 до 10°С, после окончания экстрагирования надосадочную жидкость сливают и проводят центрифугирование при 5000-6000 об/мин в течение 30-40 минут с последующей фильтрацией через бумажный фильтр, осуществляют стерилизующую фильтрацию, стабилизацию маточного раствора в течение 3-4 месяцев, разлив и получение готовой формы препарата.To achieve the specified technical result in a method for producing allergen from ticks of house dust of the genus Dermatophagoides, including water-salt extraction of feedstock using Evans-Coca extracting liquid, cultivating ticks for 3-4 months at 25 ± 2 ° C and relative humidity 73 ± 3% on a substrate of house dust and bristles, according to the invention, a mixture of a house dust mite culture Dermatophagoides farina or Dermatophagoides pternissinus and their cultivation medium, including excrement, mite skins of the mites and the remaining food substrate, water-salt extraction of the feedstock is carried out after mixing and homogenizing it with glass powder for three days, and the extracted material is shaken daily three times for 30 minutes with an interval of 1.5 hours, in the intervals between by shaking, the extracted material is maintained at a temperature of 2 to 10 ° C, after the extraction is completed, the supernatant is drained and centrifuged at 5000-6000 rpm for 30-40 minutes, followed by s filtered through a filter paper, a sterilizing filtration is carried out, the mother liquor stabilize for 3-4 months spilling and receiving the formulation of the drug.

Изобретение иллюстрируется на следующих примерах.The invention is illustrated by the following examples.

Пример 1. Для получения аллергена в качестве исходного сырья используют смесь культуры клещей домашней пыли Дерматофагоидес фарина и среды их культивирования, включающую экскременты, линочные шкурки клещей и оставшийся пищевой субстрат. Культура клещей находится в термостате 3-4 месяца. Все это время поддерживается постоянная температура 26±2°С и влажность воздуха 75±5%. Влажность воздуха определяется по показаниям гигрометра. Один раз в две недели необходимо контролировать показатели термометра и гигрометра, рыхлить субстрат, проводить аэрацию термостатов, проводить контроль видовой специфичности клещей. Микропрепараты готовят в жидкости Фора-Берлезе или молочной кислоте. Определение вида клещей осуществляется по таблицам, изложенным в «Методах обнаружения и определения аллергенных клещей домашней пыли» Е.В. Дубининой, Б.Д. Плетнева, Л., 1977. Стеклянный порошок, содержащий клещей и среду культивирования, в которую входят экскременты, личиночные шкурки клещей и другие компоненты помещают в ступку с целью измельчения и завязывают марлей с отверстием в центре.Example 1. To obtain an allergen, a mixture of house dust mite culture Dermatophagoides Farin and their cultivation medium, including excrement, mite skins of mites and the remaining food substrate, is used as a feedstock. The tick culture is in the thermostat for 3-4 months. All this time a constant temperature of 26 ± 2 ° C and air humidity of 75 ± 5% are maintained. Humidity is determined by the hygrometer. Once every two weeks, it is necessary to control the thermometer and hygrometer, loosen the substrate, conduct aeration of thermostats, monitor the species specificity of ticks. Micropreparations are prepared in Fora-Berlese fluid or lactic acid. The determination of the type of ticks is carried out according to the tables set out in “Methods for the detection and determination of allergenic mites of house dust” E.V. Dubinina, B.D. Pletneva, L., 1977. A glass powder containing ticks and a cultivation medium that includes excrement, larval skins of ticks and other components are placed in a mortar for grinding and tied with gauze with a hole in the center.

В отверстие марли опускают пестик и в течение 30 минут растирают содержимое. В емкость с 6,0 литрами экстрагирующей жидкости Эванс-Кока через воронку пересыпают измельченную среду культивирования клещей. Содержимое бутыли перемешивают, исключая сильное встряхивание. На 30-40 минут бутыль оставляют при комнатной температуре, после чего контролируют значение рН. Далее бутыль с раствором аллергена помещают в холодильную камеру с температурой от 2 до 10°С.A pestle is lowered into the gauze hole and the contents are ground for 30 minutes. In a container with 6.0 liters of Evans-Coca extracting liquid, the ground tick culture medium is poured through a funnel. The contents of the bottle are mixed, excluding strong shaking. For 30-40 minutes, the bottle is left at room temperature, after which the pH value is monitored. Next, a bottle with an allergen solution is placed in a refrigerator with a temperature of 2 to 10 ° C.

В последующие трое суток до полного извлечения из субстрата гликопротеидных комплексов проводят следующий режим обработки: ежедневно бутыль с экстрагируемым материалом помещают на аппарат для встряхивания жидкостей в сосудах трижды по 30 минут с интервалом 1,5 часа. В интервалах между встряхиваниями бутыль с экстрагируемым материалом должна находиться при температуре от 2 до 10°С.In the next three days, until the glycoprotein complexes are completely removed from the substrate, the following treatment regimen is carried out: daily, a bottle with extractable material is placed on the apparatus for shaking liquids in vessels three times for 30 minutes with an interval of 1.5 hours. In the intervals between shaking, the bottle with the extracted material should be at a temperature of 2 to 10 ° C.

В конце рабочего дня ежедневно контролируют рН раствора и проводят коррекцию рН до значения 7,0±0,2 добавлением 0,1 моль/л раствора гидроокиси натрия или 0,1 моль/л раствора соляной кислоты. После окончания надосадочную жидкость сливают, проводя предварительную фильтрацию. Далее осуществляют центрифугирование на рефрижераторной центрифуге при 5000-6000 об/мин в течение 30-40 минут с последующей фильтрацией через бумажный фильтр.At the end of the working day, the pH of the solution is monitored daily and the pH is adjusted to a value of 7.0 ± 0.2 by adding 0.1 mol / L sodium hydroxide solution or 0.1 mol / L hydrochloric acid solution. After the end, the supernatant is drained by preliminary filtration. Then carry out centrifugation in a refrigerator centrifuge at 5000-6000 rpm for 30-40 minutes, followed by filtration through a paper filter.

Проводят стерилизующую фильтрацию. В день проведения данной операции необходимо проконтролировать значение рН приготовленного аллергена.Sterilizing filtration is carried out. On the day of this operation, it is necessary to control the pH value of the prepared allergen.

Стабилизация маточного раствораStock solution stabilization

Стерильный раствор аллергена для стабилизации физических и биологических свойств выдерживают от 3 до 5 месяцев при температуре от 2 до 10°С. В тех случаях, когда содержание белкового азота в маточном растворе превышает 5000±2000 PNU/мл, маточный раствор аллергена в период стабилизации разводят стерильной экстрагирующей жидкостью до содержания единиц белкового азота 5000±200 PNU/мл.A sterile allergen solution to stabilize physical and biological properties can withstand from 3 to 5 months at a temperature of from 2 to 10 ° C. In cases where the content of protein nitrogen in the mother liquor exceeds 5000 ± 2000 PNU / ml, the mother liquor of the allergen during dilution is diluted with sterile extracting liquid to the content of protein nitrogen units of 5000 ± 200 PNU / ml.

После разлива маточного раствора аллергена получают готовую форму препарата.After the spill of the mother liquor of the allergen, the finished product is prepared.

Контроль свойств полученных препаратов проводили в соответствии с «Методическими указаниями первичной экспериментально-клинической апробации новых форм аллергенов».The control of the properties of the obtained preparations was carried out in accordance with the “Methodological guidelines for the primary experimental and clinical testing of new forms of allergens”.

Пример 2. Осуществляют аналогично примеру 1, за исключением того, что в качестве исходного сырья используют смесь культуры клещей домашней пыли Дерматофагоидес птерниссинус и среды их культивирования.Example 2. Carried out analogously to example 1, except that as a source of raw materials using a mixture of culture of ticks of house dust Dermatophagoides pternissinus and their cultivation environment.

Изучение свойств аллергенов из клещей домашней пыли Дерматофагоидес птерониссинус и Дерматофагоидес фаринаStudy of the properties of allergens from house dust mites Dermatophagoides pteronissinus and Dermatophagoides farina

При проведении исследований клещевых аллергенов in vitro применяли сыворотку больных, чувствительных к бытовым аллергенам.When conducting in vitro testing of tick-borne allergens, the serum of patients sensitive to household allergens was used.

Больным исследуемой и контрольной групп ставили скарификационные пробы и определяли сывороточные иммуноглобулины. При проведении исследований были отобраны сыворотки с высоким содержанием IgE-AT (3-4 класса) и при постановке скарификационных проб у больных были 3-4 креста на аллерген.Patients of the studied and control groups were given scarification tests and serum immunoglobulins were determined. When conducting studies, serums with a high IgE-AT content (grade 3-4) were selected and when setting up scarification samples, patients had 3-4 crosses for an allergen.

Проводили сравнительное определение белкового азота и белка методами: Несслера, Биуретового и по связыванию красителя кумасси G-250. Было показано, что наиболее точные результаты дает метод определения белка по Бредфорду.A comparative determination of protein nitrogen and protein was carried out using the following methods: Nessler, Biuret and Coomassie G-250 dye binding. It was shown that the most accurate results are obtained by the method of determining protein according to Bradford.

Изучение фракционного состава методом изоэлектрофокусирования показало наличие в аллергенных экстрактах 10-12 белковых фракций. Изоэлектрические точки расположены в интервале рН от 3,5 до 6,55 Дерматофагоидес птерониссинус и Дерматофагоидес фарина имеют одинаковые белковые компоненты и некоторые различия в области рН 5,25 до 6,0.The study of the fractional composition by isoelectric focusing showed the presence of 10-12 protein fractions in allergenic extracts. Isoelectric points are located in the pH range from 3.5 to 6.55. Dermatophagoides pteronissinus and Dermatophagoides farina have the same protein components and some differences in the pH range 5.25 to 6.0.

С целью определения качественного и количественного антигенного состава использовали методы ракетного и перекрестного иммуноэлектрофореза. Аллергены из клещей Дерматофагоидес птерониссинус и Дерматофагоидес фарина имеют близкий антигенный состав из 9-18 компонентов и близко по составу к Международному стандарту.In order to determine the qualitative and quantitative antigenic composition, methods of missile and cross-section immunoelectrophoresis were used. Allergens from ticks Dermatophagoides pteronissinus and Dermatophagoides farina have a close antigenic composition of 9-18 components and are close in composition to the International Standard.

Изучение фракционного состава и определение молекулярной массы аллергенов с помощью электрофореза в ПААГ (полиакриламидный гель) с додецилсульфатом натрия показало, что аллергены состоят из 10-12 фракций с молекулярной массой 10-140 кД.The study of the fractional composition and determination of the molecular weight of allergens by electrophoresis in PAG (polyacrylamide gel) with sodium dodecyl sulfate showed that allergens consist of 10-12 fractions with a molecular weight of 10-140 kD.

Изучение специфической активности фракций с помощью иммуноблотинга показало, что IgE связывались компоненты с молекулярной массой для Дерматофагоидес птерониссинус 25,18 кД, для Дерматофагоидес фарина 10,40 кД.The study of the specific activity of the fractions using immunoblotting showed that IgE bound components with a molecular weight of 25.18 kD for Dermatophagoides, 10.40 kD for Dermatophagoids.

Определение взаимодействия с аллергоспецифическими IgE и IgG антителами аллергенов из клещей методом ИФА выявило высокую специфическую активность серий клещевых аллергенов в реакции торможения ИФА. Процент торможения связывания аллергенспецифических IgE для Дерматофагоидес птерониссинус 90%, для Дерматофагоидес фарина 88%. Процент торможения связывания аллергенонеспецифических IgG антител для Дерматофагоидес птерониссинус 60%, для Дерматофагоидес фарина 49%.The determination of the interaction with allergen-specific IgE and IgG antibodies of allergens from ticks by ELISA revealed a high specific activity of a series of tick-borne allergens in the inhibition of ELISA. The percentage of inhibition of binding of allergen-specific IgE for Dermatophagoides pteronissinus is 90%, for Dermatophagoides Farin 88%. The percentage of inhibition of binding of allergen-specific IgG antibodies for Dermatophagoides pteronissinus 60%, for Dermatophagoides farina 49%.

Проведено сравнительное изучение клещевых аллергенов Дерматофагоидес птерониссинус и Дерматофагоидес фарина методом ЭФП с использованием сенсибилизированных лимфоцитов. Изменение ЭФП лимфоцитов, сенсибилизированных клещевыми аллергенами Дерматофагоидес птерониссинус и Дерматофагоидес фарина с добавлением данных аллергенов, показало видовую специфичность аллергенов, а также общность их антигенных свойств. Определение изменения ЭФП лимфоцитов под воздействием аллергенов Дерматофагоидес птерониссинус и Дерматофагоидес фарина в различных разведениях выявило большую аллергенную активность аллергена из клещей Дерматофагоидес птерониссинус. Изучение изменения различных по ЭФП субпопуляций лимфоцитов под воздействием клещевых аллергенов показало, что лимфоциты различных субпопуляций обладают неодинаковой чувствительностью к клещевым аллергенам. Максимальную чувствительность обнаруживают лимфоциты с наибольшими значениями ЭФП - третья субпопуляция.A comparative study of tick-borne allergens Dermatophagoides pteronissinus and Dermatophagoides farin by EFP using sensitized lymphocytes was carried out. Changes in the EFP of lymphocytes sensitized by tick-borne allergens Dermatophagoides pteronissinus and Dermatophagoides farina with the addition of these allergens showed the specificity of allergens, as well as the generality of their antigenic properties. Determination of the change in the EFP of lymphocytes under the influence of allergens Dermatophagoides pteronissinus and Dermatophagoides farin in various dilutions revealed a great allergenic activity of the allergen from ticks Dermatophagoides pteronissinus. The study of changes in lymphocyte subpopulations of lymphocytes different in terms of exposure to tick-borne allergens showed that lymphocytes of different subpopulations have different sensitivity to tick-borne allergens. The maximum sensitivity is detected by lymphocytes with the highest values of AFP - the third subpopulation.

Claims

A method of producing an allergen from house dust mites of the genus Dermatophagoides, including water-salt extraction of feedstock using Evans-Coca extracting liquid, cultivating mites for 3-4 months at a temperature of 25 ± 2 ° C and a relative humidity of 73 ± 3% on a substrate from house dust and bristles, characterized in that, as a feedstock, a mixture of house dust mite culture Dermatophagoides farina or Dermatophagoides pterississus and cultivation media including excrement, moult skins is used mites and the remaining food substrate, water-salt extraction of the feedstock is carried out after mixing and homogenizing it with glass powder for three days, moreover, the extracted material is shaken three times every 30 minutes with an interval of 1.5 hours, in the intervals between shakes the extracted material is maintained at temperature from 2 to 10 ° C, after extraction is completed, the supernatant is drained and centrifuged at 5000-6000 rpm for 30-40 minutes, followed by filtration through a paper filter, They sterilize filtration, stabilize the mother liquor for 3-4 months, spill and obtain the finished product.