RU2322258C2 - Antigen matrix for treatment of bone disease - Google Patents
Antigen matrix for treatment of bone disease Download PDFInfo
- Publication number
- RU2322258C2 RU2322258C2 RU2004117075/15A RU2004117075A RU2322258C2 RU 2322258 C2 RU2322258 C2 RU 2322258C2 RU 2004117075/15 A RU2004117075/15 A RU 2004117075/15A RU 2004117075 A RU2004117075 A RU 2004117075A RU 2322258 C2 RU2322258 C2 RU 2322258C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- rankl
- protein
- seq
- virus
- amino acid
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0007—Nervous system antigens; Prions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/35—Allergens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/521—Chemokines
- C07K14/523—Beta-chemokines, e.g. RANTES, I-309/TCA-3, MIP-1alpha, MIP-1beta/ACT-2/LD78/SCIF, MCP-1/MCAF, MCP-2, MCP-3, LDCF-1, LDCF-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5409—IL-5
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5437—IL-13
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
- C07K16/082—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
- C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
- C07K16/4291—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig against IgE
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5258—Virus-like particles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6075—Viral proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
- A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Virology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
ПРЕДПОСЫЛКА ИЗОБРЕТЕНИЯBACKGROUND OF THE INVENTION
Область изобретенияField of Invention
Данное изобретение относится к областям молекулярной биологии, вирусологии, иммунологии и медицины. Изобретение относится к композиции, содержащей упорядоченную и повторяющуюся матрицу антигенов или антигенных детерминант и, в частности, матрицу белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL. Более конкретно, изобретение относится к композиции, содержащей вирусоподобную частицу и по меньшей мере один связанный с ней белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL. Изобретение также относится к способу получения конъюгатов и, соответственно, упорядоченных и повторяющихся матриц. Композиции согласно изобретению применимы для получения вакцин для лечения заболеваний кости и в качестве фармацевтической вакцины для профилактики или лечения заболеваний кости и для эффективной индукции иммунных ответов, в частности гуморальных ответов. Кроме того, композиции согласно изобретению особенно применимы для эффективной индукции специфичных для аутоантигенов иммунных ответов в указанном контексте.This invention relates to the fields of molecular biology, virology, immunology and medicine. The invention relates to a composition comprising an ordered and repeating matrix of antigens or antigenic determinants, and in particular, a matrix of a RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide. More specifically, the invention relates to a composition comprising a virus-like particle and at least one RANKL protein, a RANKL fragment, or a RANKL peptide associated with it. The invention also relates to a method for producing conjugates and, accordingly, ordered and repeating matrices. The compositions of the invention are useful in the preparation of vaccines for the treatment of bone diseases and as a pharmaceutical vaccine for the prevention or treatment of bone diseases and for the effective induction of immune responses, in particular humoral responses. In addition, the compositions of the invention are particularly useful for the effective induction of autoantigen-specific immune responses in this context.
Связанная областьLinked Area
Живая кость постоянно обновляется в результате сбалансированных и согласованных процессов ремоделирования. В основном два типа клеток вносят вклад в указанное ремоделирование: остеобласты необходимы для образования кости, тогда как остеокласты стимулируют распад костного матрикса и солюбилизацию гидроксиапатита. У молодых людей с растущими костями скорость образования кости превышает скорость резорбции кости, тогда как у более старших людей скорость резорбции может превышать образование и приводить к чистой потере минеральной плотности кости и/или костной массы. В последнем случае прочность костей ослабевает, и это приводит к повышенному риску переломов, а также медленному и неполному восстановлению сломанных костей. Известно, что множество состояний у человека связано с дисбалансом в ремоделировании костей.Live bone is constantly being updated as a result of balanced and coordinated remodeling processes. Basically, two types of cells contribute to this remodeling: osteoblasts are necessary for bone formation, while osteoclasts stimulate the breakdown of the bone matrix and the solubilization of hydroxyapatite. In young people with growing bones, the rate of bone formation exceeds the rate of bone resorption, while in older people, the rate of resorption may exceed formation and lead to a net loss of bone mineral density and / or bone mass. In the latter case, bone strength weakens, and this leads to an increased risk of fractures, as well as a slow and incomplete restoration of broken bones. It is known that many conditions in humans are associated with an imbalance in bone remodeling.
В последнее время описаны три белка, которые являются ключевыми белками, вовлеченными в образование остеокластов из гематопоэтических клеток-предшественников и в регуляцию ремоделирования кости. RANKL (лиганд активатора рецептора NFkB), который также называют TNFSF11 (представитель 11 суперсемейства фактора некроза опухоли), TRANCE (TNF-родственный индуцируемый при активации цитокин), ODF (фактор дифференцировки остеокластов) или OPGL (лиганд остеопротегерина), является трансмембранным белком из 245 аминокислот, который образует гомотримеры. Часть внеклеточной области RANKL может быть удалена TACE-подобной протеазой. Кроме того, описаны варианты сплайсинга, в которых отсутствует трансмембранная область. Удаляемая часть RANKL содержит домен, который в высокой степени гомологичен TNF-α (Lum, L., et al., J. Biol. Chem. 274: 13613-13618 (2000)).Recently, three proteins have been described, which are key proteins involved in the formation of osteoclasts from hematopoietic progenitor cells and in the regulation of bone remodeling. RANKL (NFkB receptor activator ligand), also called TNFSF11 (representative of the 11th tumor necrosis factor superfamily), TRANCE (TNF-related inducible cytokine activation), ODF (osteoclast differentiation factor) or OPGL (osteoprotegerin ligand), is a transmembrane protein of 24 amino acids that forms homotrimers. Part of the extracellular region of RANKL can be removed by a TACE-like protease. In addition, splicing options are described in which there is no transmembrane region. The deleted portion of RANKL contains a domain that is highly homologous to TNF-α (Lum, L., et al., J. Biol. Chem. 274: 13613-13618 (2000)).
Способы получения белка RANKL и фрагментов RANKL описаны в WO 9846751, US 5843678, WO 98259958, US 6242586, WO 9828426, US 6242213, WO 9929865, JP 2000102390 и WO 0015807.Methods for producing RANKL protein and RANKL fragments are described in WO 9846751, US 5843678, WO 98259958, US 6242586, WO 9828426, US 6242213, WO 9929865, JP 2000102390 and WO 0015807.
RANKL взаимодействует с трансмембранной молекулой на остеокластах, называемой RANK (активатор рецептора NFkB). Это взаимодействие приводит к активации предшественника остеокласта и заканчивается образованием активных резорбирующих кость остеокластов. In vivo растворимый рецептор-ловушка, называемый остеопротегерином, вовлечен в регуляцию остеокластогенеза благодаря его способности связываться с RANKL и ингибировать взаимодействие RANKL с его рецептором RANK. Указанное ингибирование приводит к подавлению остеокластогенеза и, таким образом, обеспечивает способ, позволяющий остановить чрезмерную резорбцию кости. Взаимодействие RANKL с его рецептором RANK можно подавить рекомбинантным остеопротегерином и растворимым слитым белком RANK-Fc. В соответствии с данными наблюдениями, у RANKL- и RANK-дефицитных мышей развивается остеопетроз, тогда как у сверхэкспрессирующих RANKL трансгенных мышей, а также у мышей с дефицитом остеопротегерина развивается остеопороз (Kong YY., et al., Nature 397: 315-322 (1999), Kim, N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 97: 10905-10910 (2000), Dougall, B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 97: 1566-1571 (1999), Bucay, N., et al., Genes Dev. 12: 1260-1268 (1998)).RANKL interacts with a transmembrane molecule on osteoclasts called RANK (NFkB receptor activator). This interaction leads to the activation of the osteoclast precursor and ends with the formation of active bone resorbing osteoclasts. In vivo, a soluble trap receptor called osteoprotegerin is involved in the regulation of osteoclastogenesis due to its ability to bind to RANKL and inhibit the interaction of RANKL with its RANK receptor. Said inhibition results in suppression of osteoclastogenesis and, thus, provides a method for stopping excessive bone resorption. The interaction of RANKL with its receptor RANK can be suppressed by recombinant osteoprotegerin and soluble RANK-Fc fusion protein. According to observations, RANKL- and RANK-deficient mice develop osteopetrosis, while overexpressing RANKL transgenic mice, as well as osteoprotegerin deficient mice, develop osteoporosis (Kong YY., Et al., Nature 397: 315-322 ( 1999), Kim, N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 97: 10905-10910 (2000), Dougall, B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 97: 1566- 1571 (1999), Bucay, N., et al., Genes Dev. 12: 1260-1268 (1998)).
Важное значение системы RANKL-RANK-остеопротегерин, кроме того, подтверждено в животной модели остеопороза на грызунах, индуцированного дефицитом эстрогенов. Рекомбинантный остеопротегерин полностью отменял индуцированную овариэктомией потерю костной ткани (Simonet, W.S., et al. Cell 89: 309-319 (1997).The importance of the RANKL-RANK-osteoprotegerin system is furthermore confirmed in an animal model of rodent-induced osteoporosis induced by estrogen deficiency. Recombinant osteoprotegerin completely abolished ovariectomy-induced bone loss (Simonet, W. S., et al. Cell 89: 309-319 (1997).
В модели индуцированного адъювантом артрита инъекцией остеопротегерина можно было предотвратить потерю кости и деструкцию хряща, но не воспаление (опухание лапы). Помимо экспрессии на клетках стромы, RANKL также экспрессируется на T-клетках, и RANK обнаружен на антигенпрезентирующих клетках. Предполагается, что во время артритической реакции активированные T-клетки с повышенной экспрессией RANKL опосредуют усиление остеокластогенеза и последующую потерю кости. Взаимодействие RANKL с RANK также увеличивает долговечность и адъювантные свойства дендритных клеток (Kong Y.Y., et al., Nature 402: 304-309 (1999)).In the adjuvant-induced arthritis model, osteoprotegerin injection could prevent bone loss and cartilage destruction, but not inflammation (paw swelling). In addition to expression on stromal cells, RANKL is also expressed on T cells, and RANK is detected on antigen-presenting cells. During an arthritic reaction, activated T cells with increased RANKL expression are thought to mediate increased osteoclastogenesis and subsequent bone loss. The interaction of RANKL with RANK also increases the longevity and adjuvant properties of dendritic cells (Kong Y. Y., et al., Nature 402: 304-309 (1999)).
Разрушение альвеолярной кости и последующая утрата зубов наблюдается при периодонтальных инфекциях. In vivo ингибирование функции остеопротегерином уменьшает деструкцию альвеолярной кости и уменьшает количество периодонтальных остеокластов после заражения микробами (Teng, Y.T.A., et al., J. Clin. Invest. 106: R59-R67 (2000).Destruction of the alveolar bone and subsequent loss of teeth is observed with periodontal infections. In vivo inhibition of osteoprotegerin function reduces the destruction of the alveolar bone and reduces the number of periodontal osteoclasts after infection by microbes (Teng, Y.T.A., et al., J. Clin. Invest. 106: R59-R67 (2000).
Опухоли костей и некоторые опухолевые метастазы характеризуются повышенной резорбцией кости вследствие повышенного остеокластогенеза (Hofbauer, L.C. and Heufelder A.E., J. Clin. Endocrin. Met. 85: 2355-2363 (2000). Показано, что остеопротегерин ингибирует индуцированный раком простаты остеокластогенез и предотвращает рост опухоли простаты в костях мышей (Zhang Y., et al., J. Clin. Invest. 107:1219-1220 (2001). Он также уменьшает боль на поздних стадиях рака кости у мышей (Luger N.M., et al., Cancer Res. 61: 4038-4047 (2001)). Множественная миелома является злокачественным B-клеточным заболеванием, характеризуемым накоплением плазматических клеток в костном мозге и развитием остеолитического заболевания кости. В мышиных моделях множественной миеломы инъекция остеопротегерина или слитого белка RANK-Fc предотвращала развитие литических повреждений кости и препятствовала прогрессированию миеломы (Pearse RN., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 98: 11581-11586 (2001).Bone tumors and some tumor metastases are characterized by increased bone resorption due to increased osteoclastogenesis (Hofbauer, LC and Heufelder AE, J. Clin. Endocrin. Met. 85: 2355-2363 (2000). Osteoprotegerin has been shown to inhibit prostate cancer-induced osteoclastogenesis and prevent growth prostate tumors in mouse bones (Zhang Y., et al., J. Clin. Invest. 107: 1219-1220 (2001). It also reduces pain in advanced bone cancer in mice (Luger NM, et al., Cancer Res 61: 4038-4047 (2001)). Multiple myeloma is a malignant B-cell disease characterized by by plasma plasma cells in the bone marrow and the development of osteolytic bone disease In the mouse models of multiple myeloma, injection of osteoprotegerin or RANK-Fc fusion protein prevented the development of lytic bone damage and prevented the progression of myeloma (Pearse RN., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 11581-11586 (2001).
Центральным в этиологии асептического ослабления имплантатов простаты является перипростатический остеолизис на границе кость-имплантат, который вызван воспалением, индуцированным частицами износа. Фибробластоподобные синовиоциты, трансфицированные остеопротегерином, были способны предотвращать индуцированный частицами износа остеокластогенез в мышиной модели (Gouter J.J., et al., J. Orthop. Res. 202:169-173 (2002)).Central to the etiology of aseptic weakening of prostate implants is periprostatic osteolysis at the bone-implant border, which is caused by inflammation induced by wear particles. Fibroblast-like synoviocytes transfected with osteoprotegerin were able to prevent particle-induced osteoclastogenesis in a mouse model (Gouter J.J., et al., J. Orthop. Res. 202: 169-173 (2002)).
С высокой клинической частотой наблюдается кальцификация сосудов в популяции пациентов с остеопорозом. Участие системы RANKL-RANK-остеопротегерин показано посредством обнаружения того, что у мышей с дефицитом остеопротегерина наблюдалась кальцификация артерий, которая могла быть обратима с помощью рекомбинантного остеопротегерина (Min, H., et al., J. Exp. Med. 192: 463-474 (2000)).Vascular calcification is observed with a high clinical frequency in the population of patients with osteoporosis. The involvement of the RANKL-RANK-osteoprotegerin system has been shown by detecting that calcification of arteries was observed in mice with osteoprotegerin deficiency, which could be reversible using recombinant osteoprotegerin (Min, H., et al., J. Exp. Med. 192: 463- 474 (2000)).
Все указанные данные указывают на ключевое значение системы RANKL-RANK-остеопротегерин в регуляции резорбции кости при различных патологических состояниях. До настоящего времени ингибирование потери кости главным образом показано при инъекции рекомбинантного остеопротегерина или слитого белка RANK-Fc. Теоретически иммунизация животного RANKL должна обеспечивать продукцию RANKL-специфичных антител, которые посредством связывания с сайтом связывания RANK или стерического ингибирования должны препятствовать остеокластогенезу.All these data indicate the key importance of the RANKL-RANK-osteoprotegerin system in the regulation of bone resorption in various pathological conditions. To date, inhibition of bone loss is mainly indicated by injection of recombinant osteoprotegerin or RANK-Fc fusion protein. Theoretically, immunization of an animal with RANKL should provide for the production of RANKL-specific antibodies that, by binding to the RANK binding site or steric inhibition, should prevent osteoclastogenesis.
Однако до настоящего времени ничего не сообщалось о вакцинации белком или пептидом RANKL. Более того, не получено свидетельств того, что вакцины могут быть эффективными для защиты от заболеваний кости, так как, в частности, обычно трудно индуцировать гуморальные ответы на собственные молекулы в результате обычной вакцинации.However, to date, nothing has been reported about vaccination with the RANKL protein or peptide. Moreover, there is no evidence that vaccines can be effective in protecting against bone diseases, since, in particular, it is usually difficult to induce humoral responses to own molecules as a result of routine vaccination.
Одним из способов повышения эффективности вакцинации является увеличение степени повторяемости применяемого антигена. В отличие от изолированных белков вирусы индуцируют немедленные и эффективные иммунные ответы в отсутствие каких-либо адъювантов, как с помощью T-клеток, так и без нее (Bachmann and Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15: 235-270 (1991)). Хотя вирусы часто состоят из небольшого количества белков, они способны запускать намного более сильные иммунные ответы, чем их изолированные компоненты. В случае ответов B-клеток известно, что одним из ключевых факторов для иммуногенности вирусов является повторяемость и порядок поверхностных эпитопов. У многих вирусов обнаружена квазикристаллическая поверхность, на которой экспонирована регулярная матрица эпитопов, которая эффективно перекрестно связывает специфичные для эпитопов иммуноглобулины на B-клетках (Bachmann and Zinkernagel, Immunol. Today 17: 553-558 (1996)). Указанное перекрестное связывание поверхностных иммуноглобулинов на B-клетках является мощным сигналом активации, который непосредственно индуцирует прохождение клеточного цикла и продукцию IgM-антител. Кроме того, такие стимулированные B-клетки способны активировать хелперные T-клетки, которые, в свою очередь, индуцируют переключение с продукции IgM- на продукцию IgG-антител в B-клетках и образование долгоживущих B-клеток памяти - цель любой вакцинации (Bachmann and Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15:235-270 (1997)). Вирусная структура связана даже с образованием анти-антител, происходящим при аутоиммунном заболевании и являющимся частью естественного ответа на патогены (см. Fehr, T., et al., J Exp. Med. 185: 1785-1792 (1997)). Таким образом, антитела, презентированные на высокоорганизованной вирусной поверхности, способны индуцировать мощные ответы в виде анти-антител.One way to increase the effectiveness of vaccination is to increase the degree of repeatability of the antigen used. Unlike isolated proteins, viruses induce immediate and effective immune responses in the absence of any adjuvants, either with or without T cells (Bachmann and Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15: 235-270 (1991)) . Although viruses often consist of a small amount of proteins, they are able to trigger much stronger immune responses than their isolated components. In the case of B-cell responses, it is known that one of the key factors for the immunogenicity of viruses is the frequency and order of surface epitopes. Many viruses have a quasicrystalline surface on which a regular epitope matrix is exposed that effectively cross-binds epitope-specific immunoglobulins on B cells (Bachmann and Zinkernagel, Immunol. Today 17: 553-558 (1996)). This cross-linking of surface immunoglobulins on B cells is a potent activation signal that directly induces cell cycle progression and production of IgM antibodies. In addition, such stimulated B cells are capable of activating helper T cells, which, in turn, induce a switch from production of IgM-antibodies to production of IgG-antibodies in B-cells and the formation of long-lived memory B-cells - the goal of any vaccination (Bachmann and Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15: 235-270 (1997)). The viral structure is even associated with the formation of anti-antibodies that occur in autoimmune disease and are part of the natural response to pathogens (see Fehr, T., et al., J Exp. Med. 185: 1785-1792 (1997)). Thus, antibodies presented on a highly organized viral surface are capable of inducing potent responses in the form of anti-antibodies.
Однако, как указано, обычно иммунная система не может продуцировать антитела против структур собственного организма. В случае растворимых антигенов, присутствующих в низкой концентрации, это является следствием толерантности на уровне Th-клеток. При таких условиях связывание аутоантигена с носителем, который может обеспечивать T-помощь, может нарушить толерантность. Для растворимых белков, присутствующих в высоких концентрациях, или мембранных белков в низкой концентрации толерантными могут быть B- и Th-клетки. Однако B-клеточная толерантность может быть обратимой (анергия) и может быть нарушена введением антигена в высокоорганизованной форме, связанного с чужеродным носителем (Bachmann and Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15: 235-270 (1997)).However, as indicated, usually the immune system cannot produce antibodies against the structures of its own body. In the case of soluble antigens present in low concentration, this is a consequence of tolerance at the level of Th cells. Under such conditions, the binding of autoantigen to a carrier that can provide T-assistance can impair tolerance. For soluble proteins present in high concentrations or membrane proteins in low concentrations, B and Th cells may be tolerant. However, B-cell tolerance may be reversible (anergy) and may be impaired by the administration of a highly organized antigen bound to a foreign carrier (Bachmann and Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15: 235-270 (1997)).
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION
Авторы обнаружили, что белки RANKL, фрагменты RANKL или пептиды RANKL, которые связаны с центральной частицей, имеющей структуру с присущей ей повторяющейся организацией и, таким образом, в частности с вирусоподобными частицами (VLP) и субъединицами VLP, соответственно, приводящими к образованию высокоупорядоченных и повторяющихся конъюгатов, представляют собой эффективные иммуногены для индукции антител, специфичных в отношении RANKL. Антитела способны, соответственно, блокировать и нейтрализовать взаимодействие RANKL с его рецептором RANK. Таким образом, данное изобретение относится к терапевтическому способу лечения заболеваний кости, который основан на упорядоченной и повторяющейся матрице RANKL-центральная частица, и, в частности, к VLP-RANKL-конъюгату и -матрице, соответственно. Указанное терапевтическое средство способно индуцировать высокие титры анти-RANKL-антител у вакцинированного животного.The authors found that RANKL proteins, RANKL fragments, or RANKL peptides that bind to a central particle having a structure with its inherent repetitive organization and, in particular, to virus-like particles (VLPs) and VLP subunits, respectively, leading to the formation of highly ordered and repeated conjugates are effective immunogens for the induction of antibodies specific for RANKL. Antibodies are able, respectively, to block and neutralize the interaction of RANKL with its receptor RANK. Thus, this invention relates to a therapeutic method for treating bone diseases, which is based on an ordered and repeating matrix of a RANKL-central particle, and, in particular, to a VLP-RANKL-conjugate and a matrix, respectively. Said therapeutic agent is capable of inducing high titers of anti-RANKL antibodies in a vaccinated animal.
Таким образом, данное изобретение относится к композиции, содержащей (a) центральную частицу по меньшей мере с одним первым сайтом связывания; и (b) по меньшей мере один антиген или антигенную детерминанту по меньшей мере с одним вторым сайтом связывания, где указанный антиген или антигенная детерминанта является белком RANKL, фрагментом RANKL или пептидом RANKL и где указанный второй сайт связывания выбран из группы, состоящей из (i) сайта связывания неприродного происхождения с указанным антигеном или антигенной детерминантой; и (ii) сайта связывания природного происхождения с указанным антигеном или антигенной детерминантой, где указанный второй сайт связывания способен к ассоциации с указанным первым сайтом связывания; и где указанный антиген или антигенная детерминанта и указанная центральная частица взаимодействуют посредством указанной ассоциации, образуя упорядоченную и повторяющуюся антигенную матрицу. Предпочтительными вариантами центральных частиц, подходящих для применения в данном изобретении, являются вирус, вирусоподобная частица, бактериофаг, бактериальная фимбрия или жгутик или любая другая центральная частица, имеющая присущую ей повторяющуюся структуру, способную образовывать упорядоченную и повторяющуюся антигенную матрицу согласно данному изобретению.Thus, the present invention relates to a composition comprising (a) a central particle with at least one first binding site; and (b) at least one antigen or antigenic determinant with at least one second binding site, wherein said antigen or antigenic determinant is a RANKL protein, a RANKL fragment, or a RANKL peptide and where said second binding site is selected from the group consisting of (i ) a binding site of non-natural origin with the specified antigen or antigenic determinant; and (ii) a naturally occurring binding site with said antigen or antigenic determinant, wherein said second binding site is capable of association with said first binding site; and wherein said antigen or antigenic determinant and said central particle interact through said association to form an ordered and repeating antigenic matrix. Preferred variants of the central particles suitable for use in this invention are a virus, virus-like particle, bacteriophage, bacterial fimbria or flagellum, or any other central particle having an inherent repeating structure capable of forming an ordered and repeating antigenic matrix according to this invention.
Более конкретно, изобретение относится к композиции, содержащей упорядоченную и повторяющуюся матрицу антигенов или антигенных детерминант, и, таким образом, в частности конъюгаты белок RANKL-, фрагмент RANKL- или пептид RANKL-VLP. Более конкретно, изобретение относится к композиции, содержащей вирусоподобную частицу и по меньшей мере один связанный с ней белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL. Изобретение также относится к способу получения конъюгатов и упорядоченных и повторяющихся матриц, соответственно. Композиции согласно изобретению применимы для получения вакцин для лечения заболеваний кости и в качестве фармацевтических вакцин для профилактики или лечения заболеваний кости и для эффективной индукции иммунных ответов, в частности гуморальных ответов. Кроме того, композиции согласно изобретению особенно применимы для эффективной индукции специфичных для аутоантигенов иммунных ответов в указанном контексте.More specifically, the invention relates to a composition comprising an ordered and repeating matrix of antigens or antigenic determinants, and thus, in particular, RANKL-protein conjugates, RANKL-fragment or RANKL-VLP peptide. More specifically, the invention relates to a composition comprising a virus-like particle and at least one RANKL protein, a RANKL fragment, or a RANKL peptide associated with it. The invention also relates to a method for producing conjugates and ordered and repeating matrices, respectively. The compositions of the invention are useful in the preparation of vaccines for the treatment of bone diseases and as pharmaceutical vaccines for the prevention or treatment of bone diseases and for the effective induction of immune responses, in particular humoral responses. In addition, the compositions of the invention are particularly useful for the effective induction of autoantigen-specific immune responses in this context.
В данном изобретении белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL обычно связан с центральной частицей и, соответственно, с VLP ориентированным образом, образуя упорядоченную и повторяющуюся матрицу антигенов белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL. Кроме того, высокоповторяющаяся и организованная структура центральных частиц и, соответственно, VLP опосредует экспонирование белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL высокоупорядоченным и повторяющимся образом, приводя к образованию высокоорганизованной и повторяющейся антигенной матрицы. Кроме того, связывание белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL с центральной частицей и, соответственно, с VLP обеспечивает эпитопы хелперных T-клеток, так как центральная частица и VLP являются чужеродными по отношению к хозяину, иммунизируемому матрицей центральная частица-белок RANKL, -фрагмент RANKL или -пептид RANKL и, соответственно, VLP-белок RANKL, -фрагмент RANKL или -пептид RANKL. Указанные матрицы отличаются от конъюгатов предшествующего уровня техники своей высокоорганизованной структурой, размерами и повторяемостью антигена на поверхности матрицы.In the present invention, the RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide is usually bound to the central particle and, accordingly, to the VLP in an oriented manner, forming an ordered and repeating matrix of antigens of the RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide. In addition, the highly repetitive and organized structure of the central particles and, accordingly, VLP mediates the exposure of the RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide in a highly ordered and repetitive manner, leading to the formation of a highly organized and repeating antigenic matrix. In addition, the binding of the RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide to the central particle and, accordingly, to VLP provides epitopes of helper T cells, since the central particle and VLP are foreign to the host immunized with the central particle-protein RANKL matrix, RANKL fragment or RANKL peptide and, accordingly, RANKL VLP protein, RANKL fragment or RANKL peptide. These matrices differ from prior art conjugates in their highly organized structure, size and repeatability of antigen on the matrix surface.
В одном аспекте изобретения белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL экспрессируют в подходящем хозяине экспрессии, совестимом с правильной укладкой белка RANKL или фрагмента RANKL, или синтезируют, тогда как центральную частицу и, соответственно, VLP, экспрессируют и очищают из экспрессирующего хозяина, подходящего для укладки и сборки центральной частицы и, соответственно, VLP. Белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL также можно синтезировать химическим способом. Затем собирают матрицу белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL посредством связывания белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL с центральной частицей и, соответственно, с VLP.In one aspect of the invention, the RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide is expressed in a suitable expression host compatible with the proper folding of the RANKL protein or RANKL fragment, or synthesized, while the central particle and, accordingly, VLP are expressed and purified from an expression host suitable for laying and assembling the central particle and, accordingly, VLP. The RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide can also be synthesized chemically. A matrix of the RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide is then assembled by binding the RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide to the central particle and, accordingly, to VLP.
В другом аспекте данное изобретение относится к композиции, содержащей (a) вирусоподобную частицу и (b) по меньшей мере один антиген или антигенную детерминанту, где указанный антиген или указанная антигенная детерминанта является белком RANKL, фрагментом RANKL или пептидом RANKL и где указанный по меньшей мере один антиген или антигенная детерминанта связаны с вирусоподобной частицей.In another aspect, the invention relates to a composition comprising (a) a virus-like particle and (b) at least one antigen or antigenic determinant, wherein said antigen or said antigenic determinant is a RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide and where at least one antigen or antigenic determinant is associated with a virus-like particle.
В следующем аспекте данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей (a) композицию по п.1 или п.22 и (b) приемлемый фармацевтический носитель.In a further aspect, the invention relates to a pharmaceutical composition comprising (a) the composition according to
В еще одном аспекте данное изобретение относится к композиции вакцины, содержащей композицию, включающую в себя (a) центральную частицу по меньшей мере с одним первым сайтом связывания; и (b) по меньшей мере один антиген или антигенную детерминанту по меньшей мере с одним вторым сайтом связывания, где указанный антиген или антигенная детерминанта является белком RANKL, фрагментом RANKL или пептидом RANKL и где указанный второй сайт связывания выбран из группы, состоящей из (i) сайта связывания неприродного происхождения с указанным антигеном или антигенной детерминантой; и (ii) сайта связывания природного происхождения с указанным антигеном или антигенной детерминантой, где указанный второй сайт связывания способен к ассоциации с указанным первым сайтом связывания; и где указанный антиген или антигенная детерминанта и указанная центральная частица взаимодействуют посредством указанной ассоциации, образуя упорядоченную и повторяющуюся антигенную матрицу.In yet another aspect, the invention provides a vaccine composition comprising a composition comprising (a) a central particle with at least one first binding site; and (b) at least one antigen or antigenic determinant with at least one second binding site, wherein said antigen or antigenic determinant is a RANKL protein, a RANKL fragment, or a RANKL peptide and where said second binding site is selected from the group consisting of (i ) a binding site of non-natural origin with the specified antigen or antigenic determinant; and (ii) a naturally occurring binding site with said antigen or antigenic determinant, wherein said second binding site is capable of association with said first binding site; and wherein said antigen or antigenic determinant and said central particle interact through said association to form an ordered and repeating antigenic matrix.
В следующем аспекте данное изобретение относится к композиции вакцины, содержащей композицию, где указанная композиция содержит (a) вирусоподобную частицу; и (b) по меньшей мере один антиген или антигенную детерминанту, где указанный антиген или указанная антигенная детерминанта является белком RANKL, фрагментом RANKL или пептидом RANKL; и где указанный по меньшей мере один антиген или антигенная детерминанта связаны с указанной вирусоподобной частицей.In a further aspect, the invention relates to a vaccine composition comprising a composition, wherein said composition comprises (a) a virus-like particle; and (b) at least one antigen or antigenic determinant, wherein said antigen or said antigenic determinant is a RANKL protein, a RANKL fragment, or a RANKL peptide; and wherein said at least one antigen or antigenic determinant is associated with said virus-like particle.
Еще в одном аспекте данное изобретение относится к способу получения композиции по п.1, включающему в себя (a) получение вирусоподобной частицы; и (b) получение по меньшей мере одного антигена или антигенной детерминанты, где указанный антиген или указанная антигенная детерминанта является белком RANKL, фрагментом RANKL или пептидом RANKL; (c) объединение указанной вирусоподобной частицы и указанного по меньшей мере одного антигена или антигенной детерминанты, так чтобы указанный по меньшей мере один антиген или антигенная детерминанта были связаны с указанной вирусоподобной частицей.In another aspect, this invention relates to a method for producing a composition according to
Еще в одном аспекте данное изобретение относится к способу получения композиции по п.22, включающему в себя (a) получение центральной частицы по меньшей мере с одним первым сайтом связывания; (b) получение по меньшей мере одного антигена или антигенной детерминанты по меньшей мере с одним вторым сайтом связывания, где указанный антиген или антигенная детерминанта является белком RANKL, фрагментом RANKL или пептидом RANKL и где указанный второй сайт связывания выбран из группы, состоящей из (i) сайта связывания неприродного происхождения с указанным антигеном или антигенной детерминантой; и (ii) сайта связывания природного происхождения с указанным антигеном или антигенной детерминантой; и где указанный второй сайт связывания способен к ассоциации с указанным первым сайтом связывания; и (c) объединение указанной центральной частицы и указанного по меньшей мере одного антигена или антигенной детерминанты, где указанный антиген или антигенная детерминанта и указанная центральная частица взаимодействуют путем указанной ассоциации, образуя упорядоченную и повторяющуюся антигенную матрицу.In another aspect, this invention relates to a method for producing a composition according to
В другом аспекте данное изобретение относится к способу иммунизации, включающему в себя введение композиции по п.1 или п.22 животному или человеку.In another aspect, the invention relates to a method of immunization, comprising administering a composition according to
В следующем аспекте данное изобретение относится к применению композиции по п.1 или п.22 для производства лекарственного средства для лечения заболеваний кости.In a further aspect, the invention relates to the use of a composition according to
Еще в одном аспекте данное изобретение относится к применению композиции по п.1 или п.22 для приготовления лекарственного средства для терапевтического или профилактического лечения заболеваний кости, предпочтительно энцефалопатий млекопитающих. Кроме того, еще в одном аспекте данное изобретение относится к применению композиции по п.1 или п.22 либо отдельно, либо в комбинации с другими агентами, для производства композиции, вакцины, лекарственного средства или медицинского препарата для терапии или профилактики заболеваний кости, в частности энцефалопатий млекопитающих, и/или для стимуляции иммунной системы млекопитающего.In another aspect, this invention relates to the use of a composition according to
Таким образом, изобретение, в частности, относится к композициям вакцин, которые подходят для профилактики и/или ослабления заболеваний кости или связанных с ними состояний. Изобретение, кроме того, относится к способам иммунизации и вакцинации, соответственно, для профилактики и/или ослабления заболеваний кости и связанных с ними состояний у животных, в частности у коров, овец и крупного рогатого скота, а также у человека. Композиции согласно изобретению можно использовать профилактически или терапевтически.Thus, the invention, in particular, relates to vaccine compositions that are suitable for the prevention and / or weakening of bone diseases or related conditions. The invention also relates to methods of immunization and vaccination, respectively, for the prevention and / or weakening of bone diseases and related conditions in animals, in particular in cows, sheep and cattle, as well as in humans. The compositions of the invention can be used prophylactically or therapeutically.
В конкретных вариантах изобретение относится к способам профилактики и/или ослабления заболеваний кости или связанных с ними состояний, которые вызваны или обострены продуктами «собственных» генов, т.е. в используемом в данном описании смысле «аутоантигенами». В родственных вариантах изобретение относится к способам индуцирования иммунологических ответов у животных и человека, соответственно, которые приводят к продукции антител, которые предотвращают и/или ослабляют заболевания кости или связанные с ними состояния, которые вызваны или обострены продуктами «собственных» генов.In specific embodiments, the invention relates to methods for preventing and / or attenuating bone diseases or related conditions that are caused or exacerbated by the products of “native” genes, i.e. as used herein, “autoantigens”. In related embodiments, the invention relates to methods for inducing immunological responses in animals and humans, respectively, which lead to the production of antibodies that prevent and / or weaken bone diseases or related conditions that are caused or exacerbated by the products of “native” genes.
Как будет понятно специалисту в данной области, когда композиции согласно изобретению вводят животному или человеку, они могут быть в композиции, которая содержит соли, буферные вещества, адъюванты или другие вещества, которые требуются для повышения эффективности композиции. Примеры веществ, подходящих для применения при получении фармацевтических композиций, приведены во многих источниках, включая Remington's Pharmaceutical Sciences (Osol, A, ed., Mack Publishing Co. (1990)).As will be understood by one of skill in the art, when the compositions of the invention are administered to an animal or human, they can be in a composition that contains salts, buffers, adjuvants, or other substances that are required to increase the effectiveness of the composition. Examples of substances suitable for use in the manufacture of pharmaceutical compositions are provided in many sources, including Remington's Pharmaceutical Sciences (Osol, A, ed., Mack Publishing Co. (1990)).
Говорят, что композиции согласно изобретению являются «фармакологически приемлемыми», если может быть допустимо их введение человеку-реципиенту. Кроме того, композиции согласно изобретению будут вводиться в «терапевтически эффективном количестве» (т.е. в количестве, которое дает требуемый физиологический эффект).The compositions of the invention are said to be “pharmacologically acceptable” if administration to a human recipient can be permissible. In addition, the compositions of the invention will be administered in a “therapeutically effective amount” (ie, in an amount that produces the desired physiological effect).
Композиции согласно изобретению можно вводить различными способами, известными в данной области, но обычно они будут вводиться путем инъекции, инфузии, ингаляции, перорального введения или другими подходящими физическими способами. Альтернативно композиции можно вводить внутримышечно, внутривенно или подкожно. К компонентам композиций для введения относятся стерильные водные растворы (например, физиологический раствор соли) или неводные растворы и суспензии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъекционные органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Можно использовать носители или окклюзионные повязки, чтобы увеличить проницаемость кожи и усилить абсорбцию антигена.The compositions of the invention can be administered by various methods known in the art, but will usually be administered by injection, infusion, inhalation, oral administration, or other suitable physical methods. Alternatively, the compositions may be administered intramuscularly, intravenously or subcutaneously. The components of the compositions for administration include sterile aqueous solutions (e.g., physiological saline) or non-aqueous solutions and suspensions. Examples of non-aqueous solvents are propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable organic esters such as ethyl oleate. Carriers or occlusive dressings can be used to increase skin permeability and enhance antigen absorption.
Другие варианты данного изобретения будут очевидны для специалиста в свете того, что известно в данной области, следующих чертежей и описания изобретения и формулы изобретения.Other variations of the present invention will be apparent to those skilled in the art in light of what is known in the art, of the following drawings and description of the invention and claims.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
На фиг.1 показана экспрессия и очистка C-RANKL. Очистку C-RANKL анализировали в SDS-геле в восстанавливающих условиях. Гель красили Кумасси бриллиантовым голубым. Молекулярные массы маркерных белков приведены на левом поле. Дорожка 1: маркер низкой молекулярной массы. Дорожка 2 и 3: надосадок клеточных лизатов клеток BL21/DE3, трансформированных пустым вектором pGEX6p1 и pGEX-RANKL, соответственно, после шестнадцати часов индукции с помощью IPTG 0,4 мМ. Дорожка 4: очищенный белок GST-PS-C-RANKL после колонки FF, улавливающей GST. Дорожка 5: Фракция, не связанная с колонкой FF, улавливающей GST. Дорожка 6: очищенный белок GST-PS-C-RANKL после расщепления протеазой PreScission. Дорожка 7: несвязанная фракция с колонки FF, улавливающей GST, на которую наносили продукт расщепления GST-RANKL, которая содержит очищенный C-RANKL. Дорожка 8: связанная фракция с колонки FF, улавливающей GST, на которую наносили продукт расщепления GST-PS-C-RANKL и элюировали с помощью GSH.Figure 1 shows the expression and purification of C-RANKL. Purification of C-RANKL was analyzed on an SDS gel under reducing conditions. The gel was stained with Coomassie brilliant blue. The molecular weights of marker proteins are shown in the left margin. Lane 1: low molecular weight marker.
На фиг.2 показана экспрессия и очистка RANKL-C.Figure 2 shows the expression and purification of RANKL-C.
На фиг.2A показана очистка GST-EK-RANKL-C. Образцы белков анализировали в SDS-ПААГ в восстанавливающих условиях. Гель красили Кумасси бриллиантовым голубым. Молекулярные массы маркерных белков приведены на левом поле. Дорожка 1: предварительно окрашенный белковый маркер для широкого диапазона (New England Biolabs). Дорожка 2: осветленный клеточный лизат клеток BL21/DE3, трансформированных плазмидой pMod-GST-EK-mRANKL-C1 после индукции в течение ночи с использованием 0,1 мМ IPTG. Дорожка 3: поток, проходящий через колонку FF, улавливающую GST, нагруженную осветленным лизатом с дорожки 2. Дорожка 4: первая промывка колонки FF, улавливающей GST. Дорожка 5: вторая промывка колонки FF, улавливающей GST. Дорожка 6: третья промывка колонки FF, улавливающей GST. Дорожки 7-15: элюированные фракции 1-9 с колонки FF, улавливающей GST, содержащие очищенный слитый белок GST-EK-RANKL-C и небольшое количество белка GST-EK.2A shows the purification of GST-EK-RANKL-C. Protein samples were analyzed in SDS-PAGE under reducing conditions. The gel was stained with Coomassie brilliant blue. The molecular weights of marker proteins are shown in the left margin. Lane 1: pre-stained protein marker for a wide range (New England Biolabs). Lane 2: clarified cell lysate of BL21 / DE3 cells transformed with plasmid pMod-GST-EK-mRANKL-C1 after induction overnight using 0.1 mM IPTG. Lane 3: flow through a GF-trapping column FF loaded with a clarified lysate from
На фиг.2B показано расщепление GST-EK-RANKL-C энтерокиназой MaxTM.FIG. 2B shows the cleavage of GST-EK-RANKL-C with EnterTM kinase Max ™ .
Расщепление GST-EK-RANKL-C анализировали в SDS-ПААГ в восстанавливающих условиях. Гель красили Кумасси бриллиантовым голубым. Молекулярные массы маркерных белков приведены на левом поле. Дорожка 1: предварительно окрашенный белковый маркер для широкого диапазона (New England Biolabs). Дорожка 2: Очищенный слитый белок GST-EK-RANKL-C. Дорожка 3: продукты расщепления после 16 час инкубации при 4°C с энтерокиназой MaxTM.The cleavage of GST-EK-RANKL-C was analyzed in SDS-PAGE under reducing conditions. The gel was stained with Coomassie brilliant blue. The molecular weights of marker proteins are shown in the left margin. Lane 1: pre-stained protein marker for a wide range (New England Biolabs). Lane 2: Purified GST-EK-RANKL-C Fusion Protein. Lane 3: cleavage products after 16 hours of incubation at 4 ° C with Max TM enterokinase.
На фиг.2C показана очистка RANKL-C.2C shows the purification of RANKL-C.
Очистку RANKL-C после удаления GST-EK методом аффинной хроматографии на глутатион-сефарозе анализировали в SDS-ПААГ в восстанавливающих условиях. Гель красили Кумасси бриллиантовым голубым. Молекулярные массы маркерных белков приведены на левом поле. Дорожка 1: предварительно окрашенный белковый маркер для широкого диапазона (New England Biolabs). Дорожка 2 и 3: продукты расщепления GST-EK и RANKL-C после 16 час инкубации GST-EK-RANKL-C при 4°C с энтерокиназой MaxTM. Дорожка 4 и 5: различные количества несвязанной фракции с колонки FF, улавливающей GST, которая содержит белок RANKL-C высокой чистоты.Purification of RANKL-C after removal of GST-EK by affinity chromatography on glutathione-sepharose was analyzed in SDS-PAGE under reducing conditions. The gel was stained with Coomassie brilliant blue. The molecular weights of marker proteins are shown in the left margin. Lane 1: pre-stained protein marker for a wide range (New England Biolabs).
На фиг.3 показано связывание C-RANKL с капсидным белком Qβ.Figure 3 shows the binding of C-RANKL to the Qβ capsid protein.
На фиг.3A показан SDS-ПААГ-анализ продуктов связывания: белки анализировали в 16% SDS-гелях в восстанавливающих условиях. Гель красили Кумасси бриллиантовым голубым. Молекулярные массы маркерных белков приведены на левом поле. Идентичность полос белка показана на правом поле. Дорожка 1: предварительно окрашенный белковый маркер для широкого диапазона (New England Biolabs). Дорожка 2: дериватизованный капсидный белок Qβ. Дорожка 3: очищенный белок C-RANKL. Дорожка 4: реакция связывания C-RANKL/Qβ.FIG. 3A shows SDS-PAGE analysis of binding products: proteins were analyzed on 16% SDS gels under reducing conditions. The gel was stained with Coomassie brilliant blue. The molecular weights of marker proteins are shown in the left margin. The identity of the protein bands is shown in the right margin. Lane 1: pre-stained protein marker for a wide range (New England Biolabs). Lane 2: derivatized Qβ capsid protein. Lane 3: purified C-RANKL protein. Lane 4: C-RANKL / Qβ binding reaction.
Фиг.3B и фиг.3C: Вестерн-блот-анализ продуктов связывания. Белки разгоняли в 16% SDS-гелях в восстанавливающих условиях, подвергали блоттингу на нитроцеллюлозные мембраны и регистрировали с помощью анти-Qβ-антисыворотки (фиг.3B) или анти-RANKL-антитела (фиг.3C). Молекулярные массы маркерных белков приведены на левом поле. Идентичность белковых полос указана на правом поле. Дорожка 1: предварительно окрашенный белковый маркер для широкого диапазона (New England Biolabs). Дорожка 2: дериватизованный капсидный белок Qβ. Дорожка 3: очищенный белок C-RANKL. Дорожка 4: реакция связывания C-RANKL/Qβ.FIG. 3B and FIG. 3C: Western blot analysis of binding products. Proteins were dispersed in 16% SDS gels under reducing conditions, blotted onto nitrocellulose membranes and recorded using anti-Qβ antiserum (Figure 3B) or anti-RANKL antibody (Figure 3C). The molecular weights of marker proteins are shown in the left margin. The identity of the protein bands is indicated on the right margin. Lane 1: pre-stained protein marker for a wide range (New England Biolabs). Lane 2: derivatized Qβ capsid protein. Lane 3: purified C-RANKL protein. Lane 4: C-RANKL / Qβ binding reaction.
На фиг.4 показан ELISA для RANKL-специфичного IgG у мышей, иммунизированных C-RANKL, связанным с Qβ.4 shows an ELISA for RANKL-specific IgG in mice immunized with C-RANKL linked to Qβ.
Самок мышей Balb/c вакцинировали подкожно 25 мкг C-RANKL, связанного с Qβ, в PBS в 0 день, 16 день и 64 день с добавлением или без добавления квасцов. Сыворотку, полученную в 0, 16, 23, 64 и 78 дни, анализировали в отношении антител, специфичных для RANKL. Титры ELISA выражали в виде среднего для тех разведений сывороток, которые давали половину максимальной OD420 в анализе ELISA.Female Balb / c mice were vaccinated subcutaneously with 25 μg C-RANKL bound to Qβ in PBS on
На фиг.5 показана нейтрализующая активность антител, индуцированных у мышей, иммунизированных C-RANKL, связанным с Qβ.Figure 5 shows the neutralizing activity of antibodies induced in mice immunized with C-RANKL bound to Qβ.
На фиг.5A показан анализ связывания C-RANKL и его родственного лиганда RANK. Планшеты для ELISA покрывали 10 мкг/мл C-RANKL и инкубировали с серийными разведениями слитого белка RANK-Fc или неродственного слитого с Fc белка. Регистрацию связанного RANK осуществляли с помощью конъюгированных с HRP анти-Fc-антител.5A shows a binding analysis of C-RANKL and its related ligand, RANK. ELISA plates were coated with 10 μg / ml C-RANKL and incubated with serial dilutions of a RANK-Fc fusion protein or an unrelated Fc protein fusion. Registration of bound RANK was performed using HRP conjugated anti-Fc antibodies.
На фиг.5B показано ингибирование связывания C-RANKL/RANK-Fc антителами сыворотки мышей, вакцинированных C-RANKL, связанным с Qβ. Планшеты для Elisa покрывали 10 мкг/мл C-RANKL и подвергали совместной инкубации с серийными разведениями сывороток мышей, полученных на 78 день, и 1 нМ слитого белка RANK-Fc. Связывание слитого белка с C-RANKL регистрировали с использованием конъюгированного с пероксидазой хрена анти-Fc-антитела.FIG. 5B shows the inhibition of the binding of C-RANKL / RANK-Fc to the serum antibodies of mice vaccinated with C-RANKL bound to Qβ. Elisa plates were coated with 10 μg / ml C-RANKL and co-incubated with serial dilutions of mouse sera obtained on
На фиг.6A-C изображена очистка белков AP205 для применения в VLP, которую анализировали с помощью SDS-ПААГ и Вестерн-блоттинга.6A-C depict AP205 protein purification for use in VLP, which was analyzed by SDS-PAGE and Western blotting.
На фиг.7A-B изображены электронные микрофотографии сравнения фаговых частиц AP205 с вирусоподобными частицами AP205, спонтанно собираемыми из рекомбинантного белка, экспрессированного в E. coli и очищенного.7A-B are electron micrographs of a comparison of phage particles of AP205 with virus-like particles of AP205 spontaneously assembled from a recombinant protein expressed in E. coli and purified.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Если не оговорено особо, все технические и научные термины, используемые в данном описании, имеют такие же значения, которые обычно подразумеваются специалистами в области, к которой относится данное изобретение. Хотя на практике или при проверке данного изобретения можно использовать любые способы и вещества, сходные или эквивалентные способам и веществам, описанным в данной заявке, предпочтительные способы и вещества описаны ниже.Unless otherwise specified, all technical and scientific terms used in this description have the same meanings that are usually implied by specialists in the field to which this invention relates. Although any methods and substances similar or equivalent to the methods and substances described herein can be used in practice or in testing this invention, preferred methods and substances are described below.
1. Определения:1. Definitions:
Аминокислотный линкер: «аминокислотный линкер» или называемый также в данном описании «линкер» в используемом смысле либо связывает антиген или антигенную детерминанту со вторым сайтом связывания, либо - более предпочтительно - уже содержит или включает в себя второй сайт связывания, обычно - но не обязательно - в виде аминокислотного остатка, предпочтительно в виде остатка цистеина. Однако термин «аминокислотный линкер» в используемом в данном описании смысле не предназначен для обозначения того, что такой аминокислотный линкер состоит исключительно из аминокислотных остатков, хотя аминокислотный линкер, состоящий из аминокислотных остатков, является предпочтительным вариантом согласно данному изобретению. Остатки аминокислот аминокислотного линкера предпочтительно состоят из аминокислот природного происхождения или неприродных аминокислот, известных в данной области, всех L или всех D или их смесей. Однако аминокислотный линкер, содержащий молекулу с сульфгидрильной группой или остаток цистеина, также входит в данное изобретение. Такая молекула предпочтительно содержит остаток C1-C6-алкила, циклоалкила (C5,C6), арила или гетероарила. Однако? кроме аминокислотного линкера, в объем данного изобретения также следует включить линкер, предпочтительно содержащий остаток C1-C6-алкила, циклоалкила (C5,C6), арила или гетероарила и не имеющий никакой аминокислоты (аминокислот). Связь между антигеном или антигенной детерминантой или необязательно вторым сайтом связывания и аминокислотным линкером предпочтительно осуществляется с помощью по меньшей мере одной ковалентной связи, более предпочтительно с помощью по меньшей мере одной пептидной связи.Amino acid linker: an "amino acid linker" or also referred to as a "linker" in the sense used either binds an antigen or antigenic determinant to a second binding site, or - more preferably - already contains or includes a second binding site, usually - but not necessarily - in the form of an amino acid residue, preferably in the form of a cysteine residue. However, the term "amino acid linker" in the sense used in this description is not intended to mean that such an amino acid linker consists solely of amino acid residues, although an amino acid linker consisting of amino acid residues is a preferred embodiment according to this invention. The amino acid residue of the amino acid linker is preferably composed of naturally occurring amino acids or unnatural amino acids known in the art, all L or all D, or mixtures thereof. However, an amino acid linker containing a molecule with a sulfhydryl group or a cysteine residue is also included in this invention. Such a molecule preferably contains a residue of C1-C6 alkyl, cycloalkyl (C5, C6), aryl or heteroaryl. However? in addition to the amino acid linker, a linker, preferably containing the remainder of C1-C6 alkyl, cycloalkyl (C5, C6), aryl or heteroaryl and having no amino acid (s), should also be included in the scope of the present invention. The bond between the antigen or antigenic determinant or optionally the second binding site and the amino acid linker is preferably carried out using at least one covalent bond, more preferably using at least one peptide bond.
Животные: В используемом в данном описании смысле подразумевается, что термин «животное» включает в себя, например, человека, овец, лосей, оленей, оленей-мулов, норок, млекопитающих, обезьян, лошадей, крупный рогатый скот, свиней, коз, собак, кошек, крыс, мышей, птиц, кур, рептилий, рыб, насекомых и паукообразных.Animals: As used in this description, it is understood that the term "animal" includes, for example, humans, sheep, moose, deer, mule deer, mink, mammals, monkeys, horses, cattle, pigs, goats, dogs , cats, rats, mice, birds, chickens, reptiles, fish, insects and arachnids.
Антитело: В используемом в данном описании смысле термин «антитело» относится к молекулам, которые способны связывать эпитоп или антигенную детерминанту. Подразумевается, что термин включает в себя целые антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, включая одноцепочечные антитела. Наиболее предпочтительно антитела являются антигенсвязывающими фрагментами антител человека и включают в себя, не ограничиваясь указанным, Fab, Fab' и F(ab')2, Fd, одноцепочечные Fv (scFv), одноцепочечные антитела, связанные дисульфидными связями Fv (sdFv) и фрагменты, содержащие либо VL-, либо VH-домен. Источником антител может быть любое животное, включая птиц и млекопитающих. Предпочтительно антитела получены от человека, мыши, кролика, козы, морской свинки, верблюда, лошади или цыпленка. В используемом в данном описании смысле «человеческие» антитела включают в себя антитела, имеющие аминокислотную последовательность иммуноглобулина человека, и включают антитела, выделенные из библиотек иммуноглобулинов человека или из животных, трансгенных по одному или нескольким иммуноглобулинам человека и которые не экспрессируют эндогенных иммуноглобулинов, как описано, например, в патенте США № 5939598 Kucherlapati et al.Antibody: As used herein, the term “antibody” refers to molecules that are capable of binding an epitope or antigenic determinant. The term is intended to include whole antibodies and antigen binding fragments thereof, including single chain antibodies. Most preferably, the antibodies are antigen binding fragments of human antibodies and include, but are not limited to, Fab, Fab 'and F (ab') 2, Fd, single chain Fv (scFv), single chain antibodies linked by Fv disulfide bonds (sdFv), and fragments containing either V L - or V H domain. The source of antibodies can be any animal, including birds and mammals. Preferably, the antibodies are from a human, mouse, rabbit, goat, guinea pig, camel, horse or chicken. As used herein, “human” antibodies include antibodies having the amino acid sequence of a human immunoglobulin and include antibodies isolated from human immunoglobulin libraries or from animals transgenic to one or more human immunoglobulins and which do not express endogenous immunoglobulins, as described for example, in US patent No. 5939598 Kucherlapati et al.
Антиген: В используемом в данном описании смысле «антиген» относится к молекуле, способной подвергаться связыванию антителом или рецептором T-клеток (TCR), если она презентирована молекулами MHC. Термин «антиген» в используемом в данном описании смысле также охватывает T-клеточные эпитопы. Кроме того, антиген может узнаваться иммунной системой и/или способен индуцировать гуморальный иммунный ответ и/или клеточный иммунный ответ, приводящий к активации B- и/или T-лимфоцитов. Однако это может требовать, по меньшей мере в некоторых случаях, чтобы антиген содержал или был связан с Th-клеточным эпитопом и был введен в адъюванте. Антиген может иметь один или несколько эпитопов (B- и T-эпитопов). Подразумевается, что указанная выше специфичная реакция указывает на то, что антиген будет предпочтительно реагировать, обычно высокоизбирательным образом, с соответствующим ему антителом или TCR и не будет реагировать со множеством других антител или TCR, которые могут быть вызваны другими антигенами. В используемом в данном описании смысле антигены также могут представлять собой смеси нескольких отдельных антигенов.Antigen: As used herein, “antigen” refers to a molecule capable of being bound by an antibody or T-cell receptor (TCR) if it is presented by MHC molecules. The term “antigen” as used herein also encompasses T-cell epitopes. In addition, the antigen can be recognized by the immune system and / or is capable of inducing a humoral immune response and / or a cellular immune response leading to activation of B and / or T lymphocytes. However, this may require, at least in some cases, that the antigen contain or be associated with a Th-cell epitope and be administered in an adjuvant. An antigen may have one or more epitopes (B and T epitopes). It is understood that the above specific reaction indicates that the antigen will preferably react, usually in a highly selective manner, with its corresponding antibody or TCR and will not react with many other antibodies or TCR that may be caused by other antigens. As used herein, antigens can also be mixtures of several individual antigens.
Антигенная детерминанта: В используемом в данном описании смысле подразумевается, что термин «антигенная детерминанта» относится к такой части антигена, которая специфично распознается либо B-, либо T-лимфоцитами. B-лимфоциты, отвечающие на антигенные детерминанты, продуцируют антитела, тогда как T-лимфоциты отвечают на антигенные детерминанты пролиферацией и установлением эффекторных функций, необходимых для опосредования клеточного и/или гуморального иммунитета.Antigenic determinant: As used in this description, it is understood that the term "antigenic determinant" refers to that part of the antigen that is specifically recognized by either B- or T-lymphocytes. B-lymphocytes that respond to antigenic determinants produce antibodies, while T-lymphocytes respond to antigenic determinants by proliferation and the establishment of effector functions necessary to mediate cellular and / or humoral immunity.
Ассоциация: В используемом в данном описании смысле термин «ассоциация» в применении к первому и второму сайтам связывания относится к связыванию первого и второго сайтов связывания, которое предпочтительно осуществляется посредством по меньшей мере одной непептидной связи. Природа ассоциации может быть ковалентной, ионной, гидрофобной, полярной или любой их комбинацией, предпочтительно природа ассоциации является ковалентной.Association: As used herein, the term “association” as applied to the first and second binding sites refers to the binding of the first and second binding sites, which is preferably carried out through at least one non-peptide bond. The nature of the association may be covalent, ionic, hydrophobic, polar, or any combination thereof, preferably the nature of the association is covalent.
Сайт связывания, первый: В используемом в данном описании смысле фраза «первый сайт связывания» относится к элементу неприродного или природного происхождения, с которым может вступать в ассоциацию второй сайт связывания, расположенный на антигене или антигенной детерминанте. Первый сайт связывания может быть белком, полипептидом, аминокислотой, пептидом, сахаром, полинуклеотидом, природным или синтетическим полимером, вторичным метаболитом или соединением (биотин, флуоресцеин, ретинол, дигоксигенин, ионы металлов, фенилметилсульфонилфторид) или их комбинацией или их химически реакционно-способной группой. Первый сайт связывания обычно и предпочтительно расположен на поверхности центральной частицы, такой как предпочтительно вирусоподобная частица. Многочисленные первые сайты связывания обычно присутствуют на поверхности центральной частицы и, соответственно, вирусоподобной частицы в повторяющейся конфигурации.Binding site, first: As used herein, the phrase “first binding site” refers to an element of non-natural or natural origin with which a second binding site located on an antigen or antigenic determinant can associate. The first binding site may be a protein, polypeptide, amino acid, peptide, sugar, polynucleotide, natural or synthetic polymer, a secondary metabolite or compound (biotin, fluorescein, retinol, digoxygenin, metal ions, phenylmethylsulfonyl fluoride) or a combination thereof or a chemically reactive group thereof . The first binding site is usually and preferably located on the surface of the central particle, such as preferably a virus-like particle. Numerous first binding sites are usually present on the surface of a central particle and, accordingly, a virus-like particle in a repeating configuration.
Сайт связывания, второй: В используемом в данном описании смысле фраза «второй сайт связывания» относится к элементу, находящемуся в ассоциации с антигеном или антигенной детерминантой, с которым может вступать в ассоциацию первый сайт связывания, расположенный на поверхности центральной частицы и, соответственно, вирусоподобной частицы. Второй сайт связывания антигена или антигенной детерминанты может быть белком, полипептидом, пептидом, сахаром, полинуклеотидом, природным или синтетическим полимером, вторичным метаболитом или соединением (биотин, флуоресцеин, ретинол, дигоксигенин, ионы металлов, фенилметилсульфонилфторид) или их комбинацией или их химически реакционно-способной группой. На антигене или антигенной детерминанте присутствует по меньшей мере один второй сайт связывания. Термин «антиген или антигенная детерминанта по меньшей мере с одним вторым сайтом связывания», таким образом, относится к антигену или антигенной конструкции, содержащей по меньшей мере антиген или антигенную детерминанту и второй сайт связывания. Однако, в частности, в случае второго сайта связывания, который имеет неприродное происхождение, т.е. не естественным образом возник в антигене или антигенной детерминанте, указанные антиген или антигенные конструкции содержат «аминокислотный линкер».Binding site, second: In the sense used in this description, the phrase “second binding site” refers to an element in association with an antigen or antigenic determinant, with which the first binding site located on the surface of the central particle and, accordingly, virus-like can come into association particles. The second antigen or antigenic determinant binding site may be a protein, polypeptide, peptide, sugar, polynucleotide, a natural or synthetic polymer, a secondary metabolite or compound (biotin, fluorescein, retinol, digoxygenin, metal ions, phenylmethylsulfonyl fluoride) or a combination thereof, or a combination thereof or capable group. At least one second binding site is present on the antigen or antigenic determinant. The term “antigen or antigenic determinant with at least one second binding site”, therefore, refers to an antigen or antigenic construct containing at least an antigen or antigenic determinant and a second binding site. However, in particular, in the case of the second binding site, which has a non-natural origin, i.e. did not naturally occur in an antigen or antigenic determinant, said antigen or antigenic constructs contain an “amino acid linker”.
Заболевания кости: Термин «заболевания кости» в используемом в данном описании смысле охватывает, в частности, состояния, характеризующиеся повышенной резорбцией кости. Термин «заболевания кости» включает в себя, но не ограничен указанным, остеопороз в его различных формах, такой как первичный остеопороз (такой как идиопатический, постменопаузный, инволюционный или старческий остеопороз) и вторичный остеопороз. Последний включает в себя остеопороз, вызванный избытком глюкокортикоидов, гиперпаратиреоидизмом, гипертиреоидизмом, гипергонадизмом, гиперпролактинемией, сахарным диабетом, остеопороз, индуцированный лекарственными средствами, такой как остеопороз, вызванный глюкокортикостероидами, этанолом, дилантином, табаком, барбитуратами или гепарином), остеопороз, индуцированный прекращением приема лекарственных средств, и разнообразные состояния, связанные с повышенной резорбцией кости, такие как хроническая почечная недостаточность, болезнь печени, синдромы мальабсорбции, хроническое обструктивное легочное заболевание, саркоидоз. Следующие состояния с повышенной резорбцией кости включают в себя болезнь Пэджета, семейный распространяющийся остеолизис, спонтанный остеолизис, потерю кости, связанную с ревматоидным артритом, резорбцию кости и потерю зубов при периодонтальном заболевании, остеомиелит, гиперкальцемию при злокачественных опухолях, опухоли кости, злокачественные опухоли, связанные с метастазами в костях, и потерю кости, вызванную потерей массы, которая обнаружена при космическом полете. Специалисты в данной области могут идентифицировать другие состояния, характеризующиеся повышенной резорбцией кости.Diseases of the bone: The term "bone disease" as used in this description, includes, in particular, conditions characterized by increased bone resorption. The term "bone disease" includes, but is not limited to, osteoporosis in its various forms, such as primary osteoporosis (such as idiopathic, postmenopausal, involutional or senile osteoporosis) and secondary osteoporosis. The latter includes osteoporosis caused by an excess of glucocorticoids, hyperparathyroidism, hyperthyroidism, hypergonadism, hyperprolactinemia, diabetes mellitus, drug-induced osteoporosis, such as osteoporosis caused by glucocorticosteroids, ethanol, tablantiomyelitis, dileantomy, baritomyrtosis, dilantomy, baritomyrtosis, dilantomy, and drugs, and various conditions associated with increased bone resorption, such as chronic renal failure, pain zn liver malabsorption syndromes, chronic obstructive pulmonary disease, sarcoidosis. The following conditions with increased bone resorption include Paget's disease, familial spreading osteolysis, spontaneous osteolysis, bone loss associated with rheumatoid arthritis, bone resorption and tooth loss in periodontal disease, osteomyelitis, hypercalcemia in malignant tumors, bone tumors, related malignant tumors with bone metastases, and bone loss caused by the loss of mass found during space flight. Specialists in this field can identify other conditions characterized by increased bone resorption.
Связь: В используемом в данном описании смысле термин «связь» относится к связыванию или присоединению, которое может быть ковалентным, например посредством химического связывания, или нековалентным, например ионные взаимодействия, гидрофобные взаимодействия, водородные связи и т.д. Ковалентные связи, например, могут быть сложноэфирными, эфирными, фосфоэфирными, амидными, пептидными, имидными связями, связями углерод-сера, связями углерод-фосфор и тому подобными. Термин «связанный» является более широким и включает в себя такие термины, как «соединенный», «слитый» и «прикрепленный».Communication: In the sense used in this description, the term “communication” refers to the binding or attachment, which may be covalent, for example by chemical bonding, or non-covalent, for example, ionic interactions, hydrophobic interactions, hydrogen bonds, etc. Covalent bonds, for example, can be ester, ether, phosphoether, amide, peptide, imide bonds, carbon-sulfur bonds, carbon-phosphorus bonds and the like. The term “connected” is broader and includes terms such as “connected”, “merged” and “attached”.
Покрывающий белок (белки): В используемом в данном описании смысле термин «покрывающий белок (белки)» относится к белку (белкам) бактериофага или РНК-фага, которые могут быть включены в сборку капсида бактериофага или РНК-фага. Однако по отношению к специфичному генному продукту гена покрывающего белка РНК-фага используют термин «CP». Например, специфичный генный продукт гена покрывающего белка РНК-фага Qβ называют «CP Qβ», тогда как «покрывающие белки» бактериофага Qβ содержат «CP Qβ», а также белок A1. Капсид бактериофага Qβ главным образом состоит из CP Qβ с небольшим содержанием белка A1. Подобным образом, покрывающий белок VLP Qβ главным образом содержит CP Qβ с небольшим содержанием белка A1.Coating protein (s): As used herein, the term “coating protein (s)” refers to a bacteriophage or RNA phage protein (s) that can be included in a bacteriophage or RNA phage capsid assembly. However, with respect to the specific gene product of the gene of the RNA phage coat protein, the term “CP” is used. For example, a specific gene product of the coat protein of the Qβ RNA phage gene is called “CP Qβ”, while the “cover proteins” of the bacteriophage Qβ contain “CP Qβ” as well as protein A1. The bacteriophage Qβ capsid mainly consists of CP Qβ with a small amount of A1 protein. Similarly, the VLP Qβ coating protein mainly contains CP Qβ with a low A1 protein content.
Центральная частица: В используемом в данном описании смысле термин «центральная частица» относится к жесткой структуре с присущей ей повторяющейся организацией. Центральная частица в используемом в данном описании смысле может быть продуктом процесса синтеза или продуктом биологического процесса.Central particle: In the sense used in this description, the term "central particle" refers to a rigid structure with its inherent repetitive organization. The central particle in the sense used in this description may be a product of a synthesis process or a product of a biological process.
Связанный: Термин «связанный» в используемом в данном описании смысле относится к связыванию посредством ковалентных связей или сильных нековалентных взаимодействий, обычно и предпочтительно к связыванию посредством ковалентных связей. В данном изобретении можно использовать любой способ, обычно используемый специалистами в данной области для связывания биологически активных веществ.Bound: The term “bound,” as used herein, refers to binding via covalent bonds or strong non-covalent interactions, usually and preferably to binding via covalent bonds. In this invention, you can use any method commonly used by specialists in this field for the binding of biologically active substances.
Эффективное количество: В используемом в данном описании смысле термин «эффективное количество» относится к количеству, необходимому или достаточному, чтобы осуществить требуемое биологическое действие. Эффективным количеством композиции может быть количество, которое дает возможность достичь данного выбранного результата, и определение такого количества может быть обычной практикой для специалиста в данной области. Например, эффективным количеством для лечения недостаточности иммунной системы может быть количество, необходимое для того, чтобы вызвать активацию иммунной системы, приводящую к развитию специфичного для антигена иммунного ответа при воздействии антигена. Этот термин также является синонимом «достаточного количества».Effective amount: As used herein, the term “effective amount” refers to the amount necessary or sufficient to carry out the desired biological effect. An effective amount of a composition may be an amount that makes it possible to achieve a given selected result, and determining such an amount may be common practice for one skilled in the art. For example, an effective amount for treating a deficiency of the immune system may be the amount necessary to cause activation of the immune system, leading to the development of an antigen-specific immune response when exposed to the antigen. This term is also synonymous with "enough."
Эффективное количество для любого конкретного применения может варьировать в зависимости от таких факторов, как заболевание или состояние, подвергаемое лечению, конкретная вводимая композиция, масса субъекта и/или тяжесть заболевания или состояния. Специалист в данной области может эмпирически определить эффективное количество конкретной композиции согласно данному изобретению без необходимости в чрезмерном экспериментировании.The effective amount for any particular application may vary depending on factors such as the disease or condition being treated, the particular composition administered, the weight of the subject and / or the severity of the disease or condition. One of skill in the art can empirically determine the effective amount of a particular composition according to this invention without the need for excessive experimentation.
Эпитоп: В используемом в данном описании смысле «эпитоп» относится к непрерывным или прерывающимся частям полипептида, обладающим антигенной или иммуногенной активностью у животного, предпочтительно млекопитающего и наиболее предпочтительно человека. Эпитоп распознается антителом или T-клеткой посредством его T-клеточного рецептора в контексте молекулы MHC. «Иммуногенный эпитоп» в используемом в данном описании смысле определяют как часть полипептида, которая вызывает гуморальный ответ или индуцирует T-клеточный ответ у животного, который определяется любым способом, известным в данной области (см., например, Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002 (1983)). Термин «антигенный эпитоп» в используемом в данном описании смысле определяют как часть белка, посредством которой антитело может иммуноспецифически связывать свой антиген, что определяют любым способом, хорошо известным в данной области. Иммуноспецифическое связывание исключает неспецифическое связывание, но не обязательно исключает перекрестную реакционную способность по отношению к другим антигенам. Антигенные эпитопы не обязательно должны быть иммуногенными. Антигенные эпитопы также могут быть T-клеточными эпитопами, и в этом случае они могут иммуноспецифически связываться T-клеточным рецептором в контексте молекулы MHC.Epitope: As used herein, an “epitope” refers to the continuous or discontinuous portions of a polypeptide having antigenic or immunogenic activity in an animal, preferably a mammal, and most preferably a human. An epitope is recognized by an antibody or T cell through its T cell receptor in the context of an MHC molecule. An “immunogenic epitope” as used herein is defined as the part of a polypeptide that elicits a humoral response or induces a T-cell response in an animal that is determined by any method known in the art (see, for example, Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002 (1983)). The term “antigenic epitope” as used herein is defined as part of a protein by which an antibody can immunospecifically bind its antigen, as determined by any method well known in the art. Immunospecific binding excludes non-specific binding, but does not necessarily exclude cross-reactivity with other antigens. Antigenic epitopes do not have to be immunogenic. Antigenic epitopes can also be T-cell epitopes, in which case they can immunospecifically bind to the T-cell receptor in the context of the MHC molecule.
Эпитоп может содержать 3 аминокислоты в пространственной конформации, которая уникальна для эпитопа. Как правило, эпитоп состоит по меньшей мере примерно из 5 таких аминокислот и более обычно состоит по меньшей мере примерно из 8-10 таких аминокислот. Если эпитоп является органической молекулой, он может быть небольшим, таким как нитрофенил.An epitope can contain 3 amino acids in a spatial conformation that is unique to the epitope. Typically, an epitope consists of at least about 5 such amino acids and more usually consists of at least about 8-10 such amino acids. If the epitope is an organic molecule, it may be small, such as nitrophenyl.
Слияние: В используемом в данном описании смысле термин «слияние» относится к комбинации аминокислотных последовательностей разного происхождения в одной полипептидной цепи посредством комбинирования в рамке считывания кодирующих их нуклеотидных последовательностей. Термин «слияние» особо включает в себя внутренние слияния, т.е. инсерцию последовательностей разного происхождения в полипептидную цепь, кроме слияния с одним из ее концов.Fusion: As used herein, the term “fusion” refers to a combination of amino acid sequences of different origin in one polypeptide chain by combining in the reading frame the nucleotide sequences encoding them. The term “merger” specifically includes internal mergers, i.e. the insertion of sequences of different origin in the polypeptide chain, except for merging with one of its ends.
Иммунный ответ: В используемом в данном описании смысле термин «иммунный ответ» относится к гуморальному иммунному ответу и/или клеточному иммунному ответу, приводящему к активации или пролиферации B- и/или T-лимфоцитов и/или антигенпрезентирующих клеток. Однако в некоторых случаях иммунные ответы могут быть низкой интенсивности, и они становятся регистрируемыми только при использовании по меньшей мере одного вещества согласно изобретению. «Иммуногенный» относится к агенту, используемому для стимуляции иммунной системы живого организма с тем, чтобы усилить и направить на иммуногенный агент одну или несколько функций иммунной системы. «Иммуногенный полипептид» является полипептидом, который вызывает клеточный и/или гуморальный иммунный ответ либо отдельно, либо в связанном с носителем виде в присутствии или в отсутствие адъюванта. Предпочтительно может быть активирована антигенпрезентирующая клетка.Immune response: As used herein, the term "immune response" refers to a humoral immune response and / or a cellular immune response leading to the activation or proliferation of B and / or T lymphocytes and / or antigen presenting cells. However, in some cases, immune responses may be of low intensity, and they become detectable only when using at least one substance according to the invention. "Immunogenic" refers to an agent used to stimulate the immune system of a living organism in order to enhance and direct one or more functions of the immune system to the immunogenic agent. An “immunogenic polypeptide” is a polypeptide that elicits a cellular and / or humoral immune response, either alone or in a carrier bound form in the presence or absence of an adjuvant. Preferably, an antigen presenting cell can be activated.
Вещество, которое «усиливает» иммунный ответ, относится к веществу в том случае, когда наблюдается иммунный ответ, который становится больше или усиливается или каким-либо образом отклоняется при добавлении вещества, по сравнению с таким же иммунным ответом, измеренным без добавления вещества. Например, может быть измерена литическая активность цитотоксических T-клеток, например, с использованием анализа высвобождения 51Cr в образцах, полученных с применением и без применения вещества в ходе иммунизации. Говорят, что количество вещества, при котором литическая активность CTL усилена по сравнению с литической активностью CTL без вещества, является количеством, достаточным для усиления иммунного ответа животного на антиген. В предпочтительном варианте иммунный ответ усилен по меньшей мере примерно в 2 раза, более предпочтительно примерно в 3 раза или больше. Также может быть изменено количество или тип секретируемых цитокинов. Альтернативно может быть изменено количество индуцируемых антител или их подклассов.A substance that "enhances" the immune response refers to a substance when an immune response is observed that becomes larger or amplifies or in some way deviates when a substance is added, compared with the same immune response measured without adding a substance. For example, the lytic activity of cytotoxic T cells can be measured, for example, using 51 Cr release analysis in samples obtained with and without a substance during immunization. It is said that the amount of a substance in which the lytic activity of CTL is enhanced compared to the lytic activity of CTL without a substance is an amount sufficient to enhance the animal's immune response to the antigen. In a preferred embodiment, the immune response is enhanced at least about 2 times, more preferably about 3 times or more. The amount or type of secreted cytokines may also be altered. Alternatively, the amount of inducible antibodies or their subclasses can be changed.
Иммунизация: В используемом в данном описании смысле термины «иммунизировать» или «иммунизация» или связанные термины относятся к приданию способности вырабатывать достаточно сильный иммунный ответ (включая гуморальный и/или клеточный иммунитет, такой как эффекторные CTL) против антигена или эпитопа, являющегося мишенью. Указанные термины не требуют, чтобы был сформирован полный иммунитет, а скорее, чтобы был получен иммунный ответ, который значительно выше исходного уровня. Например, млекопитающее может считаться иммунизированным против антигена-мишени, если после применения способов согласно изобретению возникает клеточный и/или гуморальный иммунный ответ на антиген-мишень.Immunization: As used herein, the terms “immunize” or “immunization” or related terms refer to imparting the ability to generate a sufficiently strong immune response (including humoral and / or cellular immunity, such as effector CTLs) against an antigen or epitope that is a target. These terms do not require that complete immunity be formed, but rather, that an immune response is obtained that is significantly higher than the baseline. For example, a mammal can be considered immunized against a target antigen if, after application of the methods of the invention, a cellular and / or humoral immune response to the target antigen occurs.
Природное происхождение: В используемом в данном описании смысле термин «природное происхождение» означает, что целое или часть целого не синтезируют, а оно существует или продуцируется в природе.Natural origin: In the sense used in this description, the term "natural origin" means that the whole or part of the whole is not synthesized, but that it exists or is produced in nature.
Неприродный: В используемом в данном описании смысле термин, в общем, означает полученный не из природы, более конкретно, термин означает полученный искусственно человеком.Unnatural: In the sense used in this description, the term, in general, means obtained not from nature, more specifically, the term means obtained artificially by man.
Неприродное происхождение: В используемом в данном описании смысле термин «неприродное происхождение» в общем означает «синтезирован или получен не из природы»; более конкретно, термин означает «получен искусственно человеком».Unnatural origin: In the sense used in this description, the term “non-natural origin” generally means “synthesized or obtained not from nature”; more specifically, the term means "artificially obtained by man."
Упорядоченная и повторяющаяся матрица антигенов или антигенных детерминант: В используемом в данном описании смысле термин «упорядоченная и повторяющаяся матрица антигенов или антигенных детерминант» в общем относится к повторяющемуся образцу антигенов или антигенных детерминант, обычно и предпочтительно характеризующемуся однородным пространственным расположением антигенов или антигенных детерминант по отношению к центральной частице и, соответственно, вирусоподобной частице. В одном варианте изобретения повторяющийся образец может иметь геометрический рисунок. Типичными и предпочтительными примерами подходящих упорядоченных и повторяющихся матриц антигенов или антигенных детерминант являются матрицы, которые имеют строго повторяющиеся паракристаллические порядки расположения антигенов или антигенных детерминант, предпочтительно с расстояниями от 1 до 30 нанометров, предпочтительно от 5 до 15 нанометров.An ordered and repeating matrix of antigens or antigenic determinants: As used herein, the term “ordered and repeating matrix of antigens or antigenic determinants” generally refers to a repeating sample of antigens or antigenic determinants, usually and preferably characterized by a uniform spatial arrangement of antigens or antigenic determinants with respect to to the central particle and, accordingly, the virus-like particle. In one embodiment of the invention, the repeating pattern may have a geometric pattern. Typical and preferred examples of suitable ordered and repeating matrices of antigens or antigenic determinants are matrices that have strictly repeating paracrystalline orders of antigens or antigenic determinants, preferably with distances from 1 to 30 nanometers, preferably from 5 to 15 nanometers.
Фимбрии: В используемом в данном описании смысле термин «фимбрии» (в единственном числе «фимбрия») относится к внеклеточным структурам бактериальных клеток, состоящим из белковых мономеров (например, мономеров пилина), которые организованы в упорядоченные и повторяющиеся структуры. Кроме того, фимбрии являются структурами, которые вовлечены в такие процессы, как связывание бактериальных клеток с поверхностными рецепторами клетки-хозяина, межклеточные генетические обмены и распознавание клетками друг друга. Примеры фимбрий включают фимбрии типа 1, P-фимбрии, фимбрии F1C, S-фимбрии и фимбрии 987P. Дополнительные примеры фимбрий указаны ниже.Fimbriae: As used in this description, the term “fimbriae” (in the singular “fimbriae”) refers to the extracellular structures of bacterial cells consisting of protein monomers (eg, pilin monomers) that are organized into ordered and repeating structures. In addition, fimbriae are structures that are involved in processes such as the binding of bacterial cells to the surface receptors of the host cell, intercellular genetic exchanges, and cell recognition by each other. Examples of fimbriae include
Структуры, подобные фимбриям: В используемом в данном описании смысле фраза «структура, подобная фимбриям» относится к структурам, имеющим характеристики, сходные с характеристиками фимбрий, и состоящим из белковых мономеров. Одним примером «структуры, подобной фимбриям» является структура, образованная бактериальной клеткой, которая экспрессирует модифицированные белки пилина, которые не образуют упорядоченные и повторяющиеся матрицы, которые идентичны матрицам природных фимбрий.Structures similar to fimbriae: As used in this description, the phrase “structure similar to fimbriae” refers to structures having characteristics similar to those of fimbriae and consisting of protein monomers. One example of a “fimbria-like structure” is a structure formed by a bacterial cell that expresses modified pilin proteins that do not form ordered and repeating matrices that are identical to those of natural fimbria.
Полипептид: В используемом в данном описании смысле термин «полипептид» относится к молекуле, состоящей из мономеров (аминокислот), линейно связанных амидными связями (также называемыми пептидными связями). Термин указывает на молекулярную цепь аминокислот и не относится к конкретной длине продукта. Таким образом, пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды и белки включены в определение полипептида. Подразумевается, что данный термин также относится к модификациям полипептида после экспрессии, например гликозилированию, ацетилированию, фосфорилированию и тому подобному. Рекомбинантный или производный полипептид необязательно транслируют с определенной последовательности нуклеиновой кислоты. Его также можно создать любым способом, включая химический синтез.Polypeptide: As used herein, the term “polypeptide” refers to a molecule consisting of monomers (amino acids) linearly linked by amide bonds (also called peptide bonds). The term refers to the molecular chain of amino acids and does not refer to the specific length of the product. Thus, peptides, dipeptides, tripeptides, oligopeptides and proteins are included in the definition of a polypeptide. It is understood that this term also refers to modifications of the polypeptide after expression, for example, glycosylation, acetylation, phosphorylation and the like. A recombinant or derivative polypeptide is optionally translated from a specific nucleic acid sequence. It can also be created in any way, including chemical synthesis.
Белок RANKL: Термин «белок RANKL» в используемом в данном описании смысле относится к белку, кодируемому геном RANKL. Различные варианты белка RANKL могут быть обусловлены точечными мутациями нуклеотидов и полиморфизмом, соответственно, а также инсерциями, делециями и/или заменами одного или нескольких нуклеотидов и должны быть включены в объем данного изобретения. Дополнительная вариабельность может быть обусловлена посттрансляционными модификациями, такими как дифференциально гликозилированные формы RANKL, а также протеолитически расщепленные формы RANKL (Lum, L., et al., J. Biol. Chem. 274: 13613-13618 (2000). Имеется ряд известных в настоящее время вариантов сплайсинга гена RANKL человека и гена RANKL других видов, которые вместе с возможными вариантами, указанными выше, также входят в объем изобретения. Таким образом, термин «белок RANKL» в используемом в данном описании смысле также должен охватывать варианты белка RANKL, включая, но не ограничиваясь этим, указанные выше предпочтительные примеры.RANKL protein: The term "RANKL protein" as used herein refers to a protein encoded by the RANKL gene. Different variants of the RANKL protein may be due to point mutations of the nucleotides and polymorphism, respectively, as well as insertions, deletions and / or substitutions of one or more nucleotides and should be included in the scope of this invention. Additional variability may be due to post-translational modifications, such as differentially glycosylated forms of RANKL, as well as proteolytically cleaved forms of RANKL (Lum, L., et al., J. Biol. Chem. 274: 13613-13618 (2000). presently, splicing variants of the human RANKL gene and other types of RANKL gene, which, together with the possible variants mentioned above, are also included in the scope of the invention. Thus, the term "RANKL protein" as used in this description should also cover variants of the RANKL protein, including I, but not limited to, the above preferred examples.
В используемом в данном описании смысле термин «фрагмент RANKL» имеет широкое определение как любой полипептид длиной по меньшей мере 50 аминокислот, который представляет собой часть белка RANKL, наиболее предпочтительно подвергнутую укладке часть RANKL и наиболее предпочтительно внеклеточную часть RANKL, еще более предпочтительно область, гомологичную TNF-α. Термин фрагмент RANKL также охватывает рекомбинантно полученные белки и, соответственно, полипептиды, соответствующие изоформам сплайсинга и протеолитически расщепленным формам RANKL и все его варианты, описанные выше.As used herein, the term “RANKL fragment” is broadly defined as any polypeptide of at least 50 amino acids in length, which is part of a RANKL protein, most preferably a folding part of RANKL and most preferably an extracellular part of RANKL, even more preferably a region homologous TNF-α. The term RANKL fragment also encompasses recombinantly produced proteins and, accordingly, polypeptides corresponding to splicing isoforms and proteolytically cleaved RANKL forms and all its variants described above.
В используемом в данном описании смысле термин «пептид RANKL» имеет широкое определение как любой пептид, который представляет собой часть белка RANKL или фрагмента RANKL и содержит по меньшей мере два, предпочтительно по меньшей мере три, более предпочтительно по меньшей мере четыре, более предпочтительно по меньшей мере пять, более предпочтительно по меньшей мере шесть, следующих друг за другом аминокислот исходного белка RANKL или фрагмента RANKL, наиболее предпочтительно внеклеточной части RANKL. Кроме того, термин «пептид RANKL» предпочтительно должен охватывать любую часть указанного пептида RANKL, где указанная часть предпочтительно может быть получена путем делеции одной или нескольких аминокислот на N- и/или C-конце. Пептид RANKL может быть получен рекомбинантной экспрессией в эукариотических или прокариотических системах экспрессии в виде отдельного пептида RANKL или в виде слияния с другими аминокислотами или белками, например, чтобы облегчить укладку, экспрессию или растворимость пептида RANKL или облегчить очистку пептида RANKL. Чтобы сделать возможным связывание пептидов RANKL и белков субъединиц VLP или капсидов, к пептиду RANKL может быть добавлен по меньшей мере один второй сайт связывания. Альтернативно пептиды RANKL можно синтезировать с использованием способов, известных в данной области. Термин пептид RANKL в используемом в данном описании смысле также предпочтительно должен включать в себя пептид, который имитирует трехмерную структуру поверхности RANKL. Такой пептид RANKL не обязательно получен из непрерывной аминокислотной последовательности RANKL, а может быть образован несмежными аминокислотными остатками из RANKL. Такие пептиды даже могут содержать аминокислоты, которые не присутствуют в соответствующем белке RANKL.As used herein, the term "RANKL peptide" is broadly defined as any peptide that is part of a RANKL protein or RANKL fragment and contains at least two, preferably at least three, more preferably at least four, more preferably at least five, more preferably at least six, successive amino acids of the parent RANKL protein or RANKL fragment, most preferably the extracellular portion of RANKL. In addition, the term “RANKL peptide” should preferably encompass any portion of said RANKL peptide, wherein said portion can preferably be obtained by deletion of one or more amino acids at the N- and / or C-terminus. The RANKL peptide can be obtained by recombinant expression in eukaryotic or prokaryotic expression systems as a single RANKL peptide or as a fusion with other amino acids or proteins, for example, to facilitate the folding, expression or solubility of the RANKL peptide or to facilitate the purification of the RANKL peptide. To enable the binding of RANKL peptides and proteins of VLP subunits or capsids, at least one second binding site can be added to the RANKL peptide. Alternatively, RANKL peptides can be synthesized using methods known in the art. The term RANKL peptide, as used herein, should also preferably include a peptide that mimics the three-dimensional surface structure of RANKL. Such a RANKL peptide is not necessarily derived from the continuous amino acid sequence of RANKL, but may be formed by non-contiguous amino acid residues from RANKL. Such peptides may even contain amino acids that are not present in the corresponding RANKL protein.
Остаток: В используемом в данном описании смысле подразумевается, что термин «остаток» означает специфичную аминокислоту в полипептидном остове или боковой цепи.Residue: As used herein, the term “residue” is intended to mean a specific amino acid in a polypeptide backbone or side chain.
Аутоантиген (собственный антиген): В используемом в данном описании смысле термин «аутоантиген» относится к белкам, кодируемым ДНК хозяина, и продукты, образованные белками или РНК, кодируемыми ДНК хозяина, определяют как собственные. Кроме того, белки, которые являются результатом комбинации двух или нескольких собственных молекул или которые представляют собой часть собственной молекулы, и белки, которые обладают высокой гомологией с двумя собственными молекулами, которые определены выше (>95%, предпочтительно >97%, более предпочтительно >99%), также могут считаться собственными.Autoantigen (intrinsic antigen): As used herein, the term “autoantigen” refers to proteins encoded by the host DNA, and products formed by proteins or RNA encoded by the host DNA are defined as intrinsic. In addition, proteins that are the result of a combination of two or more of their own molecules or which are part of their own molecules, and proteins that are highly homologous with two of their own molecules, as defined above (> 95%, preferably> 97%, more preferably> 99%) can also be considered own.
Лечение: В используемом в данном описании смысле термины «лечение», «лечить», «подвергнутый лечению» или «процесс лечения» относится к профилактике и/или терапии. Например, в случае использования по отношению к инфекционному заболеванию термин относится к профилактическому лечению, которое повышает устойчивость субъекта к инфекции патогеном или, другими словами, уменьшает вероятность того, что субъект станет инфицированным патогеном или будет проявлять симптомы болезни, которые можно отнести к инфекции, а также к лечению, после того, как субъект стал инфицированным, чтобы бороться с инфекцией, например, чтобы уменьшить или уничтожить инфекцию или не допустить того, чтобы субъекту стало хуже. В случае использования по отношению к заболеванию кости термин «лечение» относится к профилактическому или терапевтическому лечению, которое ингибирует или снижает повышенную резорбцию кости, которая связана с заболеваниями кости.Treatment: As used herein, the terms “treatment”, “treat”, “treated” or “treatment process” refer to prophylaxis and / or therapy. For example, when used with respect to an infectious disease, the term refers to prophylactic treatment that increases the subject's resistance to a pathogen infection or, in other words, reduces the likelihood that the subject will become infected with a pathogen or exhibit symptoms of the disease that can be attributed to infection, and also to treatment, after the subject has become infected in order to fight the infection, for example, to reduce or destroy the infection or to prevent the subject from getting worse. When used with respect to bone disease, the term "treatment" refers to prophylactic or therapeutic treatment that inhibits or reduces the increased bone resorption that is associated with bone diseases.
Вакцина: В используемом в данном описании смысле термин «вакцина» относится к препарату, который содержит композицию согласно данному изобретению и который находится в форме, которую можно вводить животному. Обычно вакцина содержит среду в виде обычного физиологического раствора или забуференного водного раствора, в которой суспендирована или растворена композиция согласно данному изобретению. В указанной форме композицию согласно данному изобретению легко можно использовать для того, чтобы предотвратить, улучшить или другим образом воздействовать на состояние. При введении в хозяина вакцина способна возбуждать иммунный ответ, включая, но не ограничиваясь указанным, продукцию антител и/или цитокинов и/или активацию цитотоксических T-клеток, антигенпрезентирующих клеток, хелперных T-клеток, дендритных клеток и/или другие клеточные ответы.Vaccine: In the sense used in this description, the term "vaccine" refers to a preparation that contains a composition according to this invention and which is in a form that can be administered to an animal. Typically, the vaccine contains the medium in the form of a normal saline solution or a buffered aqueous solution in which the composition according to this invention is suspended or dissolved. In this form, the composition according to this invention can easily be used in order to prevent, improve or otherwise affect the condition. When introduced into the host, the vaccine is capable of eliciting an immune response, including, but not limited to, production of antibodies and / or cytokines and / or activation of cytotoxic T cells, antigen-presenting cells, helper T cells, dendritic cells and / or other cellular responses.
Необязательно вакцина согласно данному изобретению дополнительно содержит адъювант, который может присутствовать либо в небольшой, либо в большой пропорции относительно соединения согласно данному изобретению. Термин «адъювант» в используемом в данном описании смысле относится к неспецифичным стимуляторам иммунного ответа или веществам, которые делают возможным создание депо в организме хозяина, которые при комбинировании с вакциной согласно данному изобретению обеспечивают еще более усиленный иммунный ответ. Можно использовать множество адъювантов. Примеры включают полный и неполный адъювант Фрейнда, гидроксид алюминия и модифицированный мурамилдипептид.Optionally, the vaccine according to this invention further comprises an adjuvant, which may be present in either a small or a large proportion relative to the compound of this invention. The term “adjuvant” as used in this description refers to non-specific stimulants of the immune response or substances that make it possible to create a depot in the host, which when combined with the vaccine according to this invention provide an even more enhanced immune response. You can use many adjuvants. Examples include Freund's complete and incomplete adjuvant, aluminum hydroxide, and a modified muramyl dipeptide.
Вирусоподобная частица (VLP): В используемом в данном описании смысле термин «вирусоподобная частица» относится к структуре, подобной вирусной частице. Кроме того, вирусоподобная частица согласно изобретению является нерепликативной и неинфекционной, так как не содержит всего или части вирусного генома, в частности репликативных и инфекционных компонентов вирусного генома. Вирусоподобная частица согласно изобретению может содержать нуклеиновую кислоту, отличную от ее генома. Типичным и предпочтительным вариантом вирусоподобной частицы согласно данному изобретению является капсид вируса, такой как вирусный капсид соответствующего вируса, бактериофага или РНК-фага. Термины «вирусный капсид» или «капсид», которые используются в данном описании, взаимозаменяемо относятся к макромолекулярной конструкции, состоящей из белковых субъединиц вируса. Обычно и предпочтительно белковые субъединицы вируса собираются в вирусный капсид и, соответственно, «капсид», имеющий структуру с присущей ей повторяющейся организацией, где указанная структура обычно является сферической или трубчатой. Например, капсиды РНК-фагов или HBcAg имеют сферическую форму с икосаэдрической симметрией. Термин «капсидоподобная структура» в используемом в данном описании смысле относится к собранной из макромолекул конструкции, состоящей из белковых субъединиц вируса, имеющей аналогичную капсиду морфологию в определенном выше смысле, но имеющей отклонения от типичной симметричной сборки при сохранении достаточной степени порядка и повторяемости.Virus-like particle (VLP): As used herein, the term “virus-like particle” refers to a structure similar to a virus particle. In addition, the virus-like particle according to the invention is non-replicative and non-infectious, as it does not contain all or part of the viral genome, in particular the replicative and infectious components of the viral genome. The virus-like particle according to the invention may contain a nucleic acid different from its genome. A typical and preferred embodiment of a virus-like particle according to this invention is a virus capsid, such as a viral capsid of the corresponding virus, bacteriophage or RNA phage. The terms “viral capsid” or “capsid”, as used herein, interchangeably refer to a macromolecular construct consisting of protein subunits of the virus. Usually and preferably, the protein subunits of the virus are assembled into a viral capsid and, accordingly, a “capsid" having a structure with its inherent repetitive organization, where this structure is usually spherical or tubular. For example, capsid RNA phages or HBcAg have a spherical shape with icosahedral symmetry. The term “capsid-like structure” as used herein refers to a macromolecule-assembled construct consisting of protein subunits of the virus, having a similar capsid morphology in the sense defined above, but deviating from a typical symmetrical assembly while maintaining a sufficient degree of order and repeatability.
Вирусоподобная частица бактериофага: В используемом в данном описании смысле термин «вирусоподобная частица бактериофага» относится к вирусоподобной частице, аналогичной по структуре бактериофагу, но являющейся нерепликативной и неинфекционной, и не содержащей по меньшей мере гена или генов, кодирующих аппарат репликации бактериофага, и обычно также не содержащей гена или генов, кодирующих белок или белки, отвечающие за прикрепление вируса или проникновение вируса в хозяина. Однако данное определение также должно охватывать вирусоподобные частицы бактериофагов, в которых вышеуказанный ген или гены еще присутствуют, но неактивны и, следовательно, также приводят к нереплицирующимся и неинфекционным вирусоподобным частицам бактериофагов.Virus-like particle of a bacteriophage: In the sense used in this description, the term “virus-like particle of a bacteriophage” refers to a virus-like particle similar in structure to a bacteriophage, but which is non-replicative and non-infectious, and does not contain at least the gene or genes encoding the bacteriophage replication apparatus, and usually also not containing a gene or genes encoding a protein or proteins responsible for the attachment of a virus or the penetration of a virus into a host. However, this definition should also encompass virus-like particles of bacteriophages in which the above gene or genes are still present but inactive and therefore also lead to non-replicating and non-infectious virus-like particles of bacteriophages.
VLP покрывающего белка РНК-фага: Капсидную структуру, образованную в результате самосборки 180 субъединиц покрывающего белка РНК-фага и необязательно содержащую РНК хозяина, называют «VLP покрывающего белка РНК-фага». Конкретным примером является VLP покрывающего белка Qβ. В данном конкретном случае VLP покрывающего белка Qβ может быть собрана либо исключительно из субъединиц CP Qβ (образованных при экспрессии гена CP Qβ, содержащего, например, стоп-кодон TAA, препятствующий любой экспрессии более длинного белка A1 посредством супрессии, см. Kozlovska, T.M., et al., Intervirology 39: 9-15 (1996)), либо дополнительно содержит субъединицы белка A1 в собранной конструкции капсида.VLP of the RNA phage coat protein: The capsid structure resulting from the self-assembly of 180 subunits of the RNA phage coat protein and optionally containing the host RNA is called the “VLP of the RNA phage coat protein”. A specific example is the VLP of the Qβ coat protein. In this particular case, the VLP of the Qβ coat protein can be assembled either exclusively from CP Qβ subunits (formed by expression of the CP Qβ gene containing, for example, the TAA stop codon that inhibits any expression of the longer A1 protein by suppression, see Kozlovska, TM, et al., Intervirology 39: 9-15 (1996)), or further comprises subunits of protein A1 in the assembled capsid construct.
Вирусная частица: Термин «вирусная частица» в используемом в данном описании смысле относится к морфологической форме вируса. У некоторых типов вирусов она содержит геном, окруженный белковым капсидом; другие имеют дополнительные структуры (например, оболочки, хвосты и т.д.).Viral particle: The term "viral particle" as used in this description refers to the morphological form of the virus. In some types of viruses, it contains a genome surrounded by a protein capsid; others have additional structures (e.g. shells, tails, etc.).
Один или форма единственного числа: При использовании в данном описании терминов «один» или форм единственного числа они означают «по меньшей мере» один или «один или несколько», если не оговорено особо.One or the singular: When used in this description, the terms “one” or the singular, they mean “at least” one or “one or more”, unless otherwise specified.
Как будет понятно специалистам в данной области, некоторые варианты изобретения касаются применения методик на основе рекомбинантной нуклеиновой кислоты, таких как клонирование, полимеразная цепная реакция, очистка ДНК и РНК, экспрессия рекомбинантных белков в прокариотических и эукариотических клетках и т.д. Такие методики хорошо известны специалистам в данной области, и их легко можно найти в опубликованных руководствах по лабораторным способам (например, Sambrook, J. et al., eds., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd. edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel, F. et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John H. Wiley and Sons, Inc. (1997)). Фундаментальные лабораторные методики для работы с линиями клеток культур тканей (Celis, J., ed., Cell Biology, Academic Press, 2nd edition, (1998)) и методики на основе антител (Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988); Deutscher, M.P., «Guide to Protein Purification», Meth. Enzymol. 128, Academic Press San Diego (1990); Scopes, R.K., Protein Purification Principles and Practice, 3rd ed., Springer-Verlag, New York (1994)) также в достаточной мере описаны в литературе, все указанные публикации включены в данное описание в виде ссылки.As will be appreciated by those skilled in the art, some embodiments of the invention relate to the use of recombinant nucleic acid-based techniques such as cloning, polymerase chain reaction, DNA and RNA purification, expression of recombinant proteins in prokaryotic and eukaryotic cells, etc. Such techniques are well known to those skilled in the art and can easily be found in published laboratory methods manuals (e.g., Sambrook, J. et al., Eds., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press , Cold Spring Harbor, NY (1989); Ausubel, F. et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, John H. Wiley and Sons, Inc. (1997)). Fundamental laboratory techniques for working with tissue culture cell lines (Celis, J., ed., Cell Biology, Academic Press, 2nd edition, (1998)) and antibody-based techniques (Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988); Deutscher, MP, Guide to Protein Purification, Meth. Enzymol. 128, Academic Press San Diego (1990); Scopes, RK, Protein Purification Principles and Practice, 3rd ed., Springer-Verlag, New York (1994)) are also adequately described in the literature, all of these publications are incorporated herein by reference.
2. Композиции и способы усиления иммунного ответа2. Compositions and methods of enhancing the immune response
Заявленное изобретение относится к композициям и способам усиления иммунного ответа против белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL у животного. Композиции согласно изобретению содержат или альтернативно состоят из (a) центральной частицы по меньшей мере с одним первым сайтом связывания; и (b) по меньшей мере одного антигена или антигенной детерминанты по меньшей мере с одним вторым сайтом связывания, где указанный антиген или антигенная детерминанта является белком RANKL, фрагментом RANKL или пептидом RANKL и где указанный второй сайт связывания выбран из группы, состоящей из (i) сайта связывания неприродного происхождения с указанным антигеном или антигенной детерминантой; и (ii) сайта связывания природного происхождения с указанным антигеном или антигенной детерминантой, где указанный второй сайт связывания способен вступать в ассоциацию с указанным первым сайтом связывания; и где указанный антиген или антигенная детерминанта и указанная центральная частица взаимодействуют благодаря указанной ассоциации, образуя упорядоченную и повторяющуюся антигенную матрицу. Более конкретно, композиции согласно изобретению содержат - или альтернативно - состоят из вирусоподобной частицы и по меньшей мере одного антигена или антигенной детерминанты, где антиген или антигенная детерминанта является белком RANKL, фрагментом RANKL или пептидом RANKL и где по меньшей мере один антиген или антигенная детерминанта связаны с вирусоподобной частицей, так что образуется упорядоченная и повторяющаяся антиген-VLP-матрица. Кроме того, изобретение дает возможность специалисту-практику легко конструировать такую композицию, наряду с прочим, для лечения и/или профилактического предотвращения костных заболеваний, характеризующихся повышенной резорбцией кости.The claimed invention relates to compositions and methods for enhancing the immune response against RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide in an animal. The compositions of the invention comprise or alternatively consist of (a) a central particle with at least one first binding site; and (b) at least one antigen or antigenic determinant with at least one second binding site, wherein said antigen or antigenic determinant is a RANKL protein, a RANKL fragment, or a RANKL peptide and where said second binding site is selected from the group consisting of (i ) a binding site of non-natural origin with the specified antigen or antigenic determinant; and (ii) a naturally occurring binding site with said antigen or antigenic determinant, wherein said second binding site is capable of associating with said first binding site; and wherein said antigen or antigenic determinant and said central particle interact due to said association to form an ordered and repeating antigenic matrix. More specifically, the compositions of the invention comprise — or alternatively — consist of a virus-like particle and at least one antigen or antigenic determinant, wherein the antigen or antigenic determinant is a RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide and where at least one antigen or antigenic determinant is associated with a virus-like particle, so that an ordered and repeating VLP antigen matrix is formed. In addition, the invention enables a practitioner to easily design such a composition, among other things, for the treatment and / or prophylactic prevention of bone diseases characterized by increased bone resorption.
В одном варианте центральная частица содержит вирус, фимбрию бактерии, структуру, образованную из бактериального пилина, бактериофаг, вирусоподобную частицу, частицу вирусного капсида или их рекомбинантную форму. Любой вирус, известный в данной области, имеющий упорядоченную и повторяющуюся структуру покрывающего и/или корового белка, может быть выбран в качестве центральной частицы согласно изобретению; примеры подходящих вирусов включают в себя вирус Синдбис и другие альфавирусы, рабдовирусы (например, вирус везикулярного стоматита), пикорнавирусы (например, риновирус человека, вирус Аиши), тогавирусы (например, вирус краснухи), ортомиксовирусы (например, вирус Тогото, вирус Баткен, вирус чумы птиц), вирусы полиомы (например, полиомавирус BK, полиомавирус JC, вирус полиомы птиц BFDV), парвовирусы, ротавирусы, вирус Норуолк, вирус ящура, ретровирус, вирус гепатита B, вирус табачной мозаики, вирус овечьих кошар и вирус папилломы человека, и предпочтительно РНК-фаг, бактериофаг Qβ, бактериофаг R17, бактериофаг M11, бактериофаг MX1, бактериофаг NL95, бактериофаг fr, бактериофаг GA, бактериофаг SP, бактериофаг MS2, бактериофаг f2, бактериофаг PP7 (например, см. таблицу 1 в Bachmann, M.F. and Zinkernagel, R.M., Immunol. Today 17: 553-558 (1996)).In one embodiment, the central particle comprises a virus, fimbriae bacteria, a structure formed from bacterial pilin, a bacteriophage, a virus-like particle, a virus capsid particle, or a recombinant form thereof. Any virus known in the art having an ordered and repeating structure of a coating and / or core protein may be selected as the central particle of the invention; examples of suitable viruses include Sindbis virus and other alphaviruses, rhabdoviruses (e.g. vesicular stomatitis virus), picornaviruses (e.g. human rhinovirus, Aisha virus), togaviruses (e.g. rubella virus), orthomyxoviruses (e.g. Togoto virus, Batken virus, plague virus), polyoma viruses (e.g., BK poliomavirus, JC polyomavirus, BFDV bird polyoma virus), parvoviruses, rotaviruses, Norwalk virus, foot and mouth disease virus, retrovirus, hepatitis B virus, tobacco mosaic virus, sheep’s nightmare virus and human papillomavirus, and prefer specifically RNA phage, bacteriophage Qβ, bacteriophage R17, bacteriophage M11, bacteriophage MX1, bacteriophage NL95, bacteriophage fr, bacteriophage GA, bacteriophage SP, bacteriophage MS2, bacteriophage f2, bacteriophage PP7 (for example, see Table 1 in Bachmann, MF and Zinkernagel , RM, Immunol. Today 17: 553-558 (1996)).
В следующем варианте в изобретении используют генетическую инженерию вируса, чтобы создать слияние между упорядоченным и повторяющимся белком вирусной оболочки и первым сайтом связывания, содержащим гетерологичный белок, пептид, антигенную детерминанту или предпочтительно реакционно-способный аминокислотный остаток. Другие генетические манипуляции, известные специалистам в данной области, могут быть включены в конструирование композиций согласно изобретению; например, может требоваться ограничение способности рекомбинантного вируса к репликации посредством генетической мутации. Кроме того, вирус, используемый для данного изобретения, является некомпетентным по репликации вследствие химической или физической инактивации или, как указано, вследствие отсутствия компетентного по репликации генома. Вирусный белок, выбранный для слияния с первым сайтом связывания, должен иметь организованную и повторяющуюся структуру. Такая организованная и повторяющаяся структура включает в себя паракристаллические организации с расстояниями 5-30 нм, предпочтительно 5-15 нм, на поверхности вируса. Результатом создания слитого белка данного типа будут множественные, упорядоченные и повторяющиеся первые сайты связывания на поверхности вируса при отражении нормальной организации нативного вирусного белка. Как будет понятно специалистам в данной области, первый сайт связывания может быть частью или может быть любым подходящим белком, полипептидом, сахаром, полинуклеотидом, пептидом (аминокислотой), природным или синтетическим полимером, вторичным метаболитом или их комбинацией, которые могут служить для специфичного связывания антигена или антигенной детерминанты, приводящего к образованию упорядоченной и повторяющейся матрицы антигена или антигенной детерминанты.In a further embodiment, the invention uses genetic engineering of the virus to create a fusion between the ordered and repeating viral coat protein and the first binding site containing a heterologous protein, peptide, antigenic determinant, or preferably a reactive amino acid residue. Other genetic manipulations known to those skilled in the art may be included in the design of the compositions of the invention; for example, it may be necessary to limit the ability of a recombinant virus to replicate through a genetic mutation. In addition, the virus used for this invention is incompetent for replication due to chemical or physical inactivation or, as indicated, due to the lack of a replication competent genome. The viral protein selected for fusion with the first binding site must have an organized and repeating structure. Such an organized and repeating structure includes paracrystalline organizations with distances of 5-30 nm, preferably 5-15 nm, on the surface of the virus. The result of creating a fusion protein of this type will be multiple, ordered and repeated first binding sites on the surface of the virus, reflecting the normal organization of the native viral protein. As will be appreciated by those skilled in the art, the first binding site may be part or may be any suitable protein, polypeptide, sugar, polynucleotide, peptide (amino acid), natural or synthetic polymer, secondary metabolite, or a combination thereof, which may serve to specifically bind antigen or an antigenic determinant, leading to the formation of an ordered and repeating matrix of antigen or antigenic determinant.
В другом варианте изобретения центральная частица является рекомбинантным альфавирусом и более конкретно рекомбинантным вирусом Синдбис. Альфавирусы являются вирусами с позитивной нитью РНК, которые реплицируют свою геномную РНК полностью в цитоплазме инфицированной клетки и без промежуточных ДНК-продуктов (Strauss, J. and Strauss, E., Microbiol. Rev. 58: 491-562 (1994)). Большое внимание было обращено на несколько представителей семейства альфавирусов, Синдбис (Xiong, C. et al., Science 243: 1188-1191 (1989); Schlesinger, S., Trends Biotechnol. 11: 18-22 (1993)), вирус леса Семлики (SFV) (Liljeström, P. and Garoff, H., Bio/Technology 9: 1356-1361 (1991)) и другие (Davis, N.L. et al., Virology 171: 189-204 (1989)) в качестве основанных на вирусах экспрессирующих векторов для множества различных белков (Lundstrom, K., Curr. Opin. Biotechnol. 8: 578-582 (1997); Liljeström, P., Curr. Opin. Biotechnol. 5: 495-500 (1994)) и в качестве кандидатов для разработки вакцин. Недавно выпущен ряд патентов, направленных на применение альфавирусов для экспрессии гетерологичных белков и разработки вакцин (см. патенты США № 5766602, 5792462, 5739026, 5789245 и 5814482). Конструирование альфавирусных центральных частиц согласно изобретению можно осуществить способами, широко известными в области технологии рекомбинантной ДНК, которые описаны в вышеуказанных статьях, которые включены в данное описание в виде ссылки.In another embodiment of the invention, the central particle is a recombinant alphavirus, and more particularly a recombinant Sindbis virus. Alphaviruses are positive RNA strand viruses that replicate their genomic RNA completely in the cytoplasm of an infected cell and without intermediate DNA products (Strauss, J. and Strauss, E., Microbiol. Rev. 58: 491-562 (1994)). Much attention was paid to several representatives of the alphavirus family, Sindbis (Xiong, C. et al., Science 243: 1188-1191 (1989); Schlesinger, S., Trends Biotechnol. 11: 18-22 (1993)), forest virus Semlic (SFV) (Liljeström, P. and Garoff, H., Bio / Technology 9: 1356-1361 (1991)) and others (Davis, NL et al., Virology 171: 189-204 (1989)) as based viruses expressing vectors for many different proteins (Lundstrom, K., Curr. Opin. Biotechnol. 8: 578-582 (1997); Liljeström, P., Curr. Opin. Biotechnol. 5: 495-500 (1994)) and as candidates for vaccine development. Recently, a number of patents have been issued aimed at the use of alphaviruses for the expression of heterologous proteins and the development of vaccines (see US patents No. 5766602, 5792462, 5739026, 5789245 and 5814482). The construction of the alphavirus core particles according to the invention can be carried out by methods well known in the art of recombinant DNA technology, which are described in the above articles, which are incorporated herein by reference.
Множество различных рекомбинантных клеток-хозяев можно использовать для получения основанной на вирусе центральной частицы для связывания антигена или антигенной детерминанты. Например, известно, что альфавирусы имеют широкий круг хозяев; вирус Синдбис инфицирует культивируемые клетки млекопитающих, рептилий и амфибий, а также некоторые клетки насекомых (Clark, H., J. Natl. Cancer Inst. 51:645 (1973); Leake, C., J. Gen. Virol. 35:335 (1977); Stollar, V. in The Togaviruses, R.W. Schlesinger, Ed., Academic Press, (1980), pp.583-621). Таким образом, в практике данного изобретения можно использовать множество рекомбинантных клеток-хозяев. Клетки BHK, COS, Vero, HeLa и CHO особенно подходят для продукции гетерологичных белков, так как они имеют возможность гликозилировать гетерологичные белки сходным с клетками человека образом (Watson, E. et al., Glycobiology 4: 227, (1994)) и могут быть отобраны в ходе селекции (Zang, M. et al., Bio/Technology 13:389 (1995)) или сконструированы генетическим способом (Renner W. et al., Biotech. Bioeng. 4: 476 (1995); Lee K. et al. Biotech. Bioeng. 50:336 (1996)), так, чтобы они росли в среде, не содержащей сыворотки, а также в суспензии.Many different recombinant host cells can be used to obtain a virus-based central particle to bind an antigen or antigenic determinant. For example, it is known that alphaviruses have a wide range of hosts; Sindbis virus infects cultured mammalian, reptile and amphibian cells, as well as some insect cells (Clark, H., J. Natl. Cancer Inst. 51: 645 (1973); Leake, C., J. Gen. Virol. 35: 335 (1977); Stollar, V. in The Togaviruses, RW Schlesinger, Ed., Academic Press, (1980), pp. 583-621). Thus, in the practice of this invention, many recombinant host cells can be used. BHK, COS, Vero, HeLa, and CHO cells are particularly suitable for the production of heterologous proteins, as they have the ability to glycosylate heterologous proteins in a manner similar to human cells (Watson, E. et al., Glycobiology 4: 227, (1994)) and can be selected by selection (Zang, M. et al., Bio / Technology 13: 389 (1995)) or genetically engineered (Renner W. et al., Biotech. Bioeng. 4: 476 (1995); Lee K. et al. Biotech. Bioeng. 50: 336 (1996)), so that they grow in serum-free medium as well as in suspension.
Введение полинуклеотидных векторов в клетки-хозяева можно осуществить способами, описанными в стандартных лабораторных руководствах (см., например, Sambrook, J. et al., eds., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd. edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Chapter 9; Ausubel, F. et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John H. Wiley and Sons, Inc. (1997), Chapter 16), включая такие способы как электропорация, опосредованная DEAE-декстраном трансфекция, трансфекция, микроинъекция, опосредованная катионными липидами трансфекция, трансдукция, введение с помощью царапин, баллистическое введение и инфекция. Способы введения экзогенных последовательностей ДНК в клетки-хозяева обсуждается в Felgner, P. et al., патент США № 5580859.The introduction of polynucleotide vectors into host cells can be accomplished by the methods described in standard laboratory manuals (see, for example, Sambrook, J. et al., Eds., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989),
Упакованные последовательности РНК также можно использовать для инфекции клеток-хозяев. Указанные упакованные последовательности РНК можно ввести в клетки-хозяева путем добавления их в культуральную среду. Например, получение неинфекционных альфавирусных частиц описано в ряде источников, включая «Sindbis Expression System», Version C (Invitrogen, номер в каталоге K750-1).Packed RNA sequences can also be used to infect host cells. These packaged RNA sequences can be introduced into host cells by adding them to the culture medium. For example, the preparation of non-infectious alphavirus particles has been described in a number of sources, including the Sindbis Expression System, Version C (Invitrogen, catalog number K750-1).
Когда в качестве рекомбинантных клеток-хозяев для получения основанных на вирусах центральных частиц используют клетки млекопитающих, указанные клетки обычно выращивают в культуре ткани. Способы выращивания клеток в культуре хорошо известны в данной области (см., например, Celis, J., ed., Cell Biology, Academic Press, 2nd edition, (1998); Sambrook, J. et al., eds., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd. edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel, F. et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John H. Wiley and Sons, Inc. (1997); Freshney, R., Culture of Animal Cells, Alan R. Liss, Inc. (1983)).When mammalian cells are used as recombinant host cells to obtain virus-based central particles, these cells are usually grown in tissue culture. Methods of growing cells in culture are well known in the art (see, for example, Celis, J., ed., Cell Biology, Academic Press, 2nd edition, (1998); Sambrook, J. et al., Eds., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989); Ausubel, F. et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, John H. Wiley and Sons, Inc. (1997); Freshney, R., Culture of Animal Cells, Alan R. Liss, Inc. (1983)).
Следующие примеры РНК-вирусов, подходящих для применения в качестве центральных частиц в данном изобретении, включают, но не ограничены указанным, следующие вирусы: представителей семейства Reoviridae, включая род Orthoreovirus (множественные серотипы ретровирусов млекопитающих и птиц), род Orbivirus (вирус синего языка, вирус Эугенанги, вирус Кемерово, вирус африканской болезни лошадей и вирус колорадской клещевой лихорадки) и род Rotavirus (ротавирус человека, вирус диареи телят Небраски, ротавирус мышей, ротавирус обезьян, бычий или овечий ротавирус, ротавирус птиц); семейство Picomaviridae, включая род Enterovirus (полиовирус, вирус Коксаки A и B, кишечные цитопатические «сиротские» вирусы человека (ECHO), вирусы гепатита A, C, D, E и G, энтеровирусы обезьян, вирусы энцефаломиелита мышей (ME), Poliovirus muris, бычьи энтеровирусы, энтеровирусы свиней, род Cardiovirus (вирус энцефаломиокардита (EMC), вирус Менго), род Rhinovirus (риновирусы человека, включая по меньшей мере 113 подтипов; другие риновирусы), род Apthovirus (вирус ящура (FMDV)); семейство Calciviridae, включая вирус везикулярной экзантемы свиней, вирус морских львов Сан-Мигель, кошачий пикорнавирус и вирус Норуолк; семейство Togaviridae, включая род Alphavirus (вирус восточного энцефалита лошадей, вирус леса Семлики, вирус Синдбис, вирус Чикунгунья, вирус О'Ньонг-Ньонг, вирус реки Росс, вирус венесуэльского энцефалита лошадей, вирус западного энцефалита лошадей), род Flavirius (вирус москитной желтой лихорадки, вирус Денге, вирус японского энцефалита, вирус энцефалита Сан-Луи, вирус энцефалита долины Мюррей, вирус Западного Нила, вирус Кунжин, вирус центральноевропейского клещевого энцефалита, вирус дальневосточного клещевого энцефалита, вирус леса Киасанур, вирус Louping III, вирус Повассан, вирус Омской геморрагической лихорадки), род Rubivirus (вирус краснухи), род Pestivirus (вирус болезни слизистых оболочек, вирус холеры свиней, вирус пограничной болезни); семейство Bunyaviridae, включая род Bunyvirus (вирус Буньямвера и родственные вирусы, группа вирусов Калифорнийского энцефалита), род Phlebovirus (вирус сицилийской москитной лихорадки, вирус лихорадки долины Рифт), род Nairovirus (вирус геморрагической лихорадки Крым-Конго, вирус болезни овец Найроби) и род Uukuvirus (вирус Уукуниеми и родственные вирусы); семейство Orthomyxoviridae, включая род вируса гриппа (вирус гриппа типа A, множество серотипов у человека); вирус гриппа свиней и вирусы гриппа птиц и лошадей; вирус гриппа типа B (множество серотипов у человека) и вирус гриппа типа C (возможно отдельный род); семейство Paramyxoviridae, включая род Paramyxovirus (вирус парагриппа типа 1, вирус Сендай, вирус гемадсорбции, вирусы парагриппа типов 2-5, вирус ньюкаслской болезни, вирус свинки), род Morbillivirus (вирус кори, вирус подострого склерозирующего панэнцефалита, вирус чумки, вирус чумы рогатого скота), род Pneumovirus (респираторно-синцитиальный вирус (RSV), бычий респираторно-синцитиальный вирус и вирус пневмонии мышей); вирус леса, семейство Rhabdoviridae, включая род Vesiculovirus (VSV), вирус Чандипура, вирус Фландерс-Харт Парк), род Lyssavirus (вирус бешенства), рабдовирусы рыб и филовирусы (вирус Марбург и вирус Эбола); семейство Arenaviridae, включая вирус лимфоцитарного хориоменингита (LCM), вирус комплекса Такарибе и вирус Ласса; семейство Coronoaviridae, включая вирус инфекционного бронхита (IBV), вирус гепатиты мышей, кишечный коронавирус человека и вирус инфекционного кошачьего перитонита (кошачий коронавирус).The following examples of RNA viruses suitable for use as central particles in this invention include, but are not limited to, the following viruses: representatives of the Reoviridae family, including the genus Orthoreovirus (multiple serotypes of mammalian and avian retroviruses), the genus Orbivirus (blue tongue virus, Eugenangi virus, Kemerovo virus, African horse disease virus and Colorado tick-borne fever virus) and the genus Rotavirus (human rotavirus, Nebraska calf diarrhea virus, mouse rotavirus, monkey rotavirus, bovine or sheep’s rotavirus, company Irus birds); Picomaviridae family, including the genus Enterovirus (poliovirus, Coxsackie virus A and B, intestinal cytopathic orphan human viruses (ECHO), hepatitis A, C, D, E and G viruses, monkey enteroviruses, mouse encephalomyelitis viruses (ME), Poliovirus muris , bovine enteroviruses, swine enteroviruses, genus Cardiovirus (encephalomyocarditis virus (EMC), Mengo virus), genus Rhinovirus (human rhinoviruses, including at least 113 subtypes; other rhinoviruses, genus Apthovirus (FMD virus), family Calciviridae, including swine vesicular exanthema virus, San Miguel sea lion virus, feline picornavirus Norwalk virus; Togaviridae family, including the genus Alphavirus (horse eastern encephalitis virus, Semlica forest virus, Sindbis virus, Chikungunya virus, O'Nyong Nyong virus, Ross river virus, equine Venezuelan encephalitis virus, horse western encephalitis virus), genus Flavirius ( yellow fever mosquito virus, Dengue virus, Japanese encephalitis virus, San Louis encephalitis virus, Murray Valley encephalitis virus, West Nile virus, Kunzhin virus, tick-borne tick-borne encephalitis virus, Far Eastern tick-borne encephalitis virus, forest virus Kiasanur, Louping III virus, Povassan virus, Omsk hemorrhagic fever virus), genus Rubivirus (rubella virus), genus Pestivirus (mucous membrane disease virus, swine cholera virus, border disease virus); the Bunyaviridae family, including the Bunyvirus genus (Bunyamver virus and related viruses, the California encephalitis virus group), the Phlebovirus genus (Sicilian mosquito fever virus, Rift Valley fever virus), the Nairovirus genus (Hemorrhagic fever virus, Nyme-Crimean and Syndrome disease) Uukuvirus (Uukuniemi virus and related viruses); the Orthomyxoviridae family, including the genus of the influenza virus (type A influenza virus, many serotypes in humans); swine flu virus and bird and horse flu viruses; type B influenza virus (many serotypes in humans) and type C influenza virus (possibly a separate genus); the Paramyxoviridae family, including the genus Paramyxovirus (parainfluenza virus type 1, Sendai virus, hemodisorption virus, parainfluenza viruses type 2-5, Newcastle disease virus, mumps virus), the genus Morbillivirus (measles virus, subacute sclerosing panencephalitis virus, distemper virus, plague virus cattle), the genus Pneumovirus (respiratory syncytial virus (RSV), bovine respiratory syncytial virus and mouse pneumonia virus); forest virus, the Rhabdoviridae family, including the genus Vesiculovirus (VSV), Chandipur virus, Flanders-Hart Park virus), the genus Lyssavirus (rabies virus), fish rhabdoviruses and filoviruses (Marburg virus and Ebola virus); the Arenaviridae family, including lymphocytic choriomeningitis virus (LCM), Takaribe complex virus and Lassa virus; the Coronoaviridae family, including infectious bronchitis virus (IBV), mouse hepatitis virus, human intestinal coronavirus and infectious feline peritonitis virus (feline coronavirus).
Иллюстративные ДНК-вирусы, которые можно использовать в качестве центральных частиц, включают, но не ограничены указанным: семейство Poxviridae, включая род Orthopoxvirus (вирус натуральной оспы, вирус белой оспы, вирус оспы обезьян, вирус оспы коров, вирус оспы буйволов, вирус оспы кроликов, вирус эктромелии), род Leporipoxvirus (миксома, фиброма), род Avipoxvirus (вирус оспы домашних птиц и вирус оспы других птиц), род Capripoxvirus (оспа овец, оспа коз), род Suipoxvirus (оспа свиней), род Parapoxvirus (вирус инфекционного пустулезного дерматита, вирус псевдооспы коров («узелков доярок»), вирус папулезного стоматита крупного рогатого скота); семейство Iridoviridae (вирус африканской лихорадки свиней, вирусы лягушки 2 и 3, вирус лимфоцистоза рыб); семейство Herpesviridae, включая альфа-герпесвирусы (вирусы простого герпеса типа 1 и 2, вирус Варицелла-Зостер, вирус аборта лошадей, вирус герпеса лошадей типа 2 и 3, вирус псевдобешенства, вирус инфекционного бычьего кератоконъюнктивита, вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, вирус кошачьего ринотрахеита, вирус инфекционного ларинготрахеита), бета-герпесвирусы (цитомегаловирус человека и цитомегаловирусы свиней, обезьян и грызунов); гамма-герпесвирусы (вирус Эпштейна-Барр (EBV), вирус болезни Марека, Herpes saimiri (герпес беличьих обезьян), Herpesvirus ateles (вирус герпеса паукообразных обезьян), Herpesvirus sylvilagus (вирус герпеса лесных кроликов), вирус герпеса морских свинок, вирус опухоли Люкке); и семейство Adenoviridae, включая род Mastadenovirus (подгруппы A, B, C, D и E человека и не относящиеся к подгруппам; аденовирусы обезьян (по меньшей мере 23 серотипа), инфекционный гепатит собак и аденовирусы крупного рогатого скота, свиней, овец, лягушек и многих других видов, род Aviadenovirus (аденовирусы птиц); и некультивируемые аденовирусы; семейство Papoviridae, включая род Papillomavirus (вирусы папилломы человека, вирусы папилломы крупного рогатого скота, вирусы папилломы кроликов Шоупа и различные патогенные вирусы папилломы других видов), род Polyomavirus (полиомавирус, вакуолизирующий вирус обезьян (SV-40), вакуолизирующий вирус кроликов (RKV), K-вирус, BK-вирус, JC-вирус и другие вирусы полиомы приматов, такие как лимфотропный вирус папилломы); семейство Parvoviridae, включая род аденоассоциированных вирусов, род Parvovirus (вирус кошачьей панлейкопении, парвовирус крупного рогатого скота, парвовирус собак, вирус алеутской болезни норок и т.д.). Наконец, ДНК-вирусы могут включать такие вирусы, как агенты хронической инфекционной невропатии (вирус CHINA).Illustrative DNA viruses that can be used as central particles include, but are not limited to: the Poxviridae family, including the genus Orthopoxvirus (smallpox virus, smallpox virus, monkeypox virus, cowpox virus, buffalo smallpox virus, rabbit smallpox virus , ectromelia virus), genus Leporipoxvirus (myxoma, fibroma), genus Avipoxvirus (smallpox virus and smallpox virus of other birds), genus Capripoxvirus (smallpox sheep, smallpox goats), genus Suipoxvirus (smallpox pigs), genus Parapoxvirus (infectious papular virus dermatitis, cow pseudo-virus virus (“milkmaids nodules” ), the virus of papular stomatitis in cattle); family Iridoviridae (African swine fever virus, frog viruses 2 and 3, fish lymphocystosis virus); Herpesviridae family, including alpha herpes viruses (herpes simplex viruses type 1 and 2, Varicella-Zoster virus, horse abortion virus, horse herpes simplex virus type 2 and 3, pseudorabies virus, infectious bovine keratoconjunctivitis virus, cattle infectious rhinotracheitis virus, feline virus rhinotracheitis, infectious laryngotracheitis virus), beta herpes viruses (human cytomegalovirus and cytomegalovirus pigs, monkeys and rodents); gamma herpes viruses (Epstein-Barr virus (EBV), Marek’s disease virus, Herpes saimiri (squirrel monkey herpes), Herpesvirus ateles (herpes monkey virus herpes virus), Herpesvirus sylvilagus (forest rabbit herpes virus), Guinea pig herpes virus, ); and the Adenoviridae family, including the genus Mastadenovirus (subgroups A, B, C, D and E of humans and not belonging to subgroups; monkey adenoviruses (at least 23 serotypes), infectious hepatitis in dogs and adenoviruses in cattle, pigs, sheep, frogs and many other species, the genus Aviadenovirus (avian adenoviruses); and uncultivated adenoviruses; the Papoviridae family, including the genus Papillomavirus (human papillomaviruses, cattle papillomaviruses, Shope rabbit papillomaviruses and various other pathogenic papillomaviruses of other species), polyomav at monkey monkey virus (SV-40), rabbit vacuolating virus (RKV), K virus, BK virus, JC virus and other primate polyoma viruses such as lymphotropic papilloma virus); Parvoviridae family, including the adeno-associated virus genus, the genus Parvovirus (feline panleukopenia virus, cattle parvovirus, dog parvovirus, mink disease Aleut virus, etc.) Finally, DNA viruses can include viruses such as agents of chronic infectious neuropathy (CHINA virus).
В других вариантах бактериальный пилин, субфрагмент бактериального пилина или слитый белок, который содержит либо бактериальный пилин, либо его субфрагмент, используют для приготовления композиций и, соответственно, вакцинных композиций согласно изобретению. Примеры белков пилина включают пилины, продуцируемые Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Caulobacter crescentus, Pseudomonas stutzeri и Pseudomonas aeruginosa. Аминокислотные последовательности белков пилина, подходящие для применения в случае данного изобретения, включают в себя последовательности, указанные в записях GenBank AJ000636 (SEQ ID NO:1), AJ132364 (SEQ ID NO:2), AF229646 (SEQ ID NO:3), AF051814 (SEQ ID NO:4), AF051815 (SEQ ID NO:5) и X00981 (SEQ ID NO:6), полное описание которых включено в данную заявку в виде ссылки.In other embodiments, a bacterial pilin, a sub-fragment of a bacterial pilin, or a fusion protein that contains either a bacterial pilin or a sub-fragment thereof, is used to prepare compositions and, accordingly, vaccine compositions according to the invention. Examples of pilin proteins include pilins produced by Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Caulobacter crescentus, Pseudomonas stutzeri and Pseudomonas aeruginosa. Amino acid sequences of pilin proteins suitable for use in the case of this invention include those indicated in GenBank AJ000636 (SEQ ID NO: 1), AJ132364 (SEQ ID NO: 2), AF229646 (SEQ ID NO: 3), AF051814 (SEQ ID NO: 4), AF051815 (SEQ ID NO: 5) and X00981 (SEQ ID NO: 6), the full description of which is incorporated herein by reference.
Белки бактериального пилина обычно процессируются с удалением N-концевых лидерных последовательностей перед экспортом белков в бактериальную периплазму. Кроме того, как будет понятно специалисту в данной области, белки бактериального пилина, используемые для получения композиций и, соответственно, композиций вакцин согласно изобретению, как правило, не будут иметь лидерной последовательности, присутствующей в естественных условиях.Bacterial pilin proteins are usually processed to remove N-terminal leader sequences before exporting proteins to bacterial periplasm. In addition, as will be understood by a person skilled in the art, the bacterial pilin proteins used to prepare the compositions and, accordingly, the vaccine compositions of the invention will generally not have a leader sequence present in vivo.
Одним конкретным примером белка пилина, подходящего для применения в данном изобретении, является P-пилин E. coli (запись в GenBank AF237482 (SEQ ID NO:7)). Примером пилина E. coli типа 1, подходящего для применения в изобретении, является пилин, имеющий аминокислотную последовательность, указанную в GenBank, запись P04128 (SEQ ID NO:8), которая кодируется нуклеиновой кислотой, имеющей нуклеотидную последовательность, указанную в GenBank, запись M27603 (SEQ ID NO:9). Полное описание указанных данных GenBank включено в данную заявку в виде ссылки. И снова в большинстве случаев зрелая форма указанного выше белка может быть использована для приготовления композиции и, следовательно, композиции вакцины согласно изобретению.One specific example of a pilin protein suitable for use in this invention is E. coli P-pilin (entry in GenBank AF237482 (SEQ ID NO: 7)). An example of an E. coli pilin of
Бактериальные пилины или субфрагменты пилинов, подходящие для применения в практике данного изобретения, как правило, будут способны вступать в ассоциацию с образованием упорядоченных и повторяющихся антигенных матриц.Bacterial pilins or pilin sub-fragments suitable for use in the practice of this invention will typically be able to associate to form ordered and repeating antigenic matrices.
Способы получения фимбрий и подобных фимбриям структур in vitro хорошо известны в данной области. Например, Bullitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 12890-12895 (1996) описали реконструирование in vitro субъединиц P-фимбрий E. coli. Кроме того, Eshdat et al., J. Bacteriol. 148: 308-314 (1981) описали способы, подходящие для диссоциации фимбрий типа-1 E. coli и реконструирование фимбрий. Коротко, указанные способы заключаются в следующем: фимбрии подвергают диссоциации путем инкубации при 37°C в насыщенном гидрохлориде гуанидина. Затем белки пилина очищают путем хроматографирования, после чего димеры пилина образуют при диализе против 5 мМ гидрохлорида трис(гидроксиметил)аминометана (pH 8,0). Eshdat et al. также обнаружили, что димеры пилина снова подвергаются сборке, образуя фимбрии, при диализе против 5 мМ трис(гидроксиметил)аминометана (pH 8,0), содержащего 5 мМ MgCl2.Methods for producing fimbriae and fimbria-like structures in vitro are well known in the art. For example, Bullitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 12890-12895 (1996) described in vitro reconstruction of E. coli P-fimbria subunits. In addition, Eshdat et al., J. Bacteriol. 148: 308-314 (1981) described methods suitable for dissociating fimbriae type-1 E. coli and reconstructing fimbriae. Briefly, these methods are as follows: fimbriae are subjected to dissociation by incubation at 37 ° C in saturated guanidine hydrochloride. Then, the pilin proteins are purified by chromatography, after which the pilin dimers form during dialysis against 5 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride (pH 8.0). Eshdat et al. they also found that pilin dimers reassembled to form fimbriae during dialysis against 5 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane (pH 8.0) containing 5 mM MgCl 2 .
Кроме того, используя, например, обычные способы генетической инженерии и модификации белка, белки пилина можно модифицировать так, чтобы они содержали первый сайт связывания, с которым связывают антиген или антигенную детерминанту посредством второго сайта связывания. Альтернативно антигены или антигенные детерминанты можно непосредственно связывать посредством второго сайта связывания с аминокислотными остатками, которые присутствуют в указанных белках в природе. Затем указанные модифицированные белки пилина можно использовать в композициях вакцин согласно изобретению.In addition, using, for example, conventional genetic engineering and protein modification methods, pilin proteins can be modified to contain a first binding site to which an antigen or antigenic determinant is bound via a second binding site. Alternatively, antigens or antigenic determinants can be directly linked via a second binding site to amino acid residues that are naturally occurring in these proteins. Then these modified pilin proteins can be used in vaccine compositions according to the invention.
Бактериальные белки пилина, используемые для получения композиций и, соответственно, композиций вакцин согласно изобретению, можно модифицировать способом, подобным способу, приведенному в данном описании для HBcAg. Например, остатки цистеина и лизина могут быть либо делетированы, либо заменены другими аминокислотными остатками, и к полученным белкам может быть добавлен первый сайт связывания. Кроме того, белки пилина могут быть либо экспрессированы в модифицированной форме, либо химически модифицированы после экспрессии. Подобным образом можно собрать интактные фимбрии из бактерий и затем модифицировать химическим способом.The bacterial pilin proteins used to prepare the compositions and, accordingly, the vaccine compositions of the invention can be modified in a manner similar to the method described herein for HBcAg. For example, cysteine and lysine residues can either be deleted or replaced with other amino acid residues, and the first binding site can be added to the resulting proteins. In addition, pilin proteins can either be expressed in a modified form or chemically modified after expression. Similarly, intact fimbriae can be collected from bacteria and then chemically modified.
В другом варианте фимбрии или подобные фимбриям структуры собирают из бактерий (например, E. coli) и используют для образования композиций и композиций вакцин согласно изобретению. Одним примером фимбрий, подходящих для получения композиций и вакцинных композиций, является фимбрия типа-1 E. coli, которая образуется из мономеров пилина, имеющих аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:8.In another embodiment, fimbriae or fimbria-like structures are harvested from bacteria (e.g., E. coli) and used to form vaccine compositions and compositions of the invention. One example of fimbriae suitable for preparing compositions and vaccine compositions is E. coli type-1 fimbriae, which is formed from pilin monomers having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8.
В данной области известен ряд способов сбора бактериальных фимбрий. Например, Bullitt and Makowski (Biophys. J. 74: 623-632 (1998)), описали способ очистки фимбрий в случае сбора P-фимбрий E. coli. Согласно данному способу фимбрии срезают с E. coli, имеющих гиперколичество фимбрий и содержащих P-фимбрия-плазмиду, и очищают, используя циклы растворения и осаждения с MgCl2 (1,0 М).A number of methods for collecting bacterial fimbriae are known in the art. For example, Bullitt and Makowski (Biophys. J. 74: 623-632 (1998)) described a method for purifying fimbriae in the case of collection of E. coli P-fimbriae. According to this method, fimbriae are cut off with E. coli having a hyperquantity of fimbria and containing a P-fimbria plasmid, and purified using dissolution and precipitation cycles with MgCl 2 (1.0 M).
После сбора фимбрии или подобные фимбриям структуры можно модифицировать множеством способов. Например, к фимбриям можно добавить первый сайт связывания, с которым могут быть связаны антигены или антигенные детерминанты посредством второго сайта связывания. Другими словами, бактериальные фимбрии или подобные фимбриям структуры можно собирать и модифицировать, получая в результате упорядоченные и повторяющиеся антигенные матрицы.After collecting fimbriae or similar fimbria structures can be modified in many ways. For example, a first binding site can be added to fimbriae, to which antigens or antigenic determinants can be linked via a second binding site. In other words, bacterial fimbriae or fimbria-like structures can be assembled and modified, resulting in ordered and repeating antigenic matrices.
Антигены или антигенные детерминанты могут быть связаны с остатками цистеина или остатками лизина природного происхождения, присутствующими в фимбиях или подобных фимбриям структурах. В таких случаях высокая упорядоченность и повторяемость аминокислотного остатка природного происхождения могут регулировать связывание антигенов или антигенных детерминант с фимбриями или подобными фимбриям структурами. Например, фимбрии или подобные фимбриям структуры могут быть связаны со вторыми сайтами связывания антигенов или антигенных детерминант с использованием гетеробифункционального перекрестно сшивающего агента.Antigens or antigenic determinants may be associated with cysteine residues or naturally occurring lysine residues present in fimbias or fimbria-like structures. In such cases, the high orderliness and repeatability of the naturally occurring amino acid residue may regulate the binding of antigens or antigenic determinants to fimbriae or fimbria-like structures. For example, fimbriae or fimbria-like structures can be linked to second binding sites of antigens or antigenic determinants using a heterobifunctional cross-linking agent.
Когда для получения композиций и вакцинных композиций согласно изобретению используют структуры, которые синтезируются организмами в природе (например, фимбрии), часто преимущество будет давать генетическое конструирование указанных организмов так, чтобы они продуцировали структуры, обладающие требуемыми характеристиками. Например, когда используют фимбрии типа-1 E. coli, E. coli, из которых собирают указанные фимбрии, можно модифицировать так, чтобы они продуцировали структуры с конкретными характеристиками. Примеры возможных модификаций белков пилина включают инсерцию одного или нескольких остатков лизина, делецию или замену одного или нескольких естественно присущих остатков лизина и делецию или замену одного или нескольких естественно присущих остатков цистеина (например, остатков цистеина в положениях 44 и 84 в SEQ ID NO:8).When structures that are naturally synthesized by organisms (e.g., fimbriae) are used to prepare the compositions and vaccine compositions of the invention, the genetic design of these organisms will often be advantageous so that they produce structures that possess the desired characteristics. For example, when type-1 fimbriae are used, E. coli, E. coli, from which these fimbriae are collected, can be modified to produce structures with specific characteristics. Examples of possible modifications of pilin proteins include the insertion of one or more lysine residues, deletion or replacement of one or more naturally occurring lysine residues, and the deletion or replacement of one or more naturally occurring cysteine residues (e.g., cysteine residues at
Кроме того, могут быть осуществлены дополнительные модификации в генах пилина, которые приводят к продуктам экспрессии, содержащим другой первый сайт связывания, отличный от остатка лизина (например, домен FOS или JUN). Конечно, подходящий первый сайт связывания в общем будет ограничен сайтами, которые не препятствуют образованию из белков пилина фимбрий или подобных фимбриям структур, подходящих для применения в композициях вакцин согласно изобретению.In addition, further modifications can be made to the pilin genes that result in expression products containing a different first binding site other than a lysine residue (eg, FOS or JUN domain). Of course, a suitable first binding site will generally be limited to sites that do not prevent the formation of fimbriae pilina or similar fimbriae structures from proteins suitable for use in vaccine compositions of the invention.
Гены пилина, которые в природе имеются в бактериальных клетках, могут быть модифицированы in vivo (например, посредством гомологичной рекомбинации), или в указанные клетки могут быть встроены гены пилина с конкретными характеристиками. Например, гены пилина могут быть введены в бактериальные клетки в виде компонента либо реплицирующегося клонирующего вектора, либо вектора, который встраивается в бактериальную хромосому. Встроенные гены пилина также могут быть связаны с последовательностями, контролирующими регуляцию экспрессии (например, lac-оператором).Pilin genes that are naturally found in bacterial cells can be modified in vivo (for example, by homologous recombination), or pilin genes with specific characteristics can be inserted into these cells. For example, pilin genes can be introduced into bacterial cells as a component of either a replicating cloning vector or a vector that integrates into the bacterial chromosome. The inserted pilin genes can also be linked to sequences that control the regulation of expression (for example, a lac operator).
В большинстве случаев фимбрии или подобные фимбриям структуры, используемые в композициях и, соответственно, в композициях вакцин согласно изобретению, будут построены из субъединицы пилина одного типа. Как правило, будут использоваться фимбрии или подобные фимбриям структуры, состоящие из идентичных субъединиц, так как предполагается, что они образуют структуры, которые представляют собой высокоупорядоченные и повторяющиеся антигенные матрицы.In most cases, fimbriae or fimbria-like structures used in the compositions and, accordingly, in the vaccine compositions of the invention will be constructed from the same type pilin subunit. Typically, fimbriae or fimbria-like structures consisting of identical subunits will be used, since it is assumed that they form structures that are highly ordered and repeating antigenic matrices.
Однако композиции согласно изобретению также включают в себя композиции и вакцины, содержащие фимбрии и подобные фимбриям структуры, образованные из гетерогенных субъединиц пилина. Субъединицы пилина, которые образуют указанные фимбрии или подобные фимбриям структуры, могут быть экспрессированы с генов, присутствующих в бактериальных клетках в природе, или могут быть введены в клетки. Когда оба гена - и присутствующий в природе ген пилина, и введенный ген экспрессируются в клетке, которая образует фимбрии или подобные фимбриям структуры, результатом, как правило, будут структуры, образованные из смеси указанных белков пилина. Кроме того, когда в бактериальной клетке экспрессируются два или более генов пилина, относительная экспрессия каждого гена пилина обычно будет фактором, который определяет соотношение различных субъединиц пилина в фимбриях или подобных фимбриям структурах.However, the compositions of the invention also include compositions and vaccines containing fimbriae and fimbria-like structures formed from heterogeneous pilin subunits. The pilin subunits that form these fimbriae or fimbria-like structures can be expressed from genes present in bacterial cells in nature, or can be introduced into cells. When both genes, both the naturally occurring pilin gene and the introduced gene, are expressed in a cell that forms fimbriae or fimbria-like structures, the result will usually be structures formed from a mixture of these pilin proteins. In addition, when two or more pilin genes are expressed in a bacterial cell, the relative expression of each pilin gene will usually be a factor that determines the ratio of the different pilin subunits in fimbriae or fimbria-like structures.
В том случае, когда требуются фимбрии или подобные фимбриям структуры, имеющие конкретный состав из смешанных субъединиц пилина, экспрессию по меньшей мере одного из генов пилина можно регулировать гетерологичным индуцируемым промотором. Такие промоторы, а также другие генетические элементы можно использовать для того, чтобы регулировать относительные количества различных субъединиц пилина, продуцируемых в бактериальной клетке, а следовательно, состав фимбрий или подобных фимбриям структур.In the case where fimbriae or fimbria-like structures having a specific composition of mixed pilin subunits are required, the expression of at least one of the pilin genes can be regulated by a heterologous inducible promoter. Such promoters, as well as other genetic elements, can be used to regulate the relative amounts of the various pilin subunits produced in the bacterial cell, and therefore the composition of the fimbriae or fimbria-like structures.
Кроме того, антиген или антигенная детерминанта может быть связана с бактериальными фимбриями или подобными фимбриям структурами связью, которая не является пептидной связью, бактериальные клетки, которые продуцируют фимбрии или подобные фимбриям структуры, используемые в композициях согласно изобретению, можно генетически сконструировать так, чтобы создавать белки пилина, которые слиты с антигеном или антигенной детерминантой. Такие слитые белки, которые образуют фимбрии или подобные фимбриям структуры, подходят для применения в композициях вакцин согласно изобретению.In addition, the antigen or antigenic determinant can be linked to bacterial fimbriae or fimbria-like structures by a bond that is not a peptide bond, bacterial cells that produce fimbriae or fimbria-like structures used in the compositions of the invention can be genetically engineered to create proteins pilin, which are fused with an antigen or antigenic determinant. Such fusion proteins that form fimbriae or fimbria-like structures are suitable for use in vaccine compositions of the invention.
Вирусоподобные частицы в контексте данной заявки относятся к структурам, аналогичным вирусной частице, но которые являются непатогенными. В общем, вирусоподобные частицы не содержат вирусного генома и, следовательно, являются неинфекционными. Также вирусоподобные частицы могут продуцироваться в больших количествах в результате гетерологичной экспрессии и могут быть легко очищены.Virus-like particles in the context of this application refer to structures similar to a virus particle, but which are non-pathogenic. In general, virus-like particles do not contain the viral genome and therefore are non-infectious. Also, virus-like particles can be produced in large quantities as a result of heterologous expression and can be easily purified.
В предпочтительном варианте вирусоподобной частицей является рекомбинантная вирусоподобная частица. Специалист в данной области может получить VLP, используя методику рекомбинантной ДНК и вирусные кодирующие последовательности, которые легко- и общедоступны. Например, кодирующую последовательность белка оболочки или кора вируса можно сконструировать для экспрессии в бакуловирусном экспрессирующем векторе, используя коммерчески доступный бакуловирусный вектор, под регуляторным контролем вирусного промотора с соответствующими модификациями последовательности, чтобы обеспечить функциональную связь кодирующей последовательности с регуляторной последовательностью. Кодирующую последовательность белка оболочки или кора вируса также можно сконструировать для экспрессии, например, в бактериальном экспрессирующем векторе.In a preferred embodiment, the virus-like particle is a recombinant virus-like particle. One of skill in the art can obtain VLP using a recombinant DNA technique and viral coding sequences that are readily and generally available. For example, the coding sequence of a coat protein or virus cortex can be constructed for expression in a baculovirus expression vector using a commercially available baculovirus vector, under the regulatory control of a viral promoter with appropriate sequence modifications, to provide a functional link between the coding sequence and the regulatory sequence. The coding sequence of the envelope protein or virus core can also be constructed for expression, for example, in a bacterial expression vector.
Примеры VLP включают, но не ограничены указанным, белки капсида вируса гепатита B (Ulrich, et al., Virus Res. 50: 141-182 (1998)), вируса кори (Warnes, et al., Gene 160: 173-178 (1995)), вируса Синдбис, ротавируса (патент США 5071651 и патент США 5374426), вируса везикулярного стоматита, болезни «ноги и рта» (Twomey, et al., Vaccine 13: 1603-1610, (1995)), вируса Норуолк (Jiang, X., et al., Science 250: 1580-1583 (1990); Matsui, S.M., et al., J. Clin. Invest. 87: 1456-1461 (1991)), ретровирусный белок GAG (WO 96/30523), белок p1 ретротранспозона Ty, поверхностный белок вируса гепатита B (WO 92/11291), вируса папилломы человека (WO 98/15631), РНК-фагов, Ty, fr-фага, GA-фага и Qβ-фага.Examples of VLP include, but are not limited to, hepatitis B virus capsid proteins (Ulrich, et al., Virus Res. 50: 141-182 (1998)), measles virus (Warnes, et al., Gene 160: 173-178 ( 1995)), Sindbis virus, rotavirus (US patent 5071651 and US patent 5374426), vesicular stomatitis virus, foot and mouth disease (Twomey, et al., Vaccine 13: 1603-1610, (1995)), Norwalk virus ( Jiang, X., et al., Science 250: 1580-1583 (1990); Matsui, SM, et al., J. Clin. Invest. 87: 1456-1461 (1991)), GAG retroviral protein (WO 96 / 30523), Ty retrotransposon protein p1, hepatitis B virus surface protein (WO 92/11291), human papillomavirus (WO 98/15631), RNA phages, Ty, fr phage, GA phage and Qβ phage.
Как легко будет понятно специалистам в данной области, VLP согласно изобретению не ограничена какой-либо конкретной формой. Частицу можно синтезировать химическим способом или посредством биологического процесса, который может быть природным или неприродным. В качестве примера такой тип варианта включает вирусоподобную частицу или ее рекомбинантную форму.As will be readily apparent to those skilled in the art, the VLP of the invention is not limited to any particular form. The particle can be synthesized chemically or through a biological process, which may be natural or non-natural. As an example, this type of variant includes a virus-like particle or its recombinant form.
В более конкретном варианте, VLP может содержать или, альтернативно, по существу состоять или, альтернативно, состоять из рекомбинантных полипептидов или их фрагментов, выбранных из рекомбинантных полипептидов ротавируса, рекомбинантных полипептидов вируса Норуолк, рекомбинантных полипептидов альфавируса, рекомбинантных полипептидов вируса ящура, рекомбинантных полипептидов вируса кори, рекомбинантных полипептидов вируса Синдбис, рекомбинантных полипептидов вируса полиомы, рекомбинантных полипептидов ретровируса, рекомбинантных полипептидов вируса гепатита B (например, HBcAg), рекомбинантных полипептидов вируса табачной мозаики, рекомбинантных полипептидов вируса овечьих кошар, рекомбинантных полипептидов вируса папилломы человека, рекомбинантных полипептидов бактериофагов, рекомбинантных полипептидов РНК-фагов, рекомбинантных полипептидов Ty, рекомбинантных полипептидов fr-фага, рекомбинантных полипептидов GA-фага и рекомбинантных полипептидов Qβ-фага. Вирусоподобная частица, кроме того, может содержать, или, альтернативно, по существу состоять, или, альтернативно, состоять из одного или нескольких фрагментов таких полипептидов, а также вариантов таких полипептидов. Варианты полипептидов могут иметь, например, по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 97% или 99% идентичности на аминокислотном уровне со своими аналогами дикого типа.In a more specific embodiment, the VLP may contain or, alternatively, essentially consist of or, alternatively, consist of recombinant polypeptides or fragments thereof, selected from recombinant rotavirus polypeptides, recombinant Norwalk virus polypeptides, recombinant alphavirus polypeptides, recombinant virus polypeptides of virus I measles, recombinant Sindbis virus polypeptides, recombinant polyoma virus polypeptides, recombinant retrovirus polypeptides, recombinant hepatitis B virus polypeptides (e.g., HBcAg), recombinant tobacco mosaic virus polypeptides, sheep's nightmare recombinant polypeptides, human papilloma virus recombinant polypeptides, bacteriophage recombinant polypeptides, recombinant RNA polypeptides, recombinant recombinant polypeptides, recombinant recombinant polypeptides, recombinant recombinant polypeptides GA-phage and recombinant Qβ-phage polypeptides. A virus-like particle may also contain, or alternatively essentially consist of, or, alternatively, consist of one or more fragments of such polypeptides, as well as variants of such polypeptides. Variants of the polypeptides may have, for example, at least 80%, 85%, 90%, 95%, 97% or 99% amino acid identity with their wild-type counterparts.
В предпочтительном варианте вирусоподобная частица содержит, по существу состоит или, альтернативно, состоит из рекомбинантных белков или их фрагментов РНК-фага. Предпочтительно РНК-фаг выбран из группы, состоящей из a) бактериофага Qβ; b) бактериофага R17; c) бактериофага fr; d) бактериофага GA; e) бактериофага SP; f) бактериофага MS2; g) бактериофага M11; h) бактериофага MX1; i) бактериофага NL95; k) бактериофага f2 и l) бактериофага PP7.In a preferred embodiment, the virus-like particle contains essentially consists or alternatively consists of recombinant proteins or fragments of RNA phage. Preferably, the RNA phage is selected from the group consisting of a) bacteriophage Qβ; b) bacteriophage R17; c) bacteriophage fr; d) bacteriophage GA; e) bacteriophage SP; f) bacteriophage MS2; g) bacteriophage M11; h) bacteriophage MX1; i) bacteriophage NL95; k) bacteriophage f2; and l) bacteriophage PP7.
В другом предпочтительном варианте данного изобретения вирусоподобная частица содержит или, альтернативно, по существу состоит или, альтернативно, состоит из рекомбинантных белков или их фрагментов, РНК-бактериофага Qβ или РНК-бактериофага fr.In another preferred embodiment of the invention, the virus-like particle contains or, alternatively, essentially consists of or, alternatively, consists of recombinant proteins or fragments thereof, Qβ RNA bacteriophage or fr. RNA bacteriophage.
В другом предпочтительном варианте данного изобретения рекомбинантные белки содержат или, альтернативно, по существу состоят или, альтернативно, состоят из покрывающих белков РНК-фага.In another preferred embodiment of the present invention, the recombinant proteins contain or, alternatively, essentially consist or alternatively consist of covering RNA phage proteins.
Покрывающие белки РНК-фага, образующие капсиды или VLP, или фрагменты покрывающих белков бактериофага, совместимые с самосборкой в капсид или VLP, таким образом, являются следующими предпочтительными вариантами данного изобретения. Покрывающие белки бактериофага Qβ, например, могут быть рекомбинантно экспрессированы в E. coli. Кроме того, при такой экспрессии указанные белки спонтанно образуют капсиды. Кроме того, указанные капсиды образуют структуру с присущей ей повторяющейся организацией.Coating RNA phage proteins forming capsids or VLPs or fragments of bacteriophage coating proteins compatible with self-assembly into capsid or VLP are thus further preferred embodiments of the present invention. Bacteriophage Qβ coating proteins, for example, can be recombinantly expressed in E. coli. In addition, with such expression, these proteins spontaneously form capsids. In addition, these capsids form a structure with its inherent repetitive organization.
Конкретные предпочтительные примеры покрывающих белков бактериофага, которые можно использовать для получения композиций согласно изобретению, включают покрывающие белки таких РНК-бактериофагов, как бактериофаг Qβ (SEQ ID NO:10; база данных PIR, инвентарный No. VCBPQβ, относящаяся к CP Qβ и SEQ ID NO:11; инвентарный No. AAA16663, относящаяся к белку A1 Qβ), бактериофаг R17 (SEQ ID NO:12; PIR, инвентарный No. VCBPR7), бактериофаг fr (SEQ ID NO:13; PIR, инвентарный No. VCBPFR), бактериофаг GA (SEQ ID NO:14; GenBank, инвентарный No. NP-040754), бактериофаг SP (SEQ ID NO:15; GenBank, инвентарный No. CAA30374, относящаяся к CP SP, и SEQ ID NO:16; инвентарный No. NP 695026, относящаяся к белку A1 SP), бактериофаг MS2 (SEQ ID NO:17; PIR, инвентарный No. VCBPM2), бактериофаг M11 (SEQ ID NO:18; GenBank, инвентарный No. AAC06250), бактериофаг MX1 (SEQ ID NO:19; GenBank, инвентарный No. AAC14699), бактериофаг NL95 (SEQ ID NO:20; GenBank, инвентарный No. AAC14704), бактериофаг f2 (SEQ ID NO:21; GenBank, инвентарный No. P03611), бактериофаг PP7 (SEQ ID NO:22). Кроме того, белок A1 бактериофага Qβ или C-концевые укороченные формы, в которых отсутствуют до 100, 150 или 180 аминокислот из его C-конца, могут быть включены в сборку капсида из покрывающих белков Qβ. Как правило, процентное содержание белка A1 Qβ относительно CP Qβ в собранной конструкции капсида будет ограничено, чтобы обеспечить образование капсида.Specific preferred examples of bacteriophage coat proteins that can be used to prepare compositions of the invention include bacteriophage RNA coat proteins such as Qβ bacteriophage (SEQ ID NO: 10; PIR Database, Inventory No. VCBPQβ Related to CP Qβ and SEQ ID NO: 11; Inventory No. AAA16663 relating to A1 Qβ protein), bacteriophage R17 (SEQ ID NO: 12; PIR, Inventory No. VCBPR7), bacteriophage fr (SEQ ID NO: 13; PIR, Inventory No. VCBPFR), Bacteriophage GA (SEQ ID NO: 14; GenBank, Inventory No. NP-040754), Bacteriophage SP (SEQ ID NO: 15; GenBank, Inventory No. CAA30374 Related to CP SP, and SEQ ID NO: 1 6; Inventory No. NP 695026 relating to Protein A1 SP), bacteriophage MS2 (SEQ ID NO: 17; PIR, Inventory No. VCBPM2), bacteriophage M11 (SEQ ID NO: 18; GenBank, Inventory No. AAC06250), bacteriophage MX1 (SEQ ID NO: 19; GenBank, inventory No. AAC14699), bacteriophage NL95 (SEQ ID NO: 20; GenBank, inventory No. AAC14704), bacteriophage f2 (SEQ ID NO: 21; GenBank, inventory No. P03611), bacteriophage PP7 (SEQ ID NO: 22). In addition, protein A1 of the bacteriophage Qβ or C-terminal truncated forms in which up to 100, 150 or 180 amino acids from its C-terminus are absent can be included in the capsid assembly of the Qβ coat proteins. Typically, the percentage of A1 Qβ protein relative to CP Qβ in the assembled capsid construct will be limited to allow for capsid formation.
Также обнаружено, что покрывающий белок Qβ подвергается самосборке в капсиды при экспрессии в E. coli (Kozlovska TM. et al., GENE 137: 133-137 (1993)). Полученные капсиды или вирусоподобные частицы имели икосаэдрическую структуру капсида, подобную структуре фага, с диаметром 25 нм и квазисимметрию T=3. Кроме того, определена кристаллическая структура фага Qβ. Капсид содержит 180 копий покрывающего белка, которые связаны в ковалентные пентамеры и гексамеры дисульфидными мостиками (Golmohammadi, R. et al., Structure 4: 543-5554 (1996)), обеспечивая поразительную стабильность капсида из покрывающего белка Qβ. Однако капсиды или VLP, полученные из рекомбинантного покрывающего белка Qβ, могут содержать субъединицы, не связанные дисульфидными связями с другими субъединицами в капсиде или не полностью связанные. Таким образом, при загрузке рекомбинантного капсида Qβ на невосстанавливающий SDS-ПААГ видны полосы, соответствующие мономерному покрывающему белку Qβ, а также полосы, соответствующие гексамеру или пентамеру покрывающего белка Qβ. Не полностью связанные дисульфидными связями субъединицы могут быть видны в виде полосы димера, тримера или даже тетрамера в невосстанавливающем SDS-ПААГ. Белок капсида Qβ также проявляет необычную резистентность к органическим растворителям и денатурирующим агентам. Неожиданно авторы обнаружили, что такие высокие концентрации ДМСО и ацетонитрила как 30%, и такие высокие концентрации гуанидиния как 1 М, не влияют на стабильность капсида. Высокая стабильность капсида из покрывающего белка Qβ является признаком, дающим преимущество, в частности, для его применения при иммунизации и вакцинации млекопитающих и человека согласно данному изобретению.It was also found that the Qβ coating protein undergoes self-assembly into capsids when expressed in E. coli (Kozlovska TM. Et al., GENE 137: 133-137 (1993)). The resulting capsids or virus-like particles had an icosahedral capsid structure similar to that of a phage with a diameter of 25 nm and a quasi-symmetry of T = 3. In addition, the crystal structure of phage Qβ was determined. The capsid contains 180 copies of the coating protein, which are linked into covalent pentamers and hexamers by disulfide bridges (Golmohammadi, R. et al., Structure 4: 543-5554 (1996)), providing amazing stability of the capsid of the Qβ coating protein. However, capsids or VLPs derived from the recombinant Qβ coat protein may contain subunits that are not disulfide bonded to other subunits in the capsid or are not fully bonded. Thus, when a recombinant Qβ capsid is loaded onto a non-reducing SDS-PAGE, bands corresponding to the monomeric Qβ coating protein are visible, as well as bands corresponding to the hexamer or pentamer of the Qβ coating protein. Subunits that are not fully linked by disulfide bonds can be seen as a dimer, trimer or even tetramer band in non-reducing SDS-PAGE. The Qβ capsid protein also exhibits unusual resistance to organic solvents and denaturing agents. Unexpectedly, the authors found that such high concentrations of DMSO and acetonitrile as 30%, and such high concentrations of guanidinium as 1 M, do not affect the stability of the capsid. The high stability of the capsid from the Qβ coating protein is an advantage, in particular for its use in immunization and vaccination of mammals and humans according to this invention.
При экспрессии в E. coli N-концевой метионин покрывающего белка Qβ обычно удаляется, как обнаружили авторы в результате N-концевого секвенирования по Эдману, как описано в Stoll, E. et al. J. Biol. Chem. 252: 990-993 (1977). VLP, состоящая из покрывающих белков Qβ, где удален N-концевой метионин, или VLP, содержащие смесь покрывающих белков Qβ, где N-концевой метионин либо отщеплен, либо присутствует, также входят в объем данного изобретения.When expressed in E. coli, the N-terminal methionine of the Qβ coat protein is usually removed as found by Edman N-terminal sequencing as described by Stoll, E. et al. J. Biol. Chem. 252: 990-993 (1977). VLPs consisting of Qβ coating proteins where the N-terminal methionine is removed, or VLPs containing a mixture of Qβ coating proteins, where the N-terminal methionine is either cleaved or present, are also within the scope of this invention.
Кроме того, также показано, что покрывающие белки РНК-фага подвергаются самосборке при экспрессии в бактериальном хозяине (Kastelein, RA. et al., Gene 23: 245-254 (1983), Kozlovskaya, TM. et al., Dokl. Akad. Nauk SSSR 287: 452-455 (1986), Adhin, MR. et al., Virology 170: 238-242 (1989), Ni, CZ., et al., Protein Sci. 5: 2485-2493 (1996), Priano, C. et al., J. Mol. Biol. 249: 283-297 (1995)). Капсид фага Qβ, кроме покрывающего белка, содержит так называемый полностью считываемый белок A1 и белок созревания A2. A1 образуется в результате супрессии в стоп-кодоне UGA и имеет длину 329 а/к. Капсид рекомбинантного покрывающего белка фага Qβ, используемый в данном изобретении, лишен белка лизиса A2 и содержит РНК из хозяина. Покрывающий белок РНК-фагов является РНК-связывающим белком и взаимодействует со стволовой петлей сайта связывания рибосомы гена репликазы, действуя в качестве репрессора трансляции в ходе жизненного цикла вируса. Последовательность и структурные элементы взаимодействия известны (Witherell, GW. and Uhlenbeck, OC. Biochemistry 28: 71-76 (1989); Lim F. et al., J. Biol. Chem. 271: 31839-31845 (1996)). Известно, что стволовая петля и РНК в общем вовлечены в сборку вируса (Golmohammadi, R. et al., Structure 4: 543-5554 (1996)).In addition, it has also been shown that RNA phage coat proteins self-assemble when expressed in a bacterial host (Kastelein, RA. Et al., Gene 23: 245-254 (1983), Kozlovskaya, TM. Et al., Dokl. Akad. Nauk SSSR 287: 452-455 (1986), Adhin, MR. Et al., Virology 170: 238-242 (1989), Ni, CZ., Et al., Protein Sci. 5: 2485-2493 (1996), Priano, C. et al., J. Mol. Biol. 249: 283-297 (1995)). The phage Qβ capsid, in addition to the covering protein, contains the so-called fully readable protein A1 and maturation protein A2. A1 is formed as a result of suppression in the UGA stop codon and has a length of 329 a / c. The capsid of the recombinant phage Qβ coat protein used in this invention lacks the A2 lysis protein and contains RNA from the host. The covering RNA phage protein is an RNA binding protein and interacts with the stem loop of the replicase gene ribosome binding site, acting as a translation repressor during the virus life cycle. The sequence and structural elements of the interaction are known (Witherell, GW. And Uhlenbeck, OC. Biochemistry 28: 71-76 (1989); Lim F. et al., J. Biol. Chem. 271: 31839-31845 (1996)). The stem loop and RNA are known to be generally involved in the assembly of the virus (Golmohammadi, R. et al., Structure 4: 543-5554 (1996)).
В следующем предпочтительном варианте данного изобретения вирусоподобная частица содержит или, альтернативно, по существу состоит или, альтернативно, состоит из рекомбинантных белков или их фрагментов РНК-фага, где рекомбинантные белки содержат, по существу состоят или, альтернативно, состоят из мутантных покрывающих белков РНК-фага, предпочтительно мутантных покрывающих белков РНК-фагов, указанных выше. В другом предпочтительном варианте мутантные покрывающие белки РНК-фага модифицированы удалением по меньшей мере одного остатка лизина путем замены или добавлением по меньшей мере одного остатка лизина путем замены; альтернативно мутантные покрывающие белки РНК-фага модифицированы делецией по меньшей мере одного остатка лизина или добавлением по меньшей мере одного остатка лизина посредством инсерции.In a further preferred embodiment of the invention, the virus-like particle contains or, alternatively, essentially consists of or, alternatively, consists of recombinant proteins or fragments of RNA phage, where the recombinant proteins contain, essentially consist or, alternatively, consist of mutant RNA-covering proteins phage, preferably mutant coat proteins of RNA phages mentioned above. In another preferred embodiment, the mutant RNA phage coat proteins are modified by removing at least one lysine residue by substitution or by adding at least one lysine residue by substitution; alternatively, mutant RNA phage coat proteins are modified by deletion of at least one lysine residue or addition of at least one lysine residue by insertion.
В другом предпочтительном варианте вирусоподобная частица содержит или, альтернативно, по существу состоит или, альтернативно, состоит из рекомбинантных белков или их фрагментов РНК-бактериофага Qβ, где рекомбинантные белки содержат или, альтернативно, по существу состоят, или, альтернативно, состоят из покрывающих белков, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10, или смеси покрывающих белков, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:11, или мутантов SEQ ID NO:11, и где N-концевой метионин предпочтительно отщеплен.In another preferred embodiment, the virus-like particle contains or, alternatively, essentially consists of or, alternatively, consists of recombinant proteins or fragments of RNA bacteriophage Qβ, where the recombinant proteins contain or, alternatively, essentially consist, or, alternatively, consist of covering proteins having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, or mixtures of coating proteins having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11, or mutants of SEQ ID NO: 11, and where the N-terminal methionine is preferably cleaved.
В следующем предпочтительном варианте данного изобретения вирусоподобная частица содержит, по существу состоит или, альтернативно, состоит из рекомбинантных белков Qβ или их фрагментов, где рекомбинантные белки содержат или альтернативно, по существу состоят или, альтернативно, состоят из мутантных покрывающих белков Qβ. В другом предпочтительном варианте указанные мутантные покрывающие белки модифицированы удалением по меньшей мере одного остатка лизина посредством замены или добавлением по меньшей мере одного остатка лизина посредством замены. Альтернативно указанные мутантные покрывающие белки модифицированы делецией по меньшей мере одного остатка лизина или добавлением по меньшей мере одного остатка лизина посредством инсерции.In a further preferred embodiment of the present invention, the virus-like particle contains essentially consists or alternatively consists of recombinant Qβ proteins or fragments thereof, where the recombinant proteins contain or alternatively essentially consist or, alternatively, consist of mutant Qβ coating proteins. In another preferred embodiment, said mutant coating proteins are modified by removing at least one lysine residue by substitution or by adding at least one lysine residue by substitution. Alternatively, said mutant coating proteins are modified by deletion of at least one lysine residue or by adding at least one lysine residue by insertion.
На поверхности капсида из покрывающего белка Qβ экспонированы четыре остатка лизина. Мутанты Qβ, для получения которых экспонированные остатки лизина заменяют аргининами, также могут быть использованы для данного изобретения. Таким образом, в практике изобретения могут быть использованы следующие мутанты покрывающего белка Qβ и мутантные VLP Qβ: «Qβ-240» (Lys13-Arg; SEQ ID NO:23), «Qβ-243» (Asn 10-Lys; SEQ ID NO:24), «Qβ-250» (Lys 2-Arg, Lys13-Arg; SEQ ID NO:25), «Qβ-251» (SEQ ID NO:26) и «Qβ-259» (Lys 2-Arg, Lys16-Arg; SEQ ID NO:27). Таким образом, в следующем предпочтительном варианте данного изобретения вирусоподобная частица содержит, по существу состоит или, альтернативно, состоит из рекомбинантных белков мутантных покрывающих белков Qβ, которые содержат белки, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из следующей группы: a) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:23; b) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:24; c) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:25; d) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:26; и e) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:27. Конструирование, экспрессия и очистка указанных выше покрывающих белков Qβ, VLP и капсидов из мутантных покрывающих белков Qβ, соответственно, описаны в находящейся на рассмотрении заявке на выдачу патента США № 10/050902, поданной настоящим правопреемником 18 января 2002. В частности, ссылка относится к примеру 18 указанной выше заявки.Four lysine residues are exposed on the surface of the capsid from the Qβ coating protein. Qβ mutants, for which exposed lysine residues are replaced with arginines, can also be used for this invention. Thus, the following Qβ coating protein mutants and Qβ mutant VLPs can be used in the practice of the invention: “Qβ-240” (Lys13-Arg; SEQ ID NO: 23), “Qβ-243” (Asn 10-Lys; SEQ ID NO : 24), Qβ-250 (Lys 2-Arg, Lys13-Arg; SEQ ID NO: 25), Qβ-251 (SEQ ID NO: 26) and Qβ-259 (Lys 2-Arg, Lys16-Arg; SEQ ID NO: 27). Thus, in a further preferred embodiment of the invention, the virus-like particle contains essentially consists or alternatively consists of recombinant proteins of mutant Qβ coating proteins, which contain proteins having an amino acid sequence selected from the following group: a) amino acid sequence of SEQ ID NO: 23; b) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24; c) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; d) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26; and e) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27. The construction, expression and purification of the aforementioned Qβ, VLP coating proteins and capsids from mutant Qβ coating proteins, respectively, are described in pending application for US patent No. 10/050902 filed by this assignee on January 18, 2002. In particular, the link refers to Example 18 of the above application.
В следующем предпочтительном варианте данного изобретения вирусоподобная частица содержит или, альтернативно, по существу состоит или, альтернативно, состоит из рекомбинантных белков Qβ или их фрагментов, где рекомбинантные белки содержат, по существу состоят или, альтернативно, состоят из смеси любого одного из вышеупомянутых мутантов Qβ и соответствующего белка A1.In a further preferred embodiment of the invention, the virus-like particle contains or, alternatively, essentially consists or alternatively consists of recombinant Qβ proteins or fragments thereof, where the recombinant proteins contain, essentially consist or, alternatively, consist of a mixture of any one of the above Qβ mutants and the corresponding protein A1.
В следующем предпочтительном варианте данного изобретения вирусоподобная частица содержит или, альтернативно, по существу состоит или, альтернативно, состоит из рекомбинантных белков РНК-фага AP205 или их фпагментов.In a further preferred embodiment of the present invention, the virus-like particle contains or, alternatively, essentially consists of or, alternatively, consists of recombinant proteins of the AP205 RNA phage or their phage.
Геном AP205 состоит из белка созревания, покрывающего белка, репликазы и двух открытых рамок считывания, не присутствующих в родственных фагах; гена лизиса и открытой рамки считывания, играющей роль в трансляции гена созревания (Klovins,J., et al., J. Gen. Virol. 83: 1523-33 (2002)). Покрывающий белок AP205 можно экспрессировать с плазмиды pAP283-58 (SEQ ID NO:111), которая является производной pQb10 (Kozlovska, T.M., et al., Gene 137: 133-37 (1993)) и которая содержит сайт связывания рибосомы AP205. Альтернативно покрывающий белок AP205 может быть клонирован в pQb185 ниже сайта связывания рибосомы, присутствующего в векторе. Оба способа приводят к экспрессии белка и образованию капсидов, как описано в одновременно находящейся на рассмотрении предварительной заявке на выдачу патента США № 60/396126, имеющей название «Молекулярные антигенные матрицы» и поданной настоящим правопреемником 17 июля 2002, которая включена в виде ссылки в полном объеме. Векторы pQb10 и pQb185 являются векторами, полученными из вектора pGEM, и экспрессия клонированных генов в указанных векторах контролируется промотором trp (Kozlovska, T.M., et al., Gene 137:133-37 (1993)). Плазмида pAP283-58 (SEQ ID NO:111) содержит предполагаемый сайт связывания рибосомы AP205 в следующей последовательности, которая расположена ниже сайта XbaI и непосредственно выше стартового кодона ATG покрывающего белка AP205: tctagaATTTTCTGCGCACCCATCCCGGGTGGCGCCCAAAGTGAGGAAAATCACatg (SEQ ID NO:115). Вектор pQb185 содержит последовательность Шайна-Далгарно ниже сайта XbaI и выше стартового кодона (tctagaTTAACCCAACGCGTAGGAGTCAGGCCatg (SEQ ID NO:116), последовательность Шайна-Далгарно подчеркнута).The AP205 genome consists of a maturation protein, a covering protein, a replicase, and two open reading frames not present in related phages; lysis gene and open reading frame, which plays a role in the translation of the maturation gene (Klovins, J., et al., J. Gen. Virol. 83: 1523-33 (2002)). The AP205 coating protein can be expressed from plasmid pAP283-58 (SEQ ID NO: 111), which is a derivative of pQb10 (Kozlovska, TM, et al., Gene 137: 133-37 (1993)) and which contains the AP205 ribosome binding site. Alternatively, the AP205 coat protein can be cloned into pQb185 below the ribosome binding site present in the vector. Both methods result in protein expression and capsid formation, as described in the pending application for the grant of US patent No. 60/396126, entitled "Molecular Antigenic Matrices" and filed by this assignee on July 17, 2002, which is incorporated by reference in full volume. The vectors pQb10 and pQb185 are vectors derived from the pGEM vector, and the expression of cloned genes in these vectors is controlled by the trp promoter (Kozlovska, TM, et al., Gene 137: 133-37 (1993)). Plasmid pAP283-58 (SEQ ID NO: 111) contains the putative AP205 ribosome binding site in the following sequence, which is located below the XbaI site and immediately above the ATG start codon of AP205 coat protein: tctagaATTTTCTGCGCACCCATCCCGGGTGGCGCCCAAAGT GAGGAg AQCat AATCat AATCat AATCat. Vector pQb185 contains the Shine-Dalgarno sequence below the XbaI site and above the start codon (tctagaTTAACCCAACGCGT AGGAG TCAGGCCatg (SEQ ID NO: 116), the Shine-Dalgarno sequence is underlined).
В следующем предпочтительном варианте данного изобретения вирусоподобная частица содержит или, альтернативно, по существу состоит или, альтернативно состоит из рекомбинантных покрывающих белков РНК-фага AP205 или их фрагментов.In a further preferred embodiment of the invention, the virus-like particle comprises or, alternatively, essentially consists of, or alternatively consists of recombinant AP205 RNA phage coat proteins or fragments thereof.
Таким образом, указанный предпочтительный вариант данного изобретения включает в себя покрывающие белки AP205, которые образуют капсиды. Такие белки экспрессируют рекомбинантно или получают из природных источников. Покрывающие белки AP205, продуцированные в бактериях, спонтанно образуют капсиды, что подтверждается электронной микроскопией (ЭМ) и иммунодиффузией. Структурные особенности капсида, образованного покрывающим белком AP205 (SEQ ID NO:112), и особенности капсида, образованного покрывающим белком РНК-фага AP205, почти не отличаются при наблюдении в ЭМ. VLP AP205 являются высокоиммуногенными и могут быть связаны с антигенами и/или антигенными детерминантами с образованием конструкций вакцин, экспонирующих антигены и/или антигенные детерминанты, ориентированные повторяющимся образом. Против экспонированных таким образом антигенов вырабатываются высокие титры антител, что свидетельствует о том, что связанные антигены и/или антигенные детерминанты доступны для взаимодействия с молекулами антител и являются иммуногенными.Thus, said preferred embodiment of the invention includes AP205 coat proteins that form capsids. Such proteins are expressed recombinantly or obtained from natural sources. The AP205 coating proteins produced in bacteria spontaneously form capsids, as evidenced by electron microscopy (EM) and immunodiffusion. The structural features of the capsid formed by the AP205 coat protein (SEQ ID NO: 112) and the features of the capsid formed by the AP205 RNA phage coat protein are almost identical when observed in EM. AP205 VLPs are highly immunogenic and can be associated with antigens and / or antigenic determinants to form vaccine constructs exposing antigens and / or antigenic determinants in a repetitive manner. High antibody titers are produced against antigens exposed in this way, which indicates that the associated antigens and / or antigenic determinants are available for interaction with antibody molecules and are immunogenic.
В следующем предпочтительном варианте данного изобретения вирусоподобная частица содержит или, альтернативно, по существу состоит, или, альтернативно, состоит из рекомбинантных мутантных покрывающих белков РНК-фага AP205 или их фрагментов.In a further preferred embodiment of the invention, the virus-like particle contains or, alternatively, essentially consists of, or, alternatively, consists of recombinant mutant coat proteins of RNA phage AP205 or fragments thereof.
Компетентные в отношении сборки мутантные формы VLP AP205, включая покрывающий белок AP205 с заменой пролина в положении аминокислоты 5 на треонин (SEQ ID NO:113), также можно использовать в практике изобретения, и они составляют следующий предпочтительный вариант изобретения. Указанные VLP, VLP AP205, полученные из природных источников, или вирусные частицы AP205 могут быть связаны с антигенами с образованием упорядоченных повторяющихся матриц антигенов согласно данному изобретению.Assembly-competent mutant forms of the VLP of AP205, including the AP205 coating protein with the substitution of proline at
Мутантный покрывающий белок P5-T AP205 может быть экспрессирован из плазмиды pAP281-32 (SEQ ID No. 114), которая получена непосредственно из pQb185 и которая содержит ген мутантного покрывающего белка AP205 вместо гена покрывающего белка Qβ. Векторы для экспрессии покрывающего белка AP205 трансфицировали в E. coli для экспрессии покрывающего белка AP205.The mutant P5-T AP205 coat protein can be expressed from plasmid pAP281-32 (SEQ ID No. 114), which is derived directly from pQb185 and which contains the AP205 mutant cover protein gene instead of the Qβ coat protein gene. Vectors for expression of the AP205 coat protein were transfected into E. coli to express the AP205 coat protein.
Способы экспрессии покрывающего белка и, соответственно, мутантного покрывающего белка, приводящей к самосборке в VLP, описаны в совместно рассматриваемой предварительной заявке на выдачу патента США, имеющей название «Молекулярные антигенные матрицы» и поданной настоящим правопреемником 17 июля 2002, которая включена в виде ссылки в полном объеме. Подходящие штаммы E. coli включают, но не ограничены указанным, E. coli K802, JM 109, RR1. Подходящие векторы и штаммы и их комбинации можно идентифицировать в результате тестирования экспрессии покрывающего белка и, соответственно, мутантного покрывающего белка с помощью SDS-ПААГ и образования и сборки капсида сначала с помощью необязательной очистки капсидов гель-фильтрацией и затем их тестированием в анализе иммунодиффузии (тест Оухтерлони) или с помощью электронной микроскопии (Kozlovska, T.M., et al., Gene 137:133-37 (1993)).Methods for expressing a coating protein and, correspondingly, a mutant coating protein leading to self-assembly in the VLP are described in the jointly pending provisional application for US patent, entitled "Molecular Antigenic Matrices" and filed by this assignee on July 17, 2002, which is incorporated by reference in full volume. Suitable strains of E. coli include, but are not limited to, E. coli K802,
Покрывающие белки AP205, экспрессированные с векторов pAP283-58 и pAP281-32, могут быть лишены начальной аминокислоты метионина вследствие процессинга в цитоплазме E. coli. Расщепленные, нерасщепленные формы VLP AP205 или их смеси являются следующими предпочтительными вариантами изобретения.The AP205 coating proteins expressed from the vectors pAP283-58 and pAP281-32 may be deprived of the initial amino acid methionine due to processing in the E. coli cytoplasm. Cleaved, unsplit forms of VLP AP205 or mixtures thereof are further preferred embodiments of the invention.
В следующем предпочтительном варианте данного изобретения вирусоподобная частица содержит или, альтернативно, по существу состоит или, альтернативно, состоит из смеси рекомбинантных покрывающих белков РНК-фага AP205 или их фрагментов и рекомбинантных мутантных покрывающих белков РНК-фага AP205 или их фрагментов.In a further preferred embodiment of the invention, the virus-like particle comprises or, alternatively, essentially consists of or alternatively consists of a mixture of recombinant AP205 RNA phage coat proteins or fragments thereof and AP205 RNA phage recombinant mutant coat proteins or fragments thereof.
В следующем предпочтительном варианте данного изобретения вирусоподобная частица содержит или, альтернативно, по существу состоит или, альтернативно, состоит из фрагментов рекомбинантных покрывающих белков или рекомбинантных мутантных покрывающих белков РНК-фага AP205.In a further preferred embodiment of the invention, the virus-like particle contains or, alternatively, essentially consists of or, alternatively, consists of fragments of recombinant coat proteins or recombinant mutant coat proteins of RNA phage AP205.
Фрагменты рекомбинантного покрывающего белка AP205, способные собираться в VLP и, соответственно, капсид, также применимы в практике изобретения. Указанные фрагменты можно образовать путем делеции либо внутри, либо на концах покрывающего белка и мутантного покрывающего белка, соответственно. Инсерции в последовательность покрывающего белка и мутантного покрывающего белка или слияния антигенных последовательностей с последовательностью покрывающего белка и мутантного покрывающего белка, которые совместимы со сборкой в VLP, являются следующими вариантами изобретения, которые приводят к химерным покрывающим белкам AP205 и частицам, соответственно. Последствия инсерций, делеций и слияний с последовательностью покрывающего белка, и то, совместимо ли это со сборкой в VLP, можно определить с помощью электронной микроскопии.Fragments of the recombinant coating protein AP205, capable of collecting in VLP and, accordingly, capsid, are also applicable in the practice of the invention. These fragments can be formed by deletion either internally or at the ends of the coating protein and mutant coating protein, respectively. Insertions into the sequence of a coating protein and a mutant coating protein, or fusion of antigenic sequences with a sequence of a coating protein and a mutant coating protein that are compatible with the assembly in the VLP, are further embodiments of the invention that result in AP205 chimeric coating proteins and particles, respectively. The effects of insertions, deletions and fusions with the sequence of the covering protein, and whether it is compatible with the assembly in VLP, can be determined using electron microscopy.
Частицы, образованные покрывающим белком, фрагментами покрывающего белка или химерными покрывающими белками AP205, описанными выше, можно выделить в чистой форме в результате комбинирования стадий фракционирования путем осаждения и стадий очистки гель-фильтрацией с использованием колонок, например, с сефарозой CL-4B, сефарозой CL-2B, сефарозой CL-6B и их комбинаций, как описано в совместно рассматриваемой предварительной заявке на выдачу патента США, имеющей название «Молекулярные антигенные матрицы» и поданной настоящим правопреемником 17 июля 2002, которая включена в виде ссылки в полном объеме. Другие способы выделения вирусоподобных частиц известны в данной области и могут быть использованы для выделения вирусоподобных частиц (VLP) бактериофага AP205. Например, применение ультрацентрифугирования для выделения VLP дрожжевого ретротранспозона Ty описано в патенте США № 4918166, который включен в данное описание в виде ссылки в полном объеме.Particles formed by a coating protein, coating protein fragments, or AP205 chimeric coating proteins described above can be isolated in pure form by combining the fractionation steps by precipitation and gel filtration purification steps using columns, for example, with Sepharose CL-4B, Sepharose CL -2B, Sepharose CL-6B and combinations thereof, as described in the jointly pending provisional application for a US patent, entitled "Molecular Antigenic Matrices" and filed by this assignee on Jul 17 I am 2002, which is incorporated by reference in its entirety. Other methods for isolating virus-like particles are known in the art and can be used to isolate virus-like particles (VLPs) of the bacteriophage AP205. For example, the use of ultracentrifugation to isolate the VLP of the yeast retrotransposon Ty is described in US Pat. No. 4,918,166, which is incorporated herein by reference in its entirety.
Определена кристаллическая структура нескольких РНК-бактериофагов (Golmohammadi, R. et al., Structure 4: 543-554 (1996)). Используя указанную информацию, можно идентифицировать экспонированные на поверхности остатки и, таким образом, покрывающие белки РНК-фага можно модифицировать так, чтобы один или несколько реакционно-способных аминокислотных остатков можно было встроить с помощью инсерции или замены. В итоге указанные модифицированные формы покрывающих белков бактериофага также можно использовать для данного изобретения. Таким образом, варианты белков, которые образуют капсиды или капсидоподобные структуры (например, покрывающие белки бактериофага Qβ, бактериофага R17, бактериофага fr, бактериофага GA, бактериофага SP и бактериофага MS2), также можно использовать для получения композиций согласно данному изобретению.The crystal structure of several RNA bacteriophages has been determined (Golmohammadi, R. et al., Structure 4: 543-554 (1996)). Using this information, residues exposed on the surface can be identified, and thus, the covering proteins of the RNA phage can be modified so that one or more reactive amino acid residues can be inserted by insertion or substitution. As a result, these modified forms of bacteriophage coating proteins can also be used for this invention. Thus, variants of the proteins that form capsids or capsid-like structures (e.g., covering proteins of the bacteriophage Qβ, bacteriophage R17, bacteriophage fr, bacteriophage GA, bacteriophage SP, and bacteriophage MS2) can also be used to prepare the compositions of this invention.
Хотя последовательность вариантов белков, обсуждаемых выше, будет отличаться от их аналогов дикого типа, указанные варианты белков, как правило, будут сохранять способность образовывать капсиды или капсидоподобные структуры. Таким образом, изобретение, кроме того, включает в себя композиции и, соответственно, композиции вакцин, которые, кроме того, содержат варианты белков, которые образуют капсиды или капсидоподобные структуры, а также способы получения таких композиций и, соответственно, композиций вакцин, отдельные субъединицы белка, используемые для получения таких композиций, и молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют указанные субъединицы белка. Таким образом, в объем изобретения включены вариантные формы белков дикого типа, которые образуют капсиды или капсидоподобные структуры и сохраняют способность вступать в ассоциацию и образовать капсиды или капсидоподобные структуры.Although the sequence of protein variants discussed above will differ from their wild-type counterparts, these protein variants will typically retain the ability to form capsids or capsid-like structures. Thus, the invention also includes compositions and, accordingly, vaccine compositions, which, in addition, contain variants of proteins that form capsids or capsid-like structures, as well as methods for producing such compositions and, accordingly, vaccine compositions, individual subunits the protein used to prepare such compositions; and nucleic acid molecules that encode the protein subunits. Thus, variant forms of wild-type proteins that form capsids or capsid-like structures and retain the ability to associate and form capsids or capsid-like structures are included within the scope of the invention.
В результате изобретение, кроме того, включает в себя композиции и, соответственно, композиции вакцин, содержащие белки, которые содержат или, альтернативно, по существу состоят или, альтернативно, состоят из аминокислотных последовательностей, которые по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 97% или 99% идентичны белкам дикого типа, которые образуют упорядоченные матрицы и, соответственно, матрицы, имеющие присущую им повторяющуюся структуру.As a result, the invention further includes vaccine compositions and, accordingly, vaccine compositions containing proteins that contain or, alternatively, essentially consist or, alternatively, consist of amino acid sequences that are at least 80%, 85%, 90%, 95%, 97% or 99% are identical to wild-type proteins, which form ordered matrices and, accordingly, matrices having their inherent repeating structure.
Кроме того, в объем изобретения включены молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют белки, используемые для получения композиций согласно данному изобретению.In addition, nucleic acid molecules that encode proteins used to prepare the compositions of this invention are included within the scope of the invention.
В других вариантах изобретение, кроме того, относится к композициям, содержащим белки, которые содержат или, альтернативно, по существу состоят или, альтернативно, состоят из аминокислотных последовательностей, которые по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 97% или 99% идентичны любой из аминокислотных последовательностей, показанных в SEQ ID NO:10-27.In other embodiments, the invention also relates to compositions containing proteins that contain or, alternatively, essentially consist or, alternatively, consist of amino acid sequences that are at least 80%, 85%, 90%, 95%, 97% or 99% are identical to any of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 10-27.
Белки, подходящие для применения в данном изобретении, также включают укороченные на C-конце мутанты белков, которые образуют капсиды или капсидоподобные структуры или VLP. Конкретные примеры таких укороченных мутантов включают белки, имеющие аминокислотную последовательность, показанную в любой из SEQ ID NO:10-27, где 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15 или 17 аминокислот были удалены из C-конца. Как правило, указанные укороченные на C-конце мутанты будут сохранять способность образовывать капсиды или капсидоподобные структуры.Proteins suitable for use in this invention also include C-terminus-shortened protein mutants that form capsids or capsid-like structures or VLPs. Specific examples of such truncated mutants include proteins having the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 10-27, where 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15, or 17 amino acids have been removed from C- the end. Typically, these shortened mutants at the C-terminus will retain the ability to form capsids or capsid-like structures.
Следующие белки, подходящие для применения в данном изобретении, также включают укороченные на N-конце мутанты белков, которые образуют капсиды или капсидоподобные структуры. Конкретные примеры таких укороченных мутантов включают белки, имеющие аминокислотную последовательность, показанную в любой из SEQ ID NO:10-27, где 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15 или 17 аминокислот были удалены из N-конца. Как правило, указанные укороченные на N-конце мутанты будут сохранять способность образовывать капсиды или капсидоподобные структуры.The following proteins suitable for use in this invention also include N-terminally shortened protein mutants that form capsids or capsid-like structures. Specific examples of such truncated mutants include proteins having the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 10-27, where 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15, or 17 amino acids have been removed from N- the end. Typically, these N-terminally shortened mutants will retain the ability to form capsids or capsid-like structures.
Дополнительные белки, подходящие для применения в данном изобретении, включают укороченные на N- и C-конце мутанты, которые образуют капсиды или капсидоподобные структуры. Подходящие укороченные мутанты включают белки, имеющие аминокислотную последовательность, показанную в любой из SEQ ID NO:10-27, где 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15 или 17 аминокислот были удалены из N-конца и 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15 или 17 аминокислот были удалены с C-конца. Как правило, указанные укороченные на N-конце и на C-конце мутанты будут сохранять способность образовывать капсиды или капсидоподобные структуры.Additional proteins suitable for use in this invention include N- and C-terminus-truncated mutants that form capsids or capsid-like structures. Suitable truncated mutants include proteins having the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 10-27, where 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15, or 17 amino acids have been removed from the N-terminus and 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15, or 17 amino acids were removed from the C-terminus. Typically, these mutants shortened at the N-terminus and C-terminus will retain the ability to form capsids or capsid-like structures.
Изобретение, кроме того, относится к композициям, содержащим белки, которые содержат или, альтернативно, по существу состоят или, альтернативно, состоят из аминокислотных последовательностей, которые по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 97% или 99% идентичны описанным выше укороченным мутантам.The invention also relates to compositions containing proteins that contain or, alternatively, essentially consist or, alternatively, consist of amino acid sequences that are at least 80%, 85%, 90%, 95%, 97% or 99% are identical to the shortened mutants described above.
Таким образом, изобретение относится к композициям и композициям вакцин, полученным из белков, которые образуют капсиды или VLP, способам получения указанных композиций из отдельных белковых субъединиц и VLP или капсидов, способам получения указанных отдельных белковых субъединиц, молекул нуклеиновой кислоты, которые кодируют указанные субъединицы, и способам вакцинации и/или способам, вызывающим иммунологические ответы у индивидуумов, с использованием указанных композиций согласно данному изобретению.Thus, the invention relates to vaccine compositions and compositions obtained from proteins that form capsids or VLPs, methods for producing said compositions from individual protein subunits and VLPs or capsids, methods for producing said individual protein subunits, nucleic acid molecules that encode said subunits, and vaccination methods and / or methods that elicit immunological responses in individuals using the compositions of this invention.
Как указано ранее, изобретение включает в себя вирусоподобные частицы или их рекомбинантные формы. В одном предпочтительном варианте частицы, используемые в композициях согласно изобретению, состоят из корового белка гепатита B (HBcAg) или фрагмента HBcAg. В следующем варианте частицы, используемые в композициях согласно изобретению, состоят из корового белка гепатита B (HBcAg) или фрагмента белка HBcAg, который был модифицирован, с тем, чтобы либо удалить, либо уменьшить количество свободных остатков цистеина. Zhou et al. (J. Virol. 66: 5393-5398 (1992)) показали, что HBcAg, которые были модифицированы, с тем, чтобы удалить имеющиеся в природных условиях остатки цистеина, сохраняют способность вступать в ассоциацию и образовывать капсиды. Таким образом, VLP, подходящие для применения в композициях согласно изобретению, включают в себя VLP, содержащие модифицированные HBcAg или их фрагменты, в которых один или несколько имеющихся в природных условиях остатков цистеина были либо делетированы, либо заменены другим аминокислотным остатком (например, остатком серина).As indicated previously, the invention includes virus-like particles or their recombinant forms. In one preferred embodiment, the particles used in the compositions of the invention are comprised of hepatitis B core protein (HBcAg) or an HBcAg fragment. In a further embodiment, the particles used in the compositions of the invention are comprised of hepatitis B core protein (HBcAg) or an HBcAg protein fragment that has been modified to either remove or reduce the amount of free cysteine residues. Zhou et al. (J. Virol. 66: 5393-5398 (1992)) showed that HBcAg, which were modified in order to remove naturally occurring cysteine residues, retain the ability to associate and form capsids. Thus, VLPs suitable for use in the compositions of the invention include VLPs containing modified HBcAg or fragments thereof in which one or more naturally occurring cysteine residues have been either deleted or replaced with another amino acid residue (e.g., a serine residue )
HBcAg является белком, образуемым в результате процессинга белка-предшественника корового антигена гепатита B. Идентифицирован ряд изотипов HBcAg, и их аминокислотные последовательности легко доступны специалистам в данной области. В большинстве случаев композиции и, соответственно, композиции вакцин согласно изобретению могут быть получены с использованием процессированной формы HBcAg (т.е. HBcAg, из которого была удалена N-концевая лидерная последовательность белка-предшественника корового антигена гепатита B).HBcAg is a protein formed by processing the hepatitis B core antigen precursor protein. A number of HBcAg isotypes have been identified and their amino acid sequences are readily available to those skilled in the art. In most cases, the compositions and, accordingly, the vaccine compositions of the invention can be prepared using a processed form of HBcAg (i.e., HBcAg from which the N-terminal leader sequence of the hepatitis B core antigen precursor protein has been removed).
Кроме того, когда HBcAg будут получать в условиях, при которых процессинг не будет происходить, HBcAg, как правило, будет экспрессироваться в «процессированной» форме. Например, когда для получения HBcAg согласно изобретению будет использоваться система экспрессии E. coli, направляющая экспрессию белка в цитоплазме, указанные белки, как правило, будут экспрессироваться так, чтобы в них отсутствовала N-концевая лидерная последовательность белка-предшественника корового антигена гепатита B.In addition, when HBcAg will be obtained under conditions under which processing will not occur, HBcAg will typically be expressed in “processed” form. For example, when an E. coli expression system directing protein expression in the cytoplasm is used to produce the HBcAg according to the invention, these proteins will typically be expressed so that they lack the N-terminal leader sequence of the hepatitis B core antigen precursor protein.
Получение вирусоподобных частиц гепатита B, которые можно использовать для данного изобретения, описано, например, в WO 00/32227 и в указанной заявке, в частности, в примерах с 17 по 19 и с 21 по 24, а также в WO 01/85208 и в ней, в частности, в примерах с 17 по 19, с 21 по 24, с 31 по 41, и в находящейся на рассмотрении заявке на выдачу патента США № 10/050902, поданной настоящим правопреемником 18 января 2002. В случае последней заявки это, в частности, относится к примеру 23, 24, 31 и 51. Все три документа включены в данное описание в виде ссылки в полном объеме.The preparation of hepatitis B virus-like particles that can be used for this invention is described, for example, in WO 00/32227 and in said application, in particular in Examples 17 to 19 and from 21 to 24, as well as in WO 01/85208 and in it, in particular, in examples 17 to 19, 21 to 24, 31 to 41, and in pending application for the grant of US patent No. 10/050902, filed by this assignee on January 18, 2002. In the case of the last application, this in particular, refers to example 23, 24, 31 and 51. All three documents are incorporated into this description by reference in full.
Данное изобретение также включает в себя варианты HBcAg, которые были модифицированы, чтобы делетировать или заменить один или несколько дополнительных остатков цистеина. В данной области известно, что свободные остатки цистеина могут быть вовлечены в ряд побочных химических реакций. Указанные побочные реакции включают в себя дисульфидные обмены, реакцию с химическими веществами или метаболитами, которые, например, инъецированы или образованы при комбинированной терапии с другими веществами, или прямое окисление и реакцию с нуклеотидами при воздействии УФ-света. Таким образом, могут быть образованы токсичные аддукты, особенно если учесть тот факт, что HBcAg имеют устойчивую тенденцию к связыванию нуклеиновых кислот. Таким образом, токсичные аддукты могут быть представлены множеством видов, каждый из которых отдельно может присутствовать в низкой концентрации, но вместе они достигают токсичных уровней.The invention also includes HBcAg variants that have been modified to remove or replace one or more additional cysteine residues. It is known in the art that free cysteine residues may be involved in a number of adverse chemical reactions. These adverse reactions include disulfide exchanges, reactions with chemicals or metabolites, which, for example, are injected or formed during combination therapy with other substances, or direct oxidation and reaction with nucleotides when exposed to UV light. Thus, toxic adducts can be formed, especially considering the fact that HBcAg have a steady tendency to nucleic acid binding. Thus, toxic adducts can be represented by many species, each of which may separately be present in low concentrations, but together they reach toxic levels.
С точки зрения указанного выше, одним их преимуществ применения в композициях вакцин HBcAg, которые были модифицированы, чтобы удалить имеющиеся в природных условиях остатки цистеина, является то, что количество сайтов, с которыми могут связываться токсичные элементы в том случае, когда связаны антигены или антигенные детерминанты, может быть уменьшено, или они могут быть вообще удалены.From the point of view of the above, one of the advantages of using HBcAg vaccines in compositions that have been modified to remove naturally occurring cysteine residues is that the number of sites to which toxic elements can bind when antigens or antigenic determinants may be reduced, or they may be removed altogether.
Идентифицирован ряд вариантов HBcAg природного происхождения, подходящих для применения в практике данного изобретения. Yuan et al., (J. Virol. 73: 10122-10128 (1999)), например, описывают варианты, в которых остаток изолейцина в положении, соответствующем положению 97 в SEQ ID NO:28, заменен либо остатком лейцина, либо остатков фенилаланина. Аминокислотные последовательности ряда вариантов HBcAg, а также нескольких вариантов предшественника корового антигена гепатита B описаны в GenBank, запись AAF121240 (SEQ ID NO:29), AF121239 (SEQ ID NO:30), X85297 (SEQ ID NO:31), X02496 (SEQ ID NO:32), X85305 (SEQ ID NO:33), X85303 (SEQ ID NO:34), AF151735 (SEQ ID NO:35), X85259 (SEQ ID NO:36), X85286 (SEQ ID NO:37), X85260 (SEQ ID NO:38), X85317 (SEQ ID NO:39), X85298 (SEQ ID NO:40), AF043593 (SEQ ID NO:41), M20706 (SEQ ID NO:42), X85295 (SEQ ID NO:43), X80925 (SEQ ID NO:44), X85284 (SEQ ID NO:45), X85275 (SEQ ID NO:46), X72702 (SEQ ID NO:47), X85291 (SEQ ID NO:48), X65258 (SEQ ID NO:49), X85302 (SEQ ID NO:50), M32138 (SEQ ID NO:51), X85293 (SEQ ID NO:52), X85315 (SEQ ID NO:53), U95551 (SEQ ID NO:54), X85256 (SEQ ID NO:55), X85316 (SEQ ID NO:56), X85296 (SEQ ID NO:57), AB033559 (SEQ ID NO:58), X59795 (SEQ ID NO:59), X85299 (SEQ ID NO:60), X85307 (SEQ ID NO:61), X65257 (SEQ ID NO:62), X85311 (SEQ ID NO:63), X85301 (SEQ ID NO:64), X85314 (SEQ ID NO:65), X85287 (SEQ ID NO:66), X85272 (SEQ ID NO:67), X85319 (SEQ ID NO:68), AB010289 (SEQ ID NO:69), X85285 (SEQ ID NO:70), AB010289 (SEQ ID NO:71), AF121242 (SEQ ID NO:72), M90520 (SEQ ID NO:73), P03153 (SEQ ID NO:74), AF110999 (SEQ ID NO:75) и M95589 (SEQ ID NO:76), описания каждой из которых включены в данную заявку в виде ссылки. Указанные варианты HBcAg отличаются по аминокислотной последовательности в ряде положений, включая аминокислотные остатки, которые соответствуют аминокислотным остаткам, распложенным в положениях 12, 13, 21, 22, 24, 29, 32, 33, 35, 38, 40, 42, 44, 45, 49, 51, 57, 58, 59, 64, 66, 67, 69, 74, 77, 80, 81, 87, 92, 93, 97, 98, 100, 103, 105, 106, 109, 113, 116, 121, 126, 130, 133, 135, 141, 147, 149, 157, 176, 178, 182 и 183 в SEQ ID NO:77. Следующие варианты HBcAg, подходящие для применения в композициях согласно изобретению и которые могут быть дополнительно модифицированы согласно изложенному в данном описании, описаны в WO 01/98333, WO 01/77158 и WO 02/14478.A number of naturally occurring HBcAg variants have been identified that are suitable for use in the practice of this invention. Yuan et al., (J. Virol. 73: 10122-10128 (1999)), for example, describe variants in which the isoleucine residue at the position corresponding to position 97 in SEQ ID NO: 28 is replaced with either a leucine residue or phenylalanine residues . The amino acid sequences of a number of HBcAg variants as well as several variants of the hepatitis B core antigen precursor are described in GenBank, entry AAF121240 (SEQ ID NO: 29), AF121239 (SEQ ID NO: 30), X85297 (SEQ ID NO: 31), X02496 (SEQ ID NO: 32), X85305 (SEQ ID NO: 33), X85303 (SEQ ID NO: 34), AF151735 (SEQ ID NO: 35), X85259 (SEQ ID NO: 36), X85286 (SEQ ID NO: 37) , X85260 (SEQ ID NO: 38), X85317 (SEQ ID NO: 39), X85298 (SEQ ID NO: 40), AF043593 (SEQ ID NO: 41), M20706 (SEQ ID NO: 42), X85295 (SEQ ID NO: 43), X80925 (SEQ ID NO: 44), X85284 (SEQ ID NO: 45), X85275 (SEQ ID NO: 46), X72702 (SEQ ID NO: 47), X85291 (SEQ ID NO: 48), X65258 (SEQ ID NO: 49), X85302 (SEQ ID NO: 50), M32138 (SEQ ID NO: 51), X85293 (SEQ ID NO: 52), X85315 (SEQ ID NO: 53), U95551 (SEQ ID NO : 54), X85256 (SEQ ID NO: 55), X85316 (SEQ ID NO: 56), X85296 (SEQ ID NO: 57), AB033559 (SEQ ID NO: 58), X59795 (SEQ ID NO: 59 ), X85299 (SEQ ID NO: 60), X85307 (SEQ ID NO: 61), X65257 (SEQ ID NO: 62), X85311 (SEQ ID NO: 63), X85301 (SEQ ID NO: 64), X85314 (SEQ ID NO: 65), X85287 (SEQ ID NO: 66), X85272 (SEQ ID NO: 67), X85319 (SEQ ID NO: 68), AB010289 (SEQ ID NO: 69), X85285 (SEQ ID NO: 70) , AB010289 (SEQ ID NO: 71), AF121242 (SEQ ID NO: 72), M90520 (SEQ ID NO: 73), P03153 (SEQ ID NO: 74), AF110999 (SEQ ID NO: 75) and M95589 (SEQ ID NO: 76), descriptions of each of which are incorporated herein by reference. These HBcAg variants differ in amino acid sequence in a number of positions, including amino acid residues that correspond to amino acid residues located at
Как указано выше, как правило, в композициях и, соответственно, композициях вакцин согласно изобретению будут использованы процессированные HBcAg (т.е. те, в которых отсутствуют лидерные последовательности). Данное изобретение включает в себя композиции вакцин, а также способы применения таких композиций, в которых используются описанные выше варианты HBcAg.As indicated above, as a rule, processed HBcAg (i.e., those in which there are no leader sequences) will be used in the compositions and, accordingly, the vaccine compositions of the invention. The present invention includes vaccine compositions as well as methods of using such compositions that use the HBcAg variants described above.
Имеет ли аминокислотная последовательность полипептида аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 97% или 99% идентична одной из указанных выше аминокислотных последовательностей дикого типа или ее части, можно определить стандартным способом с использованием известных компьютерных программ, таких как программа Bestfit. При использовании Bestfit или любой другой программы выравнивания последовательностей для того, чтобы определить, идентична ли конкретная последовательность, например, на 95% эталонной аминокислотной последовательности, параметры устанавливают так, чтобы процент идентичности рассчитывался по всей полной длине эталонной аминокислотной последовательности и чтобы были разрешены пробелы в гомологии до 5% от общего количества аминокислотных остатков в эталонной последовательности.Whether the amino acid sequence of the polypeptide has an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 97% or 99% identical to one of the above wild-type amino acid sequences or part thereof, can be determined by a standard method using known computer programs such as Bestfit. When using Bestfit or any other sequence alignment program to determine if a particular sequence is identical, for example, to 95% of the reference amino acid sequence, the parameters are set so that the percentage of identity is calculated over the entire full length of the reference amino acid sequence and that spaces are allowed in homology to 5% of the total number of amino acid residues in the reference sequence.
Варианты и предшественники HBcAg, имеющие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO:29-72 и 73-76, относительно сходны друг с другом. Таким образом, ссылка на аминокислотный остаток варианта HBcAg, расположенный в положении, которое соответствует конкретному положению в SEQ ID NO:77, относится к аминокислотному остатку, который присутствует в данном положении в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:77. Гомология между указанными вариантами HBcAg среди вирусов гепатита B, которые инфицируют млекопитающих, в большинстве случаев достаточно высока, так что специалист в данной области не будет иметь больших трудностей при просмотре обеих последовательностей, аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:77, и аминокислотной последовательности конкретного варианта HBcAg, и при идентификации «соответствующих» аминокислотных остатков. Кроме того, аминокислотная последовательность HBcAg, показанная в SEQ ID NO:73, в которой представлена аминокислотная последовательность HBcAg, полученного из вируса, который инфицирует лесных сурков, имеет достаточно высокую гомологию с HBcAg, имеющим аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:77, так что легко увидеть, что инсерция из трех аминокислотных остатков присутствует в SEQ ID NO:64 между остатками аминокислот 155 и 156 SEQ ID NO:77.HBcAg variants and precursors having the amino acid sequences indicated in SEQ ID NOs: 29-72 and 73-76 are relatively similar to each other. Thus, a reference to the amino acid residue of an HBcAg variant located at a position that corresponds to a particular position in SEQ ID NO: 77 refers to the amino acid residue that is present at that position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 77. The homology between these HBcAg variants among the hepatitis B viruses that infect mammals is in most cases quite high, so that a person skilled in the art will not have great difficulty viewing both sequences, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 77, and the amino acid sequence a specific variant of HBcAg, and in the identification of “relevant” amino acid residues. In addition, the amino acid sequence of HBcAg shown in SEQ ID NO: 73, which shows the amino acid sequence of HBcAg derived from a virus that infects woodchucks, has a fairly high homology with HBcAg having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 77, so it is easy to see that an insertion of three amino acid residues is present in SEQ ID NO: 64 between
Изобретение также включает в себя композиции вакцин, которые содержат варианты HBcAg вирусов гепатита B, которые инфицируют птиц, а также композиции вакцин, которые содержат фрагменты указанных вариантов HBcAg. В случае указанных вариантов HBcAg один, два, три или более остатков цистеина, присутствующих в указанных полипептидах в природных условиях, могут быть либо заменены другим аминокислотным остатком, либо делетированы перед их включением в композиции вакцин согласно изобретению.The invention also includes vaccine compositions that contain HBcAg variants of hepatitis B viruses that infect birds, as well as vaccine compositions that contain fragments of these HBcAg variants. In the case of these HBcAg variants, one, two, three or more cysteine residues present in the indicated polypeptides under natural conditions can either be replaced with another amino acid residue or deleted before being included in the vaccine compositions of the invention.
Как обсуждается выше, удаление свободных остатков цистеина уменьшает количество сайтов, в которых токсичные компоненты могут связываться с HBcAg, а также удаляет сайты, в которых может происходить перекрестное связывание остатков лизина и цистеина одной и той же или соседних молекул HBcAg. Таким образом, в другом варианте данного изобретения один или несколько остатков цистеина белка капсида вируса гепатита B либо делетированы, либо заменены другим аминокислотным остатком.As discussed above, the removal of free cysteine residues reduces the number of sites where toxic components can bind to HBcAg, and also removes sites where cross-linking of lysine and cysteine residues of the same or neighboring HBcAg molecules can occur. Thus, in another embodiment of the invention, one or more cysteine residues of the hepatitis B virus capsid protein is either deleted or replaced with another amino acid residue.
В других вариантах композиции и, соответственно, композиции вакцин согласно изобретению будут содержать HBcAg, из которых была удалена C-концевая область (например, аминокислотные остатки 145-185 или 150-185 SEQ ID NO:77). Таким образом, дополнительные модифицированные HBcAg, подходящие для применения в практике данного изобретения, включают укороченные на C-конце мутанты. Подходящие укороченные мутанты включают HBcAg, в которых 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 34, 35 аминокислот были удалены из C-конца.In other embodiments, the compositions and, accordingly, the vaccine compositions of the invention will contain HBcAg from which the C-terminal region has been removed (e.g., amino acid residues 145-185 or 150-185 of SEQ ID NO: 77). Thus, further modified HBcAg suitable for use in the practice of the present invention include C-terminated shortened mutants. Suitable truncated mutants include HBcAg in which 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 34, 35 amino acids have been removed from the C-terminus.
HBcAg, подходящие для применения в практике данного изобретения, также включают укороченные на N-конце мутанты. Подходящие укороченные мутанты включают модифицированные HBcAg, в которых 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15 или 17 аминокислот были удалены из N-конца.HBcAg suitable for use in the practice of this invention also include N-terminally shortened mutants. Suitable truncated mutants include modified HBcAg in which 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15, or 17 amino acids have been removed from the N-terminus.
Следующие HBcAg, подходящие для применения в практике данного изобретения, включают укороченные на N- и C-концах мутанты. Подходящие укороченные мутанты включают HBcAg, в которых 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15 и 17 аминокислот были удалены из N-конца и 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 34, 35 аминокислот были удалены из C-конца.The following HBcAg suitable for use in the practice of this invention include shortened at the N - and C-ends of the mutants. Suitable truncated mutants include HBcAg in which 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15, and 17 amino acids have been removed from the N-terminus and 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 34 , 35 amino acids were deleted from the C-terminus.
Изобретение, кроме того, включает в себя композиции и, соответственно, композиции вакцин, содержащие полипептиды HBcAg, содержащие или, альтернативно, по существу состоящие или, альтернативно, состоящие из аминокислотных последовательностей, которые по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 97% или 99% идентичны описанным выше укороченным мутантам.The invention also includes vaccine compositions and, accordingly, vaccine compositions containing HBcAg polypeptides containing or, alternatively, essentially consisting of, or, alternatively, consisting of amino acid sequences that are at least 80%, 85%, 90% , 95%, 97% or 99% are identical to the shortened mutants described above.
В некоторых вариантах согласно изобретению в полипептид HBcAg вводят остаток лизина, чтобы опосредовать связывание белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL с VLP HBcAg. В предпочтительных вариантах композиции согласно изобретению получают с использованием HBcAg, содержащего или, альтернативно, состоящего из аминокислот 1-144 или 1-149, 1-185 SEQ ID NO:77, который модифицирован так, чтобы аминокислоты, соответствующие положениям 79 и 80 были заменены пептидом, имеющим аминокислотную последовательность Gly-Gly-Lys-Gly-Gly (SEQ ID NO:117; SEQ ID NO:78). В следующих предпочтительных вариантах остатки цистеина в положениях 48 и 107 SEQ ID NO:77 мутированы в серин. Изобретение, кроме того, включает в себя композиции, содержащие соответствующие полипептиды, имеющие аминокислотные последовательности, показанные в любой из SEQ ID NO:29-74, которые также имеют указанные выше изменения аминокислот. Кроме того, в объем изобретения включены дополнительные варианты HBcAg, которые способны ассоциировать с образованием капсида или VLP и имеют указанные выше изменения аминокислот. Таким образом, изобретение, кроме того, включает в себя композиции и, соответственно, композиции вакцин, содержащие полипептиды HBcAg, которые содержат или, альтернативно, состоят из аминокислотных последовательностей, которые по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 97% или 99% идентичны любой из аминокислотных последовательностей дикого типа, и формы указанных белков, которые были процессированы в подходящих для этого случаях, чтобы удалить N-концевую лидерную последовательность, и модифицированы указанными выше изменениями.In some embodiments of the invention, a lysine residue is introduced into the HBcAg polypeptide to mediate the binding of the RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide to the HBLAg VLP. In preferred embodiments, the compositions of the invention are prepared using HBcAg containing or alternatively consisting of amino acids 1-144 or 1-149, 1-185 of SEQ ID NO: 77, which is modified so that the amino acids corresponding to
Композиции или композиции вакцин согласно изобретению могут содержать смеси различных HBcAg. Таким образом, указанные композиции вакцин могут состоять из HBcAg, которые отличаются по аминокислотной последовательности. Например, могут быть получены композиции вакцин, содержащие HBcAg «дикого типа» и модифицированный HBcAg, в котором один или несколько аминокислотных остатков были изменены (например, делетированы, встроены или заменены). Кроме того, предпочтительными композициями вакцин согласно изобретению являются композиции, которые представляют собой высокоупорядоченную и повторяющуюся антигенную матрицу, в которой антигеном является белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL.Compositions or vaccine compositions according to the invention may contain mixtures of different HBcAg. Thus, these vaccine compositions may consist of HBcAg, which differ in amino acid sequence. For example, vaccine compositions containing wild-type HBcAg and modified HBcAg can be prepared in which one or more amino acid residues have been altered (eg, deleted, inserted, or replaced). In addition, preferred vaccine compositions according to the invention are compositions that are a highly ordered and repeating antigenic matrix in which the antigen is a RANKL protein, a RANKL fragment or a RANKL peptide.
В следующем предпочтительном варианте данного изобретения по меньшей мере один белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL связан с указанной центральной частицей и, соответственно, вирусоподобной частицей по меньшей мере одной ковалентной связью. Предпочтительно по меньшей мере один белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL связан с центральной частицей и, соответственно, с вирусоподобной частицей по меньшей мере одной ковалентной связью, при этом указанная ковалентная связь является непептидной связью, что приводит к образованию упорядоченной и повторяющейся матрицы центральная частица-RANKL и, соответственно, RANKL-VLP-матрицы или -конъюгата. Данная матрица или, соответственно, конъюгат RANKL-VLP обычно и предпочтительно имеет повторяющуюся и упорядоченную структуру, так как по меньшей мере один, но обычно несколько белков RANKL, фрагментов RANKL или пептидов RANKL связаны с VLP ориентированным образом. Предпочтительно более 10, 20, 40, 80, 120 белков RANKL, фрагментов RANKL или пептидов RANKL связаны с VLP. Образование повторяющейся и упорядоченной RANKL-VLP-матрицы и, соответственно, конъюгата, обеспечивается ориентированным и направленным, а также определенным связыванием и, соответственно, присоединением по меньшей мере одного белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL к VLP, как будет понятно из нижеследующего. Кроме того, обычная присущая высокоповторяющаяся и организованная структура VLP преимущественно вносит вклад в экспонирование белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL высокоупорядоченным и повторяющимся образом, приводя к образованию высокоорганизованной и повторяющейся RANKL-VLP-матрицы и, соответственно, RANKL-VLP-конъюгата.In a further preferred embodiment of the present invention, at least one RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide is bound to said central particle and, accordingly, a virus-like particle of at least one covalent bond. Preferably, at least one RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide is bound to a central particle and, accordingly, to a virus-like particle of at least one covalent bond, said covalent bond being a non-peptide bond, which leads to the formation of an ordered and repeating central particle matrix -RANKL and, accordingly, RANKL-VLP-matrix or-conjugate. This matrix or, accordingly, the RANKL-VLP conjugate usually and preferably has a repeating and ordered structure, since at least one, but usually several RANKL proteins, RANKL fragments or RANKL peptides are oriented in a oriented manner with VLP. Preferably, more than 10, 20, 40, 80, 120 RANKL proteins, RANKL fragments, or RANKL peptides are associated with VLP. The formation of a repeating and ordered RANKL-VLP matrix and, accordingly, the conjugate is provided by oriented and directed, as well as certain binding and, accordingly, the attachment of at least one RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide to VLP, as will be understood from the following. In addition, the usual inherent highly repeatable and organized VLP structure predominantly contributes to the exposure of the RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide in a highly ordered and repetitive manner, resulting in the formation of a highly organized and repeating RANKL-VLP matrix and, accordingly, RANKL-VLP conjugate.
Таким образом, предпочтительные конъюгаты и, соответственно, матрицы согласно изобретению отличаются от конъюгатов предшествующего уровня техники своей высокоорганизованной структурой, размерами и повторяемостью антигена на поверхности матрицы. Предпочтительный вариант данного изобретения, кроме того, позволяет осуществлять экспрессию как частицы, так и антигена в экспрессирующем хозяине, обеспечивая правильную упаковку антигена, т.е. по меньшей мере одного белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL и правильную упаковку и сборку VLP.Thus, preferred conjugates and, accordingly, matrices according to the invention differ from prior art conjugates in their highly organized structure, size and repeatability of the antigen on the matrix surface. A preferred embodiment of the invention furthermore allows the expression of both the particle and the antigen in the expression host, ensuring proper packaging of the antigen, i.e. at least one RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide and proper packaging and assembly of the VLP.
В данном изобретении заявлены способы связывания белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL с центральными частицами и, соответственно, с VLP. Как указано в одном аспекте данного изобретения белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL связан с центральной частицей и, соответственно, с VLP с помощью химического перекрестного связывания обычно и предпочтительно с использованием гетеробифункционального перекрестно сшивающего агента. В данной области известно несколько гетеробифункциональных перекрестно сшивающих агентов. В предпочтительных вариантах гетеробифункциональный перекрестно сшивающий агент содержит функциональную группу, которая может взаимодействовать с предпочтительными первыми сайтами связывания, т.е. с аминогруппой боковой цепи остатков лизина центральной частицы и VLP или по меньшей мере одной субъединицы VLP, соответственно, и дополнительную функциональную группу, которая может взаимодействовать с предпочтительным вторым сайтом связывания, т.е. остатком цистеина, имеющимся в природных условиях, который сделан доступным для реакции посредством восстановления, или сконструированным на белке RANKL, фрагменте RANKL или пептиде RANKL и необязательно также сделанным доступным для реакции посредством восстановления. Первая стадия способа, обычно называемая дериватизацией, представляет собой взаимодействие центральной частицы или VLP с перекрестно сшивающим агентом. Продуктом данной реакции является активированная центральная частица или активированная VLP, также называемая активированным носителем. На второй стадии непрореагировавший перекрестно сшивающий агент удаляют, используя обычные способы, такие как гель-фильтрация или диализ. На третьей стадии осуществляют взаимодействие белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL с активированным носителем и данную стадию обычно называют стадией связывания. Непрореагировавший белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL необязательно можно удалить на четвертой стадии, например, диализом. В данной области известно несколько гетеробифункциональных перекрестно сшивающих агентов. Указанные агенты включают предпочтительные перекрестно сшивающие агенты SMPH (Pierce), сульфо-MBS, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMPB, сульфо-SMCC, SVSB, SIA и другие перекрестно сшивающие агенты, доступные, например, из Pierce Chemical Company (Rockford, IL, USA) и имеющие одну функциональную группу, реакционно-способную по отношению к аминогруппам, и одну функциональную группу, реакционно-способную по отношению к остаткам цистеина. Все указанные выше перекрестно сшивающие агенты приводят к образованию тиоэфирной связи. Другой класс перекрестно сшивающих агентов, подходящих для практики изобретения, характеризуется введением дисульфидной связи между белком RANKL, фрагментом RANKL или пептидом RANKL и центральной частицей или VLP при связывании. Предпочтительные перекрестно сшивающие агенты, относящиеся к данному классу, включают, например, SPDP и сульфо-LC-SPDP (Pierce). На степень дериватизации центральной частицы и, соответственно, VLP перекрестно сшивающим агентом можно влиять различными экспериментальными условиями, такими как концентрация каждого из партнеров реакции, избыток одного реагента по сравнению с другим, pH, температура и ионная сила. Степень связывания, т.е. количество белка RANKL, фрагмента RANKL или пептидов RANKL на субъединицу центральной частицы и, соответственно VLP, можно корректировать различными экспериментальными условиями, описанными выше, чтобы обеспечить соответствие требованиям вакцины. Растворимость белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL может накладывать ограничение на количество белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL, которое можно связать с каждой субъединицей, и в таких случаях, где полученная вакцина может быть нерастворимой, полезным может быть уменьшение количества белка RANKL, фрагмента RANKL или пептидов RANKL на субъединицу.The present invention provides methods for binding a RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide to central particles and, accordingly, to VLP. As indicated in one aspect of the invention, the RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide is coupled to a central particle and, accordingly, to VLP via chemical crosslinking, usually and preferably using a heterobifunctional crosslinking agent. Several heterobifunctional cross-linking agents are known in the art. In preferred embodiments, the heterobifunctional cross-linking agent contains a functional group that can interact with preferred first binding sites, i.e. with the amino group of the side chain of the lysine residues of the central particle and the VLP or at least one VLP subunit, respectively, and an additional functional group that can interact with a preferred second binding site, i.e. a naturally-occurring cysteine residue that is made available for reaction by reduction, or engineered on a RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide, and optionally also made available for reaction by reduction. The first step of the process, commonly called derivatization, is the interaction of a central particle or VLP with a cross-linking agent. The product of this reaction is an activated core particle or activated VLP, also called an activated carrier. In a second step, unreacted cross-linking agent is removed using conventional methods such as gel filtration or dialysis. In a third step, the RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide is reacted with an activated carrier, and this step is commonly referred to as the binding step. Unreacted RANKL protein, a RANKL fragment, or a RANKL peptide can optionally be removed in a fourth step, for example, by dialysis. Several heterobifunctional cross-linking agents are known in the art. These agents include preferred cross-linking agents SMPH (Pierce), sulfo-MBS, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMPB, sulfo-SMCC, SVSB, SIA and other cross-linking agents available, for example, from Pierce Chemical Company (Rockford, IL, USA) and having one functional group reactive with respect to amino groups and one functional group reactive with cysteine residues. All of the above cross-linking agents lead to the formation of a thioether bond. Another class of cross-linking agents suitable for the practice of the invention is characterized by the introduction of a disulfide bond between the RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide and the central particle or VLP upon binding. Preferred cross-linking agents of this class include, for example, SPDP and sulfo-LC-SPDP (Pierce). The degree of derivatization of the central particle and, accordingly, the VLP cross-linking agent can be influenced by various experimental conditions, such as the concentration of each of the reaction partners, the excess of one reagent compared to another, pH, temperature and ionic strength. The degree of binding, i.e. the amount of RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptides per subunit of the central particle and, accordingly, VLP, can be adjusted by various experimental conditions described above to ensure compliance with vaccine requirements. The solubility of the RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide may impose a limit on the amount of RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide that can be associated with each subunit, and in cases where the vaccine obtained may be insoluble, it may be useful to reduce the amount of RANKL protein. a RANKL fragment or RANKL peptides per subunit.
Особенно предпочтительным способом связывания белка RANKL, фрагмента RANKL или пептидов RANKL с центральной частицей и, соответственно, с VLP является связывание остатка лизина на поверхности центральной частицы и, соответственно, VLP с остатком цистеина на белке RANKL, фрагменте RANKL или пептиде RANKL. Таким образом, в предпочтительном варианте данного изобретения первым сайтом связывания является остаток лизина, а вторым сайтом связывания является остаток цистеина. В некоторых вариантах может требоваться конструирование аминокислотного линкера, содержащего остаток цистеина, в качестве второго сайта связывания или в качестве его части, к белку RANKL, фрагменту RANKL или пептиду RANKL для связывания с центральной частицей и, соответственно, с VLP. Альтернативно цистеин может быть введен в белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL либо посредством инсерции, либо мутации. Альтернативно остаток цистеина или тиоловую группу можно ввести с помощью химического связывания.A particularly preferred method of binding the RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptides to the central particle and, accordingly, to the VLP is to bind the lysine residue on the surface of the central particle and, accordingly, VLP to the cysteine residue on the RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide. Thus, in a preferred embodiment of the invention, the first binding site is a lysine residue, and the second binding site is a cysteine residue. In some embodiments, it may be necessary to construct an amino acid linker containing a cysteine residue, as a second binding site or as part of it, to a RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide to bind to a central particle and, accordingly, to VLP. Alternatively, cysteine can be introduced into the RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide, either by insertion or mutation. Alternatively, a cysteine residue or thiol group may be introduced by chemical coupling.
Выбор аминокислотного линкера будет зависеть от природы антигена и, соответственно, аутоантигена, т.е. от природы белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL, от его биохимических свойств, таких как pI, распределение заряда и гликозилирование. В общем, предпочтительны гибкие аминокислотные линкеры. Предпочтительные варианты аминокислотного линкера выбраны из группы, состоящей из: (a) CGG; (b) N-концевого линкера гамма 1; (c) N-концевого линкера гамма 3; (d) шарнирных участков Ig; (e) N-концевых глициновых линкеров; (f) (G)kC(G)n при n=0-12 и k=0-5; (g) N-концевых глицин-сериновых линкеров; (h) (G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n (SEQ ID NO:118) при n=0-3, k=0-5, m=0-10, l=0-2; (i) GGC; (k) GGC-NH2; (l) C-концевого линкера гамма 1; (m) C-концевого линкера гамма 3; (n) C-концевых глициновых линкеров; (o) (G)nC(G)k при n=0-12 и k=0-5; (p) C-концевых глицин-сериновых линкеров; (q) (G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k (SEQ ID NO:119) при n=0-3, k=0-5, m=0-10, l=0-2 и o=0-8.The choice of amino acid linker will depend on the nature of the antigen and, accordingly, autoantigen, i.e. from the nature of the RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide, from its biochemical properties such as pI, charge distribution, and glycosylation. In general, flexible amino acid linkers are preferred. Preferred amino acid linker variants are selected from the group consisting of: (a) CGG; (b) N-terminal linker gamma 1; (c) an N-terminal gamma-3 linker; (d) hinge sections of Ig; (e) N-terminal glycine linkers; (f) (G) k C (G) n for n = 0-12 and k = 0-5; (g) N-terminal glycine-serine linkers; (h) (G) k C (G) m (S) l (GGGGS) n (SEQ ID NO: 118) for n = 0-3, k = 0-5, m = 0-10, l = 0- 2; (i) GGC; (k) GGC-NH2; (l) C-terminal linker gamma 1; (m) C-terminal linker gamma 3; (n) C-terminal glycine linkers; (o) (G) n C (G) k for n = 0-12 and k = 0-5; (p) C-terminal glycine-serine linkers; (q) (G) m (S) l (GGGGS) n (G) o C (G) k (SEQ ID NO: 119) for n = 0-3, k = 0-5, m = 0-10, l = 0-2 and o = 0-8.
Следующими предпочтительными примерами аминокислотных линкеров являются шарнирный участок иммуноглобулинов, глицин-сериновые линкеры (GGGGS)n (SEQ ID NO:120) и глициновые линкеры (G)n, которые все, кроме того, содержат остаток цистеина в качестве второго сайта связывания и необязательно дополнительные остатки глицина. Обычно предпочтительными примерами указанных аминокислотных линкеров являются N-концевой гамма 1: CGDKTHTSPP (SEQ ID NO:121); C-концевой гамма 1: DKTHTSPPCG (SEQ ID NO:122); N-концевой гамма 3: CGGPKPSTPPGSSGGAP (SEQ ID NO:123); C-концевой гамма 3: PKPSTPPGSSGGAPGGCG (SEQ ID NO:124); N-концевой глициновый линкер: GCGGGG (SEQ ID NO:125); C-концевой глициновый линкер: GGGGCG (SEQ ID NO:126); C-концевой глицин-лизиновый линкер: GGKKGC (SEQ ID NO:127); N-концевой глицин-лизиновый линкер: CGKKGG (SEQ ID NO:128).Further preferred examples of amino acid linkers are the hinge region of immunoglobulins, glycine-serine linkers (GGGGS) n (SEQ ID NO: 120) and glycine linkers (G) n , which all further contain a cysteine residue as a second binding site and optionally additional glycine residues. Typically, preferred examples of these amino acid linkers are N-terminal gamma 1: CGDKTHTSPP (SEQ ID NO: 121); C-terminal gamma 1: DKTHTSPPCG (SEQ ID NO: 122); N-terminal gamma 3: CGGPKPSTPPGSSGGAP (SEQ ID NO: 123); C-terminal gamma 3: PKPSTPPGSSGGAPGGCG (SEQ ID NO: 124); N-terminal glycine linker: GCGGGG (SEQ ID NO: 125); C-terminal glycine linker: GGGGCG (SEQ ID NO: 126); C-terminal glycine-lysine linker: GGKKGC (SEQ ID NO: 127); N-terminal glycine-lysine linker: CGKKGG (SEQ ID NO: 128).
В следующем предпочтительном варианте данного изобретения и, в частности, в том случае, если антигеном является пептид RANKL, предпочтительными в качестве аминокислотных линкеров являются линкеры GGCG (SEQ ID NO:162), GGC или GGC-NH2 («NH2» означает амидирование) на C-конце пептида или CGG на его N-конце. В общем, остатки глицина будут встроены между основной массой аминокислот и цистеином, используемым в качестве второго сайта связывания, чтобы избежать возможных стерических помех со стороны аминокислоты основной массы в реакции связывания.In a further preferred embodiment of the present invention, and in particular if the antigen is a RANKL peptide, GGCG linkers (SEQ ID NO: 162), GGC or GGC-NH2 (“NH2” means amidation) are preferred as amino acid linkers C-terminus of a peptide or CGG at its N-terminus. In general, glycine residues will be inserted between the bulk of the amino acids and the cysteine used as the second binding site in order to avoid possible steric interference from the bulk amino acids in the binding reaction.
Остаток цистеина, присутствующий на белке RANKL, фрагменте RANKL или пептиде RANKL должен быть в своем восстановленном состоянии, чтобы реагировать с гетеробифункциональным перекрестно сшивающим агентом на активированной VLP, то есть должен быть доступным свободный цистеин или остаток цистеина со свободной сульфгидрильной группой. В том случае, когда остаток цистеина для функционирования в качестве сайта связывания находится в окисленной форме, например, если он образует дисульфидный мостик, требуется восстановление указанного дисульфидного мостика, например, с помощью DTT, TCEP или β-меркаптоэтанола.The cysteine residue present on the RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide must be in its reduced state in order to react with a heterobifunctional cross-linking agent on the activated VLP, i.e. free cysteine or a cysteine residue with a free sulfhydryl group must be available. In the case where the cysteine residue to function as a binding site is in an oxidized form, for example, if it forms a disulfide bridge, restoration of the indicated disulfide bridge is required, for example, using DTT, TCEP or β-mercaptoethanol.
Связывание белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL с центральной частицей или, соответственно, с VLP с использованием гетеробифункционального перекрестно сшивающего агента согласно описанным выше предпочтительным способам позволяет осуществлять связывание белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL с центральной частицей и, соответственно, с VLP ориентированным образом. Другие способы связывания белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL с центральной частицей и, соответственно, с VLP включают способы, при которых белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL перекрестно сшивают с центральной частицей и, соответственно, с VLP, используя карбодиимид, EDC и NHS. Белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL также сначала может быть тиолирован в ходе реакции, например, с SATA, SATP или иминотиоланом. Затем белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL при необходимости после снятия защиты можно связывать с центральной частицей и, соответственно, VLP следующим образом. После отделения избытка реагента для тиолирования осуществляют взаимодействие белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL с центральной частицей и, соответственно, с VLP, предварительно активированной гетеробифункциональным перекрестно сшивающим агентом, содержащим реакционно-способный по отношению к цистеину остаток и, следовательно, экспонирующим по меньшей мере одну или несколько функциональных групп, реагирующих с остатками цистеина, с которыми может реагировать тиолированный белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL, такой как описано выше. Необязательно в реакционную смесь могут быть включены небольшие количества восстанавливающего агента. В следующих способах белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL связывают с центральной частицей и, соответственно, с VLP, используя гомобифункциональный перекрестно сшивающий агент, такой как глутаральдегид, DSG, BM[PEO]4, BS3, (Pierce Chemical Company, Rockford, IL, USA) или другие известные гомобифункциональные перекрестно сшивающие агенты с функциональными группами, реагирующими с аминогруппами или карбоксильными группами центральной частицы и, соответственно, VLP.The binding of the RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide to the central particle or, respectively, to the VLP using a heterobifunctional cross-linking agent according to the preferred methods described above allows the binding of the RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide to the central particle and, accordingly, to the VLP oriented way. Other methods for linking a RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide to a central particle and, accordingly, to VLP include methods in which the RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide cross-link with the central particle and, respectively, to VLP using carbodiimide, EDC and NHS. The RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide can also be first thiolated during the reaction, for example, with SATA, SATP or iminothiolan. Then, the RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide, if necessary, after deprotection can be coupled to the central particle and, accordingly, VLP as follows. After separation of the excess reagent for thiolation, the RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide is reacted with the central particle and, accordingly, with VLP pre-activated by a heterobifunctional cross-linking agent containing a cysteine-reactive residue and, therefore, exhibiting at least one or more functional groups that react with cysteine residues with which the thiolated RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide, such as described above, can react e. Optionally, small amounts of a reducing agent may be included in the reaction mixture. In the following methods, a RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide is coupled to a central particle and, accordingly, to VLP using a homobifunctional crosslinking agent such as glutaraldehyde, DSG, BM [PEO] 4 , BS 3 , (Pierce Chemical Company, Rockford, IL, USA) or other known homobifunctional cross-linking agents with functional groups reacting with amino groups or carboxyl groups of the central particle and, accordingly, VLP.
В следующем варианте белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL связывают с центральной частицей и, соответственно, с VLP посредством модификации углеводных остатков, присутствующих на гликозилированном белке RANKL, фрагменте RANKL или пептиде RANKL, и последующего взаимодействия с центральной частицей и, соответственно, с VLP. В одном варианте осуществляют реакцию гликозилированного белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL с периодатом натрия в условиях реакции мягкого окисления углеводного остатка, получая активированный белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL с одной или несколькими функциональными альдегидными группами. Активированный таким образом белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL отделяют от избытка периодата натрия и затем подвергают взаимодействию с центральной частицей и, соответственно, с VLP, при котором остатки лизина центральной частицы и, соответственно, VLP или по меньшей мере одной субъединицы VLP взаимодействуют с ранее образованной альдегидной функциональной группой на белке RANKL, фрагменте RANKL или пептиде RANKL, например, как описано Hermanson, G.T. в Bioconjugate Techniques, Academic Press Inc., San Diego, CA, USA. Самополимеризацию активированного белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL можно контролировать, корректируя pH, как описано в вышеуказанной публикации. Образованное основание Шиффа предпочтительно далее восстанавливают цианоборогидридом натрия, который затем удаляют гель-фильтрацией или диализом. Альтернативно можно осуществлять взаимодействие центральной частицы и, соответственно, VLP с EDC по карбоксильным группам центральной частицы и, соответственно, VLP или по меньшей мере одной субъединицы VLP и дигидразидом, таким как дигидразид адипиновой кислоты, получая остаток гидразида, доступный для реакции с одной или несколькими альдегидными функциональными группами, присутствующими на активированном белке RANKL, фрагменте RANKL или пептиде RANKL. Образованный таким образом гидразон затем можно восстанавливать цианоборогидридом натрия. Альтернативно активированный белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL с одной или несколькими альдегидными функциональными группами подвергают реакции с цистеамином, получая в результате введение группы цистеина в белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL. Дополнительные способы перекрестного сшивания и перекрестно сшивающие агенты, подходящие для связывания белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL с центральной частицей и, соответственно, с VLP, а также руководство по осуществлению реакций связывания и применению химических перекрестно сшивающих агентов и способам химического перекрестного сшивания можно найти в Hermanson, G.T. in Bioconjugate Techniques, Academic Press Inc., San Diego, CA, USA.In a further embodiment, the RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide is bound to the central particle and, accordingly, to VLP by modifying the carbohydrate residues present on the glycosylated RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide, and subsequent interaction with the central particle and, accordingly, with VLP . In one embodiment, the glycosylated RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide and sodium periodate are reacted with a mild oxidation reaction of the carbohydrate residue to produce an activated RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide with one or more aldehyde functional groups. The RANKL protein activated in this way, the RANKL fragment or the RANKL peptide is separated from the excess sodium periodate and then reacted with the central particle and, accordingly, VLP, in which lysine residues of the central particle and, accordingly, VLP or at least one VLP subunit interact with a previously formed aldehyde functional group on a RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide, for example, as described by Hermanson, GT at Bioconjugate Techniques, Academic Press Inc., San Diego, CA, USA. The self-polymerization of the activated RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide can be controlled by adjusting the pH as described in the above publication. The Schiff base formed is preferably further reduced with sodium cyanoborohydride, which is then removed by gel filtration or dialysis. Alternatively, the central particle and, accordingly, VLP and EDC can interact with the carboxyl groups of the central particle and, accordingly, VLP or at least one VLP subunit and a dihydrazide, such as adipic acid dihydrazide, to obtain a hydrazide residue available for reaction with one or more aldehyde functional groups present on the activated RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide. The hydrazone thus formed can then be reduced with sodium cyanoborohydride. Alternatively, the activated RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide with one or more aldehyde functional groups is reacted with cysteamine, resulting in the introduction of a cysteine group into the RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide. Additional cross-linking methods and cross-linking agents suitable for binding the RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide to the central particle and, accordingly, to the VLP, as well as guidance on the implementation of binding reactions and the use of chemical cross-linking agents and chemical cross-linking methods can be found in Hermanson, GT in Bioconjugate Techniques, Academic Press Inc., San Diego, CA, USA.
Другие способы связывания VLP с белком RANKL, фрагментом RANKL или пептидом RANKL включают способы, при которых центральную частицу и, соответственно, VLP биотинилируют и белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL экспрессируют в виде белка, слитого со стрептавидином, или способы, при которых биотинилируют как белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL, так и центральную частицу и, соответственно, VLP, например, как описано в WO 00/23955. В данном случае белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL сначала можно связать со стрептавидином или авидином, корректируя отношение белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL к стрептавидину так, чтобы свободные сайты связывания еще были доступными для связывания центральной частицы и, соответственно VLP, которую добавляют на следующей стадии. Альтернативно все компоненты можно смешать в реакции «в одном сосуде». Другие пары лиганд-рецептор, где имеется растворимая форма рецептора и лиганда и которые способны к перекрестному сшиванию с центральной частицей и, соответственно, с VLP или белком RANKL, фрагментом RANKL или пептидом RANKL, можно использовать в качестве связывающих агентов для связывания белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL с центральной частицей и, соответственно, с VLP. Альтернативно либо лиганд, либо рецептор могут быть слиты с белком RANKL, фрагментом RANKL или пептидом RANKL и таким образом опосредовать связывание с центральной частицей и, соответственно, с VLP, химически связанной или слитой либо с рецептором, либо с лигандом, соответственно. Слияние также можно осуществлять посредством инсерции или замены.Other methods of binding VLP to a RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide include methods in which the central particle and, accordingly, VLP are biotinylated and the RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide are expressed as a protein fused to streptavidin, or methods in which biotinylate as a RANKL protein, a RANKL fragment or a RANKL peptide, and a central particle and, accordingly, VLP, for example, as described in WO 00/23955. In this case, the RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide can first be coupled to streptavidin or avidin by adjusting the ratio of the RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide to streptavidin so that free binding sites are still available for binding of the central particle and, accordingly, VLP, which add in the next step. Alternatively, all components may be mixed in a “single vessel” reaction. Other ligand-receptor pairs where there is a soluble form of the receptor and ligand and which are capable of cross-linking with the central particle and, accordingly, with VLP or RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide, can be used as binding agents for binding of RANKL protein, fragment RANKL or RANKL peptide with a central particle and, accordingly, with VLP. Alternatively, either the ligand or receptor can be fused to a RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide and thus mediate binding to a central particle and, accordingly, to a VLP chemically coupled to either a receptor or a ligand, respectively. Merging can also be accomplished by insertion or replacement.
Как уже говорилось, в предпочтительном варианте данного изобретения VLP является VLP РНК-фага и в более предпочтительном варианте VLP является VLP покрывающего белка РНК-фага Qβ.As already mentioned, in a preferred embodiment of the present invention, the VLP is the VLP of the RNA phage, and in a more preferred embodiment, the VLP is the VLP of the Qβ RNA phage coat protein.
Одна или несколько молекул антигена, т.е. белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL, могут быть связаны с одной субъединицей капсида или VLP покрывающих белков РНК-фага, предпочтительно через экспонированные остатки лизина VLP РНК-фагов, если это стерически допустимо. Таким образом, особым признаком VLP покрывающих белков РНК-фагов и, в частности, VLP покрывающего белка Qβ является возможность связывать несколько антигенов на субъединицу. Это обеспечивает возможность образования плотной антигенной матрицы.One or more antigen molecules, i.e. the RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide can be linked to a single subunit of the capsid or VLP of the RNA phage coat proteins, preferably via the exposed lysine residues of the VLP RNA phages, if sterically permissible. Thus, a special feature of the VLP coat proteins of RNA phages and, in particular, the VLP coat protein Qβ is the ability to bind several antigens to the subunit. This allows the formation of a dense antigenic matrix.
В предпочтительном варианте изобретения связывание и, соответственно, присоединение по меньшей мере белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL с центральной частицей и, соответственно, вирусоподобной частицей осуществляют посредством взаимодействия и, соответственно, ассоциации между по меньшей мере одним первым сайтом связывания вирусоподобной частицы и по меньшей мере одним вторым сайтом связывания антигена или антигенной детерминанты.In a preferred embodiment of the invention, the binding and, accordingly, the attachment of at least a RANKL protein, a RANKL fragment or a RANKL peptide with a central particle and, accordingly, a virus-like particle is carried out through interaction and, accordingly, association between at least one first virus-like particle binding site and at least one second antigen or antigenic determinant binding site.
VLP или капсиды из покрывающего белка Qβ экспонируют определенное количество остатков лизина на своей поверхности с определенной топологией, при этом три остатка лизина направлены внутрь капсида и взаимодействуют с РНК, а четыре других остатка лизина экспонированы на наружную сторону капсида. Указанные определенные свойства предпочтительны для связывания антигенов с наружной стороной частицы, а не с внутренней стороны частицы, где остатки лизина взаимодействуют с РНК. VLP из других покрывающих белков РНК-фагов также имеют определенное количество остатков лизина на своей поверхности и определенную топологию указанных остатков лизина.VLP or capsids from the Qβ coating protein expose a certain amount of lysine residues on its surface with a specific topology, with three lysine residues directed inside the capsid and interact with RNA, and four other lysine residues exposed on the outside of the capsid. These specific properties are preferred for binding of antigens to the outside of the particle, rather than from the inside of the particle, where lysine residues interact with RNA. VLPs from other covering RNA phage proteins also have a certain amount of lysine residues on their surface and a specific topology of these lysine residues.
В следующих предпочтительных вариантах данного изобретения первый сайт связывания является остатком лизина и/или второй сайт связывания содержит сульфгидрильную группу или остаток цистеина. В очень предпочтительном варианте данного изобретения первый сайт связывания является остатком лизина, а второй сайт связывания является остатком цистеина.In further preferred embodiments of the invention, the first binding site is a lysine residue and / or the second binding site contains a sulfhydryl group or a cysteine residue. In a very preferred embodiment of the present invention, the first binding site is a lysine residue, and the second binding site is a cysteine residue.
В очень предпочтительных вариантах изобретения белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL связан через остаток цистеина, либо природно присутствующий на белке RANKL, фрагменте RANKL или пептиде RANKL, либо сконструированный, с остатками лизина VLP покрывающего белка РНК-фага и, в частности, VLP покрывающего белка Qβ.In very preferred embodiments, the RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide is linked via a cysteine residue, either naturally occurring on the RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide, or constructed with lysine residues of the VLP coat RNA phage protein and, in particular, the VLP coat Qβ protein.
Другим преимуществом VLP, полученных из РНК-фагов, является высокий выход их экспрессии в бактериях, который позволяет получать большие количества материала при допустимой стоимости.Another advantage of VLPs derived from RNA phages is the high yield of their expression in bacteria, which allows large quantities of material to be obtained at an affordable cost.
Как указано, конъюгаты и матрицы, соответственно, согласно изобретению отличаются от конъюгатов предшествующего уровня техники своей высокоорганизованной структурой, размерами и повторяемостью антигена на поверхности матрицы. Кроме того, применение VLP в качестве носителей позволяет образовывать прочные антигенные матрицы и конъюгаты, соответственно, с изменяемой плотностью антигенов. В частности, применение VLP РНК-фагов и, таким образом, в частности, применение VLP покрывающего белка РНК-фага Qβ позволяет достигать очень высокой плотности эпитопа. Получение композиций VLP покрывающих белков РНК-фагов с высокой плотностью эпитопов можно осуществлять с использованием инструкций, приведенных в данной заявке.As indicated, the conjugates and matrices, respectively, according to the invention differ from the prior art conjugates in their highly organized structure, size and repeatability of the antigen on the matrix surface. In addition, the use of VLP as carriers allows the formation of strong antigenic matrices and conjugates, respectively, with a variable density of antigens. In particular, the use of VLP of RNA phages, and thus, in particular, the use of VLP of the Qβ RNA phage coat protein, allows for a very high epitope density. Obtaining compositions of VLP coating proteins of RNA phages with a high density of epitopes can be carried out using the instructions provided in this application.
На антигене или антигенной детерминанте может присутствовать либо природный, либо неприродный второй сайт связывания, который определен в данном описании. В случае отсутствия подходящего второго сайта связывания природного происхождения на антигене или антигенной детерминанте необходимо сконструировать неприродный второй сайт связывания на антигене.Either a natural or non-natural second binding site, as defined herein, may be present on an antigen or antigenic determinant. In the absence of a suitable second binding site of natural origin on the antigen or antigenic determinant, it is necessary to construct a non-natural second binding site on the antigen.
Как описано выше, четыре остатка лизина экспонированы на поверхности VLP покрывающего белка Qβ. Обычно такие остатки дериватизируют в ходе реакции с перекрестно сшивающей молекулой. В том случае, когда не все экспонированные остатки лизина могут быть связаны с антигеном, остатки лизина, которые прореагировали с перекрестно сшивающим агентом, остаются с перекрестно сшивающей молекулой, связанной с ε-аминогруппой после стадии дериватизации. Это приводит к исчезновению одного или нескольких положительных зарядов, которое может быть нежелательным для растворимости и стабильности VLP. Заменяя некоторые остатки лизина аргининами, как в заявленных мутантах покрывающего белка Qβ, описанных ниже, авторы предотвратили чрезмерное исчезновение положительных зарядов, так как остатки аргинина не взаимодействуют с перекрестно сшивающим агентом. Кроме того, замена остатков лизина аргининами может приводить к более определенной антигенной матрице, так как меньше сайтов доступно для реакции с антигеном.As described above, four lysine residues are exposed on the surface of the VLP of the Qβ coat protein. Typically, such residues are derivatized during a reaction with a cross-linking molecule. In the case where not all exposed lysine residues can be associated with an antigen, lysine residues that have reacted with a cross-linking agent remain with the cross-linking molecule bound to the ε-amino group after the derivatization step. This results in the disappearance of one or more positive charges, which may be undesirable for the solubility and stability of the VLP. By replacing some lysine residues with arginines, as in the claimed mutants of the Qβ coating protein described below, the authors prevented the positive charges from disappearing excessively, since the arginine residues do not interact with the cross-linking agent. In addition, replacing lysine residues with arginines can lead to a more specific antigenic matrix, since fewer sites are available for reaction with the antigen.
Таким образом, экспонированные остатки лизина заменяли аргининами в следующих мутантах покрывающего белка Qβ и мутантных VLP Qβ, описанных в данной заявке: Qβ-240 (Lys13-Arg; SEQ ID NO:23), Qβ-250 (Lys 2-Arg, Lys13-Arg; SEQ ID NO:25) и Qβ-259 (Lys 2-Arg, Lys16-Arg; SEQ ID NO:27). Конструкции клонировали, белки экспрессировали, VLP очищали и использовали для связывания с пептидными и белковыми антигенами. Также конструировали Qβ-251 (SEQ ID NO:26), и руководство по поводу того, как экспрессировать, очищать и связывать VLP покрывающего белка Qβ-251, можно найти на протяжении данной заявки.Thus, the exposed lysine residues were replaced with arginines in the following Qβ coating protein mutants and Qβ mutant VLPs described in this application: Qβ-240 (Lys13-Arg; SEQ ID NO: 23), Qβ-250 (Lys 2-Arg, Lys13- Arg; SEQ ID NO: 25) and Qβ-259 (Lys 2-Arg, Lys16-Arg; SEQ ID NO: 27). The constructs were cloned, proteins were expressed, VLP was purified and used to bind to peptide and protein antigens. Qβ-251 was also designed (SEQ ID NO: 26), and guidance on how to express, purify and bind the VLP of the Qβ-251 coat protein can be found throughout this application.
В следующем варианте авторы предложили мутантный покрывающий белок Qβ с одним дополнительным остатком лизина, подходящий для получения матрицы антигенов с еще более высокой плотностью. Данный мутантный покрывающий белок Qβ, Qβ-243 (Asn 10-Lys; SEQ ID NO:24) клонировали, белок экспрессировали и капсид или VLP выделяли и очищали, показав, что введение дополнительного остатка лизина совместимо с самосборкой субъединиц в капсид или VLP. Таким образом, матрицы и, соответственно, конъюгаты белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL можно получить с использованием VLP мутантов покрывающего белка Qβ. Особенно предпочтительным способом связывания антигенов с VLP и, в частности, с VLP покрывающих белков РНК-фага является связывание остатка лизина, присутствующего на поверхности VLP покрывающих белков РНК-фага, с остатком цистеина, природно присутствующим или сконструированным на антигене, т.е. белке RANKL, фрагменте RANKL или пептиде RANKL. Для того чтобы остаток цистеина был эффективным в качестве второго сайта связывания, сульфгидрильная группа должна быть доступной для связывания. Таким образом, остаток цистеина должен быть в своем восстановленном состоянии, то есть должен быть доступным свободный цистеин или остаток цистеина со свободной сульфгидрильной группой. В том случае, когда остаток цистеина для функционирования в качестве второго сайта связывания находится в окисленной форме, например, если он образует дисульфидный мостик, требуется восстановление указанного дисульфидного мостика, например, с помощью DTT, TCEP или β-меркаптоэтанола. Концентрация восстановителя и молярный избыток восстановителя по сравнению с антигеном должен уточняться для каждого антигена. При необходимости тестируют пределы титрования, начиная с таких низких концентраций восстановителя, как 10 мкМ или ниже до 10-20 мМ или выше, и оценивают связывание антигена с носителем. Несмотря на то что низкие концентрации восстановителя совместимы с реакцией связывания, как описано в находящейся на рассмотрении заявке на выдачу патента США № 10/050902, поданной настоящим правопреемником 18 января 2002, более высокие концентрации ингибируют реакцию связывания, как будет понятно специалисту в данной области, и в этом случае восстановитель необходимо удалить диализом или гель-фильтрацией. Преимущественно pH буфера для диализа или уравновешивающего буфера ниже 7, предпочтительно 6. Совместимость буфера с низким значением pH с активностью и стабильностью антигена необходимо проверять.In a further embodiment, the authors proposed a mutant coating protein Qβ with one additional lysine residue, suitable for obtaining an antigen matrix with an even higher density. This mutant Qβ coating protein, Qβ-243 (Asn 10-Lys; SEQ ID NO: 24) was cloned, the protein was expressed, and the capsid or VLP was isolated and purified, showing that the addition of an additional lysine residue was compatible with self-assembly of the subunits in capsid or VLP. Thus, matrices and, accordingly, conjugates of the RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide can be obtained using VLP mutants of the Qβ coat protein. A particularly preferred method for binding antigens to VLPs, and in particular to VLPs of RNA phage coat proteins, is to bind a lysine residue present on the surface of the VLPs of RNA phage coat proteins with a cysteine residue naturally present or engineered on an antigen, i.e. RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide. In order for the cysteine residue to be effective as a second binding site, the sulfhydryl group must be available for binding. Thus, the cysteine residue must be in its reduced state, that is, free cysteine or a cysteine residue with a free sulfhydryl group must be available. In the case where the cysteine residue for functioning as the second binding site is in an oxidized form, for example, if it forms a disulfide bridge, the indicated disulfide bridge must be restored, for example, using DTT, TCEP or β-mercaptoethanol. The concentration of the reducing agent and the molar excess of the reducing agent compared to the antigen should be specified for each antigen. If necessary, the titration limits are tested, starting from such low concentrations of a reducing agent as 10 μM or lower to 10-20 mm or higher, and the binding of antigen to the carrier is evaluated. Although low concentrations of the reducing agent are compatible with the binding reaction, as described in pending application for US patent No. 10/050902 filed by this assignee on January 18, 2002, higher concentrations inhibit the binding reaction, as will be understood by a person skilled in the art, and in this case, the reducing agent must be removed by dialysis or gel filtration. Advantageously, the pH of the dialysis or equilibration buffer is below 7, preferably 6. The compatibility of the low pH buffer with antigen activity and stability should be checked.
Плотность эпитопа на VLP покрывающих белков РНК-фага можно модулировать, выбирая перекрестно сшивающий агент и другие условия реакции. Например, перекрестно сшивающие агенты сульфо-GMBS и SMPH обычно обеспечивают достижение высокой плотности эпитопа. На дериватизацию положительно влияет высокая концентрация реагирующих веществ, и манипулирование условиями реакции можно использовать для того, чтобы контролировать количество антигенов, связанных с VLP покрывающих белков РНК-фага и, в частности, с VLP покрывающего белка Qβ.The density of the epitope on the VLP of the coating proteins of the RNA phage can be modulated by choosing a cross-linking agent and other reaction conditions. For example, cross-linking agents sulfo-GMBS and SMPH usually provide high epitope densities. Derivatization is positively affected by a high concentration of reactants, and manipulation of the reaction conditions can be used to control the amount of antigens associated with the VLP of the RNA phage coat proteins and, in particular, with the Vβ coat protein Qβ.
Перед конструированием неприродного второго сайта связывания необходимо выбрать положение, в котором он должен быть слит, встроен или, в общем, сконструирован. Выбор положения второго сайта связывания в качестве примера может быть основан на кристаллической структуре антигена. Такая кристаллическая структура антигена может давать информацию о доступности C- или N-концов молекулы (определенной, например, исходя из их доступности для растворителя) или об экспонировании по отношению к растворителю остатков, подходящих для использования в качестве вторых сайтов связывания, таких как остатки цистеина. Экспонированные дисульфидные мостики, как в случае Fab-фрагментов, также могут быть источником второго сайта связывания, так как их, как правило, можно превратить в отдельные остатки цистеина посредством умеренного восстановления. Будут выбраны умеренные условия восстановления, не влияющие на иммуногенность белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL. В общем, в том случае, когда целью иммунизации аутоантигеном является ингибирование взаимодействия данного аутоантигена с его природными лигандами, второй сайт связывания будет добавлен таким образом, чтобы он давал возможность образовывать антитела против сайта взаимодействия с природными лигандами. Таким образом, положение второго сайта связывания будет выбрано так, чтобы избежать стерических помех со стороны второго сайта связывания или любого содержащего его аминокислотного линкера. В следующих вариантах требуется гуморальный ответ, направленный на сайт, отличный от сайта взаимодействия аутоантигена с его природным лигандом. В таких вариантах второй сайт связывания может быть выбран так, чтобы он предотвращал образование антител против сайта взаимодействия аутоантигена с его природными лигандами.Before constructing a non-natural second binding site, it is necessary to choose the position in which it should be merged, integrated, or, in general, constructed. The selection of the position of the second binding site as an example may be based on the crystal structure of the antigen. Such a crystal structure of the antigen can provide information on the availability of the C- or N-ends of the molecule (determined, for example, based on their availability to the solvent) or on exposure to the solvent of residues suitable for use as second binding sites, such as cysteine residues . Exposed disulfide bridges, as in the case of Fab fragments, can also be a source of a second binding site, since they can usually be converted into individual cysteine residues through moderate recovery. Moderate recovery conditions will be selected that do not affect the immunogenicity of the RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide. In general, when the goal of immunization with an autoantigen is to inhibit the interaction of a given autoantigen with its natural ligands, a second binding site will be added so that it allows the formation of antibodies against the interaction site with natural ligands. Thus, the position of the second binding site will be chosen so as to avoid steric interference from the second binding site or any amino acid linker containing it. In the following embodiments, a humoral response is required directed to a site other than the site of interaction of the autoantigen with its natural ligand. In such embodiments, the second binding site can be chosen so that it prevents the formation of antibodies against the site of interaction of the autoantigen with its natural ligands.
Другие критерии для выбора положения второго сайта связывания включают состояние олигомеризации антигена, сайт олигомеризации, присутствие кофактора и наличие экспериментального доказательства обнаружения сайтов в структуре антигена и последовательности, в которой модификация антигена совместима с функцией аутоантигена или с образованием антител, распознающих аутоантиген.Other criteria for choosing the position of the second binding site include the antigen oligomerization state, the oligomerization site, the presence of a cofactor, and the presence of experimental evidence for the detection of sites in the antigen structure and the sequence in which the modification of the antigen is compatible with the function of autoantigen or with the formation of antibodies that recognize autoantigen.
В наиболее предпочтительных вариантах белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL содержит единственный второй сайт связывания или единственный реакционно-способный сайт связывания, способный к ассоциации с первыми сайтами связывания на центральной частице и VLP или субъединицах VLP, соответственно. Это обеспечивает определенное и равномерное связывание и, соответственно, ассоциацию по меньшей мере одного, но обычно нескольких, предпочтительно более 10, 20, 40, 80, 120, антигенов с центральной частицей и VLP, соответственно. Таким образом, обеспечение одного второго сайта связывания или одного реакционно-способного сайта связывания на антигене обеспечивает один тип равномерного связывания и ассоциации, соответственно, приводящий к очень высокоупорядоченной и повторяющейся матрице. Например, если связывание и ассоциацию, соответственно, осуществляют посредством взаимодействия лизина (в качестве первого сайта связывания) и цистеина (в качестве второго сайта связывания), то согласно данному предпочтительному варианту изобретения гарантировано, что только один остаток цистеина на антиген, независимо от того, присутствует ли на антигене данный остаток цистеина природного или неприродного происхождения, способен связываться и ассоциировать, соответственно, с VLP и первым сайтом связывания центральной частицы, соответственно.In most preferred embodiments, the RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide contains a single second binding site or a single reactive binding site capable of association with the first binding sites on the central particle and VLP or VLP subunits, respectively. This provides a certain and uniform binding and, accordingly, the association of at least one, but usually several, preferably more than 10, 20, 40, 80, 120, antigens with the central particle and VLP, respectively. Thus, providing one second binding site or one reactive antigen binding site provides one type of uniform binding and association, respectively, resulting in a very highly ordered and repeating matrix. For example, if the binding and association, respectively, is carried out through the interaction of lysine (as the first binding site) and cysteine (as the second binding site), then according to this preferred embodiment of the invention, it is guaranteed that only one cysteine residue per antigen, regardless of whether a given cysteine residue of natural or non-natural origin is present on the antigen, is able to bind and associate, respectively, with VLP and the first binding site of the central particle, respectively Twain.
В некоторых вариантах конструирование второго сайта связывания на антигене требует слияния аминокислотного линкера, содержащего аминокислоту, подходящую в качестве второго сайта связывания согласно описаниям данного изобретения. Таким образом, в предпочтительном варианте данного изобретения аминокислотный линкер связан с антигеном или антигенной детерминантой посредством по меньшей мере одной ковалентной связи. Предпочтительно аминокислотный линкер содержит или, альтернативно, состоит из второго сайта связывания. В следующем предпочтительном варианте аминокислотный линкер содержит сульфгидрильную группу или остаток цистеина. В другом предпочтительном варианте аминокислотным линкером является цистеин. Некоторые критерии выбора аминокислотного линкера, а также дополнительные предпочтительные варианты аминокислотного линкера согласно изобретению уже указаны выше.In some embodiments, the construction of a second binding site on an antigen requires the fusion of an amino acid linker containing an amino acid suitable as a second binding site according to the descriptions of this invention. Thus, in a preferred embodiment of the invention, the amino acid linker is coupled to an antigen or antigenic determinant via at least one covalent bond. Preferably, the amino acid linker contains or, alternatively, consists of a second binding site. In a further preferred embodiment, the amino acid linker contains a sulfhydryl group or a cysteine residue. In another preferred embodiment, the amino acid linker is cysteine. Some criteria for the selection of the amino acid linker, as well as additional preferred variants of the amino acid linker according to the invention are already indicated above.
В следующем предпочтительном варианте изобретения по меньшей мере один антиген или антигенная детерминанта, т.е. белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL, слит с центральной частицей и вирусоподобной частицей соответственно. Как указано выше, VLP обычно состоит по меньшей мере из одной субъединицы, собирающейся в VLP. Таким образом, снова в следующем предпочтительном варианте изобретения антиген или антигенная детерминанта, предпочтительно по меньшей мере один белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL слит по меньшей мере с одной субъединицей вирусоподобной частицы или белка, который может быть включен в VLP, с образованием химерного слияния VLP-субъединица-белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL.In a further preferred embodiment of the invention, at least one antigen or antigenic determinant, i.e. RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide, fused to the central particle and virus-like particle, respectively. As indicated above, a VLP typically consists of at least one subunit assembled in a VLP. Thus, again in a further preferred embodiment of the invention, the antigen or antigenic determinant, preferably at least one RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide, is fused to at least one subunit of the virus-like particle or protein that can be incorporated into the VLP to form a chimeric fusion RANKL VLP subunit protein, RANKL fragment or RANKL peptide.
Слияние белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL можно осуществить путем инсерции в последовательность субъединицы VLP или путем слияния либо с N-, либо с C-концом VLP-субъединицы или белка, который может быть включен в VLP. В дальнейшем при упоминании слитых белков пептида с субъединицей VLP подразумевают слияние либо с концами последовательности субъединицы либо внутреннюю инсерцию пептида в последовательность субъединицы.The fusion of the RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide can be accomplished by insertion into the sequence of the VLP subunit or by fusion with either the N- or C-terminus of the VLP subunit or protein that can be incorporated into the VLP. Hereinafter, when referring to fusion proteins of a peptide with a VLP subunit, it is meant to merge either at the ends of the subunit sequence or internal insertion of the peptide into the subunit sequence.
Слияние также можно осуществить путем инсерции последовательностей белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL в вариант субъединицы VLP, где часть последовательности субъединицы была делетирована, полученные продукты далее называют укороченными мутантами. Укороченные мутанты могут иметь N- или C-концевые или внутренние делеции части последовательности субъединицы VLP. Например, конкретный HBcAg VLP, например, с делецией аминокислотных остатков с 79 по 81 является укороченным мутантом с внутренней делецией. Слияние белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL либо с N-, либо с C-концом укороченных мутантов VLP-субъединиц также приводит к образованию вариантов согласно данному изобретению. Подобным образом, слияние эпитопа с последовательностью субъединицы VLP также можно осуществить путем замены, при которой, например, для конкретного HBcAg VLP аминокислоты 79-81 заменяют чужеродным эпитопом. Таким образом, слияние, которое упоминается в дальнейшем, можно осуществить путем инсерции последовательности белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL в последовательность субъединицы VLP путем замены части последовательности субъединицы VLP последовательностью белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL или посредством комбинирования делеции, замены или инсерции.Merging can also be accomplished by inserting the sequences of the RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide into a variant of the VLP subunit, where part of the subunit sequence has been deleted, the resulting products are hereinafter referred to as truncated mutants. The truncated mutants may have N- or C-terminal or internal deletions of part of the VLP subunit sequence. For example, a particular HBcAg VLP, for example, with a deletion of
Химерные конструкции белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL-субъединица VLP, как правило, будут способны к самосборке в VLP. VLP, экспонирующие эпитопы, слитые с их субъединицами, также называют в данном описании химерными VLP. Как указано, вирусоподобная частица содержит или, альтернативно, состоит по меньшей мере из одной субъединицы VLP. В следующем варианте изобретения вирусоподобная частица содержит или, альтернативно, состоит из смеси химерных субъединиц VLP и нехимерных субъединиц VLP, т.е. субъединиц VLP, не имеющих слитого с ними антигена, образуя в результате так называемые мозаичные частицы. Это может иметь преимущества для обеспечения образования и сборки в VLP. В указанных вариантах доля химерных VLP-субъединиц может составлять 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95% или больше.Chimeric constructs of a RANKL protein, RANKL fragment, or VLP RANKL subunit peptide will typically be capable of self-assembly in VLP. VLPs exhibiting epitopes fused to their subunits are also referred to herein as chimeric VLPs. As indicated, a virus-like particle contains or, alternatively, consists of at least one VLP subunit. In a further embodiment of the invention, the virus-like particle contains or, alternatively, consists of a mixture of chimeric VLP subunits and non-chimeric VLP subunits, i.e. VLP subunits lacking antigen fused with them, resulting in the so-called mosaic particles. This may have advantages for providing education and assembly in VLP. In these embodiments, the proportion of chimeric VLP subunits can be 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95% or more.
Могут быть добавлены фланкирующие аминокислотные остатки к любому концу последовательности пептида или эпитопа, который необходимо слить с любым из концов последовательности субъединицы VLP, или для внутренней инсерции такой пептидной последовательности в последовательность субъединицы VLP. Остатки глицина и серина являются особенно предпочтительными аминокислотами для использования во фланкирующих последовательностях, добавляемых к белку RANKL, фрагменту RANKL или пептиду RANKL, который необходимо слить. Остатки глицина придают дополнительную гибкость, которая может снижать возможное дестабилизирующее действие слияния чужеродной последовательности в последовательность субъединицы VLP.Flanking amino acid residues can be added to either end of the sequence of the peptide or epitope that needs to be fused to either end of the VLP subunit sequence, or for internal insertion of such a peptide sequence into the VLP subunit sequence. Glycine and serine residues are particularly preferred amino acids for use in flanking sequences added to the RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide to be fused. Glycine residues give additional flexibility, which can reduce the possible destabilizing effect of the fusion of a foreign sequence into the sequence of the VLP subunit.
В конкретном варианте изобретения VLP является VLP корового антигена гепатита B. Описаны слитые белки либо с N-концом HBcAg (Neyrinck, S. et al., Nature Med. 5: 1157-1163 (1999)), либо инсерции в так называемую основную иммунодоминантную область (MIR) (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44:98-114 (2001)), WO 01/98333), и указанные слияния являются предпочтительными вариантами изобретения. Также описаны варианты HBcAg природного происхождения с делециями в MIR (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001), публикация специально включена в виде ссылки в полном объеме), и слияния с N- или C-концом, а также инсерции в положение MIR, соответствующее сайту делеции по сравнению с HBcAg дикого типа, являются следующими вариантами изобретения. Также описаны слияния с C-концом (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001)). Специалист в данной области легко найдет руководство по поводу того, как конструировать слитые белки, используя классические способы молекулярной биологии (Sambrook, J. et al., eds., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd. edition, Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Ho et al., Gene 77:51 (1989)). Описаны векторы и плазмиды, кодирующие HBcAg и слитые белки HBcAg и применимые для экспрессии HBcAg и слитых белков HBcAg (Pumpens, P. and Grens, E. Intervirology 44: 98-114 (2001), Neyrinck, S. et al., Nature Med. 5: 1157-1163 (1999)), которые можно использовать в практике изобретения. Авторы также описали в виде примера (пример 6) инсерцию эпитопа в MIR HBcAg с получением в результате химерного подвергаемого самосборке HBcAg. Важным фактором для оптимизации эффективности самосборки и экспонирования эпитопа, встраиваемого в MIR HBcAg, является выбор места инсерции, а также количество аминокислот, которые необходимо делетировать из последовательности HBcAg в MIR (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001); EP 421635; патент США 6231864) при инсерции, или другими словами, какие аминокислоты из HBcAg необходимо заменить новым эпитопом. Например, описана замена аминокислот HBcAg 76-80, 79-81, 79-80, 75-85 или 80-81 чужеродными эпитопами (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001); EP 0421635; патент США 6231864). HBcAg содержит длинный аргининовый хвост (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001)), который не имеет существенного значения для сборки капсида и способен к связыванию нуклеиновых кислот (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001)). HBcAg, либо содержащие аргининовый хвост, либо не имеющие такового, являются вариантами изобретения.In a specific embodiment, the VLP is the VLP of hepatitis B core antigen. Fusion proteins are described either with the N-terminus of HBcAg (Neyrinck, S. et al., Nature Med. 5: 1157-1163 (1999)), or insertion into the so-called basic immunodominant region (MIR) (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001)), WO 01/98333), and these mergers are preferred variants of the invention. Also described are variants of naturally occurring HBcAgs with deletions in MIR (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001), the publication is specifically incorporated by reference in full), and mergers with N- or C- end, as well as insertion at the MIR position corresponding to the deletion site compared to wild-type HBcAg, are further embodiments of the invention. C-terminal fusions are also described (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001)). One skilled in the art will easily find guidance on how to construct fusion proteins using classical molecular biology techniques (Sambrook, J. et al., Eds., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd. Edition, Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), Ho et al., Gene 77:51 (1989)). Vectors and plasmids encoding HBcAg and HBcAg fusion proteins and useful for the expression of HBcAg and HBcAg fusion proteins are described (Pumpens, P. and Grens, E. Intervirology 44: 98-114 (2001), Neyrinck, S. et al., Nature Med 5: 1157-1163 (1999)), which can be used in the practice of the invention. The authors also described, by way of example (Example 6), the insertion of an epitope into HBcAg MIR, resulting in a chimeric self-assembly of HBcAg. An important factor for optimizing the efficiency of self-assembly and exposure of the epitope embedded in HBcAg MIR is the choice of insertion site, as well as the number of amino acids that must be deleted from the HBcAg sequence in MIR (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001); EP 421635; US patent 6231864) at insertion, in other words, which amino acids from HBcAg need to be replaced with a new epitope. For example, the replacement of HBcAg amino acids 76-80, 79-81, 79-80, 75-85 or 80-81 with foreign epitopes is described (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001); EP 0421635 ; US patent 6231864). HBcAg contains a long arginine tail (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001)), which is not essential for capsid assembly and is capable of binding nucleic acids (Pumpens, P. and Grens, E ., Intervirology 44: 98-114 (2001)). HBcAg, either containing arginine tail or not having one, are variants of the invention.
В следующем предпочтительном варианте изобретения VLP является VLP РНК-фага. Основные покрывающие белки РНК-фагов спонтанно собираются в VLP при экспрессии в бактериях и, а частности, в E. coli. Конкретные примеры покрывающих белков бактериофагов, которые можно использовать для получения композиций согласно изобретению, включают покрывающие белки таких РНК-бактериофагов, как бактериофаг Qβ (SEQ ID NO:10; база данных PIR, инвентарный No. VCBPQβ, относящаяся к CP Qβ, и SEQ ID NO:11; инвентарный No. AAA16663, относящаяся к белку A1 Qβ) и бактериофаг fr (SEQ ID NO:4; PIR, инвентарный No. VCBPFR).In a further preferred embodiment of the invention, the VLP is the VLP of an RNA phage. The main covering proteins of RNA phages spontaneously assemble in VLP when expressed in bacteria and, in particular, in E. coli. Specific examples of bacteriophage coat proteins that can be used to prepare compositions of the invention include bacteriophage RNA coat proteins such as the Qβ bacteriophage (SEQ ID NO: 10; PIR Database, Inventory No. VCBPQβ Related to CP Qβ, and SEQ ID NO: 11; Inventory No. AAA16663 relating to A1 Qβ protein) and bacteriophage fr (SEQ ID NO: 4; PIR, Inventory No. VCBPFR).
В более предпочтительном варианте по меньшей мере один белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL сливают с покрывающим белком Qβ. Описаны конструкции слитых белков, в которых эпитопы были слиты с C-концом укороченной формы белка A1 Qβ или встроены в белок A1 (Kozlovska, T.M., et al., Intervirology, 39: 9-15 (1996)). Белок A1 образуется при супрессии в стоп-кодоне UGA и имеет длину 329 а/к или 328 а/к, если принять во внимание отщепление N-концевого метионина. Отщепление N-концевого метионина перед аланином (вторая аминокислота, кодируемая геном CP Qβ) обычно имеет место в E. coli, и так обстоит дело для N-концов покрывающих белков CP Qβ. Часть гена A1 с 3'-стороны от амбер-кодона UGA кодирует удлинение CP, которое имеет длину 195 аминокислот. Инсерция по меньшей мере одного белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL между положениями 72 и 73 удлинения CP приводит к образованию следующих вариантов согласно изобретению (Kozlovska, T.M., et al., Intervirology 39: 9-15 (1996)). Слияние белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL с C-концом укороченного на C-конце белка A1 Qβ приводит к образованию следующих предпочтительных вариантов согласно изобретению. Например, Kozlovska et al., (Intervirology, 39: 9-15 (1996)) описали слияния белка A1 Qβ, в которых эпитоп слит с C-концом удлинения CP Qβ, укороченным в положении 19.In a more preferred embodiment, at least one RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide is fused to the Qβ coat protein. Fusion protein constructs are described in which epitopes are fused to the C-terminus of the shortened form of A1 Qβ protein or inserted into A1 protein (Kozlovska, T.M., et al., Intervirology, 39: 9-15 (1996)). Protein A1 is formed by suppression in the UGA stop codon and has a length of 329 a / k or 328 a / k, if we take into account the cleavage of the N-terminal methionine. Cleavage of the N-terminal methionine in front of alanine (the second amino acid encoded by the CP Qβ gene) usually occurs in E. coli, and this is the case for the N-terminus of the covering protein Q Qβ. The portion of the A1 gene on the 3 ′ side of the UGA amber codon encodes a CP extension that is 195 amino acids in length. The insertion of at least one RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide between
Как описано Kozlovska et al. (Intervirology, 39: 9-15 (1996)), сборка частиц, экспонирующих слитые эпитопы, обычно требует присутствия как слияния белок A1-белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL, так и CP дикого типа, чтобы образовать мозаичную частицу. Однако варианты, содержащие вирусоподобные частицы, и, таким образом, в частности, VLP покрывающего белка РНК-фага Qβ, которые состоят исключительно из субъединиц VLP, имеющих по меньшей мере один слитый с ними белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL, также входят в объем данного изобретения.As described by Kozlovska et al. (Intervirology, 39: 9-15 (1996)), the assembly of particles exhibiting fused epitopes typically requires the presence of both a fusion of the RANKL A1 protein, RANKL fragment or RANKL peptide, and wild-type CP to form a mosaic particle. However, variants containing virus-like particles, and thus, in particular, the VLP of the Qβ RNA phage coat protein, which consist exclusively of VLP subunits having at least one RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide, are also included Scope of the Invention
Получение мозаичных частиц можно осуществить рядом способов. Kozlovska et al., Intervirolog., 39: 9-15 (1996) описывают два способа, которые оба можно использовать в практике изобретения. В первом способе эффективное экспонирование слитого эпитопа на VLP опосредовано экспрессией плазмиды, кодирующей слияние белка A1 Qβ, имеющего стоп-кодон UGA между CP и удлинением CP, в штамме E. coli, несущем плазмиду, кодирующую клонированную тРНК-супрессор UGA, который приводит к трансляции кодона UGA в Trp (плазмида pISM3001 (Smiley B.K., et al., Gene 134: 33-40 (1993))). В другом способе стоп-кодон гена CP модифицируют в UAA и проводят котрансфекцию со второй плазмидой, экспрессирующей слияние белка A1 с белком RANKL, фрагментом RANKL или пептидом RANKL. Вторая плазмида кодирует резистентность к различным антибиотикам, и начало репликации совместимо с первой плазмидой (Kozlovska, T.M., et al., Intervirology 39: 9-15 (1996)). В третьем способе CP и слияние белка A1 с белком RANKL, фрагментом RANKL или пептидом RANKL кодируются бицистронным образом при оперативном связывании с таким промотором, как промотор Trp, как описано на фиг.1 в Kozlovska et al., Intervirology, 39: 9-15 (1996).Obtaining mosaic particles can be carried out in a number of ways. Kozlovska et al., Intervirolog., 39: 9-15 (1996) describe two methods that can both be used in the practice of the invention. In the first method, efficient exposure of the fused epitope to VLP is mediated by expression of a plasmid encoding the fusion of A1 Qβ protein having a UGA stop codon between CP and CP extension in an E. coli strain carrying a plasmid encoding a cloned UGA suppressor tRNA that translates UGA codon in Trp (plasmid pISM3001 (Smiley BK, et al., Gene 134: 33-40 (1993))). In another method, the stop codon of the CP gene is modified in UAA and cotransfected with a second plasmid expressing the fusion of Protein A1 with RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide. The second plasmid encodes resistance to various antibiotics, and the onset of replication is compatible with the first plasmid (Kozlovska, T.M., et al., Intervirology 39: 9-15 (1996)). In a third method, CP and fusion of Protein A1 with a RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide are encoded in a bicistronic manner when operatively linked to a promoter such as a Trp promoter, as described in FIG. 1 in Kozlovska et al., Intervirology, 39: 9-15 (1996).
В следующем варианте белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL встраивают между аминокислотами 2 и 3 (нумерация CP после расщепления, то есть в том случае, когда N-концевой метионин отщеплен) CP fr, таким образом получая белковое слияние белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL-CP fr. Описаны векторы и экспрессирующие системы для конструирования и экспрессии слитых белков CP fr, самособирающихся в VLP и применимых в практике изобретения (Pushko P. et al., Prot. Eng. 6:883-891 (1993)). В конкретном варианте последовательность белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL встраивают в делеционный вариант CP fr после аминокислоты 2, когда остатки 3 и 4 CP fr удалены (Pushko P. et al., Prot. Eng. 6:883-891 (1993)).In a further embodiment, the RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide is inserted between
Слияние эпитопов с N-концевой выступающей β-шпилькой покрывающего белка РНК-фага MS-2 и последующая презентация слитого эпитопа на образованной при самосборке VLP РНК-фага MS-2 также описаны (WO 92/13081), и слияние белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL путем инсерции или замены в покрывающем белке РНК-фага MS-2 также попадает в объем изобретения.The fusion of epitopes with the N-terminal protruding β-hairpin of the coating protein of RNA phage MS-2 and the subsequent presentation of the fusion epitope on the self-assembled VLP RNA phage MS-2 are also described (WO 92/13081), and the fusion of the RANKL protein, RANKL fragment or the RANKL peptide by insertion or substitution in the coating protein of the MS-2 RNA phage also falls within the scope of the invention.
В другом варианте изобретения белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL сливают с белком капсида вируса папилломы. В более конкретном варианте белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL сливают с основным белком капсида L1 вируса папилломы крупного рогатого скота типа 1 (BPV-1). Описаны векторы и экспрессирующие системы для конструирования и экспрессии слитых белков BPV-1 в системах бакуловирус/клетки насекомых (Chackerian, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 2373-2378 (1999), WO 00/23955). Замена аминокислот 130-136 L1 BPV-1 белком RANKL, фрагментом RANKL или пептидом RANKL приводит к слитому белку L1 BPV-1-белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL, который является предпочтительным вариантом изобретения. Описано клонирование в бакуловирусном векторе и экспрессия в инфицированных бакуловирусом клетках Sf9, которые могут быть использованы в практике изобретения (Chackerian, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 2373-2378 (1999), WO 00/23955). Очистку собранных частиц, экспонирующих слитый белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL, можно осуществить рядом способов, таких, например, как гель-фильтрация или ультрацентрифугирование в градиенте сахарозы (Chackerian, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 2373-2378 (1999), WO 00/23955).In another embodiment of the invention, the RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide is fused to the papilloma virus capsid protein. In a more specific embodiment, the RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide is fused to the major cattle papilloma virus L1 capsid protein (BPV-1). Vectors and expression systems have been described for the construction and expression of BPV-1 fusion proteins in baculovirus / insect cell systems (Chackerian, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 2373-2378 (1999), WO 00 / 23955). Substitution of amino acids 130-136 L1 BPV-1 with RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide results in a fusion protein L1 BPV-1 RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide, which is a preferred embodiment of the invention. Cloning in a baculovirus vector and expression in baculovirus-infected Sf9 cells that can be used in the practice of the invention are described (Chackerian, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 2373-2378 (1999), WO 00 / 23955). Purification of collected particles exposing the RANKL fusion protein, RANKL fragment or RANKL peptide can be accomplished in a number of ways, such as gel filtration or sucrose gradient ultracentrifugation (Chackerian, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 2373-2378 (1999), WO 00/23955).
В следующем варианте изобретения белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL сливают с белком Ty, способным включаться в VLP Ty. В более конкретном варианте белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL сливают с p1 или белком капсида, кодируемым геном TYA gene (Roth, J.F., Yeast 16: 785-795 (2000)). Дрожжевые ретротранспозоны Ty1, 2, 3 и 4 выделены из Saccharomyces cerevisiae, тогда как ретротранспозон Tf1 выделен из Schizosaccharomyces pombae (Boeke, J.D. and Sandmeyer, S.B., «Yeast Transposable elements,» in The molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces: Genome dynamics, Protein Synthesis, and Energetics., p. 193, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1991)). Ретротранспозоны Ty1 и 2 родственны классу copia элементов растений и животных, тогда как Ty3 относится к семейству ретротранспозонов gypsy, которые родственны ретровирусам растений и животных. В ретротранспозоне Ty1 белок p1, также называемый Gag или капсидным белком, имеет длину 440 аминокислот. P1 расщепляется во время созревания VLP в положении 408, давая белок p2, важный компонент VLP.In a further embodiment, the RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide is fused to a Ty protein capable of being incorporated into Ty VLP. In a more specific embodiment, the RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide is fused to p1 or the capsid protein encoded by the TYA gene (Roth, J.F., Yeast 16: 785-795 (2000)). The yeast retrotransposons Ty1, 2, 3, and 4 are isolated from Saccharomyces cerevisiae, while the retrotransposon Tf1 is isolated from Schizosaccharomyces pombae (Boeke, JD and Sandmeyer, SB, “Yeast Transposable elements,” in The molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomy , Protein Synthesis, and Energetics., P. 193, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1991)). Retrotransposons Ty1 and 2 are related to the copia class of plant and animal elements, while Ty3 belongs to the gypsy family of retrotransposons that are related to plant and animal retroviruses. In the Ty1 retrotransposon, the p1 protein, also called Gag or capsid protein, has a length of 440 amino acids. P1 is cleaved during VLP maturation at position 408, giving p2 protein, an important component of VLP.
Описаны слитые с p1 белки и векторы для экспрессии указанных слитых белков в дрожжах (Adams, S.E., et al., Nature 329: 68-70 (1987)). Таким образом, например, белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL может быть слит с p1 путем инсерции последовательности, кодирующей белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL, в сайт BamH1 плазмиды pMA5620 (Adams, S.E., et al., Nature 329: 68-70 (1987)). Клонирование последовательностей, кодирующих чужеродные эпитопы, в векторе pMA5620 приводит к экспрессии слитых белков, содержащих аминокислоты 1-381 p1 Ty1-15, слитые C-терминально с N-концом чужеродного эпитопа. Подобным образом подразумевается, что N-концевое слияние белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL или внутренняя инсерция в последовательность p1 или замена части последовательности p1 также входит в объем изобретения. В частности, инсерция белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL в последовательность Ty между аминокислотами 30-31, 67-68, 113-114 и 132-133 p1-белка Ty (EP0677111) дает предпочтительные варианты согласно изобретению.Protein fusion proteins and vectors for expressing said fusion proteins in yeast are described (Adams, S.E., et al., Nature 329: 68-70 (1987)). Thus, for example, a RANKL protein, a RANKL fragment or a RANKL peptide can be fused to p1 by inserting a sequence encoding a RANKL protein, a RANKL fragment or a RANKL peptide at the BamH1 site of pMA5620 plasmid (Adams, SE, et al., Nature 329: 68 -70 (1987)). Cloning of sequences encoding foreign epitopes in the pMA5620 vector results in the expression of fusion proteins containing amino acids 1-381 p1 Ty1-15 fused C-terminally with the N-terminus of the foreign epitope. Similarly, it is understood that the N-terminal fusion of a RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide or internal insertion into the p1 sequence or replacement of part of the p1 sequence is also within the scope of the invention. In particular, the insertion of a RANKL protein, a RANKL fragment, or a RANKL peptide into the Ty sequence between amino acids 30-31, 67-68, 113-114 and 132-133 of the Ty p1 protein (EP0677111) gives preferred variants according to the invention.
Следующими VLP, подходящими для слияния белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL, являются, например, частицы, подобные ретровирусам (WO9630523), Gag HIV2 (Kang, Y.C., et al, Biol. Chem. 380: 353-364 (1999)), вирус мозаики вигны (Taylor, K.M. et al., Biol. Chem. 380: 387-392 (1999)), VLP парвовируса VP2 (Rueda, P. et al., Virology 263: 89-99 (1999)), HBsAg (патент США 4722840, EP0020416B1).Further VLPs suitable for fusion of a RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide are, for example, particles like retroviruses (WO9630523), HIV Gag (Kang, YC, et al, Biol. Chem. 380: 353-364 (1999)) Vigna mosaic virus (Taylor, KM et al., Biol. Chem. 380: 387-392 (1999)), Parvovirus VLP VP2 (Rueda, P. et al., Virology 263: 89-99 (1999)), HBsAg (US patent 4722840, EP0020416B1).
Примерами химерных VLP, подходящими для практики изобретения, также являются VLP, описанные в Intervirology 39: 1 (1996). Следующими примерами VLP, предполагаемыми для применения в изобретении, являются: HPV-1, HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-33, HPV-45, CRPV, COPV, GAG HIV, вирус табачной мозаики. Также получены вирусоподобные частицы SV-40, вируса полиомы, аденовируса, вируса простого герпеса, ротавируса и вируса Норуолк, и химерные VLP на основе указанных VLP также входят в объем данного изобретения.Examples of chimeric VLPs suitable for practicing the invention are also the VLPs described in Intervirology 39: 1 (1996). The following examples of VLP proposed for use in the invention are: HPV-1, HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-33, HPV-45, CRPV, COPV, HIV GAG, tobacco mosaic virus . Virus-like particles of SV-40, polyoma virus, adenovirus, herpes simplex virus, rotavirus and Norwalk virus were also obtained, and chimeric VLPs based on these VLPs are also included in the scope of this invention.
В следующем предпочтительном варианте данного изобретения антигеном или антигенной детерминантой является белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL.In a further preferred embodiment of the invention, the antigen or antigenic determinant is a RANKL protein, a RANKL fragment or a RANKL peptide.
В следующем очень предпочтительном варианте изобретения антигеном или антигенной детерминантой является белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL человека.In a very highly preferred embodiment of the invention, the antigen or antigenic determinant is a RANKL protein, a RANKL fragment or a human RANKL peptide.
В следующем очень предпочтительном варианте изобретения антиген или антигенная детерминанта содержит, альтернативно, по существу состоит или, альтернативно, состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из a) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:79; b) аминокислотной последовательности любого фрагмента SEQ ID NO:79.In a further very preferred embodiment of the invention, the antigen or antigenic determinant comprises, alternatively, essentially consists of or, alternatively, consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of a) amino acid sequence of SEQ ID NO: 79; b) the amino acid sequence of any fragment of SEQ ID NO: 79.
В следующем предпочтительном варианте изобретения антигеном или антигенной детерминантой является вариант белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL, например, в частности, содержащий аминокислотные замены или инсерции пептидов или полиморфизмы. Как уже указано, композиции и, соответственно, композиции вакцин, содержащие варианты белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL, включены в объем данного изобретения.In a further preferred embodiment of the invention, the antigen or antigenic determinant is a variant of the RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide, for example, in particular, containing amino acid substitutions or insertions of peptides or polymorphisms. As already indicated, compositions and, accordingly, vaccine compositions containing variants of the RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide are included in the scope of this invention.
В следующем предпочтительном варианте изобретения антигеном или антигенной детерминантой является фрагмент RANKL. Предпочтительно антигеном или антигенной детерминантой является фрагмент RANKL человека, выбранный из группы, состоящей из a) внеклеточной области RANKL человека, b) изоформы 1 сплайсинга RANKL человека, c) изоформы 2 сплайсинга, результатом которого является секретируемый RANKL человека, d) протеолитически получаемого растворимого участка RANKL человека и e) области гомологии с TNF-α.In a further preferred embodiment of the invention, the antigen or antigenic determinant is a RANKL fragment. Preferably, the antigen or antigenic determinant is a human RANKL fragment selected from the group consisting of a) extracellular region of human RANKL, b)
В следующем очень предпочтительном варианте изобретения антиген или антигенная детерминанта содержит, альтернативно, по существу состоит или, альтернативно, состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из a) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:79; b) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:80; c) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:81; d) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:82; e) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:83; f) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:84; g) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:100; h) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:101; i) аминокислотной последовательности любого фрагмента любой из SEQ ID NO:79-84, 100, 101.In a further very preferred embodiment of the invention, the antigen or antigenic determinant comprises, alternatively, essentially consists of or, alternatively, consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of a) amino acid sequence of SEQ ID NO: 79; b) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 80; c) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 81; d) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82; e) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 83; f) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 84; g) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100; h) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101; i) the amino acid sequence of any fragment of any of SEQ ID NO: 79-84, 100, 101.
Белок RANKL или фрагменты RANKL можно получить путем экспрессии кДНК RANKL в прокариотических или эукариотических системах экспрессии. Различные их примеры описаны в литературе и могут быть использованы, возможно, после модификаций, чтобы экспрессировать любой белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL любого требуемого вида. Белок RANKL и фрагменты RANKL были экспрессированы в клетках млекопитающих (Anderson, D. M., et al., Nature 390: 175-179 (1997), Lacey, D.L., et al., Cell 93: 165-176 (1998), Wong B.R., et al., J. Biol. Chem. 272: 25190-25194 (1997), Lum, L., et al., J. Biol. Chem. 274: 13613-13618 (2000)), в клетках насекомых (Willard, D., et al., Prot. Express. Purif. 20: 48-57 (2000)) и в прокариотических клетках (Xu, J., et al., J. Bone Mineral Res. 15: 2178-86 (2000), Yasuda et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95: 3597-3602 (1998)). Описания того, как получить белки и фрагменты RANKL, также приведены в WO 9846751, патенте США 5843678, WO 98259958, патенте США 6242586, WO 9828426, патенте США 6242213, WO 9929865, патенте Японии 2000102390 и WO 0015807.RANKL protein or RANKL fragments can be obtained by expressing RANKL cDNA in prokaryotic or eukaryotic expression systems. Various examples thereof are described in the literature and may be used, possibly after modifications, to express any RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide of any desired type. The RANKL protein and RANKL fragments were expressed in mammalian cells (Anderson, DM, et al., Nature 390: 175-179 (1997), Lacey, DL, et al., Cell 93: 165-176 (1998), Wong BR, et al., J. Biol. Chem. 272: 25190-25194 (1997), Lum, L., et al., J. Biol. Chem. 274: 13613-13618 (2000)), in insect cells (Willard, D., et al., Prot. Express. Purif. 20: 48-57 (2000)) and in prokaryotic cells (Xu, J., et al., J. Bone Mineral Res. 15: 2178-86 (2000) Yasuda et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95: 3597-3602 (1998)). Descriptions of how to obtain RANKL proteins and fragments are also given in WO 9846751, US Pat. No. 5,843,678, WO 98259958, US Pat. No. 6,242,586, WO 9828426, US Pat.
В следующем предпочтительном варианте изобретения антигеном или антигенной детерминантой является пептид RANKL. Такие пептиды RANKL или их фрагменты можно получить с использованием стандартных методов молекулярной биологии, при которых нуклеотидную последовательность, кодирующую представляющий интерес фрагмент, амплифицируют с помощью ПЦР и клонируют в виде слияния с полипептидной меткой, такой как гистидиновая метка, Flag-метка, myc-метка или константная область антитела (Fc-область). При введении сайта расщепления протеазой между фрагментом RANKL и меткой фрагмент RANKL можно отделить от метки после очистки, расщепляя соответствующей протеазой. В другом способе фрагмент RANKL можно синтезировать in vitro, используя стандартные реакции пептидного синтеза, известные специалисту в данной области. В следующем способе пептиды RANKL или фрагменты RANKL можно получить расщеплением протеазой или химическим расщеплением полноразмерного белка RANKL или фрагментов RANKL, оба способа хорошо известны специалистам в данной области.In a further preferred embodiment, the antigen or antigenic determinant is the RANKL peptide. Such RANKL peptides or fragments thereof can be obtained using standard molecular biology methods in which the nucleotide sequence encoding the fragment of interest is amplified by PCR and cloned into a fusion with a polypeptide tag, such as a histidine tag, Flag tag, myc tag or a constant region of an antibody (Fc region). By introducing a protease cleavage site between the RANKL fragment and the label, the RANKL fragment can be separated from the label after purification by digesting with the appropriate protease. In another method, a RANKL fragment can be synthesized in vitro using standard peptide synthesis reactions known to one skilled in the art. In the following method, RANKL peptides or RANKL fragments can be obtained by protease cleavage or chemical cleavage of a full-sized RANKL protein or RANKL fragments, both methods are well known to those skilled in the art.
В еще одном предпочтительном варианте данного изобретения антиген или антигенная детерминанта, кроме того, содержит по меньшей мере один второй сайт связывания, выбранный из группы, состоящей из (i) сайта связывания неприродного происхождения с указанным антигеном или антигенной детерминантой; и (ii) сайта связывания природного происхождения с указанным антигеном или антигенной детерминантой. Руководство по поводу того, как модифицировать белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL для связывания с вирусоподобной частицей, дано на протяжении данной заявки. Предпочтительные вторые сайты связывания содержат остаток цистеина для связывания с дериватизованной VLP, и примеры приведены в описании выше и в примерах 12 и 13.In a further preferred embodiment of the invention, the antigen or antigenic determinant further comprises at least one second binding site selected from the group consisting of (i) a binding site of non-natural origin with said antigen or antigenic determinant; and (ii) a binding site of natural origin with the specified antigen or antigenic determinant. Guidance on how to modify a RANKL protein, RANKL fragment, or RANKL peptide to bind to a virus-like particle is given throughout this application. Preferred second binding sites contain a cysteine residue for binding to a derivatized VLP, and examples are given in the description above and in examples 12 and 13.
Авторы построили модель 3-мерной структуры области RANKL человека, которая гомологична TNF-α. Авторы обнаружили, что цистеин природного происхождения может быть недоступным в подвергнутой укладке структуре для взаимодействия с первый сайтом связывания на VLP согласно данному изобретению. Модель авторов подтверждена рентгеновской структурой RANKL мыши, которая была недавно получена (Lam, J., et al., J. Clin. Invest., 108: 971-979 (2002)). N-конец является предпочтительным для присоединения второго сайта связывания, содержащего аминокислотный линкер с дополнительным остатком цистеина, как показано в примере 12. Однако аминокислотный линкер, содержащий остаток цистеина в качестве второго сайта связывания и слитый с C-концом конструкции RANKL, дает в результате следующий предпочтительный вариант согласно изобретению, который показан в примере 13. Конструкция RANKL человека с N-концевым аминокислотным линкером, содержащим остаток цистеина, слитым с внеклеточной областью RANKL, является очень предпочтительным вариантом изобретения.The authors constructed a model of the 3-dimensional structure of the human RANKL region, which is homologous to TNF-α. The authors found that naturally occurring cysteine may not be available in the stacked structure to interact with the first VLP binding site of the present invention. The authors' model is confirmed by the X-ray structure of the mouse RANKL, which was recently obtained (Lam, J., et al., J. Clin. Invest., 108: 971-979 (2002)). The N-terminus is preferred for attaching a second binding site containing an amino acid linker with an additional cysteine residue, as shown in Example 12. However, an amino acid linker containing a cysteine residue as a second binding site and fused to the C-terminus of the RANKL construct results in the following the preferred embodiment according to the invention, which is shown in Example 13. The human RANKL construct with an N-terminal amino acid linker containing a cysteine residue fused to the extracellular region of RANKL is They are very preferred embodiment of the invention.
Описаны конструкции фрагментов RANKL мыши (SEQ ID NO:96 и SEQ ID NO:99), и также могут быть созданы предпочтительные конструкции фрагментов RANKL человека и иметь, например, последовательность SEQ ID NO:100-104. Следующие предпочтительные конструкции содержат полный белок RANKL человека, фрагмент RANKL человека, выбранный из группы, состоящей из a) внеклеточной области RANKL (SEQ ID NO:82), b) изоформы 1 сплайсинга RANKL (SEQ ID NO:80), c) изоформы 2 сплайсинга, результатом которого является секретируемый RANKL (SEQ ID NO:81), d) протеолитически получаемого растворимого участка RANKL (SEQ ID NO:83) и e) области гомологии с TNF-α (SEQ ID NO:84) или последовательностей пептидов RANKL человека. Иммунизация против белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL с использованием композиций согласно изобретению, содержащих предпочтительно белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL человека, связанный с VLP, может дать способ лечения или профилактики заболеваний кости.Described constructions of mouse RANKL fragments (SEQ ID NO: 96 and SEQ ID NO: 99), and preferred constructs of human RANKL fragments can also be created and have, for example, the sequence of SEQ ID NO: 100-104. The following preferred constructs comprise a complete human RANKL protein, a human RANKL fragment selected from the group consisting of a) the extracellular region of RANKL (SEQ ID NO: 82), b) RANKL splicing isoform 1 (SEQ ID NO: 80), c)
В следующем предпочтительном варианте данного изобретения белок RANKL, фрагмент RANKL или пептид RANKL содержит по меньшей мере один антигенный сайт белка RANKL. Специалисту в данной области известно, как идентифицировать соответствующие пептиды и аминокислотные последовательности, соответственно.In a further preferred embodiment of the invention, the RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide contains at least one antigenic site of the RANKL protein. One skilled in the art knows how to identify the corresponding peptides and amino acid sequences, respectively.
В следующем предпочтительном варианте данного изобретения антигеном или антигенной детерминантой является пептид RANKL, который является ключевым для взаимодействия с рецептором RANK. Моделирование авторов структуры RANKL человека и опубликованная кристаллическая структура RANKL мыши показали, что мономер RANKL состоит из β-сандвича, состоящего из двух плоских антипараллельных β-слоев. Первый слой образован β-нитями A", A, H, C и F, тогда как второй слой образован β-нитями B', B, G, D и E. Внутренний β-слой A"AHCF вовлечен в ассоциацию между субъединицами, тогда как β-слой B'BGDE в значительной степени вносит вклад в наружную поверхность. β-нити связаны через петлю AA", петлю CD, петлю DE, петлю EF. Сборка гомотримера осуществляется так, что один край β-сэндвича в каждом мономере RANKL укладывается против внутренней гидрофобной поверхности β-слоя AHCF соседнего мономера. Предполагается, что сайт связывания RANK включает в себя карман, образованный соседними мономерами гомотримера. На основании гомологии между последовательностью мыши и человека выбраны пептиды, которые включают в себя сайт связывания RANK. В предпочтительном варианте пептиды из сайта взаимодействия RANKL с RANK выбраны из группы, состоящей из a) петли AA", включающей в себя аминокислоты 171-194 (SEQ ID NO:87), b) петли DE, включающей в себя аминокислоты 246-253 (SEQ ID NO:88), c) β-нити D, включающей в себя аминокислоты 235-245 (SEQ ID NO:89), d) петли CD, включающей в себя аминокислоты 223-234 (SEQ ID NO:90), e) петли EF, включающей в себя 262-272 (SEQ ID NO:91), f) β-нити B'-петли B'B, включающих в себя аминокислоты 200-207 (SEQ ID NO:92), g) петли GH, включающей в себя аминокислоты 300-305 (SEQ ID NO:93), h) любого фрагмента указанных пептидов a-g, i) любых N- и/или C-концевых удлинений указанных пептидов a-g по меньшей мере на одну аминокислоту и до 25 аминокислот, j) любого слияния пептидов a-i). Следующие пептиды RANKL, подходящие для применения в данном изобретении, можно определить экспериментально по свойственной им особенности индуцировать T-клеточный или гуморальный ответ. В основном это осуществляется иммунизацией экспериментального животного отдельно выбранными пептидами в иммунологически подходящей композиции и измерением T-клеточного и B-клеточного, т.е. гуморального ответа с использованием способов, известных специалисту в данной области. В том случае, когда антиген является белком, полипептидом или пептидом, указанная область может быть образована непрерывной аминокислотной последовательностью. Альтернативно эпитоп антитела может быть образован прерывистой аминокислотной последовательностью, в которой после трехмерной укладки белка, полипептида или пептида аминокислоты располагаются таким образом, что они пространственно становятся ближе друг к другу и образуют эпитоп. Представляющие интерес непрерывные пептидные фрагменты можно идентифицировать с помощью экспериментов по иммунизации, которые описаны выше.In a further preferred embodiment of the invention, the antigen or antigenic determinant is the RANKL peptide, which is key for interacting with the RANK receptor. Modeling of the authors of the human RANKL structure and the published crystal structure of the mouse RANKL showed that the RANKL monomer consists of a β-sandwich consisting of two planar antiparallel β-layers. The first layer is formed by β-strands A ", A, H, C and F, while the second layer is formed by β-strands B ', B, G, D and E. The inner β-layer A" AHCF is involved in the association between subunits, then how the β-layer of B'BGDE contributes significantly to the outer surface. The β-strands are connected through an AA "loop, a CD loop, a DE loop, an EF loop. The homotrimer is assembled so that one edge of the β-sandwich in each RANKL monomer is laid against the inner hydrophobic surface of the β-layer AHCF of the neighboring monomer. It is assumed that the binding site RANK includes a pocket formed by adjacent homotrimer monomers. Based on homology between the mouse and human sequences, peptides that include the RANK binding site are selected. In a preferred embodiment, the peptides from the RANKL-RANK interaction site are selected from a group consisting of a) an AA "loop comprising amino acids 171-194 (SEQ ID NO: 87), b) a DE loop comprising amino acids 246-253 (SEQ ID NO: 88), c) β-strands D, comprising amino acids 235-245 (SEQ ID NO: 89), d) a loop of CD, including amino acids 223-234 (SEQ ID NO: 90), e) a loop of EF, including 262-272 (SEQ ID NO: 91), f) β-strands of the B'-loop of B'B, including amino acids 200-207 (SEQ ID NO: 92), g) of the GH loop, including amino acids 300-305 (SEQ ID NO : 93), h) any fragment of said peptides ag, i) any N- and / or C-terminal extensions of said peptides ag by at least one amino acid and up to 25 amino islot, j) any fusion of peptides a-i). The following RANKL peptides suitable for use in this invention can be determined experimentally by their inherent characteristic to induce a T-cell or humoral response. This is mainly accomplished by immunizing an experimental animal with individually selected peptides in an immunologically suitable composition and measuring T-cell and B-cell, i.e. a humoral response using methods known to one skilled in the art. In the case where the antigen is a protein, polypeptide or peptide, this region may be formed by a continuous amino acid sequence. Alternatively, an antibody epitope may be formed by a discontinuous amino acid sequence in which, after three-dimensional folding of a protein, polypeptide or peptide, the amino acids are arranged so that they spatially become closer to each other and form an epitope. Continuous peptide fragments of interest can be identified using the immunization experiments described above.
Следующие предпочтительные пептиды RANKL, подходящие для применения в данном изобретении, можно идентифицировать с использованием существующих или будущих моноклональных или поликлональных антител, способы для осуществления этого известны специалистам в данной области.The following preferred RANKL peptides suitable for use in this invention can be identified using existing or future monoclonal or polyclonal antibodies; methods for accomplishing this are known to those skilled in the art.
Следующие пептиды RANKL, подходящие для применения в данном изобретении, можно идентифицировать посредством скрининга пептидных библиотек в фаговом дисплее с помощью антител, специфичных по отношению к RANKL, способом, хорошо известным специалисту в данной области.The following RANKL peptides suitable for use in this invention can be identified by screening peptide libraries in phage display using antibodies specific for RANKL in a manner well known to one skilled in the art.
В следующем предпочтительном варианте изобретения антигеном или антигенной детерминантой является изолированный RANKL любого животного, а также любые антигенные фрагменты RANKL любого животного. Специалистам в данной области известно, как получить фрагменты и пептиды из указанного выделенного белка или фрагментов RANKL.In a further preferred embodiment, the antigen or antigenic determinant is an isolated RANKL of any animal, as well as any RANKL antigenic fragments of any animal. Those skilled in the art know how to obtain fragments and peptides from said isolated protein or RANKL fragments.
Специалисту в областях, имеющих отношение к данной проблеме, будет понятно, что легко предположить другие подходящие модификации и адаптации способов и применений, описанных в данной заявке, и их можно осуществить, не выходя за пределы объема изобретения и его любого варианта. Теперь, после подробного описания данного изобретения, то же самое будет более четко понятным при обращении к следующим примерам, которые, таким образом, включены только в целях иллюстрации и не предназначены для ограничения изобретения.It will be understood by those skilled in the art that it is easy to assume other suitable modifications and adaptations of the methods and applications described in this application, and they can be carried out without departing from the scope of the invention and any variant thereof. Now, after a detailed description of the present invention, the same will be more clearly understood when referring to the following examples, which are thus included for purposes of illustration only and are not intended to limit the invention.
ПРИМЕР 1EXAMPLE 1
Конструирование и экспрессия мутантных покрывающих белков Qβ и очистка VLP или капсидов из мутантных покрывающих белков QβConstruction and expression of mutant Qβ coat proteins and purification of VLP or capsids from mutant Qβ coat proteins
Конструирование плазмиды и клонирование мутантных покрывающих белковPlasmid Construction and Cloning of Mutant Coating Proteins
Конструирование pQβ-240:Construction of pQβ-240:
Плазмиду pQβ10 (Kozlovska, TM, et al., Gene 137: 133-137) использовали в качестве исходной плазмиды для конструирования pQβ-240. Мутацию Lys13→Arg создавали обратной ПЦР. Обратные праймеры конструировали в обратных направлениях «хвост к хвосту»:Plasmid pQβ10 (Kozlovska, TM, et al., Gene 137: 133-137) was used as the starting plasmid for constructing pQβ-240. The Lys13 → Arg mutation was generated by reverse PCR. Reverse primers were designed in the reverse tail-to-tail directions:
иand
Продукты первой ПЦР использовали в качестве матриц для второй реакции ПЦР, в которой использовали верхний праймерThe products of the first PCR were used as templates for the second PCR reaction in which the top primer was used
и нижний праймерand lower primer
Продукт второй ПЦР расщепляли XbaI и Mph1103I и клонировали в экспрессирующем векторе pQβ10, который расщепляли такими же ферментами рестрикции. Реакции ПЦР осуществляли с использованием реагентов из набора для ПЦР и согласно протоколу производителя (MIX Fermentas, Vilnius, Lithuania).The second PCR product was digested with XbaI and Mph1103I and cloned in the pQβ10 expression vector, which was digested with the same restriction enzymes. PCR reactions were carried out using reagents from the PCR kit and according to the manufacturer's protocol (MIX Fermentas, Vilnius, Lithuania).
Секвенирование с использованием способа прямого включения метки подтвердило требуемые мутации. Клетки E. coli, несущие pQβ-240, поддерживали эффективный синтез белка 14 кД, мигрирующего в SDS-ПААГ совместно с контрольным покрывающим белком Qβ, выделенным из частиц фага Qβ.Sequencing using the direct tag labeling method confirmed the required mutations. E. coli cells carrying pQβ-240 supported efficient synthesis of 14 kDa protein migrating to SDS-PAGE together with a control Qβ coat protein isolated from Qβ phage particles.
Полученная в результате аминокислотная последовательность: (SEQ ID NO:23)The resulting amino acid sequence: (SEQ ID NO: 23)
Конструирование pQβ-243:Construction of pQβ-243:
Плазмиду pQβ10 использовали в качестве исходной плазмиды для конструирования pQβ-243. Мутацию Asn10→Lys создавали обратной ПЦР. Обратные праймеры конструировали в обратных направлениях «хвост к хвосту»:Plasmid pQβ10 was used as the starting plasmid for the construction of pQβ-243. The Asn10 → Lys mutation was generated by reverse PCR. Reverse primers were designed in the reverse tail-to-tail directions:
иand
Продукты первой ПЦР использовали в качестве матриц для второй реакции ПЦР, в которой использовали верхний праймерThe products of the first PCR were used as templates for the second PCR reaction in which the top primer was used
и нижний праймерand lower primer
Продукт второй ПЦР расщепляли XbaI и Mph1103I и клонировали в экспрессирующем векторе pQβ10, который расщепляли такими же ферментами рестрикции. Реакции ПЦР осуществляли с использованием реагентов из набора для ПЦР и согласно протоколу производителя (MBI Fermentas, Vilnius, Lithuania).The second PCR product was digested with XbaI and Mph1103I and cloned in the pQβ10 expression vector, which was digested with the same restriction enzymes. PCR reactions were carried out using reagents from the PCR kit and according to the manufacturer's protocol (MBI Fermentas, Vilnius, Lithuania).
Секвенирование с использованием способа прямого включения метки подтвердило требуемые мутации. Клетки E. coli, несущие pQβ-243, поддерживали эффективный синтез белка 14 кД, мигрирующего в SDS-ПААГ совместно с контрольным покрывающим белком Qβ, выделенным из частиц фага Qβ.Sequencing using the direct tag labeling method confirmed the required mutations. E. coli cells bearing pQβ-243 supported efficient synthesis of 14 kDa protein migrating to SDS-PAGE together with a control coating protein Qβ isolated from particles of phage Qβ.
Полученная в результате аминокислотная последовательность: (SEQ ID NO:24)The resulting amino acid sequence: (SEQ ID NO: 24)
Конструирование pQβ-250:Construction of pQβ-250:
Плазмиду pQβ-240 использовали в качестве исходной плазмиды для конструирования pQβ-250. Мутацию Lys2→Arg создавали сайт-специфичным мутагенезом. Верхний праймерPlasmid pQβ-240 was used as the starting plasmid for the construction of pQβ-250. The Lys2 → Arg mutation was created by site-specific mutagenesis. Top primer
и нижний праймерand lower primer
использовали для синтеза мутантного ПЦР-фрагмента, который вводили в экспрессирующий вектор pQβ-185 в уникальные сайты рестрикции NcoI и HindIII. Реакции ПЦР осуществляли с использованием реагентов из набора для ПЦР и согласно протоколу производителя (MBI Fermentas, Vilnius, Lithuania).used for the synthesis of a mutant PCR fragment, which was introduced into the expression vector pQβ-185 at the unique restriction sites NcoI and HindIII. PCR reactions were carried out using reagents from the PCR kit and according to the manufacturer's protocol (MBI Fermentas, Vilnius, Lithuania).
Секвенирование с использованием способа прямого включения метки подтвердило требуемые мутации. Клетки E. coli, несущие pQβ-250, поддерживали эффективный синтез белка 14 кД, мигрирующего в ПААГ совместно с контрольным покрывающим белком Qβ, выделенным из частиц фага Qβ.Sequencing using the direct tag labeling method confirmed the required mutations. E. coli cells carrying pQβ-250 supported efficient synthesis of 14 kDa protein migrating to PAGE together with a control Qβ coat protein isolated from Qβ phage particles.
Полученная в результате аминокислотная последовательность: (SEQ ID NO:25)The resulting amino acid sequence: (SEQ ID NO: 25)
Конструирование pQβ-251:Construction of pQβ-251:
Плазмиду pQβ10 использовали в качестве исходной плазмиды для конструирования pQβ-251. Мутацию Lys16→Arg создавали обратной ПЦР. Обратные праймеры конструировали в обратных направлениях «хвост к хвосту»:Plasmid pQβ10 was used as the starting plasmid for the construction of pQβ-251. The Lys16 → Arg mutation was generated by reverse PCR. Reverse primers were designed in the reverse tail-to-tail directions:
иand
Продукты первой ПЦР использовали в качестве матриц для второй реакции ПЦР, в которой использовали верхний праймерThe products of the first PCR were used as templates for the second PCR reaction in which the top primer was used
и нижний праймерand lower primer
Продукт второй ПЦР расщепляли XbaI и Mph1103I и клонировали в экспрессирующем векторе pQβ10, который расщепляли такими же ферментами рестрикции. Реакции ПЦР осуществляли с использованием реагентов из набора для ПЦР и согласно протоколу производителя (MBI Fermentas, Vilnius, Lithuania).The second PCR product was digested with XbaI and Mph1103I and cloned in the pQβ10 expression vector, which was digested with the same restriction enzymes. PCR reactions were carried out using reagents from the PCR kit and according to the manufacturer's protocol (MBI Fermentas, Vilnius, Lithuania).
Секвенирование с использованием способа прямого включения метки подтвердило требуемые мутации. Клетки E. coli, несущие pQβ-251, поддерживали эффективный синтез белка 14 кД, мигрирующего в SDS-ПААГ совместно с контрольным покрывающим белком Qβ, выделенным из частиц фага Qβ. Полученная в результате аминокислотная последовательность, кодируемая данной конструкцией, показана в SEQ ID NO:26.Sequencing using the direct tag labeling method confirmed the required mutations. E. coli cells carrying pQβ-251 supported efficient synthesis of 14 kDa protein migrating to SDS-PAGE together with a control Qβ coat protein isolated from Qβ phage particles. The resulting amino acid sequence encoded by this construct is shown in SEQ ID NO: 26.
Конструирование pQβ-259:Construction of pQβ-259:
Плазмиду pQβ-251 использовали в качестве исходной плазмиды для конструирования pQβ-259. Мутацию Lys2→Arg создавали сайт-специфичным мутагенезом. Верхний праймерPlasmid pQβ-251 was used as the starting plasmid for the construction of pQβ-259. The Lys2 → Arg mutation was created by site-specific mutagenesis. Top primer
и нижний праймерand lower primer
использовали для синтеза мутантного ПЦР-фрагмента, который вводили в экспрессирующий вектор pQβ-185 в уникальные сайты рестрикции NcoI и HindIII. Реакции ПЦР осуществляли с использованием реагентов из набора для ПЦР и согласно протоколу производителя (MBI Fermentas, Vilnius, Lithuania).used for the synthesis of a mutant PCR fragment, which was introduced into the expression vector pQβ-185 at the unique restriction sites NcoI and HindIII. PCR reactions were carried out using reagents from the PCR kit and according to the manufacturer's protocol (MBI Fermentas, Vilnius, Lithuania).
Секвенирование с использованием способа прямого включения метки подтвердило требуемые мутации. Клетки E. coli, несущие pQβ-259, поддерживали эффективный синтез белка 14 кД мигрирующего в SDS-ПААГ совместно с контрольным покрывающим белком Qβ, выделенным из частиц фага Qβ.Sequencing using the direct tag labeling method confirmed the required mutations. E. coli cells carrying pQβ-259 supported efficient synthesis of the 14 kDa protein migrating to SDS-PAGE together with a control Qβ coat protein isolated from Qβ phage particles.
Полученная в результате аминокислотная последовательность: (SEQ ID NO:27)The resulting amino acid sequence: (SEQ ID NO: 27)
Общие способы экспрессии и очистки Qβ и мутантов QβGeneral methods for the expression and purification of Qβ and Qβ mutants
ЭкспрессияExpression
E. coli JM109 трансформировали плазмидами, экспрессирующими покрывающий белок Qβ. В 5 мл жидкой среды LB, содержащей 20 мкг/мл ампициллина, инокулировали клоны, трансформированные плазмидами, экспрессирующими покрывающий белок Qβ. Инокулированную культуру инкубировали при 37°C в течение 16-24 час без встряхивания. Затем полученный инокулят разводили 1:100 в 100-300 мл свежей среды LB, содержащей 20 мкг/мл ампициллина, и инкубировали при 37°C в течение ночи без встряхивания. Полученный в результате второй инокулят разводили 1:50 в среде M9, содержащей 1% казаминовых кислот и 0,2% глюкозы, в колбах и инкубировали при 37°C в течение ночи при встряхивании.E. coli JM109 was transformed with plasmids expressing the Qβ coat protein. In 5 ml of LB liquid medium containing 20 μg / ml ampicillin, clones transformed with plasmids expressing the Qβ coat protein were inoculated. The inoculated culture was incubated at 37 ° C for 16-24 hours without shaking. Then, the resulting inoculum was diluted 1: 100 in 100-300 ml of fresh LB medium containing 20 μg / ml ampicillin and incubated at 37 ° C overnight without shaking. The resulting second inoculum was diluted 1:50 in M9 medium containing 1% casamino acids and 0.2% glucose in flasks and incubated at 37 ° C overnight with shaking.
ОчисткаCleaning
Растворы и буферы для способа очистки:Solutions and buffers for the cleaning method:
1. Лизирующий буфер LB 1. Lysing buffer LB
50 мМ трис-HCl pH 8,0 с 5 мМ EDTA; 0,1% тритоном X100 и свежеприготовленным PMSF в концентрации 5 микрограмм на мл, без лизоцима и ДНКазы.50 mM Tris-HCl pH 8.0 with 5 mM EDTA; 0.1% Triton X100 and freshly prepared PMSF at a concentration of 5 micrograms per ml, without lysozyme and DNase.
2. SAS 2. SAS
Насыщенный раствор сульфата аммония в воде.A saturated solution of ammonium sulfate in water.
3. Буфер NET 3. NET buffer
20 мМ трис-HCl, pH 7,8 с 5 мМ EDTA и 150 мМ NaCl.20 mM Tris-HCl, pH 7.8 with 5 mM EDTA and 150 mM NaCl.
4. ПЭГ 4. PEG
40% (мас./об.) полиэтиленгликоль 6000 в NET.40% (w / v) polyethylene glycol 6000 in NET.
Разрушение и лизисDestruction and lysis
Замороженные клетки ресуспендировали в LB из расчета 2 мл/г клеток. Смесь обрабатывали ультразвуком при 22 кГц пять раз по 15 секунд с интервалами 1 мин, чтобы охладить раствор на льду. Затем лизат центрифугировали при 14000 об/мин в течение 1 час, используя ротор Janecki K 60. Все описанные ниже стадии центрифугирования осуществляли с использованием такого же ротора, если не оговорено особо. Надосадок хранили при 4°C, тогда как обломки клеток дважды промывали в LB. После центрифугирования надосадки и промывные фракции объединяли.Frozen cells were resuspended in LB at the rate of 2 ml / g cells. The mixture was sonicated at 22 kHz five times for 15 seconds at intervals of 1 min to cool the solution on ice. The lysate was then centrifuged at 14,000 rpm for 1 hour using a
ФракционированиеFractionation
К описанному выше объединенному лизату по каплям при перемешивании добавляли насыщенный раствор сульфата аммония. Объем SAS доводили до одной пятой общего объема, чтобы получить 20% насыщения. Раствор оставляли стоять в течение ночи и центрифугировали на следующий день при 14000 об/мин в течение 20 мин. Осадок промывали небольшим количеством 20% сульфата аммония и снова центрифугировали. Полученные надосадки объединяли и по каплям добавляли SAS, чтобы получить 40% насыщения. Раствор оставляли стоять в течение ночи и на следующий день центрифугировали при 14000 об/мин в течение 20 мин. Полученный осадок растворяли в буфере NET.To the combined lysate described above, a saturated solution of ammonium sulfate was added dropwise with stirring. The SAS volume was adjusted to one fifth of the total volume to obtain 20% saturation. The solution was allowed to stand overnight and centrifuged the next day at 14,000 rpm for 20 minutes. The precipitate was washed with a small amount of 20% ammonium sulfate and centrifuged again. The resulting supernatants were combined and SAS was added dropwise to obtain 40% saturation. The solution was allowed to stand overnight and the next day was centrifuged at 14,000 rpm for 20 minutes. The resulting precipitate was dissolved in NET buffer.
ХроматографияChromatography
Капсид или белок VLP, перерастворенный в буфере NET, наносили на колонку с сефарозой CL-4B. В ходе хроматографии элюировали три пика. Первый пик главным образом содержал мембраны и фрагменты мембран, и его не собирали. Капсиды находились во втором пике, тогда как третий пик содержал другие белки E. coli.The capsid or VLP protein redissolved in NET buffer was applied to a CL-4B Sepharose column. Three peaks were eluted during chromatography. The first peak mainly contained membranes and membrane fragments, and it was not collected. Capsids were in the second peak, while the third peak contained other E. coli proteins.
Фракции пика объединяли и концентрацию NaCl доводили до конечной концентрации 0,65 М. По каплям при перемешивании добавляли объем раствора ПЭГ, соответствующий половине объединенной фракции пика. Раствор оставляли стоять в течение ночи без перемешивания. Белок капсида осаждали центрифугированием при 14000 об/мин в течение 20 мин. Затем его растворяли в минимальном объеме NET и снова нагружали на колонку с сефарозой CL-4B. Фракции пика объединяли и осаждали сульфатом аммония при 60% насыщении (мас./об.). После центрифугирования и перерастворения в буфере NET белок капсида нагружали на колонку с сефарозой CL-6B для повторной хроматографии.The peak fractions were combined and the NaCl concentration was adjusted to a final concentration of 0.65 M. A volume of PEG solution corresponding to half of the combined peak fraction was added dropwise with stirring. The solution was left to stand overnight without stirring. The capsid protein was precipitated by centrifugation at 14,000 rpm for 20 minutes. Then it was dissolved in a minimal volume of NET and again loaded onto a CL-4B Sepharose column. Peak fractions were combined and precipitated with ammonium sulfate at 60% saturation (w / v). After centrifugation and reconstitution in NET buffer, the capsid protein was loaded onto a CL-6B Sepharose column for rechromatography.
Диализ и сушкаDialysis and drying
Фракции пиков, полученные, как описано выше, объединяли и диализовали против большого объема стерильной воды и лиофилизовали для хранения.Peak fractions obtained as described above were pooled and dialyzed against a large volume of sterile water and lyophilized for storage.
Экспрессия и очистка Qβ-240Expression and purification of Qβ-240
Клетки (E. coli JM 109, трансформированные плазмидой pQβ-240) ресуспендировали в LB, обрабатывали ультразвуком пять раз по 15 секунд (рубашка, содержащая воду со льдом) и центрифугировали при 13000 об/мин в течение одного часа. Надосадок хранили при 4°C вплоть до дальнейшей обработки, тогда как обломки клеток 2 раза промывали 9 мл LB и, наконец, 9 мл 0,7 М мочевины в LB. Все надосадки объединяли и нагружали на колонку с сефарозой CL-4B. Объединенные фракции пика осаждали сульфатом аммония и центрифугировали. Затем перерастворенный белок снова очищали на колонке с сефарозой 2B и, наконец, на колонке с сефарозой 6B. Наконец пик капсида диализовали против большого объема воды и лиофилизовали, как описано выше. Сборку покрывающего белка в капсид подтверждали электронной микроскопией.Cells (
Экспрессия и очистка Qβ-243Expression and purification of Qβ-243
Клетки (E. coli RR1) ресуспендировали в LB и обрабатывали, как описано в общем способе. Белок очищали двумя последовательными стадиями гель-фильтрации на колонке с сефарозой CL-4B и, наконец, на колонке с сефарозой CL-2B. Фракции пика объединяли и лиофилизовали, как описано выше. Сборку покрывающего белка в капсид подтверждали электронной микроскопией.Cells (E. coli RR1) were resuspended in LB and processed as described in the general method. The protein was purified by two successive gel filtration steps on a CL-4B Sepharose column and finally on a CL-2B Sepharose column. Peak fractions were combined and lyophilized as described above. The assembly of the coating protein into a capsid was confirmed by electron microscopy.
Экспрессия и очистка Qβ-250Expression and purification of Qβ-250
Клетки (E. coli JM 109, трансформированные pOβ-250) ресуспендировали в LB и обрабатывали, как описано выше. Белок очищали гель-фильтрацией на колонке с сефарозой CL-4B и, наконец, на колонке с сефарозой CL-2B и лиофилизовали, как описано выше. Сборку покрывающего белка в капсид подтверждали электронной микроскопией.Cells (
Экспрессия и очистка Qβ-259Expression and purification of Qβ-259
Клетки (E. coli JM 109, трансформированные pQβ-259) ресуспендировали в LB и обрабатывали ультразвуком. Обломки клеток один раз промывали 10 мл LB и второй раз 10 мл 0,7 М мочевины в LB. Белок очищали двумя стадиями хроматографии на основе гель-фильтрации на колонке с сефарозой CL-4B. Белок диализовали и лиофилизовали, как описано выше. Сборку покрывающего белка в капсид подтверждали электронной микроскопией.Cells (
ПРИМЕР 2EXAMPLE 2
Инсерция пептида, содержащего остаток лизина, в c/e1-эпитоп HBcAg (1-149)Insertion of a peptide containing a lysine residue into the HBcAg c / e1 epitope (1-149)
Эпитоп c/e1 (остатки с 72 по 88) HBcAg расположен в верхушечной области на поверхности капсида вируса гепатита B (HBcAg). Часть данной области (пролин 79 и аланин 80) генетическим способом заменяли пептидом Gly-Gly-Lys-Gly-Gly (конструкция HBcAg-Lys: (SEQ ID NO:117)). Введенный остаток лизина содержит реакционно-способную аминогруппу в своей боковой цепи, которую можно использовать для межмолекулярного химического перекрестного сшивания частиц HBcAg с любым антигеном, содержащим свободную группу цистеина.Epitope c / e1 (
ДНК HBcAg-Lys, кодирующую аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:78, создавали с помощью ПЦР: два фрагмента, кодирующие фрагменты HBcAg (аминокислотные остатки с 1 по 78 и с 81 по 149) амплифицировали отдельно в ПЦР. Праймеры, используемые для указанных ПЦР, также вводили последовательность ДНК, кодирующую пептид Gly-Gly-Lys-Gly-Gly (SEQ ID NO:117). Фрагмент HBcAg (с 1 по 78) амплифицировали с pEco63, используя праймеры EcoRIHBcAg(s) и Lys-HBcAg(as). Фрагмент HBcAg (с 81 по 149) амплифицировали с pEco63, используя праймеры Lys-HBcAg(s) и HBcAg(1-149)Hind(as). Праймеры Lys-HBcAg(as) и Lys-HBcAg(s) вводили комплементарные последовательности ДНК на концах двух продуктов ПЦР, обеспечивая слияние двух продуктов ПЦР в последующей сборке на основе ПЦР. Сблокированные фрагменты амплифицировали в ПЦР, используя праймеры EcoRIHBcAg(s) и HbcAg(1-149)Hind(as).HBcAg-Lys DNA encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 78 was generated by PCR: two fragments encoding HBcAg fragments (
Для ПЦР использовали 100 пмоль каждого олигонуклеотида и 50 нг ДНК-матриц в 50 мл реакционных смесей, содержащих 2 единицы полимеразы Pwo, 0,1 мМ dNTP и 2 мМ MgSO4. В обеих реакциях температурные циклы осуществляли следующим образом: 94°C в течение 2 минут; 30 циклов 94°C (1 минута), 50°C (1 минута), 72°C (2 минуты).For PCR, 100 pmol of each oligonucleotide and 50 ng of DNA templates in 50 ml of reaction mixtures containing 2 units of Pwo polymerase, 0.1 mM dNTP and 2 mM MgSO 4 were used . In both reactions, temperature cycles were carried out as follows: 94 ° C for 2 minutes; 30 cycles of 94 ° C (1 minute), 50 ° C (1 minute), 72 ° C (2 minutes).
Последовательности праймеров:Primer Sequences:
Для слияния двух ПЦР-фрагментов с помощью ПЦР использовали 100 пмоль праймеров EcoRIHBcAg(s) и HBcAg(1-149)Hind(as) со 100 нг двух очищенных ПЦР-фрагментов в 50 мл реакционной смеси, содержащей 2 единицы полимеразы Pwo, 0,1 мМ dNTP и 2 мМ MgSO4. Условия циклов ПЦР представляли собой: 94°C в течение 2 минут; 30 циклов 94°C (1 минута), 50°C (1 минута), 72°C (2 минуты). Продукт, полученный при ПЦР-сборке, анализировали электрофорезом в агарозном геле, очищали и расщепляли в течение 19 часов в соответствующем буфере с ферментами рестрикции EcoRI и HindIII. Полученный при расщеплении фрагмент ДНК лигировали в EcoRI/HindIII-расщепленный вектор pKK, чтобы получить экспрессирующий вектор pKK-HBcAg-Lys. Инсерцию ПЦР-продукта в вектор анализировали с помощью рестрикционного анализа ферментами EcoRI/HindIII и секвенирования ДНК вставки.To fuse the two PCR fragments by PCR, 100 pmol of EcoRIHBcAg (s) and HBcAg (1-149) Hind (as) primers with 100 ng of two purified PCR fragments in 50 ml of the reaction mixture containing 2 units of Pwo polymerase, 0, 1 mM dNTP and 2 mM MgSO 4 . The conditions of the PCR cycles were: 94 ° C for 2 minutes; 30 cycles of 94 ° C (1 minute), 50 ° C (1 minute), 72 ° C (2 minutes). The product obtained by PCR assembly was analyzed by agarose gel electrophoresis, purified and digested for 19 hours in an appropriate buffer with restriction enzymes EcoRI and HindIII. The cleavage DNA fragment was ligated into an EcoRI / HindIII-digested pKK vector to obtain the pKK-HBcAg-Lys expression vector. The insertion of the PCR product into the vector was analyzed by restriction analysis with EcoRI / HindIII enzymes and DNA sequencing of the insert.
ПРИМЕР 3EXAMPLE 3
Экспрессия и очистка HBcAg-LysExpression and purification of HBcAg-Lys
Штаммы E. coli K802 или JM109 трансформировали вектором pKK-HBcAg-Lys. 1 мл ночной культуры бактерий использовали для того, чтобы инокулировать 100 мл среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Указанную культуру выращивали в течение 4 часов при 37°C до достижения OD при 600 нм, примерно равной 0,8. Индукцию синтеза HBcAg-Lys осуществляли добавлением IPTG до конечной концентрации 1 мМ. После индукции бактерии дополнительно встряхивали при 37°C в течение 4 часов. Бактерии собирали центрифугированием при 5000 x g в течение 15 минут. Осадок замораживали при -80°C. Осадок размораживали и ресуспендировали в буфере для лизиса бактерий (10 мМ Na2HPO4, pH 7,0; 30 мМ NaCl; 0,25% твин-20; 10 мМ EDTA) с добавлением 200 мкг/мл лизоцима и 10 мкг бензоназы (Merck). Клетки инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре и разрушали обработкой ультразвуком. Клетки E. coli, несущие экспрессирующую плазмиду pKK-HBcAg-Lys или контрольную плазмиду, использовали для индукции экспрессии HBcAg-Lys с помощью IPTG. Перед добавлением IPTG из культуры бактерий, несущих плазмиду pKK-HBcAg-Lys и из культуры бактерий, несущих контрольную плазмиду, брали образец. Через четыре часа после добавления IPTG снова брали образцы из культуры, содержащей pKK-HBcAg-Lys, и из контрольной культуры. Экспрессию белка контролировали с использованием SDS-ПААГ с последующим окрашиванием Кумасси.Strains of E. coli K802 or JM109 were transformed with the pKK-HBcAg-Lys vector. 1 ml of overnight bacterial culture was used to inoculate 100 ml of LB medium containing 100 μg / ml ampicillin. The specified culture was grown for 4 hours at 37 ° C until reaching an OD at 600 nm, approximately equal to 0.8. The synthesis of HBcAg-Lys was induced by the addition of IPTG to a final concentration of 1 mM. After induction, the bacteria were additionally shaken at 37 ° C for 4 hours. Bacteria were collected by centrifugation at 5000 xg for 15 minutes. The precipitate was frozen at -80 ° C. The pellet was thawed and resuspended in bacterial lysis buffer (10 mM Na 2 HPO 4 , pH 7.0; 30 mM NaCl; 0.25% tween-20; 10 mM EDTA) supplemented with 200 μg / ml lysozyme and 10 μg benzonase ( Merck). Cells were incubated for 30 minutes at room temperature and destroyed by sonication. E. coli cells bearing the pKK-HBcAg-Lys expression plasmid or control plasmid were used to induce the expression of HBcAg-Lys using IPTG. Before IPTG was added, a sample was taken from a culture of bacteria carrying the pKK-HBcAg-Lys plasmid and from a culture of bacteria carrying the control plasmid. Four hours after the addition of IPTG, samples were again taken from a culture containing pKK-HBcAg-Lys and from a control culture. Protein expression was monitored using SDS-PAGE followed by Coomassie staining.
Затем лизат центрифугировали в течение 30 минут при 12000 x g, чтобы удалить нерастворимые обломки клеток. Надосадок и осадок анализировали Вестерн-блоттингом, используя моноклональное антитело против HBcAg (YVS1841, приобретенное из Accurate Chemical and Scientific Corp., Westbury, NY, USA), показав, что значительное количество белка HBcAg-Lys является растворимым. Коротко, лизаты клеток E. coli, экспрессирующих HBcAg-Lys, и лизаты контрольных клеток центрифугировали при 14000 x g в течение 30 минут. Надосадок (= растворимая фракция) и осадок (= нерастворимая фракция) разделяли и разбавляли в SDS-буфере для образцов до равных объемов. Образцы анализировали в SDS-ПААГ с последующим Вестерн-блоттингом с моноклональным антителом YVS 1841.The lysate was then centrifuged for 30 minutes at 12,000 x g to remove insoluble cell debris. The supernatant and sediment were analyzed by Western blotting using a monoclonal anti-HBcAg antibody (YVS1841, purchased from Accurate Chemical and Scientific Corp., Westbury, NY, USA), showing that a significant amount of the HBcAg-Lys protein is soluble. Briefly, lysates of E. coli cells expressing HBcAg-Lys and control cell lysates were centrifuged at 14,000 x g for 30 minutes. The supernatant (= soluble fraction) and the precipitate (= insoluble fraction) were separated and diluted in SDS sample buffer to equal volumes. Samples were analyzed in SDS-PAGE followed by Western blotting with monoclonal antibody YVS 1841.
Осветленные лизаты клеток использовали для центрифугирования в ступенчатом градиенте, используя ступенчатый градиент сахарозы, состоящий из 4 мл 65% раствора сахарозы, на который наслаивали 3 мл 15% раствора сахарозы, а затем 4 мл бактериального лизата. Образец центрифугировали в течение 3 час при 100000 x g, при 4°C. После центрифугирования собирали фракции объемом 1 мл с верха градиента и анализировали в SDS-ПААГ с последующим окрашиванием Кумасси. Белок HBcAg-Lys выявляли при окрашивании Кумасси.The clarified cell lysates were used for centrifugation in a stepwise gradient using a stepwise sucrose gradient consisting of 4 ml of a 65% sucrose solution, onto which 3 ml of a 15% sucrose solution was layered, and then 4 ml of a bacterial lysate. The sample was centrifuged for 3 hours at 100,000 x g, at 4 ° C. After centrifugation, 1 ml fractions were collected from the top of the gradient and analyzed in SDS-PAGE followed by Coomassie staining. The HBcAg-Lys protein was detected by Coomassie staining.
Обогащенная фракция белка HBcAg-Lys была расположена на границе между 15 и 65% сахарозой, что свидетельствует о том, что белок образовал частицу капсида. Большинство бактериальных белков оставалось в не содержащем сахарозу верхнем слое градиента, таким образом, центрифугирование частиц HBcAg-Lys в ступенчатом градиенте приводило как к обогащению, так и к частичной очистке частиц.The enriched HBcAg-Lys protein fraction was located at the border between 15 and 65% sucrose, which indicates that the protein formed a capsid particle. Most bacterial proteins remained in the sucrose-free upper layer of the gradient, thus centrifuging HBcAg-Lys particles in a stepwise gradient resulted in both enrichment and partial purification of the particles.
Экспрессию и очистку HBcAg-Lys в крупном масштабе осуществляли следующим образом. Ночную культуру получали, высевая единичную колонию в 100 мл LB, 100 мкг/мл ампициллина и выращивая культуру в течение ночи при 37°C. На следующий день 25 мл предварительной культуры разбавляли в 800 мл среды LB с ампициллином и культуру выращивали до оптической плотности OD600, равной 0,6-0,8. Затем культуру индуцировали 1 мМ IPTG и оставляли расти еще в течение 4 часов. Клетки собирали и лизировали по существу так, как описано выше.The expression and purification of HBcAg-Lys on a large scale was carried out as follows. An overnight culture was obtained by plating a single colony in 100 ml LB, 100 μg / ml ampicillin and growing the culture overnight at 37 ° C. The next day, 25 ml of the preliminary culture was diluted in 800 ml of LB medium with ampicillin and the culture was grown to an optical density of OD 600 equal to 0.6-0.8. The culture was then induced with 1 mM IPTG and allowed to grow for another 4 hours. Cells were harvested and lysed essentially as described above.
Затем HBcAg-Lys очищали, сначала осаждая белок сульфатом аммония (30% насыщения) из осветленного лизата клеток, затем нанося перерастворенный осадок на колонку для гель-фильтрации (Sephacryl S-400, Pharmacia). Объединенные фракции снова осаждали сульфатом аммония, осадок перерастворяли и наносили второй раз на такую же колонку для гель-фильтрации. Наконец фракции объединяли и концентрировали, и концентрацию оценивали с использованием теста Бредфорда (BioRad).Then, HBcAg-Lys was purified by first precipitating the protein with ammonium sulfate (30% saturation) from the clarified cell lysate, then depositing the re-dissolved pellet on a gel filtration column (Sephacryl S-400, Pharmacia). The combined fractions were again precipitated with ammonium sulfate, the precipitate was redissolved and applied a second time on the same gel filtration column. Finally, the fractions were combined and concentrated, and the concentration was evaluated using the Bradford test (BioRad).
ПРИМЕР 4EXAMPLE 4
Конструирование HBcAg, лишенного свободных остатков цистеина и содержащего встроенный остаток лизинаConstruction of HBcAg, devoid of free cysteine residues and containing a built-in lysine residue
Коровый антиген гепатита (HBcAg), называемый в данном описании HBcAg-lys-2cys-Mut, лишенный остатков цистеина в положениях, соответствующих 48 и 107 в SEQ ID NO:77, и содержащий встроенный остаток лизина, конструировали, используя следующие способы.Hepatitis Cortical Antigen (HBcAg), referred to herein as HBcAg-lys-2cys-Mut, lacking cysteine residues at positions corresponding to 48 and 107 in SEQ ID NO: 77, and containing an integrated lysine residue, was constructed using the following methods.
Две мутации вводили сначала посредством отдельной амплификации трех фрагментов гена HBcAg-Lys, полученных, как описано выше в примере 2, со следующими комбинациями праймеров для ПЦР. Использовали способы ПЦР и обычные способы клонирования для получения гена HBcAg-lys-2cys-Mut.Two mutations were first introduced by separate amplification of three fragments of the HBcAg-Lys gene, obtained as described above in Example 2, with the following combinations of PCR primers. PCR methods and conventional cloning methods were used to obtain the HBcAg-lys-2cys-Mut gene.
Коротко, для получения фрагмента 1 использовали следующие праймеры:Briefly, to obtain
Праймер 1: EcoRIHBcAg(s)Primer 1: EcoRIHBcAg (s)
Праймер 2: 48asPrimer 2: 48as
Для получения фрагмента 2 использовали следующие праймеры:To obtain
Праймер 3: 48sPrimer 3: 48s
Праймер 4: 107asPrimer 4: 107as
Для получения фрагмента 3 использовали следующие праймеры:To obtain
Праймер 5: HBcAg149hind-asPrimer 5: HBcAg149hind-as
Праймер 6: 107sPrimer 6: 107s
Затем фрагменты 1 и 2 объединяли с использованием праймеров ПЦР EcoRIHBcAg(s) и 107as, получая фрагмент 4. Затем фрагмент 4 и фрагмент 3 объединяли с использованием праймеров EcoRIHBcAg(s) и HBcAg149hind-as, получая полноразмерный ген. Затем полноразмерный ген расщепляли ферментами EcoRI(GAATTC) и HindIII(AAGCTT) и клонировали в векторе pKK (Pharmacia), разрезанными в таких же сайтах рестрикции. Экспрессию и очистку HBcAg-lys-2cys-Mut осуществляли, как указано в примере 3.Then fragments 1 and 2 were combined using EcoRIHBcAg (s) and 107as PCR primers to give
ПРИМЕР 5EXAMPLE 5
Конструирование HBcAg1-185-LysConstruction of HBcAg1-185-Lys
Коровый антиген гепатита (HBcAg) 1-185 модифицировали, как описано в примере 2. Часть области эпитопа c/e1 (остатки с 72 по 88) (пролин 79 и аланин 80) генетическим способом заменяли пептидом Gly-Gly-Lys-Gly-Gly (конструкция HBcAg1-185-Lys: SEQ ID NO:117). Введенный остаток лизина содержит реакционно-способную аминогруппу в своей боковой цепи, которую можно использовать для межмолекулярного химического перекрестного сшивания частиц HBcAg с любым антигеном, содержащим свободную группу цистеина. Для получения гена HBcAg1-185-Lys использовали способы ПЦР и обычные способы клонирования.Hepatitis measles antigen (HBcAg) 1-185 was modified as described in Example 2. Part of the c / e1 epitope region (
Последовательность Gly-Gly-Lys-Gly-Gly (SEQ ID NO:117) встраивали путем амплификации двух отдельных фрагментов гена HBcAg из pEco63, как описано выше в примере 2, и затем посредством слияния двух фрагментов с помощью ПЦР, чтобы собрать полноразмерный ген. Использовали следующие комбинации ПЦР-праймеров:The Gly-Gly-Lys-Gly-Gly sequence (SEQ ID NO: 117) was inserted by amplification of two separate fragments of the HBcAg gene from pEco63, as described above in Example 2, and then by fusion of the two fragments using PCR to collect the full-sized gene. Used the following combinations of PCR primers:
фрагмент 1:fragment 1:
праймер 1: EcoRIHBcAg(s) (см. пример 2)primer 1: EcoRIHBcAg (s) (see example 2)
праймер 2: Lys-HBcAg(as) (см. пример 2)primer 2: Lys-HBcAg (as) (see example 2)
фрагмент 2:fragment 2:
праймер 3: Lys-HBcAg(s) (см. пример 2)primer 3: Lys-HBcAg (s) (see example 2)
праймер 4: HBcAgwtHindIIIIprimer 4: HBcAgwtHindIIII
Сборка:Assembly:
праймер 1: EcoRIHBcAg(s) (см. пример 2)primer 1: EcoRIHBcAg (s) (see example 2)
праймер 2: HBcAgwtHindIIIIprimer 2: HBcAgwtHindIIII
Затем собранный полноразмерный ген расщепляли ферментами EcoRI(GAATTC) и HindIII(AAGCTT) и клонировали в векторе pKK (Pharmacia), разрезанном в таких же сайтах рестрикции.Then, the assembled full-sized gene was digested with the EcoRI (GAATTC) and HindIII (AAGCTT) enzymes and cloned into the pKK vector (Pharmacia), cut at the same restriction sites.
ПРИМЕР 6EXAMPLE 6
Слияние пептидного эпитопа в MIR-области HbcAgFusion of the peptide epitope in the MIR region of HbcAg
Остатки 79 и 80 HBcAg1-185 заменяли эпитопом CεH3 последовательности VNLTWSRASG (SEQ ID NO:149). Последовательность CεH3 происходит из последовательности третьего константного домена тяжелой цепи IgE человека. Эпитоп встраивали в последовательность HBcAg1-185, используя способ ПЦР-сборки. На первой стадии ПЦР ген HBcAg1-185, происходящий из ATCC-клона pEco63 и амплифицированный с праймерами HBcAg-wt EcoRI fwd и HBcAg-wt Hind III rev, использовали в качестве матрицы в двух отдельных реакциях, чтобы амплифицировать два фрагмента, содержащие элементы последовательности, кодирующие последовательность CεH3. Затем указанные два фрагмента подвергали сборке на второй стадии ПЦР в реакции ПЦР-сборки.
Комбинации праймеров на первой стадии ПЦР: CεH3fwd с HBcAg-wt Hind III rev, и HBcAg-wt EcoRI fwd с CεH3rev. В реакции ПЦР-сборки два фрагмента, выделенные на первой стадии ПЦР, сначала подвергали сборке в течение 3 циклов ПЦР без внешних праймеров, которые добавляли к реакционной смеси позже для следующих 25 циклов. Внешние праймеры: HBcAg-wt EcoRI fwd и HBcAg-wt Hind III rev.The combinations of primers in the first stage of PCR: CεH3fwd with HBcAg-wt Hind III rev, and HBcAg-wt EcoRI fwd with CεH3rev. In the PCR assembly reaction, two fragments isolated in the first PCR step were first assembled for 3 PCR cycles without external primers, which were added to the reaction mixture later for the next 25 cycles. External primers: HBcAg-wt EcoRI fwd and HBcAg-wt Hind III rev.
Продукт ПЦР клонировали в pKK223.3, используя сайты EcoRI и HindIII, для экспрессии в E. coli (см. пример 2). Химерную VLP экспрессировали в E. coli и очищали, как описано в примере 2. В объеме элюирования, в котором HBcAg1-185-CεH3 элюировался при гель-фильтрации, показана сборка слитых белков в химерную VLP.The PCR product was cloned into pKK223.3 using EcoRI and HindIII sites for expression in E. coli (see Example 2). The chimeric VLP was expressed in E. coli and purified as described in Example 2. In the elution volume in which HBcAg1-185-CεH3 was eluted by gel filtration, the assembly of fusion proteins into the chimeric VLP is shown.
Последовательности праймеров:Primer Sequences:
ПРИМЕР 7EXAMPLE 7
Слияние эпитопа пептида RANKL в MIR-области HbcAgFusion of the RANKL Peptide Epitope in the MIR Region of HbcAg
Остатки 79 и 80 HBcAg1-185 заменяли эпитопом пептида RANKL с последовательностью: SIKIPSSH (SEQ ID NO:88). Конструировали два перекрывающихся праймера с использованием такой же методики, которая описана в примере 6, и слитый белок конструировали с помощью ПЦР-сборки. Продукт ПЦР клонировали в векторе pKK223.3 и экспрессировали в E. coli K802. Химерные VLP экспрессировали и очищали, как описано в примере 3.
ПРИМЕР 8EXAMPLE 8
Слияние эпитопа пептида RANKL с C-концом белка A1 Qβ, укороченного в положении 19 CP-удлиненияFusion of the RANKL peptide epitope with the C-terminus of Qβ A1 protein shortened at
Использовали праймер, который отжигается с 5'-концом гена A1 Qβ, и праймер, который отжигается с 3'-концом гена A1 и содержит дополнительный элемент последовательности, кодирующий эпитоп пептида RANKL с последовательностью: SIKIPSSH (SEQ ID NO:88), в реакции ПЦР с pQβ10 в качестве матрицы. Продукт ПЦР клонировали в pQβ10 (Kozlovska T.M. et al., Gene 137: 133-37 (1993)), и химерные VLP экспрессировали и очищали, как описано в примере 1.A primer was used that annealed at the 5'-end of the A1 gene Qβ, and a primer that was annealed at the 3'-end of the A1 gene and contained an additional sequence element encoding an epitope of the RANKL peptide with the sequence: SIKIPSSH (SEQ ID NO: 88), in PCR with pQβ10 as template. The PCR product was cloned into pQβ10 (Kozlovska T.M. et al., Gene 137: 133-37 (1993)), and chimeric VLPs were expressed and purified as described in Example 1.
ПРИМЕР 9EXAMPLE 9
Инсерция эпитопа пептида RANKL между положениями 2 и 3 покрывающего белка frInsertion of the epitope of the RANKL peptide between
Комплементарные праймеры, кодирующие последовательность эпитопа пептида RANKL с последовательностью: SIKIPSSH (SEQ ID NO:88) и содержащие Bsp119I-совместимые концы и дополнительные нуклеотиды, обеспечивающие инсерцию в рамке считывания, встраивали в Bsp119I-сайт вектора pFrd8 (Pushko, P. et al., Prot. Eng. 6: 883-91 (1993)) стандартными способами молекулярной биологии. Альтернативно выступающие концы вектора pFrd8 заполняли фрагментом Кленова после расщепления Bsp119I и олигонуклеотиды, кодирующие последовательность белка RANKL, фрагмента RANKL или пептида RANKL и дополнительные нуклеотиды для клонирования в рамке, лигировали в pFrd8 после обработки фрагментом Кленова. Клоны со вставкой в правильной ориентации анализировали секвенированием. Экспрессию и очистку химерного слитого белка в E. coli JM109 или E. coli K802 осуществляли, как описано в Pushko, P. et al, Prot. Eng. 6: 883-91 (1993), за исключением стадий хроматографии, которые выполняли с использованием сефарозы CL-4B или сефакрила S-400 (Pharmacia). Лизат клеток осаждали сульфатом аммония и очищали, используя две последовательные стадии гель-фильтрации, подобно способу, описанному для Qβ в примере 1.Complementary primers encoding a sequence of the RANKL peptide epitope with the sequence: SIKIPSSH (SEQ ID NO: 88) and containing Bsp119I-compatible ends and additional nucleotides providing a frame-wise insertion, were inserted into the Bsp119I site of the pFrd8 vector (Pushko, P. et al. , Prot. Eng. 6: 883-91 (1993)) by standard molecular biology methods. Alternatively, the protruding ends of the pFrd8 vector were filled with a Klenov fragment after cleavage of Bsp119I and oligonucleotides encoding the sequence of the RANKL protein, RANKL fragment or RANKL peptide and additional nucleotides for frame cloning were ligated into pFrd8 after treatment with the Klenov fragment. Clones with the insert in the correct orientation were analyzed by sequencing. Expression and purification of the chimeric fusion protein in E. coli JM109 or E. coli K802 was carried out as described in Pushko, P. et al, Prot. Eng. 6: 883-91 (1993), with the exception of chromatography steps that were performed using Sepharose CL-4B or Sephacryl S-400 (Pharmacia). The cell lysate was precipitated with ammonium sulfate and purified using two successive gel filtration steps, similar to the method described for Qβ in Example 1.
ПРИМЕР 10EXAMPLE 10
Инсерция эпитопа пептида RANKL между положениями 67 и 68 p1-белка Ty1 в векторе pOGS8111Insertion of an epitope of the RANKL peptide between
Синтезировали два комплементарных олигонуклеотида, кодирующих эпитоп пептида RANKL с последовательностью: SIKIPSSH (SEQ ID NO:88) с концами, совместимыми с NheI-сайтом pOGS8111. Добавляли дополнительные нуклеотиды, чтобы обеспечить инсерцию в рамке считывания последовательности, кодирующей эпитоп RANKL, согласно описанию EP06777111. Аминокислоты AS и SS, фланкирующие встроенный эпитоп, кодируются измененными NheI-сайтами, возникающими в результате инсерции олигонуклеотида в TyA(d)-ген pOGS8111.Two complementary oligonucleotides encoding an epitope of the RANKL peptide with the sequence were synthesized: SIKIPSSH (SEQ ID NO: 88) with ends compatible with the pheS8111 NheI site. Additional nucleotides were added to provide a reading frame reading of the sequence encoding the RANKL epitope as described in EP06777111. The amino acids AS and SS flanking the inserted epitope are encoded by altered NheI sites resulting from the insertion of the oligonucleotide into the TyA (d) gene pOGS8111.
POGS8111 трансформировали в штамм MC2 S. cerevisiae для экспрессии химерной VLP Ty, как описано в EP0677111 и ссылках в данном описании. Химерную VLP Ty очищали ультрацентрифугированием в градиенте сахарозы, как описано в EP0677111.POGS8111 was transformed into S. cerevisiae MC2 strain for expression of the chimeric VLP Ty, as described in EP0677111 and the references herein. The chimeric VLP Ty was purified by sucrose gradient ultracentrifugation as described in EP0677111.
ПРИМЕР 11EXAMPLE 11
Инсерция эпитопа пептида RANKL в основной белок капсида L1 вируса папилломы типа 1 (BPV-1)Insertion of the RANKL peptide epitope into the major protein of the
Последовательностью, кодирующей эпитоп пептида RANKL с последовательностью SIKIPSSH (SEQ ID NO:88), заменяли последовательность, кодирующую аминокислоты 130-136 гена L1 BPV-1, клонированного в векторе pFastBac1 (GIBCO/BRL), как описано (Chackerian, B. et al., Proc. Natl. Acad. USA 96: 2373-2378 (1999)). Последовательность конструкции проверяли анализом нуклеотидной последовательности. Рекомбинантный бакуловирус создавали с использованием бакуловирусной системы GIBCO/BRL, как описано производителем. Химерные VLP очищали из инфицированных бакуловирусом клеток Sf9, как описано Kirnbauer, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89:12180-84 (1992) и Greenstone, H.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95:1800-05 (1998).The sequence encoding the epitope of the RANKL peptide with the sequence SIKIPSSH (SEQ ID NO: 88) was replaced by the sequence encoding amino acids 130-136 of the BPV-1 L1 gene cloned in the pFastBac1 vector (GIBCO / BRL) as described (Chackerian, B. et al ., Proc. Natl. Acad. USA 96: 2373-2378 (1999)). The sequence of the construct was checked by analysis of the nucleotide sequence. Recombinant baculovirus was created using the GIBCO / BRL baculovirus system as described by the manufacturer. Chimeric VLPs were purified from baculovirus-infected Sf9 cells as described by Kirnbauer, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 12180-84 (1992) and Greenstone, H. L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 1800-05 (1998).
ПРИМЕР 12EXAMPLE 12
Введение N-концевого cys-содержащего линкера, экспрессия и очистка RANKLIntroduction N-terminal cys-containing linker, expression and purification of RANKL
Фрагмент RANKL рекомбинантно экспрессировали с N-концевым линкером, содержащим один цистеин для связывания с VLP.The RANKL fragment was recombinantly expressed with an N-terminal linker containing one cysteine for binding to VLP.
Конструирование экспрессирующей плазмидыThe construction of expressing plasmids
C-концевую кодирующую область гена RANKL амплифицировали в ПЦР с олигонуклеотидами RANKL-UP и RANKL-DOWN (олигонуклеотиды: RANKL-UP: 5'CTGCCAGGGGCCCGGGTGCGGCGGTGGCCATCATCACCACCATCACCAGCGCTTCTCAGGAG-3' (SEQ ID NO:154); RANKL-DOWN: 5'-CCGCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAAAG-3'(SEQ ID NO:155). RANKL-UP имел внутренний сайт ApaI, а RANKL-DOWN имел внутренний сайт XhoI. Продукт ПЦР расщепляли ApaI и XhoI и лигировали в pGEX-6p1 (Amersham Pharmacia). Полученную в результате плазмиду назвали pGEX-RANKL. Все стадии выполняли, используя стандартные протоколы молекулярной биологии, и последовательность проверяли. Плазмида pGEX-RANKL кодирует слитый белок глутатион-S-трансфераза-сайт расщепления PreScission-содержащий цистеин аминокислотный линкер-RANKL (GST-PS-C-RANKL). Содержащий цистеин аминокислотный линкер имел последовательность GPGCGGG (SEQ ID NO:156). Конструкция также содержит гексагистидиновую метку между содержащим цистеин аминокислотным линкером и последовательностью RANKL. Последовательности полученных в результате конструкций кДНК и белка приведены в виде SEQ-ID NO:94 и SEQ-ID NO:95.C-terminal coding region of the RANKL gene was amplified by PCR with oligos RANKL-UP and RANKL-DOWN (oligonucleotides: RANKL-UP: 5'CTGCCAGGGGCCCGGGTGCGGCGGTGGCCATCATCACCACCATCACCAGCGCTTCTCAGGAG-3 '(SEQ ID NO: 154); RANKL-DOWN: 5'-CCGCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAAAG-3 '(SEQ ID NO: 155). RANKL-UP had an internal ApaI site and RANKL-DOWN had an internal XhoI site. The PCR product was digested with ApaI and XhoI and ligated into pGEX-6p1 (Amersham Pharmacia). The resulting plasmid was named pGEX- RANKL All steps were performed using standard molecular biology protocols and the sequence was verified Plasmid pGEX-RANKL encodes a glutathione-S-transferase fusion protein cleavage site PreScission cysteine-containing amino acid linker-RANKL (GST-PS-C-RANKL). The cysteine-containing amino acid linker had the GPGCGGG sequence (SEQ ID NO: 156). The construct also contains a hexahistidine tag between the cysteine-containing amino acid linker and the RANKL The sequences of the resulting cDNA and protein constructs are given as SEQ-ID NO: 94 and SEQ-ID NO: 95.
Экспрессия и очистка C-RANKLExpression and purification of C-RANKL
Компетентные клетки Escherichia coli BL21 (DE3) Gold pLys трансформировали плазмидой pGEX-RANKL. Отдельные колонии из чашек с агаром, содержащим ампициллин, размножали в жидкой культуре (среда LB, 100 мкг/мл ампициллина) и инкубировали при 30°C в течение ночи при встряхивании 220 об/мин. Затем в один литр LB (с 100 мкг/мл ампициллина) высевали ночную культуру 1:100 об./об. и выращивали при 24°C до OD600=1. Экспрессию индуцировали 0,4 мМ IPTG. Клетки собирали через 16 час и центрифугировали при 5000 об/мин. Осадок клеток суспендировали в лизирующем буфере (50 мМ трис-HCl, pH 8,0; 25% сахарозы; 1 мМ EDTA, 1% NaN3; 10 мМ DTT; 5 мМ MgCl2; 1 мг/мл лизоцима; 0,4 U/мл ДНКазы) в течение 30 мин. Затем добавляли 2,5 объема буфера A (50 мМ трис-HCl, pH 8,0; 1% тритон X100; 100 мМ NaCl; 0,1% NaN3; 10 мМ DTT; 1 мМ PMSF) и инкубировали при 37°C в течение 15 мин. Клетки обрабатывали ультразвуком и осаждали при 9000 об/мин в течение 15 мин. Надосадок сразу же использовали для GST-аффинной хроматографии.Competent cells of Escherichia coli BL21 (DE3) Gold pLys were transformed with the plasmid pGEX-RANKL. Separate colonies from ampicillin-containing agar plates were propagated in liquid culture (LB medium, 100 μg / ml ampicillin) and incubated at 30 ° C. overnight with 220 rpm shaking. Then, in one liter of LB (with 100 μg / ml ampicillin), a night culture of 1: 100 v / v was sown. and grown at 24 ° C to OD 600 = 1. Expression was induced by 0.4 mM IPTG. Cells were harvested after 16 hours and centrifuged at 5000 rpm. The cell pellet was suspended in lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0; 25% sucrose; 1 mM EDTA, 1% NaN 3 ; 10 mM DTT; 5 mM MgCl 2 ; 1 mg / ml lysozyme; 0.4 U / ml DNase) for 30 minutes Then 2.5 volumes of buffer A were added (50 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1% Triton X100; 100 mM NaCl; 0.1% NaN 3 ; 10 mM DTT; 1 mM PMSF) and incubated at 37 ° C within 15 minutes Cells were sonicated and pelleted at 9000 rpm for 15 minutes. The supernatant was immediately used for GST affinity chromatography.
Колонку FF, улавливающую GST, объемом 5 мл (Amersham Pharmacia) уравновешивали в PBS, pH 7,3 (140 мМ NaCl; 2,7 мМ KCl; 10 мМ Na2HPO4; 1,8 мМ KH2PO4). Надосадок наносили на колонку FF, улавливающую GST, объемом 5 мл и затем колонку промывали объемом PBS, равным 5 объемам колонки. Белок GST-PS-C-RANKL элюировали, используя 50 мМ трис-HCl, pH 8,0, содержащий 10 мМ восстановленный глутатион.A 5 ml GST trap FF column (Amersham Pharmacia) was equilibrated in PBS, pH 7.3 (140 mM NaCl; 2.7 mM KCl; 10 mM Na 2 HPO 4 ; 1.8 mM KH 2 PO 4 ). The supernatant was applied to a 5 ml GST trap FF column, and then the column was washed with a PBS volume of 5 column volumes. The GST-PS-C-RANKL protein was eluted using 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, containing 10 mM reduced glutathione.
Очищенный белок GST-PS-C-RANKL расщепляли с использованием протеазы PreScission (Amersham Pharmacia). Расщепление осуществляли при 37°C в течение 1 часа, используя молярное отношение 500/1 GST-PS-C-RANKL к PreScission.The purified GST-PS-C-RANKL protein was digested using the PreScission protease (Amersham Pharmacia). Cleavage was carried out at 37 ° C for 1 hour using a molar ratio of 500/1 GST-PS-C-RANKL to PreScission.
Кроме того, в реакционной смеси для расщепления протеазой осуществляли замену буфера, используя колонку для обессоливания HiPrep 26/10 (Amersham Pharmacia), фракции, содержащие белки, объединяли и сразу же использовали для другой стадии GST-аффинной хроматографии с использованием таких условий, как условия, описанные выше. Очистку C-RANKL анализировали в SDS-ПААГ-геле в восстанавливающих условиях, показанном на фиг.1. Отщепленный C-RANKL присутствует в проходящем потоке (несвязанная фракция), тогда как нерасщепленный GST-PS-C-RANKL, отщепленный GST-PS и PreScission остаются связанными с колонкой. Белок C-RANKL (SEQ ID NO:96) ожидаемого размера 22 кД получали очищенным в высокой степени.In addition, in the protease cleavage reaction mixture, the buffer was replaced using a
ПРИМЕР 13EXAMPLE 13
Введение C-концевого cys-содержащего линкера, экспрессия и очистка RANKLIntroduction C-terminal cys-containing linker, expression and purification of RANKL
Фрагмент RANKL рекомбинантно экспрессировали с C-концевым линкером, содержащим один цистеин для связывания с VLP.The RANKL fragment was recombinantly expressed with a C-terminal linker containing one cysteine for binding to VLP.
Конструирование экспрессирующей плазмидыThe construction of expressing plasmids
MCS pET22b(+) (Novagen, Inc.) меняли на GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGATCCGGCTAGCGCTCGAGGGTTTAAACGGCGGCCGCATGCACC (SEQ ID NO:157) заменой исходной последовательности от сайта NdeI до сайта XhoI отжигаемыми олигонуклеотидами primerMCS-1F и primerMCS-1R (отжигание в 15 мМ трис-HCl-буфере, pH 8). Полученную в результате плазмиду назвали pMod00, которая имела сайты рестрикции NdeI, BamHI, NheI, XhoI, PmeI и NotI в своем MCS. Отжигаемую пару олигонуклеотидов Bamhis6-EK-Nhe-F и Bamhis6-EKNhe-R и отжигаемую пару олиго1F-C-глицин-линкер и олиго1R-C-глицин-линкер вместе лигировали в расщепленную BamHI-NotI плазмиду pMod00, чтобы получить pModEC1, которая имела N-концевую гистидиновую метку, сайт расщепления энтерокиназой и C-концевой аминокислотный глициновый линкер, содержащий один остаток цистеина.MCS pET22b (+) (Novagen, Inc.) was changed to GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACACATATGGATCCGGCTAGCGCTCGAGGGTTTAAACGGCGGCCGCATGCACC (SEQ ID NO: 157) by replacing the original sequence with the following sequence: pH 8). The resulting plasmid was named pMod00, which had the restriction sites NdeI, BamHI, NheI, XhoI, PmeI and NotI in its MCS. The annealed pair of Bamhis6-EK-Nhe-F and Bamhis6-EKNhe-R oligonucleotides and the annealed pair of oligo1F-C-glycine linker and oligo1R-C-glycine linker were ligated together into the BamHI-NotI digested pMod1 plasmid to obtain pMod1 to N-terminal histidine tag, enterokinase cleavage site, and C-terminal amino acid glycine linker containing one cysteine residue.
Фрагмент ДНК, содержащий ген глутатион-S-трансферазы с C-концевым сайтом расщепления энтерокиназой, амплифицировали с помощью ПЦР, используя олигонуклеотиды GST-UP и GST-EK из плазмиды SP-GST-EK-pCEP-Pu (Wuttke, M., et al., J. Biol. Chem., 276: 36839-36848), расщепленной NheI и BamHI, и клонировали в векторе pModEC1.A DNA fragment containing a glutathione S-transferase gene with a C-terminal enterokinase cleavage site was amplified by PCR using oligonucleotides GST-UP and GST-EK from plasmid SP-GST-EK-pCEP-Pu (Wuttke, M., et. al., J. Biol. Chem., 276: 36839-36848) digested with NheI and BamHI, and cloned into pModEC1 vector.
Полученная в результате плазмида pMod-GST-EK-C1 содержит ген, кодирующий глутатион-S-трансферазу, слитый с сайтом расщепления энтерокиназой и C-концевым cys-содержащим линкером. Затем C-концевую кодирующую последовательность RANKL амплифицировали с помощью ПЦР, используя олигонуклеотиды mRANKL-1 и mRANKL-2, расщепляли NheI и XhoI и клонировали в плазмиде pMod-GST-EK-C1. Полученная в результате плазмида pMod-GST-EK-mRANKL-C1 кодирует слитый белок, состоящий из глутатион-S-трансферазы, сайта расщепления энтерокиназой, фрагмента RANKL и содержащего цистеин аминокислотного линкера (GST-EK-RANKL-C). Последовательности полученной в результате кДНК и конструкций белка приведены в виде SEQ ID NO:97 и SEQ ID NO:98.The resulting plasmid pMod-GST-EK-C1 contains the gene encoding glutathione-S-transferase fused to the enterokinase cleavage site and the C-terminal cys-containing linker. Then, the C-terminal coding sequence of RANKL was amplified by PCR using mRANKL-1 and mRANKL-2 oligonucleotides, digested with NheI and XhoI, and cloned into plasmid pMod-GST-EK-C1. The resulting plasmid pMod-GST-EK-mRANKL-C1 encodes a fusion protein consisting of glutathione-S-transferase, an enterokinase cleavage site, a RANKL fragment and a cysteine-containing amino acid linker (GST-EK-RANKL-C). The sequences of the resulting cDNA and protein constructs are given as SEQ ID NO: 97 and SEQ ID NO: 98.
Последовательности олигонуклеотидов:Oligonucleotide Sequences:
Экспрессия и очистка RANKL-CExpression and purification of RANKL-C
Компетентные клетки Escherichia coli BL21 (DE3) Gold pLys трансформировали плазмидой pMod-GST-EK-mRANKL-C1. Отдельные колонии из чашек с агаром, содержащим ампициллин, размножали в 100 мл жидкой культуры (среда LB, 200 мкг/мл ампициллина) и инкубировали при 30°C в течение ночи и встряхивании 220 об/мин. Затем в один литр среды (SB с 150 мМ MOPS; pH 7,0; 200 мкг/мл Amp) высевали ночную культуру 1:100 об./об. и выращивали при 30°C и встряхивании 125 об/мин до OD600=2,5. Затем культуры перемещали на 18°C и через 30 мин индуцировали экспрессию белка добавлением 0,1 мМ IPTG. Бактерии собирали после ночной культуры при 18°C центрифугированием (SLA-3000, 15 мин, 4°C, 6000 об/мин), ресуспендировали в 40 мл лизирующего буфера (10 мМ Na2HPO4, 30 мМ NaCl, 10 мМ EDTA и 0,25% твин-20) и инкубировали в течение 30 мин на льду с 0,8 мг/мл лизоцима. Затем бактерии лизировали обработкой ультразвуком и инкубировали в течение 30 мин при КТ с 0,2 М MgCl2 и 8 мкл бензоназы. Лизат очищали от нерастворимого материала центрифугированием (SS-34, 30 мин, 4°C, 20000 об/мин) и сразу же использовали для аффинной хроматографии на глутатион-сефарозе.Competent Escherichia coli BL21 (DE3) Gold pLys cells were transformed with the plasmid pMod-GST-EK-mRANKL-C1. Separate colonies from ampicillin-containing agar plates were propagated in 100 ml of liquid culture (LB medium, 200 μg / ml ampicillin) and incubated at 30 ° C. overnight and shaken 220 rpm. Then, in one liter of medium (SB with 150 mM MOPS; pH 7.0; 200 μg / ml Amp), a night culture of 1: 100 v / v was seeded. and grown at 30 ° C and shaking 125 rpm to OD 600 = 2.5. The cultures were then moved to 18 ° C and after 30 minutes protein expression was induced by the addition of 0.1 mM IPTG. The bacteria were collected after overnight culture at 18 ° C by centrifugation (SLA-3000, 15 min, 4 ° C, 6000 rpm), resuspended in 40 ml of lysis buffer (10 mm Na 2 HPO 4 , 30 mm NaCl, 10 mm EDTA and 0.25% Tween-20) and incubated for 30 min on ice with 0.8 mg / ml lysozyme. Then the bacteria were lysed by sonication and incubated for 30 min at RT with 0.2 M MgCl 2 and 8 μl of benzonase. The lysate was purified from insoluble material by centrifugation (SS-34, 30 min, 4 ° C, 20,000 rpm) and immediately used for affinity chromatography on glutathione-sepharose.
Колонку FF, улавливающую GST, объемом 5 мл (Amersham Pharmacia) уравновешивали лизирующим буфером (10 мМ Na2HPO4, 30 мМ NaCl, 10 мМ EDTA и 0,25% твин-20) и нагружали осветленный лизат при постоянной скорости потока 0,5 мл/мин. Затем колонку три раза промывали 5 объемами колонки лизирующего буфера и белок GST-EK-RANKL-C элюировали в 9 фракциях по 1 мл элюирующего буфера (50 мМ трис-HCl, pH 8,0; 10 мМ восстановленный глутатион) каждая. Очистка, показанная на фиг.2A, давала слитый белок GST-EK-RANKL-C размером примерно 45 кД с небольшой долей GST-EK.A 5 ml GST trapping FF column (Amersham Pharmacia) was equilibrated with lysis buffer (10 mM Na 2 HPO 4 , 30 mM NaCl, 10 mM EDTA and 0.25% tween-20) and the clarified lysate was loaded at a constant flow rate of 0, 5 ml / min. The column was then washed three times with 5 volumes of a lysis buffer column, and GST-EK-RANKL-C protein was eluted in 9 fractions of 1 ml of elution buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0; 10 mM reduced glutathione) each. The purification shown in FIG. 2A gave a GST-EK-RANKL-C fusion protein of approximately 45 kDa with a small fraction of GST-EK.
Элюированные фракции объединяли и очищенный белок GST-EK-RANKL-C расщепляли с использованием энтерокиназы MaxTM (Invitrogen). Расщепление осуществляли при 4°C в течение 16 часов с использованием 10 единиц энтерокиназы Max на мг очищенного GST-EK-RANKL-C. На фиг.2B показано, что реакция расщепления приводила к получению RANKL-C с кажущейся М.м. примерно 16 кД.The eluted fractions were combined and the purified GST-EK-RANKL-C protein was digested using Max TM enterokinase (Invitrogen). Cleavage was carried out at 4 ° C for 16 hours using 10 units of Max enterokinase per mg of purified GST-EK-RANKL-C. FIG. 2B shows that the cleavage reaction resulted in RANKL-C with an apparent M.m. approximately 16 kD.
После расщепления раствор белка диализовали против PBS, pH 7,2 (140 мМ NaCl; 2,7 мМ KCl; 10 мМ Na2HPO4; 1,8 мМ KH2PO4) и глутатион-S-трансферазу удаляли второй аффинной хроматографией на глутатион-сефарозе. Для этого колонку FF, улавливающую GST, объемом 5 мл уравновешивали PBS pH 7,2 и на колонку нагружали раствор белка с постоянной скоростью потока 0,5 мл/мин. Фракции белка анализировали до и после хроматографии на глутатион-сефарозе в SDS-гелях. Как показано на фиг.2C, отщепленный белок RANKL-C (SEQ ID NO:99) находился в проходящем потоке с высокой степенью чистоты, тогда как белок GST-EK оставался связанным с колонкой.After cleavage, the protein solution was dialyzed against PBS, pH 7.2 (140 mM NaCl; 2.7 mM KCl; 10 mM Na 2 HPO 4 ; 1.8 mM KH 2 PO 4 ) and glutathione S-transferase was removed by second affinity chromatography on glutathione-sepharose. For this, a 5 ml GST capture FF column was equilibrated with PBS pH 7.2 and a protein solution was loaded onto the column at a constant flow rate of 0.5 ml / min. Protein fractions were analyzed before and after chromatography on glutathione-sepharose in SDS gels. As shown in FIG. 2C, the cleaved RANKL-C protein (SEQ ID NO: 99) was in a high purity passing stream, while the GST-EK protein remained bound to the column.
ПРИМЕР 14EXAMPLE 14
Связывание C-RANKL с белком капсида QβBinding of C-RANKL to Qβ capsid protein
Раствор объемом 1,48 мл капсидного белка Qβ в концентрации 6 мг/мл в 20 мМ Hepes, 150 мМ NaCl, pH 7,2, в течение 30 минут при 25°C подвергали взаимодействию с 14,8 мкл SMPH (Pierce) (из 100 мМ маточного раствора, растворенного в ДМСО). Затем реакционный раствор дважды диализовали в течение 3 часов против 2 л 20 мМ Hepes, 150 мМ NaCl, pH 7,0, при 4°C. 230 мкл раствора белка C-RANKL в концентрации 9,8 мг/мл в 20 мМ Hepes, 150 мМ NaCl, pH 7,2 в течение 30 мин при 25°C подвергали взаимодействию с 1,7 мкл 100 мМ раствора TCEP (Pierce). Для связывания 80 мкл дериватизованного и диализованного Qβ затем смешивали с 24 мкл восстановленного C-RANKL и 96 мкл 20 мМ Hepes, 150 мМ NaCl, pH 7,0, и инкубировали в течение ночи при 25°C.A solution of 1.48 ml of Qβ capsid protein at a concentration of 6 mg / ml in 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.2, was reacted with 14.8 μl SMPH (Pierce) for 30 minutes at 25 ° C (from 100 mM stock solution dissolved in DMSO). Then, the reaction solution was dialyzed twice for 3 hours against 2 L of 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.0, at 4 ° C. 230 μl of a solution of protein C-RANKL at a concentration of 9.8 mg / ml in 20 mm Hepes, 150 mm NaCl, pH 7.2 for 30 min at 25 ° C was subjected to interaction with 1.7 μl of a 100 mm TCEP solution (Pierce) . To bind, 80 μl of derivatized and dialyzed Qβ was then mixed with 24 μl of reduced C-RANKL and 96 μl of 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.0, and incubated overnight at 25 ° C.
Связанные продукты анализировали в 16% SDS-ПААГ-гелях в восстанавливающих условиях. Гели либо красили Кумасси бриллиантовым голубым, либо подвергали блоттингу на нитроцеллюлозные мембраны. В последнем случае мембраны блокировали и инкубировали либо с поликлональной кроличьей антисывороткой против Qβ (разведение 1:2000), затем с конъюгированным с пероксидазой хрена антителом козы против IgG кролика (разведения 1:5000) или с мышиным моноклональным анти-RANKL-антителом (разведение 1:2000), затем с конъюгированным с пероксидазой хрена антимышиным антителом козы (разведение 1:5000). Затем блоты проявляли с помощью реагентов для регистрации Вестерн-блоттинга ECLTM (Amersham Pharmacia). Результаты показаны на фиг.3A и фиг.3B. Связанные продукты можно было регистрировать в окрашенных Кумасси гелях (фиг.3A) и с помощью как анти-Qβ-антисыворотки, так и с помощью анти-RANKL-антитела (фиг.3B), что ясно свидетельствует о ковалентном связывании C-RANKL с белком капсида Qβ.Bound products were analyzed on 16% SDS-PAGE gels under reducing conditions. The gels were either stained with Coomassie brilliant blue or blotted onto nitrocellulose membranes. In the latter case, the membranes were blocked and incubated either with a polyclonal rabbit antiserum against Qβ (1: 2000 dilution), then with goat peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG antibody (1: 5000 dilution) or with mouse monoclonal anti-RANKL antibody (dilution 1 : 2000), then with goat peroxidase conjugated anti-mouse goat antibody (dilution 1: 5000). The blots were then developed using ECL ™ Western Blot Registration Reagents (Amersham Pharmacia). The results are shown in figa and figv. Bound products could be detected in Coomassie stained gels (Figure 3A) and with both anti-Qβ antiserum and anti-RANKL antibody (Figure 3B), which clearly indicates covalent binding of C-RANKL to protein Qβ capsid.
ПРИМЕР 15EXAMPLE 15
Иммунизация мышей C-RANKL, связанным с белком капсида QβImmunization of C-RANKL Mice Associated with Qβ Capsid Protein
Всего 8 самок мышей Balb/c вакцинировали C-RANKL, связанным с белком капсида Qβ. 25 мкг суммарного белка каждого образца разбавляли в PBS до 200 мкл и инъецировали подкожно (100 мкл с двух сторон брюшка) в 0 день, 16 день и 64 день. Четыре мыши получали вакцину без добавления адъювантов, тогда как четыре другие получали вакцину с добавлением квасцов. У мышей брали кровь из ретроорбитальной области в 0, 16, 23, 64 и 78 день и их сыворотку анализировали с использованием RANKL-специфичного ELISA.A total of 8 female Balb / c mice were vaccinated with C-RANKL bound to the Qβ capsid protein. 25 μg of the total protein of each sample was diluted in PBS to 200 μl and injected subcutaneously (100 μl on both sides of the abdomen) on
ПРИМЕР 16EXAMPLE 16
Выявление RANKL-специфичных антител в ELISADetection of RANKL-specific antibodies in ELISA
Планшеты для ELISA покрывали C-RANKL в концентрации 10 мкг/мл. Планшеты блокировали и затем инкубировали с серийными разведениями сыворотки мышей, полученной на 16, 23, 64 и 78 дни. Связанные антитела выявляли с помощью меченного ферментом антитела против IgG мыши. В качестве контроля также тестировали полученные до иммунизации сыворотки тех же самых мышей. На фиг.4 показаны средние титры RANKL-специфичных антител, которые можно выявить в сыворотке мышей, которых иммунизировали Qβ-C-RANKL в присутствии или без квасцов. Титры в ELISA выражали в виде разведений сыворотки, которые дают половину максимальной OD в анализе ELISA. У мышей, иммунизированных без квасцов, средний титр достигал 28000, тогда как средний титр у мышей, иммунизированных с добавлением квасцов, составлял 160000. Сыворотка до иммунизации не проявляла никакой реакционной способности по отношению к C-RANKL. Это ясно свидетельствует о том, что конъюгат RANKL-VLP способен индуцировать высокий титр антител против аутологичного белка.ELISA plates were coated with C-RANKL at a concentration of 10 μg / ml. The plates were blocked and then incubated with serial dilutions of mouse serum obtained on
ПРИМЕР 17EXAMPLE 17
Ингибирование взаимодействия RANKL-RANK сывороткой мышей, иммунизированных Qβ-C-RANKLInhibition of the interaction of RANKL-RANK with the serum of mice immunized with Qβ-C-RANKL
Чтобы проверить, обладают ли антитела, образованные у мышей, вакцинированных Qβ-C-RANKL, нейтрализующей активностью, разработали анализ связывания in vitro для RANKL и родственного ему рецептора RANK. Для этого планшеты для ELISA покрывали белком C-RANKL при концентрации 10 мкг/мл и инкубировали с серийными разведениями очищенного слитого белка RANK-Fc или неродственного Fc-слитого белка в качестве негативного контроля. Связывающиеся белки выявляли с использованием конъюгированного с пероксидазой хрена анти-Fc-антитела. На фиг.5A показан результат данного анализа. Обнаружено, что очищенный слитый белок RANK-Fc связывается с высокой аффинностью (половина максимального связывания при 1-3 нМ) с его лигандом RANKL, тогда как при использовании неродственного Fc-слитого белка фактически не наблюдали связывания.In order to check whether antibodies formed in mice vaccinated with Qβ-C-RANKL possess neutralizing activity, an in vitro binding assay was developed for RANKL and its related RANK receptor. For this, ELISA plates were coated with C-RANKL protein at a concentration of 10 μg / ml and incubated with serial dilutions of the purified RANK-Fc fusion protein or unrelated Fc-fusion protein as a negative control. Binding proteins were detected using horseradish peroxidase conjugated anti-Fc antibody. 5A shows the result of this analysis. It was found that the purified RANK-Fc fusion protein binds with high affinity (half maximum binding at 1-3 nM) to its RANKL ligand, whereas when using the unrelated Fc-fusion protein, virtually no binding was observed.
Затем сыворотки мышей, вакцинированных C-RANKL, связанным с Qβ, тестировали в отношении их способности ингибировать связывание RANKL с RANK-Fc. Для этого планшеты ELISA покрывали белком C-RANKL в концентрации 10 мкг/мл и инкубировали вместе с серийными разведениями сывороток мышей, полученных на 78 день, смешанными с 1 нМ слитого белка RANK-Fc. Связывание слитого белка RANK-Fc с C-RANKL регистрировали с помощью конъюгированного с пероксидазой хрена анти-Fc-антитела. На фиг.5B показано, что все 8 мышей, которые получали вакцину, продуцировали антитела, которые специфично ингибировали связывание RANK-Fc с C-RANKL. В среднем, половину максимального ингибирования достигали в случае использования разведений сывороток 1:90. Это ясно свидетельствует о том, что иммунизация конъюгатом RANKL-VLP индуцирует антитела с высокими титрами, которые способны ингибировать взаимодействие RANKL с его рецептором RANK. Таким образом, ингибирование взаимодействия RANK-RANKL посредством инъекции специфичного варианта согласно данному изобретению может устранять или предотвращать заболевания кости, характеризующиеся повышенной резорбцией кости.Then, the sera of mice vaccinated with C-RANKL bound to Qβ were tested for their ability to inhibit the binding of RANKL to RANK-Fc. For this, ELISA plates were coated with C-RANKL protein at a concentration of 10 μg / ml and incubated together with serial dilutions of mouse sera obtained on
ПРИМЕР 18EXAMPLE 18
Экспрессия и очистка рекомбинантных VLP AP205Expression and purification of recombinant VLP AP205
A. Экспрессия рекомбинантных VLP AP205A. Expression of Recombinant VLP AP205
E. coli JM109 трансформировали плазмидой pAP283-58. В 5 мл жидкой среды LB с 20 мкг/мл ампициллина инокулировали отдельную колонию и инкубировали при 37°C в течение 16-24 час без встряхивания.E. coli JM109 was transformed with the plasmid pAP283-58. A separate colony was inoculated in 5 ml of LB liquid medium with 20 μg / ml ampicillin and incubated at 37 ° C for 16-24 hours without shaking.
Полученный инокулят разводили 1:100 в 100-300 мл среды LB, содержащей 20 мкг/мл ампициллина, и инкубировали при 37°C в течение ночи без встряхивания. Полученный в результате второй инокулят разводили 1:50 в среде 2TY, содержащей 0,2% глюкозы и фосфат для забуферивания, и инкубировали при 37°C в течение ночи на качалке. Клетки собирали центрифугированием и замораживали при -80°C.The resulting inoculum was diluted 1: 100 in 100-300 ml of LB medium containing 20 μg / ml ampicillin and incubated at 37 ° C overnight without shaking. The resulting second inoculum was diluted 1:50 in 2TY medium containing 0.2% glucose and phosphate for buffering, and incubated at 37 ° C overnight on a rocking chair. Cells were harvested by centrifugation and frozen at -80 ° C.
B. Очистка рекомбинантных VLP AP205B. Purification of Recombinant VLP AP205
Растворы и буферы:Solutions and buffers:
1. Лизирующий буфер1. Lysis buffer
50 мМ трис-HCl, pH 8,0 с 5 мМ EDTA; 0,1% тритоном X100 и PMSF при концентрации 5 микрограмм на мл.50 mM Tris-HCl, pH 8.0 with 5 mM EDTA; 0.1% Triton X100 and PMSF at a concentration of 5 micrograms per ml.
2. SAS 2. S AS
Насыщенный раствор сульфата аммония в воде.A saturated solution of ammonium sulfate in water.
3. Буфер NET.3. Buffer NET .
20 мМ трис-HCl, pH 7,8 с 5 мМ EDTA и 150 мМ NaCl.20 mM Tris-HCl, pH 7.8 with 5 mM EDTA and 150 mM NaCl.
4. ПЭГ 4. PEG
40% (мас./об.) полиэтиленгликоль 6000 в NET.40% (w / v) polyethylene glycol 6000 in NET.
ЛизисLysis
Замороженные клетки ресуспендировали в лизирующем буфере из расчета 2 мл/г клеток. Смесь обрабатывали ультразвуком при 22 кГц пять раз по 15 секунд с интервалами 1 мин, чтобы охладить раствор на льду. Затем лизат центрифугировали в течение 20 минут при 12000 об/мин, используя ротор F34-6-38 (Ependorf). Все описанные ниже стадии центрифугирования выполняли с использованием такого же ротора, если не оговорено особо. Надосадок хранили при 4°C, тогда как обломки клеток дважды промывали лизирующим буфером. После центрифугирования надосадки лизата и промывные фракции объединяли.Frozen cells were resuspended in lysis buffer at the rate of 2 ml / g cells. The mixture was sonicated at 22 kHz five times for 15 seconds at intervals of 1 min to cool the solution on ice. The lysate was then centrifuged for 20 minutes at 12,000 rpm using a F34-6-38 rotor (Ependorf). All centrifugation steps described below were performed using the same rotor, unless otherwise specified. The supernatant was stored at 4 ° C, while the cell debris was washed twice with lysis buffer. After centrifugation, the lysate supernatants and wash fractions were combined.
ФракционированиеFractionation
Затем можно использовать осаждение сульфатом аммония, чтобы очистить VLP AP205. На первой стадии выбирали концентрацию сульфата аммония, при которой VLP AP205 не осаждаются. Полученный в результате осадок отбрасывали. На следующей стадии выбирали концентрацию сульфата аммония, при которой VLP AP205 осаждается количественно, и VLP AP205 выделяли из осадка, полученного на данной стадии осаждения, центрифугированием (14000 об/мин в течение 20 мин). Полученный осадок растворяли в буфере NET.Ammonium sulfate precipitation can then be used to purify the AP205 VLP. In the first step, a concentration of ammonium sulfate was chosen at which the VLP AP205 did not precipitate. The resulting precipitate was discarded. In the next step, the concentration of ammonium sulfate was selected at which the VLP of AP205 was quantitatively precipitated, and the VLP of AP205 was isolated from the precipitate obtained in this deposition step by centrifugation (14,000 rpm for 20 min). The resulting precipitate was dissolved in NET buffer.
ХроматографияChromatography
Белок капсида из объединенных надосадков наносили на колонку с сефарозой 4B (2,8 X 70 см) и элюировали буфером NET при скорости 4 мл/час/фракцию. Фракции 28-40 собирали и осаждали сульфатом аммония при 60% насыщения. Перед осаждением фракции анализировали с помощью SDS-ПААГ и Вестерн-блоттинга, используя антисыворотку, специфичную по отношению AP205 (фиг.6A и фиг.6B). Осадок, выделенный центрифугированием, перерастворяли в буфере NET и наносили на колонку с сефарозой 2B (2,3 х 65 см), элюировали при скорости 3 мл/час/фракцию. Фракции анализировали в SDS-ПААГ и фракции 44-50 собирали, объединяли и осаждали сульфатом аммония при насыщении 60%. Осадок, выделенный центрифугированием, перерастворяли в буфере NET и очищали на колонке с сефарозой 6B (2,5 X 47 см), элюировали при скорости 3 мл/час/фракцию. Фракции анализировали в SDS-ПААГ. Фракции 23-27 собирали, концентрацию соли доводили до 0,5 М и осаждали ПЭГ 6000, добавляемым из 40% маточного раствора в воде и до конечной концентрации 13,3%. Осадок, выделенный центрифугированием, перерастворяли в буфере NET и наносили на такую же колонку с сефарозой 2B, как описано выше, элюировали таким же образом. Анализ фракций в SDS-ПААГ показан на фиг.6C. Фракции 43-53 собирали и осаждали сульфатом аммония при насыщении 60%. Осадок, выделенный центрифугированием, перерастворяли в воде и полученный раствор белка диализовали против большого объема воды. Можно было выделить примерно 10 мг очищенного белка на грамм клеток.The capsid protein from the combined supernatants was loaded onto a 4B Sepharose column (2.8 X 70 cm) and eluted with NET buffer at a rate of 4 ml / hour / fraction. Fractions 28-40 were collected and precipitated with ammonium sulfate at 60% saturation. Before sedimentation, fractions were analyzed by SDS-PAGE and Western blotting using antiserum specific for AP205 (FIG. 6A and FIG. 6B). The precipitate isolated by centrifugation was redissolved in NET buffer and loaded onto a 2B Sepharose column (2.3 x 65 cm), eluting at a rate of 3 ml / hour / fraction. Fractions were analyzed in SDS-PAGE and fractions 44-50 were collected, combined and precipitated with ammonium sulfate at a saturation of 60%. The precipitate isolated by centrifugation was redissolved in NET buffer and purified on a 6B Sepharose column (2.5 X 47 cm), eluting at a rate of 3 ml / hour / fraction. Fractions were analyzed in SDS-PAGE. Fractions 23-27 were collected, the salt concentration was adjusted to 0.5 M and precipitated with PEG 6000 added from a 40% mother liquor in water and to a final concentration of 13.3%. The precipitate isolated by centrifugation was redissolved in NET buffer and applied to the same column of Sepharose 2B as described above, eluting in the same manner. Fraction analysis in SDS-PAGE is shown in FIG. 6C. Fractions 43-53 were collected and precipitated with ammonium sulfate at a saturation of 60%. The precipitate isolated by centrifugation was redissolved in water and the resulting protein solution was dialyzed against a large volume of water. About 10 mg of purified protein per gram of cells could be isolated.
Определение вирусоподобных частиц с помощью электронной микроскопии показало, что они были идентичны фаговым частицам (фиг.7A и 7B).Determination of virus-like particles by electron microscopy showed that they were identical to phage particles (FIGS. 7A and 7B).
На фиг.6A на верхней панели показан окрашенный серебром SDS-ПААГ, разгоняемый в восстанавливающих условиях, фракций, полученных на первой стадии хроматографии на сефарозе 4B. На дорожки 1-13 наносили каждую вторую фракцию из фракций с 20 по 44. Фракцию 50 наносили на дорожку 14. На второй гель наносили такие же фракции и анализировали Вестерн-блоттингом с использованием антисыворотки, специфичной по отношению к AP205, второй гель показан на нижней панели (фиг.6B).On figa on the top panel shows silver-stained SDS-PAGE, accelerated under reducing conditions, of the fractions obtained in the first stage of chromatography on sepharose 4B. On lanes 1-13, each second fraction from
На фиг.6C показан окрашенный серебром SDS-ПААГ, разгоняемый в восстанавливающих условиях, фракций с последней стадии хроматографии на сефарозе 2B. Фракции 38-54 нанесены на дорожки 1-16.On figs shows silver-stained SDS-PAGE, accelerated under reducing conditions, fractions from the last stage of chromatography on sepharose 2B. Fractions 38-54 plotted on tracks 1-16.
На фиг.7A показана ЭМ-картина частиц фага AP205, тогда как ЭМ-картина частиц рекомбинантной VLP AP205, образованной в ходе самосборки, показана на фиг.7B.FIG. 7A shows an EM picture of AP205 phage particles, while an EM picture of recombinant AP205 VLP particles generated by self-assembly is shown in FIG. 7B.
ПРИМЕР 19EXAMPLE 19
Ингибирование RANKL-индуцированного образования остеокластов сывороткой мышей, иммунизированных Qβ-C-RANKLInhibition of RANKL-induced Osteoclast Formation in Serum of Mice Immunized with Qβ-C-RANKL
Для того чтобы проверить, способны ли антитела, образованные у мышей, иммунизированных Qβ-C-RANKL, ингибировать биологическую активность RANKL, осуществляли анализ дифференцировки остеокластов in vitro. Для этого клетки костного мозга выделяли из мышей Balb/c (4-недельного возраста) и инкубировали при плотности 106/мл с рекомбинантным M-CSF мыши (5 нг/мл) в α-MEM/10% FCS в течение 16 часов. Затем неприкрепленные клетки собирали и далее культивировали с M-CSF (30 нг/мл), PGE2 (1 мкМ) и различными концентрациями C-RANKL. На 4 день образование остеокластов оценивали по количеству многоядерных клеток, позитивно окрашиваемых по резистентной к тартрату кислой фосфатазе (TRAP). Обнаружили, что C-RANKL индуцирует значительное количество TRAP-позитивных многоядерных клеток при концентрации 100-1000 нг/мл.In order to test whether antibodies formed in mice immunized with Qβ-C-RANKL are able to inhibit the biological activity of RANKL, an in vitro osteoclast differentiation assay was performed. For this, bone marrow cells were isolated from Balb / c mice (4 weeks old) and incubated at a density of 10 6 / ml with recombinant mouse M-CSF (5 ng / ml) in α-MEM / 10% FCS for 16 hours. Unattached cells were then harvested and further cultured with M-CSF (30 ng / ml), PGE2 (1 μM) and various concentrations of C-RANKL. On
Затем сыворотки мышей, вакцинированных Qβ-C-RANKL, тестировали по их способности ингибировать образование остеокластов из обработанных C-RANKL клеток костного мозга. Для этого клетки-предшественники остеокластов выделяли из мышей Balb/c и инкубировали с M-CSF (30 нг/мл), PGE2 (1 мкМ), C-RANKL (1000 нг/мл) и серийными разведениями сывороток, полученных от иммунизированных мышей, в α-MEM/10% FCS в течение 4 часов. Затем образование остеокластов анализировали путем подсчета количества TRAP-позитивных многоядерных клеток и сравнения с контролями, инкубированными только в C-RANKL и с C-RANKL и сыворотками, полученными до иммунизации.Then, the sera of mice vaccinated with Qβ-C-RANKL were tested for their ability to inhibit the formation of osteoclasts from C-RANKL-treated bone marrow cells. To do this, osteoclast precursor cells were isolated from Balb / c mice and incubated with M-CSF (30 ng / ml), PGE 2 (1 μM), C-RANKL (1000 ng / ml) and serial dilutions of sera obtained from immunized mice , in α-MEM / 10% FCS for 4 hours. The formation of osteoclasts was then analyzed by counting the number of TRAP-positive multinucleated cells and comparing with controls incubated only in C-RANKL and with C-RANKL and sera obtained prior to immunization.
ПРИМЕР 20EXAMPLE 20
Ингибирование потери кости при вакцинировании Qβ-C-RANKL в мышиной модели овариэктомииInhibition of bone loss when vaccinated with Qβ-C-RANKL in a murine model of ovariectomy
Чтобы проверить, защищает ли вакцинация Qβ-C-RANKL от потери кости, индуцированной дефицитом эстрогена, готовили модель овариэктомии (ovx) у мышей. Для этого всего 40 мышей C57/BL6 в возрасте 12 недель случайным образом распределяли на 4 группы и обрабатывали следующим образом: группу 1 не иммунизировали и подвергали ложной операции, группу 2 не иммунизировали и подвергали ovx, группу 3 иммунизировали 25 мкг Qβ-C-RANKL без квасцов и подвергали ovx и группу 4 иммунизировали 25 мкг Qβ-C-RANKL с квасцами и также подвергали ovx. Животных из групп 3 и 4 иммунизировали в 0, 14, 21 и 42 день и всех животных оперировали (либо ложно, либо ovx) на 28 день и забивали на 63 день. Массу тела измеряли в 0, 28 и 63 дни и образцы крови собирали в 0, 14, 21, 28, 42 и 63 дни. Титры антител, а также маркеры образования кости и деградации кости контролировали непрерывно, а минеральную плотность кости оценивали после забоя животных с помощью DXA-сканирования изолированного позвоночного столба и pQCT-сканирования вырезанных бедренных костей на одном дистальном участке и одном участке средней трети кости.To test whether Qβ-C-RANKL vaccination protects against bone loss induced by estrogen deficiency, a mouse ovariectomy (ovx) model was prepared. To do this, a total of 40 C57 / BL6 mice at the age of 12 weeks were randomly divided into 4 groups and processed as follows:
Теперь на основании полного описания данного изобретения с некоторыми подробностями с использованием иллюстрации и примера в целях четкого понимания специалисту в данной области будет очевидно, что то же самое можно осуществить путем модификации или изменения изобретения в широких и эквивалентных пределах условий, композиций и других параметров, не затрагивая объем изобретения или какого-либо конкретного его варианта, и что предполагается, что такие модификации или изменения входят в объем прилагаемой формулы изобретения.Now, on the basis of a full description of the present invention with some details, using an illustration and an example for the sake of a clear understanding, it will be obvious to a person skilled in the art that the same can be done by modifying or changing the invention within wide and equivalent ranges of conditions, compositions and other parameters, affecting the scope of the invention or any particular variant thereof, and that such modifications or changes are intended to be included within the scope of the appended claims.
Все публикации, патенты и заявки на выдачу патентов, упоминаемые в данном описании, являются показателем уровня специалиста в данной области, к которой данное изобретение относится, и включены в виде ссылки в такой же степени, как в случае, когда отдельно указано, что каждая отдельная публикация, патент или заявка на выдачу патента включена в виде ссылки.All publications, patents and patent applications referred to in this description are an indicator of the level of specialist in the field to which this invention relates, and are incorporated by reference to the same extent as in the case when it is separately indicated that each individual the publication, patent, or patent application is incorporated by reference.
Claims (35)
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US33104501P | 2001-11-07 | 2001-11-07 | |
US60/331,045 | 2001-11-07 | ||
US10/050,902 US7264810B2 (en) | 2001-01-19 | 2002-01-18 | Molecular antigen array |
US10/050,902 | 2002-01-18 | ||
IBPCT/IB02/00166 | 2002-01-21 | ||
US39663502P | 2002-07-19 | 2002-07-19 | |
US60/396,635 | 2002-07-19 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2004117075A RU2004117075A (en) | 2005-04-20 |
RU2322258C2 true RU2322258C2 (en) | 2008-04-20 |
Family
ID=31721335
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2004117075/15A RU2322258C2 (en) | 2001-11-07 | 2002-11-07 | Antigen matrix for treatment of bone disease |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
JP (2) | JP4658475B2 (en) |
MX (1) | MXPA04003900A (en) |
RU (1) | RU2322258C2 (en) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2006298767B2 (en) * | 2005-09-28 | 2013-01-10 | Cytos Biotechnology Ag | Interleukin-1 conjugates and uses thereof |
DK2575878T3 (en) * | 2010-05-28 | 2018-08-13 | Zoetis Belgium S A | VACCINES INCLUDING CHOLESTEROL AND CPG AS THE ONLY ADJUVENT CARRIER MOLECULES |
JP6409528B2 (en) * | 2014-11-27 | 2018-10-24 | Jnc株式会社 | Porous cellulose particles having an ion exchange group containing amino groups and a hydrophobic group containing butyl groups, a chromatography carrier containing the same, and a method for purifying virus-like particles of hepatitis B virus |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9114003D0 (en) * | 1991-06-28 | 1991-08-14 | Mastico Robert A | Chimaeric protein |
GB9213601D0 (en) * | 1992-06-26 | 1992-08-12 | Mastico Robert A | Protein based delivery system |
CA2347411C (en) * | 1998-10-21 | 2012-04-03 | The Government Of The United States Of America | Virus-like particles for the induction of autoantibodies |
-
2002
- 2002-11-07 MX MXPA04003900A patent/MXPA04003900A/en active IP Right Grant
- 2002-11-07 JP JP2003541333A patent/JP4658475B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-11-07 RU RU2004117075/15A patent/RU2322258C2/en not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-11-09 JP JP2009255878A patent/JP2010090127A/en active Pending
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
KOSLOVSKA Т. М. et al., Recombinant RNA phage Q beta capsid particles synthesized and self-assembled in Esherishia coli, Gene, 1993, Dec. 27, 137 (1), pp.133-137. KOSLOVSKA T. M. et al., RNA phage Q beta coat protein as a carrier for foreign epitopes, Intervirology, 1996, 39 (1-2), pp.9-15. HERTZ M. et al., A therapeutic RANCL vaccine induced neutralizing anti-RANCL antibodies and prevents bone loss in ovariectomired mice, J. of bone and miniral research, 2001, v.l6, suppl. 1, p.222. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2005512987A (en) | 2005-05-12 |
MXPA04003900A (en) | 2004-07-08 |
JP4658475B2 (en) | 2011-03-23 |
RU2004117075A (en) | 2005-04-20 |
JP2010090127A (en) | 2010-04-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7785873B2 (en) | Antigen arrays for treatment of bone disease | |
RU2325202C2 (en) | Conjugates of ghrelin carrier | |
US7094409B2 (en) | Antigen arrays for treatment of allergic eosinophilic diseases | |
JP4644488B2 (en) | Vaccine composition comprising amyloid beta 1-6 antigen array | |
AU2002363382B2 (en) | Antigen arrays presenting IL-5, IL-3 or eotaxin for treatment of allergic eosinophilic diseases | |
EP1441764B1 (en) | Antigen arrays comprising rankl for treatment of bone disease | |
JP2008501658A (en) | Medical use of non-human TNF-peptide carrier conjugates | |
AU2002363382A1 (en) | Antigen arrays presenting IL-5, IL-3 or eotaxin for treatment of allergic eosinophilic diseases | |
AU2002342891A1 (en) | Antigen arrays comprising RANKL for treatment of bone disease | |
EP1751186A2 (en) | Carrier conjugates of tnf-peptides | |
RU2319503C2 (en) | Composition for immunization (variants), method for its preparing and using for treatment of allergic eosinophilic diseases | |
RU2322258C2 (en) | Antigen matrix for treatment of bone disease | |
JP2005514347A5 (en) | ||
ZA200402015B (en) | Antigen arrays comprising rankl for treatment of bone disease. | |
AU2003257479B2 (en) | Ghrelin-carrier conjugates |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20121108 |