RU2318874C1 - RECOMBINANT PLASMID DNA pFastBac-B9RZ CONTAINING FRAGMENT OF MANKEYPOX VIRUS GENOME, ENCODING INTERFERON-GAMMA-BINDING PROTEIN AND STRAIN OF BACULOVIRUS BvB9RZ PRODUCING SOLUBLE INTERFERON-GAMMA-BINDING PROTEIN OF MANKEYPOX VIRUS - Google Patents

RECOMBINANT PLASMID DNA pFastBac-B9RZ CONTAINING FRAGMENT OF MANKEYPOX VIRUS GENOME, ENCODING INTERFERON-GAMMA-BINDING PROTEIN AND STRAIN OF BACULOVIRUS BvB9RZ PRODUCING SOLUBLE INTERFERON-GAMMA-BINDING PROTEIN OF MANKEYPOX VIRUS Download PDF

Info

Publication number
RU2318874C1
RU2318874C1 RU2006113756/13A RU2006113756A RU2318874C1 RU 2318874 C1 RU2318874 C1 RU 2318874C1 RU 2006113756/13 A RU2006113756/13 A RU 2006113756/13A RU 2006113756 A RU2006113756 A RU 2006113756A RU 2318874 C1 RU2318874 C1 RU 2318874C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
virus
binding protein
gamma
strain
pfastbac
Prior art date
Application number
RU2006113756/13A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2006113756A (en
Inventor
Татьяна Сергеевна Непомнящих
Ирина Павловна Гилева
Игорь Александрович Рязанкин
Сергей Николаевич Щелкунов
Original Assignee
Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора filed Critical Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора
Priority to RU2006113756/13A priority Critical patent/RU2318874C1/en
Publication of RU2006113756A publication Critical patent/RU2006113756A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2318874C1 publication Critical patent/RU2318874C1/en

Links

Images

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

FIELD: biotechnology, in particular gene engineering.
SUBSTANCE: Gene of B9R protein having high homology with extracellular segment of interferon-gamma receptor is isolated by PCR method from Mankeypox virus genome of strain Zaire-96-1-16. Then said protein is cloned in donor plasmid pFastbAC and via site-specific transposition recombinant bacmid is constructed. Said bacmid is used for pest cell transfection to generate target strain.
EFFECT: new drugs for treatment of human diseases associated with hyperproduction of interferon-gamma.
2 cl, 3 dwg, 6 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может найти применение как лекарственное средство нового поколения для борьбы с тяжелыми заболеваниями человека, связанными с гиперпродукцией интерферона гамма (IFNg).The invention relates to biotechnology, in particular to genetic engineering, and may find application as a new generation of medicine to combat severe human diseases associated with the overproduction of interferon gamma (IFNg).

Интерфероны - секретируемые видоспецифичные гликопротеины, подразделяемые на два типа (a/b и g). Взаимодействуя с соответствующими клеточными рецепторами, они индуцируют возникновение антивирусного состояния [1]. Интерфероны являются многофункциональными цитокинами, одними из важнейших регуляторов развития воспалительных и иммунных реакций в ответ на вирусную инфекцию. Однако нарушения контролируемой продукции IFNg играют критическую роль в этиологии развития ряда заболеваний человека, таких как болезнь Крона [2], диабет первого типа [3], ревматоидный артрит [4], системная красная волчанка [5], псориаз [6]. Успех при лечении этих заболеваний будет зависеть от того, насколько быстро и эффективно удасться снизить уровень IFNg в организме больного. В настоящее время имеется положительный опыт применения поликлональных [7, 8, 9, 10] и моноклональных антител [11] для лечения аутоиммунных заболеваний. Препарат гуманизированных моноклональных антител находится в настоящее время на второй стадии клинических испытаний [11]. Также существуют препараты «Анаферон» и «Анаферон детский» (per. уд. Р N 000372/01-2001), приготовленные на основе аффинно-очищенных антител, содержащие активированную форму сверхмалых доз моноклональных, поликлональных или естественных антител к IFNg, полученную преимущественно по гомеопатической технологии, применяемые для лечения гриппа и ОРВИ [12].Interferons are secreted species-specific glycoproteins, divided into two types (a / b and g). Interacting with the corresponding cellular receptors, they induce the occurrence of an antiviral state [1]. Interferons are multifunctional cytokines, one of the most important regulators of the development of inflammatory and immune responses in response to a viral infection. However, violations of the controlled production of IFNg play a critical role in the etiology of the development of a number of human diseases, such as Crohn’s disease [2], type 1 diabetes [3], rheumatoid arthritis [4], systemic lupus erythematosus [5], psoriasis [6]. Success in treating these diseases will depend on how quickly and efficiently it is possible to reduce the level of IFNg in the patient's body. Currently, there is positive experience with the use of polyclonal [7, 8, 9, 10] and monoclonal antibodies [11] for the treatment of autoimmune diseases. The preparation of humanized monoclonal antibodies is currently at the second stage of clinical trials [11]. There are also preparations “Anaferon” and “Anaferon for children” (per. Beats. P N 000372 / 01-2001), prepared on the basis of affinity-purified antibodies, containing the activated form of ultra-low doses of monoclonal, polyclonal or natural antibodies to IFNg, obtained mainly by homeopathic technology used to treat influenza and SARS [12].

Еще одним способом лечения заболеваний, связанных с высоким уровнем IFNg в организме больных людей, является применение растворимых IFNg-связывающих белков - рецепторов этого цитокина. Указанные белки были выделены из мочи [13, 14] или из клеток человека (WISH, HeLa, FS11...) [15]. Однако процесс получения рецепторов IFNg из указанных источников достаточно трудоемок и не позволяет получить лекарственное средство в достаточных количествах.Another method of treating diseases associated with high levels of IFNg in the body of sick people is the use of soluble IFNg-binding proteins - receptors of this cytokine. These proteins were isolated from urine [13, 14] or from human cells (WISH, HeLa, FS11 ...) [15]. However, the process of obtaining IFNg receptors from these sources is rather laborious and does not allow to obtain the drug in sufficient quantities.

Наиболее близким к заявляемому подходу является использование в качестве средства анти-IFNg-терапии рекомбинантных рецепторов IFNg. Рекомбинантные растворимые формы человеческого рецептора IFNg и несколько антител к этим рецепторам описаны в ряде патентов США [16, 17]. Полученную генно-инженерными методами кДНК, кодирующую IFNg-связывающий белок, клонируют и экспрессируют в клетках Е.coli, при этом полученный продукт необходимо гликозилировать. Указанные рецепторы и антитела после дальнейшего изучения предполагается использовать в качестве антагонистов IFNg, в частности для лечения аутоиммунных заболеваний.Closest to the claimed approach is the use of recombinant IFNg receptors as a means of anti-IFNg therapy. Recombinant soluble forms of the human IFNg receptor and several antibodies to these receptors are described in several US patents [16, 17]. The cDNA encoding the IFNg-binding protein obtained by genetic engineering is cloned and expressed in E. coli cells, and the resulting product must be glycosylated. These receptors and antibodies, after further study, are expected to be used as IFNg antagonists, in particular for the treatment of autoimmune diseases.

Анализ нуклеотидной последовательности генома вируса оспы обезьян (ВОО) выявил открытую рамку трансляции B9R, кодирующую белок, имеющий высокую степень гомологии с внеклеточным сегментом рецептора интерферона гамма [18]. Этот белок является одним из компонентов системы, позволяющей вирусу оспы обезьян эффективно преодолевать иммунные реакции организма человека.Analysis of the nucleotide sequence of the monkeypox virus (SBI) genome revealed an open B9R translation frame encoding a protein that has a high degree of homology with the extracellular segment of the gamma interferon receptor [18]. This protein is one of the components of the system that allows the monkeypox virus to efficiently overcome the immune responses of the human body.

Технической задачей изобретения является расширение спектра препаратов нового поколения, предназначенных для лечения заболеваний человека, связанных с гиперпродукцией интерферона гамма.An object of the invention is to expand the range of new generation drugs intended for the treatment of human diseases associated with the overproduction of interferon gamma.

Поставленная задача решается путем создания рекомбинантного бакуловируса - продуцента растворимого IFNg-связывающего белка. Первым этапом в создании штамма-продуцента является конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pFastBac-B9RZ, содержащей фрагмент генома вируса оспы обезьян, кодирующей аминокислотную последовательность IFNg-связывающего белка.The problem is solved by creating a recombinant baculovirus - a producer of soluble IFNg-binding protein. The first step in creating a producer strain is the construction of pFastBac-B9RZ recombinant plasmid DNA containing a fragment of the monkeypox virus genome that encodes the amino acid sequence of the IFNg binding protein.

Целевая плазмида pFastBac-B9RZ (фиг.1) имеет размер 5628 п.н. и молекулярную массу 3.85 мДа и состоит изThe target plasmid pFastBac-B9RZ (FIG. 1) has a size of 5628 bp. and a molecular weight of 3.85 mDa and consists of

- фрагмента генома вируса оспы обезьян штамма Zaire-96-I-16 длиной 868 п.н., кодирующего IFNg-связывающий белок;- a fragment of the genome of the smallpox virus of monkeys of the strain Zaire-96-I-16 with a length of 868 bp encoding an IFNg-binding protein;

- векторной плазмиды pFastBac [19] длиной 4760 п.н., обеспечивающей сайт-специфическую транспозицию целевого фрагмента ДНК в геном бакуловируса.- vector plasmid pFastBac [19] with a length of 4760 bp, which provides site-specific transposition of the target DNA fragment into the baculovirus genome.

Рекомбинантный бакуловирус, полученный в результате сайт-специфической транспозиции целевого фрагмента ДНК из донорной плазмиды pFastBac-B9RZ в бакуловирусный вектор (бакмиду), находящийся в E.coli [18], после заражения им клеток насекомых Sf21 продуцирует растворимый белок вируса оспы обезьян штамма Zaire-96-I-16 - аналог рецептора IFNg человека.Recombinant baculovirus obtained by site-specific transposition of the target DNA fragment from the donor plasmid pFastBac-B9RZ into the baculovirus vector (bacmid) located in E. coli [18], after infection of insect cells with Sf21, it produces a soluble monkeypox virus protein of strain Zaire- 96-I-16 is an analogue of the human IFNg receptor.

В качестве фрагмента генома вируса оспы обезьян используют фрагмент ДНК длиной 868 п.н., полученный с помощью полимеразной цепной реакции. Матрицей для амплификации служит ДНК вируса оспы обезьян штамма Zaire-96-I-16. Олигонуклеотидные праймеры для амплификации IFNg-связывающего белка вируса оспы обезьян имеют следующую структуру:As a fragment of the monkeypox virus genome, a DNA fragment of 868 bp obtained by polymerase chain reaction is used. The amplification template is monkeypox virus DNA of strain Zaire-96-I-16. The oligonucleotide primers for amplification of the IFNg-binding protein of monkeypox virus have the following structure:

1. 5′CGGGATCCATGAGATATATTATAATTCTCGCAGTTTTG 3′1.5′CGGGATCCATGAGATATATTATAATTCTCGCAGTTTTG 3 ′

2. 5′GGAATTCACCAGTGTATAATATGCAGTTTTATTTCAT 3′2.5′GGAATTCACCAGTGTATAATATGCAGTTTTATTTCAT 3 ′

В структуру праймеров 1 и 2 заложены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции BamHI и EcoRI, соответственно (выделены в последовательности праймеров жирным курсивом). В качестве плазмидного вектора, обеспечивающего сайт-специфическую транспозицию целевого фрагмента ДНК в бакмиду pMON14272 [18], используют плазмиду pFastBac [18], содержащую бакуловирусный специфический промотор pPolh для экспрессии белков в клетках насекомых, мини-Tn7-транспазон, гены устойчивости к ампициллину и гентамицину, полилинкер для клонирования целевых генов и сигнал для полиаденилирования вируса SV-40. Бакмида pMON14272 содержит низкокопийный мини-F репликон, ген устойчивости к канамицину и фрагмент ДНК, кодирующий α-донорный пептид β-галактозидазы E.coli, и обеспечивает α-комплементацию при размножении в штамме E.coli DH10BacTM в присутствии хромогенного субстрата X-gal и индуктора IPTG.The structure of primers 1 and 2 contains recognition sites for restriction endonucleases BamHI and EcoRI, respectively (highlighted in bold italics in the sequence of primers). The plasmid pFastBac [18] containing the baculovirus specific pPolh promoter for expression of proteins in insect cells, mini-Tn7-transposon, ampicillin and genes for resistance is used as a plasmid vector that provides site-specific transposition of the target DNA fragment into pMON14272 [18]. gentamicin, a polylinker for cloning target genes and a signal for polyadenylation of the SV-40 virus. PMON14272 contains the low copy bacmid mini-F replicon, kanamycin resistance gene and a DNA fragment encoding α-donor peptide of β-galactosidase E.coli, and provides α-complementation when propagated in strain E.coli DH10Bac TM in the presence of chromogenic substrate X-gal and IPTG inductor.

Выбранная бакуловирусная система экспрессии обеспечивает высокий уровень синтеза целевого продукта и его правильную посттрансляционную модификацию по сравнению с другими системами экспрессии.The selected baculovirus expression system provides a high level of synthesis of the target product and its correct post-translational modification in comparison with other expression systems.

Сущность изобретения заключается в том, что фрагмент ДНК, содержащий ген интерферон гамма-связывающего белка B9R вируса оспы обезьян штамма Zaire-96-I-16, получается с помощью ПЦР из вирусного генома, затем полученный ген клонируется в донорной плазмиде pFastBac и путем сайт-специфической транспозиции в бактериальных клетках образуется рекомбинантная бакмида, которая используется для трансфекции клеток насекомых, в результате чего генерируется рекомбинантный вирус BvB9RZ, экспрессирующий указанный ген. Нуклеотидная последовательность встроенного фрагмента приведена на фиг.2.The essence of the invention lies in the fact that the DNA fragment containing the gene for interferon gamma-binding protein B9R of smallpox virus monkeys strain Zaire-96-I-16, obtained by PCR from the viral genome, then the resulting gene is cloned in the donor plasmid pFastBac and by specific transposition in bacterial cells, a recombinant bacmid is formed, which is used to transfect insect cells, resulting in the generation of a recombinant BvB9RZ virus expressing the specified gene. The nucleotide sequence of the inserted fragment is shown in figure 2.

Штамм характеризуется следующими признаками.The strain is characterized by the following features.

Морфологические признаки. Штамм обладает свойствами типичного представителя бакуловирусов, но в отличие от векторного вируса имеет фенотип Lac-.Morphological signs. The strain has the properties of a typical representative of baculoviruses, but unlike the vector virus, it has the Lac - phenotype.

Физиолого-биохимические характеристики и культуральные свойства штамма. ДНК рекомбинантного бакуловируса имеет длину около 140000 п.н. Наличие в его геноме целевой вставки длиной 868 п.н. подтверждено с помощью метода ПЦР. При размножении рекомбинантного бакуловируса на культуре клеток насекомых Spodoptera frugiperda (Sf21) его титр не отличается от титра, получаемого при размножении вируса, не содержащего в своем геноме чужеродных фрагментов ДНК.Physiological and biochemical characteristics and cultural properties of the strain. Recombinant baculovirus DNA is about 140,000 bp in length. The presence of a target insert of 868 bp in its genome confirmed by PCR method. When a recombinant baculovirus is propagated on an insect cell culture Spodoptera frugiperda (Sf21), its titer does not differ from that obtained by propagating a virus that does not contain foreign DNA fragments in its genome.

Основным отличием штамма является его способность синтезировать IFNg-связывающий белок ВОО при инфицировании им культуры клеток насекомых Sf21.The main difference between the strain is its ability to synthesize the IFNg-binding protein BOO when infected with insect cell culture Sf21.

Полученный штамм рекомбинантного бакуловируса BvB9RZ депонирован в коллекции микроорганизмов Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» за номером V-356 от 15.08.05The resulting strain of recombinant baculovirus BvB9RZ deposited in the collection of microorganisms of the State scientific center of virology and biotechnology "Vector" under the number V-356 from 08/15/05

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами графических изображений:The invention is illustrated by the following figures of graphic images:

Фиг.1 Физическая карта плазмиды pFastBac-B9RZ. За первый нуклеотид плазмиды принимается нуклеотид A межцистронной области фага f1; Tn7L, Tn7R - фрагменты транспозона Tn7; SV40polyA - сайт полиаденилирования вируса SV40; B9R - ген интерферон гамма-связывающего белка ВОО штамма Zaire-96-I-16; pPolh - промотор полиэдрина; Ori - сайт инициации репликации; Apr, Gmr - маркеры устойчивости к ампициллину и гентамицину соответственно.Figure 1 Physical map of the plasmid pFastBac-B9RZ. The nucleotide A of the intercistronic region of phage f1 is taken as the first nucleotide of the plasmid; Tn7L, Tn7R — fragments of the transposon Tn7; SV40polyA — SV40 polyadenylation site; B9R - gene interferon gamma-binding protein BOO strain Zaire-96-I-16; pPolh is the polyhedrin promoter; Ori - replication initiation site; Ap r , Gm r are markers of resistance to ampicillin and gentamicin, respectively.

Фиг.2. Нуклеотидная последовательность гена B9R ВОО (штамм Zaire-96-I-16) и расположение специфических праймеров (показаны жирным шрифтом) на матрице. Сайты эндонуклеаз рестрикции BamHI и EcoRI, используемые при конструировании плазмиды интеграции pFastBac-B9RZ, показаны одинарным подчеркиванием. Инициирующий и терминирующий кодоны IFNg-связывающего белка ВОО показаны двойным подчеркиванием.Figure 2. The nucleotide sequence of the B9R BOO gene (strain Zaire-96-I-16) and the location of specific primers (shown in bold) on the matrix. The restriction endonucleases BamHI and EcoRI used in the construction of the integration plasmid pFastBac-B9RZ are shown with single underlining. The initiating and terminating codons of the IFNg-binding BOO protein are indicated by double underlining.

Фиг.3. Электрофоретический анализ в 1% агарозе ПЦР-фрагментов, содержащих интерферон гамма-связывающий белок ВОО, амплифицированных с помощью специфических праймеров с ДНК ВОО (дорожка 3), плазмиды pFastBac-B9RZ (дорожка 4) и с бакмиды bMON14272-B9RZ (дорожка 5). Дорожка 1 - маркеры длин «bp 100» («СибЭнзим», Россия), дорожка 2 - отрицательный контроль.Figure 3. Electrophoretic analysis in 1% agarose of PCR fragments containing interferon gamma-binding protein BOO, amplified using specific primers with BOO DNA (lane 3), plasmids pFastBac-B9RZ (lane 4) and from bacmid bMON14272-B9RZ (lane 5). Lane 1 - markers of lengths “bp 100” (SibEnzyme, Russia), lane 2 - negative control.

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его осуществления.For a better understanding of the invention, the following are examples of its implementation.

Пример 1. Способ амплификации фрагмента ДНК, содержащего ген IFNg-связывающего белка ВОО.Example 1. The method of amplification of a DNA fragment containing the gene of IFNg-binding protein BOO.

Реакцию амплификации проводят в пробирках Eppendorf в объеме 50 мкл в амплификаторах с горячей крышкой. Реакционная смесь содержит 10 мМ Tris-HCl pH 8.8, 50 мМ KCl, 2.5 мМ MgCl2, 0.1% Tween 20, 0.2 мМ dATP, 0.2 мМ dCTP, 0.2 мМ dGTP, 0.2 мМ dTTP, олигонуклеотидные праймеры в количестве 10 пмоль каждого, 2 ед.а. Tth-полимеразы, 2-10 нг ДНК-матрицы.The amplification reaction is carried out in Eppendorf tubes in a volume of 50 μl in amplifiers with a hot cap. The reaction mixture contains 10 mM Tris-HCl pH 8.8, 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl 2 , 0.1% Tween 20, 0.2 mM dATP, 0.2 mM dCTP, 0.2 mM dGTP, 0.2 mM dTTP, oligonucleotide primers in an amount of 10 pmol each, 2 food. Tth polymerase, 2-10 ng of the DNA template.

Амплификацию вели в течение 30 циклов по следующей схеме:Amplification was carried out for 30 cycles according to the following scheme:

Figure 00000002
Figure 00000002

Наличие амплифицированного продукта проверяют с помощью электрофореза в 1% агарозном геле (фиг.3).The presence of the amplified product is checked by electrophoresis in 1% agarose gel (figure 3).

Пример 2. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pFastBac-B9RZ.Example 2. Construction of recombinant plasmid DNA pFastBac-B9RZ.

5-10 мкг плазмиды pFastBac [18] и 1-5 мкг амплифицированного продукта, соответствующего гену B9R ВОО, гидролизуют эндонуклеазами рестрикции BamHI и EcoRI в стандартных условиях. Полученные фрагменты выделяют электрофорезом в 1% агарозном геле с последующей элюцией. 0.2 мкг вектора и 0.6 мкг фрагмента лигируют в стандартных условиях и полученной лигазной смесью трансформируют компетентные клетки E.coli штамма XL-blue. Клеточные Apr-клоны выращивают при 37оС в LB среде, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, до стационарной фазы. Рекомбинантную плазмидную ДНК выделяют по стандартной методике и анализируют с помощью эндонуклеаз рестрикции BamHI и EcoRI. Из клонов, содержащих встроенный фрагмент, выделяют плазмидную ДНК, структуру которой в районе встройки подтверждают определением нулеотидной последовательности методом терминации синтезируемой цепи на автоматическом секвенаторе ABM PRISMTM 310 (Perkin Elmer, США). Полученную таким образом целевую плазмиду обозначают pFastBac-B9RZ.5-10 μg of the plasmid pFastBac [18] and 1-5 μg of the amplified product corresponding to the B9R BOO gene are hydrolyzed with restriction endonucleases BamHI and EcoRI under standard conditions. The resulting fragments were isolated by electrophoresis on a 1% agarose gel, followed by elution. 0.2 μg of the vector and 0.6 μg of the fragment are ligated under standard conditions and competent E. coli strain XL-blue are transformed with the obtained ligase mixture. Cell Ap r -klony grown at 37 ° C in LB medium containing 100 .mu.g / ml ampicillin to stationary phase. Recombinant plasmid DNA was isolated by standard methods and analyzed using restriction endonucleases BamHI and EcoRI. Plasmid DNA is isolated from the clones containing the inserted fragment, the structure of which in the insertion region is confirmed by determining the nullotide sequence by the method of terminating the synthesized chain on an ABM PRISM TM 310 automatic sequencer (Perkin Elmer, USA). The target plasmid thus obtained is designated pFastBac-B9RZ.

Пример 3. Получение бакмиды pMON14272-B9RZ.Example 3. Obtaining bacmids pMON14272-B9RZ.

К 100 мкл компетентных клеток E.coli штамма DH10BacTM добавляют 1 нг плазмиды pFastBac-B9RZ. Полученную смесь инкубируют во льду в течение 30 мин, затем при 42оС в течение 45 сек с последующим охлаждением во льду в течение 2 мин. Реакционную смесь разводят 1:10 LB-бульоном и подращивают на качалке при интенсивной аэрации при 37оС в течение четырех часов. Далее клетки высевают на селективную среду - LB-агар, содержащий 100 мкг/мл X-gal, 40 мкг/мл IPTG, 50 мкг/мл канамицина, 7 мкг/мл гентамицина, 10 мкг/мл тетрациклина, и инкубируют в термостате при 37оС в течение суток. Клоны с фенотипом Lac- засевают в пробирки с 5 мл LB-бульона, содержащего 50 мкг/мл канамицина, 7 мкг/мл гентамицина, 10 мкг/мл тетрациклина, и выращивают при интенсивной аэрации при 37оС до стационарной фазы. Культуру переносят в 1.5 мл пробирки Eppendorf, осаждают клетки центрифугированием в течение 40 сек при 14000g, удаляют среду. Процедуру добавления культуры, осаждения и удаления среды повторяют еще два раза. Осадок ресуспендируют в 0.3 мл раствора 1 (10 мМ ЭДТА, 15 мМ Tris-HCl pH 8.0, 100 мкг/мл РНКазы), добавляют 0.3 мл раствора 2 (0.2 М NaOH, 1% SDS) и инкубируют при комнатной температуре 5 мин. К смеси медленно добавляют 0.3 мл раствора 3 (3 М KAc pH 5.2). Инкубируют во льду 10 мин. Центрифугируют при 14000 g в течение 10 мин. Супернатант переносят в чистую пробирку, добавляют 0.8 мл изопропанола, перемешивают и охлаждают при -20оС 5 мин, затем осаждают при 14000 g 15 мин. Осадок промывают два раза этанолом, высушивают, растворяют в 40 мкл буфера TE. Наличие в геноме бакмиды интегрированного фрагмента ДНК подтверждают с помощью ПЦР. Полученную бакмидную ДНК pMON14272-B9RZ используют для трансфекции клеток насекомых линии Sf21.To 100 μl of competent cells of E. coli strain DH10Bac add 1 ng of plasmid pFastBac-B9RZ. The resulting mixture was incubated on ice for 30 min, then at 42 ° C for 45 seconds, followed by cooling on ice for 2 min. The reaction mixture was diluted 1:10 LB-broth and were maintained on a shaker with intensive aeration at 37 ° C for four hours. Then the cells are seeded on a selective medium - LB-agar containing 100 μg / ml X-gal, 40 μg / ml IPTG, 50 μg / ml kanamycin, 7 μg / ml gentamicin, 10 μg / ml tetracycline, and incubated in an incubator at 37 about C during the day. The clones with a phenotype Lac - inoculated into tubes with 5 ml LB-broth containing 50 ug / ml kanamycin, 7 ug / ml gentamicin, 10 ug / ml tetracycline and grown with intensive aeration at 37 ° C to stationary phase. The culture is transferred to 1.5 ml Eppendorf tubes, the cells are pelleted by centrifugation for 40 seconds at 14000g, and the medium is removed. The procedure for adding culture, sedimentation and removal of the medium is repeated two more times. The precipitate was resuspended in 0.3 ml of solution 1 (10 mM EDTA, 15 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 μg / ml RNase), 0.3 ml of solution 2 (0.2 M NaOH, 1% SDS) was added and incubated at room temperature for 5 min. 0.3 ml of solution 3 (3 M KAc pH 5.2) was slowly added to the mixture. Incubated in ice for 10 minutes. Centrifuge at 14,000 g for 10 minutes. The supernatant was transferred to a clean test tube is added 0.8 ml of isopropanol, stirred and cooled at -20 ° C for 5 minutes, then pelleted at 14000 g for 15 min. The precipitate was washed twice with ethanol, dried, dissolved in 40 μl of TE buffer. The presence of an integrated DNA fragment in the bacmid genome is confirmed by PCR. The obtained bacmid DNA pMON14272-B9RZ is used to transfect insect cells of the Sf21 line.

Пример 4. Трансфекция клеток насекомых Sf21 рекомбинантной бакмидной ДНК pMON14272-B9RZ и получение рекомбинантного вируса.Example 4. Transfection of insect cells Sf21 with recombinant bacmid DNA pMON14272-B9RZ and obtaining a recombinant virus.

Клетки Sf21 засевают в лунки 6-луночного планшета из расчета, чтобы на следующий день был монослой (2×106 клеток/лунку). На следующий день готовят два раствора: 10 мкл вирусной ДНК+100 мкл среды Грейса и 6 мкл реактива CellFECTIN фирмы LifeTechnologies (США)+100 мкл среды Грейса. Растворы смешивают, инкубируют при комнатной температуре 25 мин. В это время промывают монослой клеток два раза средой Грейса. К клеткам добавляют по 0.8 мл/лунку среды Грейса и 200 мкл приготовленного раствора. Инкубируют клетки при 28оС в течение 5 ч. После этого отбирают среду и добавляют к клеткам по 2 мл среды Грейса с 10% эмбриональной сывороткой коров (ЭСК) (ООО «БиолоТ», Россия). Клетки инкубируют при 28оС в течение 2-5 суток. Далее клетки ресуспендируют (интенсивным пипетированием), центрифугируют 5 мин при 5000 g и осветленный супернатант расфасовывают в стерильные пробирки. Титр вируса определяют следующим образом. К монослою клеток Sf21 добавляют 200 мкл разведения вируса и проводят адсорбцию в течение 60 мин при комнатной температуре. Далее готовят 2% легкоплавкую агарозу («Sigma», США) и смешивают ее в расплавленном виде со средой Грейса c 10% ЭСК в соотношении 1:1. Полученную среду охлаждают в термостате до 37оС и добавляют по 2 мл на лунку, а после застывания добавляют по 2 мл на лунку среды Грейса с 10% ЭСК. Инкубируют в термостате при 28оС 5 суток. Далее добавляют по 2 мл на лунку краситель нейтральный красный, разведенный в среде Грейса с 10% ЭСК, в соотношении 1:20. Инкубируют при 28оС в течение суток. Титр определяют путем подсчета окрашенных бляшек. Последний составляет 107 БОЕ/мл. Суспензию рекомбинантного вируса хранят при -20оС.Sf21 cells are seeded in the wells of a 6-well plate so that the next day there is a monolayer (2 × 10 6 cells / well). The next day, two solutions are prepared: 10 μl of viral DNA + 100 μl of Grace medium and 6 μl of CellFECTIN reagent from LifeTechnologies (USA) +100 μl of Grace medium. The solutions are mixed, incubated at room temperature for 25 minutes. At this time, the cell monolayer is washed twice with Grace medium. To the cells add 0.8 ml / well of Grace medium and 200 μl of the prepared solution. Incubate cells at 28 ° C for 5 hours. Thereafter, the medium is taken and added to the cells in 2 ml Grace's medium with 10% fetal bovine serum (ES) (OOO "Biolot", Russia). Cells are incubated at 28 about C for 2-5 days. Then the cells are resuspended (by intensive pipetting), centrifuged for 5 min at 5000 g and the clarified supernatant is packaged in sterile tubes. The titer of the virus is determined as follows. 200 μl of virus dilution was added to the monolayer of Sf21 cells and adsorption was carried out for 60 minutes at room temperature. Next, 2% low-melting agarose (Sigma, USA) is prepared and mixed in molten form with Grace medium with 10% ESC in a 1: 1 ratio. The resulting medium is cooled in a thermostat to 37 ° C and 2 ml per well are added, and after solidification, 2 ml per well of Grace medium with 10% ESC is added. Incubated in a thermostat at 28 about 5 days. Then, 2 ml per well of neutral red dye diluted in Grace medium with 10% ESC is added in a ratio of 1:20. Incubated at 28 about C for a day. The titer is determined by counting stained plaques. The latter is 10 7 PFU / ml. Recombinant virus suspension was stored at -20 ° C.

Пример 5. Заражение клеток насекомых Sf21 рекомбинантным вирусом.Example 5. Infection of insect cells with Sf21 recombinant virus.

200 мкл размороженного вирусного материала с титром 107 наносят на монослой клеток насекомых Sf21 в матрасе для культивирования объемом 25 мл. Инкубируют 30 мин при комнатной температуре. После инкубации добавляют 2 мл среды Грейса с 10% ЭСК. Инкубируют при 28 оС в течение 2-3 суток. Далее клетки ресуспендируют интенсивным пипетированием и центрифугируют 5 мин при 5000 g. Осветленный супернатант анализируют в тесте на способность ингибировать защитное действие hIFNg от вируса энцефаломиокардита мышей (ВЭМКМ) на культуре клеток легкого из эмбриона человека L68.200 μl of thawed viral material with a titer of 10 7 is applied to a monolayer of Sf21 insect cells in a 25 ml culture mattress. Incubated for 30 minutes at room temperature. After incubation, add 2 ml of Grace medium with 10% ESC. Incubated at 28 about C for 2-3 days. Then the cells are resuspended by intensive pipetting and centrifuged for 5 min at 5000 g. The clarified supernatant is analyzed in a test for the ability to inhibit the protective effect of hIFNg from mouse encephalomyocarditis virus (VEMCM) on a lung cell culture from a human L68 embryo.

Пример 6. Определение биологической активности продукта экспрессии гена B9R.Example 6. Determination of the biological activity of the product of expression of the B9R gene.

Биологическую активность продукта экспрессии гена B9R определяют по его способности ингибировать защитное действие hIFNg от ВЭМКМ на культуре клеток легкого из эмбриона человека L68. Клетки линии L68 культивируют в 200 мкл среды DMEM с 10% эмбриональной сыворотки коров до формирования клеточного монослоя на 75-85% поверхности лунки 96-луночного планшета. При достижении необходимой плотности клеток ростовую среду заменяют на 200 мкл среды DMEM с 2% эмбриональной сыворотки коров, содержащей лизаты клеток Sf21, зараженных рекомбинантным бакуловирусом (100 мкл на лунку и последовательные двукратные разведения) и препарат hIFNg (4 нг/мл, что по данным предварительно проведенного определения защитного действия hIFNg соответствует трехкратной дозе, обеспечивающей 50% защитный эффект от действия ВЭМКМ). Планшеты инкубируют при 37оС в СО2-инкубаторе (концентрация СО2 составляла 5%). В качестве контролей используют лунки планшета, содержащие клетки L68; клетки L68+VARV-IFNgBP; клетки L68+MPXV-IFNgBP; клетки L68+ВЭМКМ, дающее фоновое значение (0%) оптической плотности; клетки L68+hIFNg, дающее 100% оптической плотности; клетки L68+ВЭМКМ+hIFNg. Количество жизнеспособных клеток определяют через двое суток после заражения ВЭМКМ окрашиванием красителем нейтральным красным [20]. Измерение оптической плотности проводят на приборе Microplate Reader ELX808 («BIO-TEK INSTRUMENTS, INC», США). Результаты выражают в процентном отношении выживших клеток относительно количества клеток в контрольных пробах. Каждая проба бралась в трех повторах, и среднее значение процента выживаемости высчитывают по формуле:The biological activity of the B9R gene expression product is determined by its ability to inhibit the protective effect of hIFNg from VEMCM on a lung cell culture from human L68 embryo. L68 cells were cultured in 200 μl of DMEM medium with 10% fetal bovine serum until a cell monolayer was formed on 75-85% of the surface of the 96-well plate well. Upon reaching the required cell density, the growth medium is replaced with 200 μl of DMEM medium with 2% fetal serum of cows containing lysates of Sf21 cells infected with recombinant baculovirus (100 μl per well and serial two-fold dilutions) and hIFNg preparation (4 ng / ml, which, according to a preliminary determination of the protective effect of hIFNg corresponds to a three-fold dose, which provides a 50% protective effect from the action of VEMKM). Plates were incubated at 37 ° C in a CO 2 incubator (CO2 concentration was 5%). As controls, plate wells containing L68 cells are used; L68 + VARV-IFNgBP cells; L68 + MPXV-IFNgBP cells; L68 + VEMKM cells giving a background value (0%) of optical density; L68 + hIFNg cells, giving 100% optical density; L68 cells + VEMKM + hIFNg. The number of viable cells is determined two days after infection with VEMCM by staining with neutral red dye [20]. The optical density was measured using a Microplate Reader EL X 808 instrument (BIO-TEK INSTRUMENTS, INC, USA). Results are expressed as a percentage of surviving cells relative to the number of cells in control samples. Each sample was taken in three repetitions, and the average value of the percentage of survival is calculated by the formula:

(ОПВЭМКМ+IFNg+IFNgBP-ОПВЭМКМ)/(ОПIFNg-ОПВЭМКМ)×100%(OD VEMKM + IFNg + IFNgBP -OP VEMKM ) / (OD IFNg- OP VEMKM ) × 100%

По данным ингибирования защитного действия hIFNg от ВЭМКМ на культуре клеток L68 при концентрации в культуральной среде hIFNg 4 нг/мл 50% гибель клеток достигается при добавлении 100 мкл культуральной среды клеток Sf21, зараженных рекомбинантным вирусом BvB9RZ, со множественностью заражения 0,01 БОЕ на клетку на седьмые сутки инфекции.According to the inhibition of the protective effect of hIFNg from VEMCM on L68 cell culture at a concentration in the hIFNg culture medium of 4 ng / ml, 50% cell death is achieved by adding 100 μl of culture medium to Sf21 cells infected with recombinant BvB9RZ virus with a multiplicity of infection of 0.01 PFU per cell on the seventh day of infection.

Таким образом, получен рекомбинантный бакуловирус BvB9RZ, обеспечивающий экспрессию гена интерферон гамма-связывающего белка B9R вируса оспы обезьян штамма Zaire-96-I-16 в клетках насекомых линии Sf21. Полученный штамм может быть использован для разработки терапевтического препарата нового поколения для борьбы с заболеваниями человека, связанными с гиперпродукцией интерферона гамма.Thus, a recombinant baculovirus BvB9RZ was obtained that provides expression of the gene for interferon gamma-binding protein B9R of smallpox virus of monkey strain Zaire-96-I-16 in insect cells of the Sf21 line. The resulting strain can be used to develop a new generation therapeutic drug to combat human diseases associated with the overproduction of interferon gamma.

Figure 00000003
Figure 00000004
Figure 00000003
Figure 00000004

Claims (2)

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pFastBac-B9RZ, несущая фрагмент генома вируса оспы обезьян штамма Zaire-96-I-16, кодирующий растворимый интерферон гамма-связывающий белок, обеспечивающая сайт-специфическую транспозицию целевого фрагмента ДНК в геном бакуловируса, размером 5628 п.н. и молекулярной массой 3,85 мДа, содержащая1. Recombinant plasmid DNA pFastBac-B9RZ, carrying a fragment of the genome of smallpox virus monkey strain Zaire-96-I-16, encoding a soluble interferon gamma-binding protein, providing site-specific transposition of the target DNA fragment in the baculovirus genome, size 5628 bp and a molecular weight of 3.85 mDa containing ПЦР-фрагмент генома вируса оспы обезьян штамма Zaire-96-I-16, содержащий ген B9R, полученный с использованием праймеровPCR fragment of the genome of the virus of smallpox monkey strain Zaire-96-I-16, containing the B9R gene obtained using primers 5′- CGGGATCCATGAGATATATTATAATTCTCGCAGTTTTG - 3′ и5′- CGGGATCCATGAGATATATTATAATTCTCGCAGTTTTG - 3 ′ and 5′- GGAATTCACCAGTGTATAATATGCAGTTTTATTTCAT - 3′,5′- GGAATTCACCAGTGTATAATATGCAGTTTTATTTCAT - 3 ′, кодирующий интерферон гамма-связывающий белок, фланкированный сайтами узнавания эндонуклеаз рестрикции BamHI и EcoRI, размером 868 п.н.;interferon-encoding gamma-binding protein flanked by recognition sites for restriction endonucleases BamHI and EcoRI, size 868 bp; BamHI-EcoRI фрагмент векторной плазмиды pFastBac, размером 4760 п.н., включающий бакуловирусный промотор pPolh, мини-Tn7-транспазон и сигнал для полиаденилирования вируса SV-40, обеспечивающий сайт-специфическую транспозицию ДНК гена B9R в геном бакуловируса;BamHI-EcoRI fragment of the vector plasmid pFastBac, size 4760 bp, including the baculovirus promoter pPolh, mini-Tn7 transposon and a signal for polyadenylation of the SV-40 virus, providing site-specific transposition of B9R gene DNA into the baculovirus genome; генетические маркеры:genetic markers: ген b-лактамазы, определяющий устойчивость к ампициллину;b-lactamase gene defining ampicillin resistance; ген аминогликозидтрансферазы, определяющий устойчивость к гентамицину;aminoglycoside transferase gene, which determines resistance to gentamicin; уникальные сайты рестрикции: BamHI (4033), EcoRI (4907).unique restriction sites: BamHI (4033), EcoRI (4907). 2. Штамм рекомбинантного бакуловируса BvB9RZ, полученный с помощью рекомбинантной плазмидной ДНК pFastBac-B9RZ по п.1, депонированный в НИИ ККМ под номером V-356, - продуцент растворимого интерферон гамма-связывающего белка, кодируемого геном B9R вируса оспы обезьян.2. The strain of recombinant baculovirus BvB9RZ obtained using the recombinant plasmid DNA pFastBac-B9RZ according to claim 1, deposited at the KKM Research Institute under the number V-356, is a producer of soluble interferon gamma-binding protein encoded by the monkeypox virus B9R gene.
RU2006113756/13A 2006-04-21 2006-04-21 RECOMBINANT PLASMID DNA pFastBac-B9RZ CONTAINING FRAGMENT OF MANKEYPOX VIRUS GENOME, ENCODING INTERFERON-GAMMA-BINDING PROTEIN AND STRAIN OF BACULOVIRUS BvB9RZ PRODUCING SOLUBLE INTERFERON-GAMMA-BINDING PROTEIN OF MANKEYPOX VIRUS RU2318874C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2006113756/13A RU2318874C1 (en) 2006-04-21 2006-04-21 RECOMBINANT PLASMID DNA pFastBac-B9RZ CONTAINING FRAGMENT OF MANKEYPOX VIRUS GENOME, ENCODING INTERFERON-GAMMA-BINDING PROTEIN AND STRAIN OF BACULOVIRUS BvB9RZ PRODUCING SOLUBLE INTERFERON-GAMMA-BINDING PROTEIN OF MANKEYPOX VIRUS

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2006113756/13A RU2318874C1 (en) 2006-04-21 2006-04-21 RECOMBINANT PLASMID DNA pFastBac-B9RZ CONTAINING FRAGMENT OF MANKEYPOX VIRUS GENOME, ENCODING INTERFERON-GAMMA-BINDING PROTEIN AND STRAIN OF BACULOVIRUS BvB9RZ PRODUCING SOLUBLE INTERFERON-GAMMA-BINDING PROTEIN OF MANKEYPOX VIRUS

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2006113756A RU2006113756A (en) 2007-10-27
RU2318874C1 true RU2318874C1 (en) 2008-03-10

Family

ID=38955581

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2006113756/13A RU2318874C1 (en) 2006-04-21 2006-04-21 RECOMBINANT PLASMID DNA pFastBac-B9RZ CONTAINING FRAGMENT OF MANKEYPOX VIRUS GENOME, ENCODING INTERFERON-GAMMA-BINDING PROTEIN AND STRAIN OF BACULOVIRUS BvB9RZ PRODUCING SOLUBLE INTERFERON-GAMMA-BINDING PROTEIN OF MANKEYPOX VIRUS

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2318874C1 (en)

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NUARA A.A., BAI H, CHTN N., BULLER R.M., WALTER M.R. J Virol. 2006 Nov; 80(21):10675-82. Epub 2006 Aug 23. BAI H., BULLER R.M., CHEN N., GREEN M., NUARA A.A. Virology. 2005 Mar 30; 334(1):41-50. SHCHELKUNOV S.N., TOTMENIN A.V., SAFRONOV P.E., et al. Virology. 2002 Jun 5; 297(2):172-94. NEPOMNIASHCHIKH T.S., LEBEDEV L.R., RIAZANKIN I.A., POZDNIAKOV S.G., GILEEVF I.P., SHCHELKUNOV S.N. Mol Biol (Mosk). 2005 Nov-Dec; 39(6):1055-62. *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2006113756A (en) 2007-10-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112266411B (en) Novel coronavirus vaccine and application thereof
Thut et al. p53 transcriptional activation mediated by coactivators TAFII40 and TAFII60
EP0198328B1 (en) Vaccinia dna
Cho et al. Down modulation of IL-18 expression by human papillomavirus type 16 E6 oncogene via binding to IL-18
Schuermann et al. The leucine repeat motif in Fos protein mediates complex formation with Jun/AP-1 and is required for transformation
ES2634513T3 (en) New hybrid promoter and recombinant vector comprising the same
US20030013076A1 (en) Parapoxvirus vectors
JP2005525822A (en) Intergenic region as an insertion site in the mutated vaccinia virus Ankara (MVA) genome
US5925516A (en) Medicaments for the treatment of papillomavirus diseases
JP2003505019A (en) Novel gene sequences encoding steroid and juvenile hormone receptor polypeptides and uses thereof
RU2318874C1 (en) RECOMBINANT PLASMID DNA pFastBac-B9RZ CONTAINING FRAGMENT OF MANKEYPOX VIRUS GENOME, ENCODING INTERFERON-GAMMA-BINDING PROTEIN AND STRAIN OF BACULOVIRUS BvB9RZ PRODUCING SOLUBLE INTERFERON-GAMMA-BINDING PROTEIN OF MANKEYPOX VIRUS
Kokuho et al. Production of biologically active, heterodimeric porcine interleukin-12 using a monocistronic baculoviral expression system
Hasnain et al. Involvement of host factors in transcription from baculovirus very late promoters-a review
JPH10507625A (en) Improving protein production in host cells
CN113061168B (en) Truncated fever with thrombocytopenia syndrome virus Gn protein and application thereof
RU2376375C2 (en) RECOMBINANT PLASMID DNA pFastBac-G2R-IgG, WHICH CONTAINS FRAGMENT OF SMALLPOX VIRUS GENOME, CODING FACTOR OF TUMOUR NECROSIS, BINDING PROTEIN, AND FRAGMENT OF HUMAN GENOME, CODING SECTION OF HEAVY CHAIN OF ANTIBODY G, AND STRAIN OF BACULOVIRUS BvG2RIgG, WHICH PRODUCES SOLUBLE CHIMERIC PROTEIN, WHICH CONSISTS OF SMALLPOX VIRUS PROTEIN, BINDING FACTOR OF TUMOUR NECROSIS, AND FRAGMENT OF HEAVY CHAIN OF HUMAN ANTIBODY G
US6103531A (en) Methods of disrupting interferon signal transduction pathways
RU2405824C1 (en) RECOMBINANT PLASMID pFastBAC-B17R DNA CONTAINING COWPOX VIRUS GENOME FRAGMENT CODING ALPHA/BETA-INTERFERON BINDING PROTEIN AND BvB17RG BACULOVIRUS STRAIN PRODUCING SOLUBLE ALPHA/BETA-INTERFERON BINDING PROTEIN OF COWPOX VIRUS
RU2241754C2 (en) Recombinant plasmid dna pfastbac-g2r comprising smallpox virus genome fragment encoding protein-analog of tumor necrosis factor receptor and strain of baculovirus btri67 producing soluble receptor of smallpox virus tumor necrosis factor
Wu et al. Characterization of neutralizing domains on varicella-zoster virus glycoprotein E defined by monoclonal antibodies
Roseman et al. The vaccinia virus HindIII F fragment: nucleotide sequence of the left 6.2 kb
CN108467865B (en) A549 cell model knock-out of Toll-like receptor 3(hTLR3)
Chao et al. Characterization of factor-independent variants derived from TF-1 hematopoietic progenitor cells: the role of the Raf/MAP kinase pathway in the anti-apoptotic effect of GM-CSF
US6514757B1 (en) Nodavirus-like DNA expression vector and uses thereof
CN108864305A (en) A kind of fusion protein and preparation method thereof being made of sheep albumin, sheep interferon gamma and sheep interferon-tau

Legal Events

Date Code Title Description
PD4A Correction of name of patent owner
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20170422