RU2315114C2 - Method for preparing dna-chips (variants) - Google Patents
Method for preparing dna-chips (variants) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2315114C2 RU2315114C2 RU2005125776/13A RU2005125776A RU2315114C2 RU 2315114 C2 RU2315114 C2 RU 2315114C2 RU 2005125776/13 A RU2005125776/13 A RU 2005125776/13A RU 2005125776 A RU2005125776 A RU 2005125776A RU 2315114 C2 RU2315114 C2 RU 2315114C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polymer
- alkali
- alcohol
- group
- solution
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Processes Of Treating Macromolecular Substances (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области молекулярной биологии и биоорганической химии, а точнее к способу ковалентной иммобилизации олигонуклеотидов на поверхности полимерных материалов, содержащих этерифицированные карбоксильные группы.The invention relates to the field of molecular biology and bioorganic chemistry, and more specifically to a method for covalent immobilization of oligonucleotides on the surface of polymeric materials containing esterified carboxyl groups.
Предшествующий уровень техникиState of the art
Технологии с использованием биологических чипов, активно развиваемые в мире, являются мощнейшим из существующих инструментов для выявления и идентификации биологических материалов. Биологические микрочипы представляют собой ту или иную твердую подложку, на которой нанесены или определенные фрагменты нуклеиновых кислот, или белки, или углеводы, или какие-либо иные молекулы-зонды, способные быть узнанными или проявлять биологическую активность.Technologies using biological chips, actively developed in the world, are the most powerful of existing tools for the identification and identification of biological materials. Biological microchips are one or another solid support on which either certain fragments of nucleic acids, or proteins, or carbohydrates, or any other probe molecules capable of being recognized or exhibiting biological activity are deposited.
В качестве твердой подложки могут выступать стекло, кремний, золото, мембранные фильтры, гидрогели на основе полиакриламида. Однако недостатками этих материалов является их высокая стоимость, а также технические трудности, возникающие при изготовлении подложки сложной геометрической формы, например, имеющей лунки, на дне которых иммобилизованы олигонуклеотиды (подобные конструкции крайне удобны, в частности, в клинических анализах для размещения на одном микрочипе нескольких образцов разных анализируемых жидкостей). Этих недостатков лишены подложки из пластмасс, легко подвергающихся термоформовке и производимых в больших объемах. Данное изобретение направлено на создание более совершенных и дешевых способов иммобилизации олигонуклеотидов на поверхности полимерных подложек, в частности, содержащих этерифицированные карбоксильные группы.Glass, silicon, gold, membrane filters, and polyacrylamide-based hydrogels can serve as a solid support. However, the disadvantages of these materials are their high cost, as well as technical difficulties encountered in the manufacture of a substrate of complex geometric shape, for example, having wells, at the bottom of which oligonucleotides are immobilized (such designs are extremely convenient, in particular, in clinical analyzes for placing several microchips on one microchip samples of different analyzed liquids). These disadvantages are deprived of substrates made of plastics, which are easily thermoformed and are produced in large volumes. This invention is directed to the creation of more advanced and cheaper methods of immobilizing oligonucleotides on the surface of polymer substrates, in particular, containing esterified carboxyl groups.
Из всего набора крупнотоннажных промышленных пластмасс наиболее удобными для химической иммобилизации молекул-зондов представляются полимеры, содержащие сравнительно высокореакционноспособные сложноэфирные группы, например полиметилметакрилат. Большинство других пластмасс являются химически инертными, что затрудняет их модификацию.Of the entire set of large-capacity industrial plastics, polymers containing relatively highly reactive ester groups, for example polymethylmethacrylate, are most suitable for chemical immobilization of probe molecules. Most other plastics are chemically inert, which makes them difficult to modify.
Ранее известные способы иммобилизации олигонуклеотидов или других молекул на поверхности полиметилметакрилата имеют ряд недостатков.Previously known methods for immobilizing oligonucleotides or other molecules on the surface of polymethyl methacrylate have several disadvantages.
Известен способ модификации сложноэфирных групп на поверхности полимера, который заключается в их аминолизе под действием полиаминов [1,2], в частности гексаметилендиамина [3] или моноаниона гексаметилендиамина [4]. На полученной таким образом аминированной поверхности проводят иммобилизацию зонда в присутствии подходящих кросс-линкеров или конденсирующих агентов.A known method of modification of ester groups on the surface of the polymer, which consists in their aminolysis under the action of polyamines [1,2], in particular hexamethylenediamine [3] or monoanion hexamethylenediamine [4]. On the thus obtained aminated surface, the probe is immobilized in the presence of suitable cross-linkers or condensing agents.
Главным недостатком этого подхода является высокая неспецифическая сорбция олигонуклеотидов, являющихся полианионами, на положительно заряженной аминированной поверхности, обладающей гидрофобными свойствами, что также увеличивает возможность неспецифической сорбции. Следствиями неспецифической сорбции являются снижение чувствительности анализа и необходимость жестких условий отмывки чипа в ходе работы.The main disadvantage of this approach is the high non-specific sorption of oligonucleotides, which are polyanions, on a positively charged aminated surface with hydrophobic properties, which also increases the possibility of non-specific sorption. The consequences of nonspecific sorption are a decrease in the sensitivity of the analysis and the need for harsh conditions for washing the chip during operation.
Известен метод [5], состоящий следующих стадий:The known method [5], consisting of the following stages:
1) проведение переэтерификации поверхностных сложноэфирных групп полимера действием поливинилового спирта в растворе;1) the transesterification of surface ester groups of the polymer by the action of polyvinyl alcohol in solution;
2) расщепление нанесенного поливинилового спирта периодатом натрия с получением на поверхности носителя высокоактивных альдегидных групп;2) cleavage of the supported polyvinyl alcohol with sodium periodate to obtain highly active aldehyde groups on the surface of the carrier;
3) проведение их конденсации с аминогруппами в составе молекулы зонда;3) carrying out their condensation with amino groups in the composition of the probe molecule;
4) восстановление образующейся азометиновой группы действием боргидрида натрия для предотвращения гидролитического расщепления сшивки.4) restoration of the resulting azomethine group by the action of sodium borohydride to prevent hydrolytic cleavage of the crosslinking.
Очевидными недостатками данного метода являются сложность, применение дорогостоящих реагентов, невозможность длительного хранения активированной подложки вследствие легкого окисления альдегидных групп на воздухе.The obvious disadvantages of this method are the complexity, the use of expensive reagents, the impossibility of long-term storage of the activated substrate due to the easy oxidation of aldehyde groups in air.
Наиболее близким к заявляемому изобретению является изобретение [6], в котором описан способ модификации поверхности полиметилметакрилата (РММА) для последующего ковалентного связывания с полинуклеотидами в диагностических целях. По данному способу поверхность РММА обрабатывают раствором щелочи в концентрации от 2-15М NaOH или КОН в диапазоне температур от 10°С до 100°С, причем полинуклеотиды перед иммобилизацией на поверхность РММА предварительно нагревают до 70-100°С в течение от 5 минут до 4 часов и затем добавляют гидрохлорид диметиламинопропилэтилкарбодиимида. Затем раствор наносят на модифицированную поверхность РММА и затем охлаждают до 4°С в течение 16 часов. Таким образом, общее время нанесения полинуклеотида на поверхность составляет до 20 часов.Closest to the claimed invention is the invention [6], which describes a method for modifying the surface of polymethyl methacrylate (PMMA) for subsequent covalent binding to polynucleotides for diagnostic purposes. In this method, the surface of the PMMA is treated with a solution of alkali in a concentration of from 2-15 M NaOH or KOH in the temperature range from 10 ° C to 100 ° C, and the polynucleotides are preheated to 70-100 ° C before being immobilized to the surface of the PMMA for 5 minutes to 4 hours and then dimethylaminopropylethylcarbodiimide hydrochloride is added. Then the solution is applied to the modified surface of the PMMA and then cooled to 4 ° C for 16 hours. Thus, the total time of application of the polynucleotide to the surface is up to 20 hours.
Недостаток данного изобретения связан с тем, что одностадийный процесс обработки поверхности РММА приводит либо к грубому воздействию на поверхность полимера и значительной эрозии поверхности при одновременном воздействии высокой концентрации щелочи и высокой температуры (15М при 100°С), или к значительно более длительному воздействию на поверхность (2М при 10°С), что значительно увеличивает общее время модификации поверхности.The disadvantage of this invention is related to the fact that the one-step surface treatment process of PMMA leads either to a rough effect on the polymer surface and significant surface erosion while being exposed to a high concentration of alkali and high temperature (15M at 100 ° C), or to a significantly longer exposure to the surface (2M at 10 ° C), which significantly increases the total surface modification time.
С другой стороны, указанный в изобретении температурный диапазон от 10°С до 100°С не позволяет использовать для быстрой модификации поверхности полимера высококонцентрированные растворы щелочи, соответствующие по составу расплавам кристаллогидратов щелочей. Например, расплав моногидрата гидроксида калия, получаемый при температуре 140°С, имеет концентрацию КОН 20М [7].On the other hand, the temperature range indicated in the invention from 10 ° C. to 100 ° C. does not allow the use of highly concentrated alkali solutions corresponding to the melts of alkali crystalline hydrates for rapid modification of the polymer surface. For example, the melt of potassium hydroxide monohydrate obtained at a temperature of 140 ° C has a KOH concentration of 20 M [7].
С целью упрощения процесса печати ДНК-чипов был предложен метод, включающий получение на поверхности подложки высокореакционноспособных групп, образующих ковалентные связи с модифицированными олигонуклеотидами в мягких условиях и в отсутствие дополнительных реагентов. Однако описанные пути реализации этого метода трудоемки из-за большого числа стадий и предполагают использование дорогостоящих реактивов. Например, в работе [3] активированная поверхность полиметилметакрилата получается в результате обработки аминированной поверхности (способ модификации указан выше) гетеробифункциональным кросс-линкером сложного строения, а именно N-гидроксисукцинимидил-3-N-сульфомалеимидопропионатом.In order to simplify the process of printing DNA chips, a method was proposed involving the production of highly reactive groups on the surface of a substrate that form covalent bonds with modified oligonucleotides under mild conditions and in the absence of additional reagents. However, the described ways to implement this method are laborious due to the large number of stages and involve the use of expensive reagents. For example, in [3], the activated surface of polymethyl methacrylate is obtained by treating the aminated surface (the modification method is indicated above) with a heterobifunctional cross-linker with a complex structure, namely, N-hydroxysuccinimidyl-3-N-sulfomaleimidopropionate.
Технической задачей, решаемой в данном изобретении, является разработка более быстрого и эффективного способа модификации поверхности для последующей иммобилизации олигонуклеотидов на поверхность полимеров, содержащих сложноэфирые группы.The technical problem solved in this invention is the development of a faster and more effective method of surface modification for subsequent immobilization of oligonucleotides on the surface of polymers containing ester groups.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Одним из объектов изобретения является усовершенствованный способ получения ДНК-чипов, который характеризуется повышенной эффективностью формирования модифицированной поверхности за счет постадийной модификации поверхности, включающей:One of the objects of the invention is an improved method for producing DNA chips, which is characterized by increased efficiency of forming a modified surface due to the step-by-step modification of the surface, including:
а) стадию выбора типа полимера и формы слайда исходя из условий его последующего применения в качестве ДНК-чипа,a) the stage of choosing the type of polymer and the shape of the slide based on the conditions for its subsequent use as a DNA chip,
б) стадию выбора условий модификации, по крайней мере, части поверхности ДНК-чипа, в соответствии с которой определяют диапазон изменения концентрации гидроксида металла и/или диапазон изменения температур, в котором происходит модификация и длительность стадий,b) the stage of selection of the conditions for the modification of at least part of the surface of the DNA chip, in accordance with which the range of changes in the concentration of metal hydroxide and / or the range of temperature changes in which the modification and duration of the stages are determined,
в) стадию предварительной обработки поверхности полимера ДНК-чипа, в процессе которой используют комбинированное воздействие водного или водно-спиртового раствора гидроксида металла в выбранном температурном и временном режиме,c) the stage of preliminary processing of the polymer surface of the DNA chip, during which the combined effect of an aqueous or aqueous-alcoholic solution of metal hydroxide is used in the selected temperature and time mode,
г) стадию формирования эффективной модифицированной поверхности, в процессе которой на модифицированной поверхности ДНК-чипа формируют достаточное количество карбоксильных групп, полученных из сложноэфирных групп полимера.d) the stage of formation of an effective modified surface, during which a sufficient number of carboxyl groups obtained from the ester groups of the polymer are formed on the modified surface of the DNA chip.
Сущность изобретения заключается в выборе условий для оптимальной модификации поверхности полимера для последующей эффективной иммобилизации олигонуклеотидов, имеющих концевую нуклеофильную группу, на поверхность модифицированного полимера, содержащего карбоксильные группы, образованные в процессе реакции щелочного гидролиза из сложноэфирных групп, входящих в состав полимера.The essence of the invention lies in the selection of conditions for the optimal modification of the polymer surface for subsequent effective immobilization of oligonucleotides having a terminal nucleophilic group on the surface of a modified polymer containing carboxyl groups formed during the alkaline hydrolysis reaction from the ester groups that make up the polymer.
Предлагаемый метод является простым и надежным, в нем не используются дорогостоящие реагенты.The proposed method is simple and reliable, it does not use expensive reagents.
Изобретение поясняется с помощью чертежей.The invention is illustrated using the drawings.
На фиг.1 показана схема модификации полимера.Figure 1 shows a diagram of the modification of the polymer.
На фиг.2 показана схема проверки эффективности модификации.Figure 2 shows a scheme for checking the effectiveness of modifications.
На фиг.3 показаны результаты иммобилизации олигонуклеотида методом, описанным F.Fixe [3].Figure 3 shows the results of the immobilization of the oligonucleotide by the method described by F. Fixe [3].
На фиг.4-8 показаны результаты иммобилизации описываемым методом.Figure 4-8 shows the results of the immobilization of the described method.
Условия модификации и иммобилизации приведены в примерах.Modification and immobilization conditions are given in the examples.
Перечень сокращенийList of abbreviations
РММА - полиметилметакрилатPMMA - polymethylmethacrylate
ПЦР - полимеразная цепная реакцияPCR - polymerase chain reaction
Варианты осуществления изобретенияEmbodiments of the invention
Способ получения ДНК-чипов с улучшенными характеристиками состоит из следующих этапов.The method of obtaining DNA chips with improved characteristics consists of the following steps.
На первом этапе осуществляют выбор типа полимера, его форму, режимы модификации его поверхности. Затем проводят модификацию поверхности, по крайней мере, одного образца.At the first stage, a choice is made of the type of polymer, its shape, and modes of modifying its surface. Then, surface modification of at least one sample is carried out.
На втором этапе проводят диагностику качества проведенной модификации. С этой целью получают или приобретают олигонуклеотиды с концевой нуклеофильной группой. В соответствии с первым вариантом изобретения получают композицию, состоящую из олигонуклеотидов и конденсирующего агента, и наносят ее на поверхность модифицированного полимера для получения иммобилизованного зонда. В соответствии со вторым вариантом изобретения на поверхности модифицированной подложки получают активированные сложноэфирные группы, на которых иммобилизация модифицированных олигонуклеотидов протекает в отсутствие конденсирующего агента. Затем проводят гибридизацию иммобилизованного зонда с комплементарным олигонуклеотидом, содержащим биотиновую метку, с последующим нанесением на поверхность конъюгата стрептавадин-пероксидаза и визуализацией метки с помощью пероксидазной реакции окисления диаминобензидина. Сравнивают интенсивность окраски точек, нанесенных указанным способом, и точек, нанесенных известными методами. В случае неудовлетворительного результата, например из-за специфики применяемого полимера, проводят коррекцию условий модификации.At the second stage, the quality of the modification is diagnosed. For this purpose, oligonucleotides with a terminal nucleophilic group are obtained or are acquired. In accordance with the first embodiment of the invention, a composition is prepared consisting of oligonucleotides and a condensing agent, and applied to the surface of the modified polymer to obtain an immobilized probe. According to a second embodiment of the invention, activated ester groups are obtained on the surface of the modified support, on which the immobilization of the modified oligonucleotides proceeds in the absence of a condensing agent. Then, the immobilized probe is hybridized with a complementary oligonucleotide containing a biotin tag, followed by applying streptavadin peroxidase to the surface of the conjugate and visualizing the tag using the peroxidase oxidation reaction of diaminobenzidine. The color intensity of the dots applied by the indicated method is compared with those applied by known methods. In the case of an unsatisfactory result, for example, due to the specificity of the polymer used, the modification conditions are corrected.
На третьем этапе проводят модификацию поверхности и формирование партии ДНК-чипов по первому или второму варианту иммобилизации олигонуклеотидного зонда.At the third stage, the surface is modified and a batch of DNA chips is formed according to the first or second variant of immobilization of the oligonucleotide probe.
Для получения более эффективной модификации поверхности важно выбрать баланс между глубиной проникновения модифицирующего агента, в качестве которого используют щелочь, и эффективностью формирования достаточного количества карбоксильных групп, полученных из сложноэфирных групп полимера.To obtain a more effective surface modification, it is important to choose a balance between the penetration depth of the modifying agent, which is used as an alkali, and the efficiency of formation of a sufficient amount of carboxyl groups obtained from the ester groups of the polymer.
Учитывая это обстоятельство, было предложено неочевидное техническое решение, которое позволяет обеспечить образование более развитой поверхности полимера за счет глубокого проникновения на первом этапе модифицирующего агента в жестких условиях воздействия на поверхность полимера и формирование в более мягких условиях на заключительном этапе модификации достаточного количества карбоксильных групп. При гидролизе сложноэфирных групп образуются карбоксильные группы, придающие поверхности полимера отрицательный заряд и гидрофильность. За счет этого неспецифическая сорбция молекул зонда на поверхности оказывается существенно ниже, чем в случае применения описанных выше известных методов, включающих получение аминированной поверхности. Снижение неспецифической сорбции позволяет сократить время отмывки чипа после гибридизации с нескольких десятков до 1-2 минут.Given this circumstance, a non-obvious technical solution was proposed that allows for the formation of a more developed polymer surface due to the deep penetration of the modifying agent at the first stage under severe conditions of exposure to the polymer surface and the formation of milder conditions at the final stage of modification of a sufficient number of carboxyl groups. During hydrolysis of ester groups, carboxyl groups are formed, which impart a negative charge and hydrophilicity to the polymer surface. Due to this, the non-specific sorption of the probe molecules on the surface is significantly lower than in the case of applying the known methods described above, including obtaining an aminated surface. Reducing non-specific sorption allows you to reduce the time of washing the chip after hybridization from several tens to 1-2 minutes.
В качестве модифицирующего агента для гидролиза полимера используют, по крайней мере, один тип гидроксида металла, входящий в группу, состоящую из NaOH, КОН, Ва(ОН)2, LiOH. В качестве полимера используют полиметилметакрилат или другой полимер, содержащий сложноэфирные группы. В качестве полимеров можно использовать полимеры, содержащие акриловые и/или метакриловые мономеры. К ним, в частности, относятся полиметилметакрилат, полиэтилметакрилат, полиметилакрилат, а также их сополимеры в комбинации друг с другом и с другими мономерами.At least one type of metal hydroxide included in the group consisting of NaOH, KOH, Ba (OH) 2 , LiOH is used as a modifying agent for polymer hydrolysis. As the polymer, polymethyl methacrylate or another polymer containing ester groups is used. As polymers, polymers containing acrylic and / or methacrylic monomers can be used. These include, in particular, polymethyl methacrylate, polyethyl methacrylate, polymethyl acrylate, as well as their copolymers in combination with each other and with other monomers.
На первой стадии предварительной обработки поверхности полимера используют максимальное значение концентрации гидроксида металла от 15 до 20М и необязательно максимальную температуру модификации в диапазоне от 80 до 140°С, а на заключительной стадии используют минимальное значение выбранного диапазона концентрации гидроксида металла от 1 до 15М и необязательно минимальную температуру модификации в диапазоне от 15 до 80°С.In the first stage of the polymer surface pretreatment, the maximum concentration of metal hydroxide from 15 to 20 M and optionally the maximum modification temperature in the range from 80 to 140 ° C are used, and in the final stage, the minimum value of the selected range of metal hydroxide concentration from 1 to 15 M and optionally the minimum modification temperature in the range from 15 to 80 ° C.
В качестве растворителя для щелочи используют воду или спирт, выбираемый из группы, состоящей из метилового, этилового, пропилового спирта, или композицию из водно-спиртовой смеси в соотношении вода:спирт в пределах от 1:20 до 20:1. Применение органических растворителей облегчает смачивание исходной гидрофобной поверхности полимера реагентом, что приводит к ускорению реакции.As a solvent for alkali, water or alcohol is used, selected from the group consisting of methyl, ethyl, propyl alcohol, or a composition of a water-alcohol mixture in the ratio of water: alcohol in the range from 1:20 to 20: 1. The use of organic solvents facilitates the wetting of the initial hydrophobic surface of the polymer with a reagent, which leads to an acceleration of the reaction.
Для сокращения времени обработки поверхности можно использовать растворы щелочей с концентрацией, превышающей растворимость при комнатной температуре. Для удобства можно применить кристаллогидраты щелочей различного состава, образующие при плавлении высококонцентрированные растворы до 20М. Например, на стадии предварительной обработки используют расплав кристаллогидрата гидроксида металла при температуре от 100 до 140°С в течение 10-200 секунд.To reduce the surface treatment time, alkali solutions with a concentration exceeding solubility at room temperature can be used. For convenience, alkali crystalline hydrates of various compositions can be used, which form highly concentrated solutions up to 20M upon melting. For example, at the pretreatment stage, a melt of metal hydroxide crystalline hydrate is used at a temperature of from 100 to 140 ° C for 10-200 seconds.
Температурные условия проведения модификации выбираются исходя из типа полимера, условий его получения и требуемых условий иммобилизации олигонуклеотидного зонда к поверхности полимера. Возможные варианты выбирают из: а) проведения модификации при постоянной температуре, выбранной из диапазона от 15 до 140°С, б) проведения модификации, при которых температура изменяется в выбранном диапазоне от максимального до минимального значения при переходе от первой стадии модификации ко второй. Выбранные границы изменения температур лежат в пределах основного диапазона от 15 до 140°С. Причем предпочтительно устанавливать верхнюю границу выбранного диапазона в пределах от 80 до 140°С, а нижнюю границу выбирать в пределах от 15 до 60°С. Временной период стадии предварительной обработки поверхности составляет от 10 сек до 5 мин, а временной период заключительной стадии модификации составляет от 30 мин до 12 часов. Применение на первом этапе модификации раствора гидроксида металла с концентрацией, превышающей его растворимость при комнатной температуре (18 моль/л для NaOH и КОН), позволяет сократить время проведения гидролиза до 10-20 секунд и получать удовлетворительные результаты иммобилизации даже в отсутствие второй стадии модификации.The temperature conditions for the modification are selected based on the type of polymer, the conditions for its preparation and the required conditions for immobilization of the oligonucleotide probe to the surface of the polymer. Possible options are selected from: a) carrying out the modification at a constant temperature selected from the range from 15 to 140 ° C, b) carrying out the modification at which the temperature changes in the selected range from maximum to minimum when moving from the first stage of modification to the second. The selected boundaries of temperature changes lie within the main range from 15 to 140 ° C. Moreover, it is preferable to set the upper limit of the selected range in the range from 80 to 140 ° C., and choose the lower limit in the range from 15 to 60 ° C. The time period of the surface pretreatment stage is from 10 seconds to 5 minutes, and the time period of the final modification stage is from 30 minutes to 12 hours. The use of a metal hydroxide solution at a first stage of modification with a concentration exceeding its solubility at room temperature (18 mol / L for NaOH and KOH) can reduce the hydrolysis time to 10-20 seconds and obtain satisfactory immobilization results even in the absence of a second modification stage.
Для иммобилизации олигонуклеотидных зондов на модифицированной поверхности полимера в рамках данного изобретения рассматривается два варианта, которые включают, но не ограничивают других вариантов иммобилизации зондов. В соответствии с первым вариантом предлагается использовать композицию, в состав которой входят олигонуклеотиды, модифицированные нуклеофильной группой, и раствор конденсирующего агента. В качестве 5' модифицирующих групп олигонуклеотидов используют нуклеофильные группы, входящие в набор амино-, гидрокси-, тио-, гидразо-, гидразино-, аминоокси-, в концентрации от 0.5 до 100 мкмоль/л.To immobilize oligonucleotide probes on a modified polymer surface, two variants are considered within the framework of the present invention, which include but are not limited to other variants of immobilization of probes. In accordance with the first embodiment, it is proposed to use a composition comprising oligonucleotides modified with a nucleophilic group and a solution of a condensing agent. Nucleophilic groups included in the set of amino, hydroxy, thio, hydrazo, hydrazino, aminooxy, at a concentration of from 0.5 to 100 μmol / L are used as 5 'modifying groups of oligonucleotides.
В качестве конденсирующего агента предлагается использовать соединения, входящие в группу, состоящую из гидрохлорида диметиламинопропилэтилкарбодиимида,карбонилдиимидазола, мезитилсульфонилтетразола,мезитилсульфонилнитротриазола, триизопропилфенилтетразола, триизопропилфенилнитротриазола в концентрации от 1 до 200 ммоль/л.As a condensing agent, it is proposed to use compounds included in the group consisting of dimethylaminopropylethylcarbodiimide hydrochloride, carbonyldiimidazole, mesityl sulfonyltetrazole, mesityl sulfonyl nitrotriazole, triisopropyl phenyltetrazole, triisopropyl phenyl nitrotriazole in a concentration of from 1 to 200 mm.
Реакции активированной различными конденсирующими агентами карбоксильной группы с нуклеофильными соединениями являются известньми, однако возможность применения этого метода к карбоксильным группам, образующимся при гидролизе указанных полимеров, неочевидна вследствие стерических затруднений, возникающих вблизи карбоксильных групп, непосредственно связанных с объемными фрагментами полимерной цепи. Такие композиции позволяют формировать надежную связь с полимером, устойчивую в широком диапазоне рН среды (2-12) и температуры (до 100°С).The reactions of the carboxyl group activated with various condensing agents with nucleophilic compounds are notorious, however, the possibility of applying this method to carboxyl groups formed during the hydrolysis of these polymers is not obvious due to steric difficulties arising near carboxyl groups directly associated with bulk fragments of the polymer chain. Such compositions make it possible to form a reliable bond with the polymer, stable in a wide range of pH (2-12) and temperature (up to 100 ° C).
В соответствии со вторым вариантом на поверхности модифицированной подложки получают активированные сложноэфирные группы, способные реагировать с олигонуклеотидами, имеющими концевую нуклеофильную группу, без конденсирующего агента. Для этого на поверхность модифицированного полимера наносят раствор, по меньшей мере, одного реагента, образующего с карбоксильной группой активный сложный эфир, в присутствии конденсирующего агента. В перечень таких реагентов входят, но не ограничивают перечень: N-гидроксисукцинимид, пара-нитрофенол, пентафторфенол или N-гидроксибензотриазол. Допустимый диапазон концентраций - от 1 до 200 ммоль/л. Конденсирующий агент выбирают из группы, состоящей из гидрохлорида диметиламинопропилэтилкарбодиимида, карбонилдиимидазола, мезитиленсульфонилтетразола, мезитиленсульфонилнитротриазола, триизопропилфенилтетразола, триизопропилфенилнитротриазола. Допустимый диапазон концентраций - от 1 до 200 ммоль/л.According to a second embodiment, activated ester groups capable of reacting with oligonucleotides having a terminal nucleophilic group without a condensing agent are obtained on the surface of the modified substrate. For this, a solution of at least one reagent, which forms an active ester with a carboxyl group in the presence of a condensing agent, is applied to the surface of the modified polymer. The list of such reagents includes, but does not limit the list: N-hydroxysuccinimide, para-nitrophenol, pentafluorophenol or N-hydroxybenzotriazole. The permissible concentration range is from 1 to 200 mmol / l. The condensing agent is selected from the group consisting of dimethylaminopropylethylcarbodiimide hydrochloride, carbonyldiimidazole, mesitylenesulfonyltetrazole, mesitylenesulfonyl nitrotriazole, triisopropyl phenyl tetrazole, triisopropyl phenyl nitrotriazole. The permissible concentration range is from 1 to 200 mmol / l.
После отмывки избытка реагента наносят раствор олигонуклеотида, имеющего концевую нуклеофильную группу. В качестве модифицирующих групп олигонуклеотидов используют нуклеофильные группы, входящие в набор амино-, гидрокси-, тио-, гидразо-, гидразино-, аминоокси-, в концентрации от 0.5 до 100 мкмоль/л.After washing off the excess reagent, a solution of an oligonucleotide having a terminal nucleophilic group is applied. As modifying groups of oligonucleotides, nucleophilic groups included in the set of amino, hydroxy, thio, hydrazo, hydrazino, aminooxy, at a concentration of from 0.5 to 100 μmol / L are used.
Проверку эффективности иммобилизации осуществляляют путем гибридизации иммобилизованного зонда с комплементарным олигонуклеотидом, содержащим биотиновую метку, с последующим нанесением на поверхность конъюгата стрептавадин-пероксидаза и визуализацией метки с помощью пероксидазной реакции окисления диаминобензидина (см. пример 12). Визуально сравнивая интенсивность окраски точек, нанесенных указанным способом, и точек, нанесенных методом, предложенным [3] F.Fixe (см фиг. 3), можно сделать вывод о правильности выбора условий.The effectiveness of immobilization is checked by hybridizing the immobilized probe with a complementary oligonucleotide containing a biotin tag, followed by applying streptavadin peroxidase to the surface of the conjugate and visualizing the tag using the peroxidase oxidation reaction of diaminobenzidine (see example 12). By visually comparing the color intensity of the dots deposited in the indicated way and the dots deposited by the method proposed by F. Fixe [3] (see Fig. 3), we can conclude that the conditions were chosen correctly.
Примеры, подтверждающие возможность осуществления изобретенияExamples confirming the possibility of carrying out the invention
Приведенные далее примеры предназначены лишь для подтверждения возможности осуществления изобретения и не ограничивают объем защиты изобретения.The following examples are intended only to confirm the feasibility of the invention and do not limit the scope of protection of the invention.
В таблице 1 приведены примеры модификации поверхности полиметилметакрилата в различных условиях.Table 1 shows examples of surface modification of polymethyl methacrylate under various conditions.
концентрация М/лType of hydroxide and
concentration M / l
Где: В - вода, С - этанол.Where: B - water, C - ethanol.
После обработки поверхность промывают дистиллированной водой в течение 5 минут.After treatment, the surface is washed with distilled water for 5 minutes.
Пример 5. Модификация образцов полиметилметакрилата с помощью расплава кристаллогидрата гидроксида металла.Example 5. Modification of samples of polymethyl methacrylate using a molten crystalline metal hydroxide hydrate.
Модификация образцов полиметилметакрилата проводилась действием расплава моногидрата гидроксида калия при температуре 140°С в течение 60 секунд. После обработки поверхность промывают дистиллированной водой в течение 5 минут. Результаты представлены на фиг.8.Modification of samples of polymethyl methacrylate was carried out by the action of a melt of potassium hydroxide monohydrate at a temperature of 140 ° C for 60 seconds. After treatment, the surface is washed with distilled water for 5 minutes. The results are presented in FIG.
Пример 6. Иммобилизация модифицированного олигонуклеотида на поверхности полимера.Example 6. Immobilization of a modified oligonucleotide on the surface of the polymer.
Ниже приведен включающий, но не ограничивающий, пример нанесения аминомодифицированного олигонуклеотида. К раствору А, содержащиму 20 мкмоль/л аминомодифицированного олигонуклеотида в воде, приливают водный раствор Б, содержащий 0.2 моль/л гидрохлорида диметиламинопропилэтилкарбодиимида и 0.2 моль/л N-метилимидазола, рН 7.0 в объемном соотношении А:Б=1:1. Смесь наносили на поверхность модифицированного согласно примера 1 полимера с помощью игольчатого споттера (модель Xpress Lane). Объем капель составлял от 10 до 200 нл. Образец ДНК-чипа с нанесенным массивом капель инкубируют во влажной атмосфере 2 часа. Образец ДНК-чипа отмывают дистиллированной водой (2 раза по 2 минуты) и сушат в беспылевой атмосфере при комнатной температуре.The following is an including, but not limiting, example of applying an amino-modified oligonucleotide. An aqueous solution B containing 0.2 mol / l dimethylaminopropylethylcarbodiimide hydrochloride and 0.2 mol / l N-methylimidazole, pH 7.0 in a volume ratio A: B = 1: 1, is poured to a solution A containing 20 μmol / L of the amino-modified oligonucleotide in water. The mixture was applied to the surface of a polymer modified according to Example 1 using a needle spotter (Xpress Lane model). The droplet volume ranged from 10 to 200 nl. A sample of a DNA chip coated with an array of droplets is incubated in a humid atmosphere for 2 hours. A DNA chip sample is washed with distilled water (2 times for 2 minutes) and dried in a dust-free atmosphere at room temperature.
Пример 7. Иммобилизация модифицированного олигонуклеотида на поверхности полимера.Example 7. Immobilization of a modified oligonucleotide on the surface of the polymer.
Нанесение аминомодифицированного олигонуклеотида осуществляют в соответствии с примером 6, где в качестве конденсирующего агента используют карбонилдиимидазол в концентрации 0.1 моль/л.The application of the amino-modified oligonucleotide is carried out in accordance with Example 6, where carbonyldiimidazole at a concentration of 0.1 mol / L is used as the condensing agent.
Пример 8. Иммобилизация модифицированного олигонуклеотида на поверхности полимера.Example 8. Immobilization of a modified oligonucleotide on the surface of the polymer.
Нанесение модифицированного олигонуклеотида осуществляют в соответствии с примером 6, где в качестве модифицированного олигонуклеотида используют гидразомодифицированный олигонуклеотид в концентрации 20 мкмоль/л.The application of the modified oligonucleotide is carried out in accordance with example 6, where a hydrazomodified oligonucleotide at a concentration of 20 μmol / L is used as the modified oligonucleotide.
Пример 9. Получение активированной поверхности полиметилметакрилата. Поверхность модифицированного согласно примера 4 полимера обрабатывали раствором, содержащим 0.1 моль/л N-гидроксисукцинимида, 0.1 моль/л гидрохлорида диметиламинопропилэтилкарбодиимида и 0.1 моль/л N-метилимидазола, рН 7.0, в течение 2 часов, отмывали дистиллированной водой (2 раза по 2 минуты) и сушили на воздухе.Example 9. Obtaining an activated surface of polymethylmethacrylate. The surface of the polymer modified according to Example 4 was treated with a solution containing 0.1 mol / L of N-hydroxysuccinimide, 0.1 mol / L of dimethylaminopropylethylcarbodiimide hydrochloride and 0.1 mol / L of N-methylimidazole, pH 7.0, for 2 hours, washed with distilled water (2 times, 2 minutes) ) and dried in air.
Пример 10. Иммобилизация аминомодифицированного олигонуклеотида на активированной поверхности полиметилметакрилата.Example 10. Immobilization of an amine-modified oligonucleotide on an activated surface of polymethyl methacrylate.
На поверхность активированного согласно примера 3 полимера наносили раствор аминомодифицированного олигонуклеотида с концентрацией 10 мкмоль/л с помощью игольчатого споттера, отмывали дистиллированной водой (3 раза по 2 минуты) и сушили на воздухе.An amine-modified oligonucleotide solution with a concentration of 10 μmol / L was applied onto the surface of the polymer activated according to Example 3 using a needle spotter, washed with distilled water (3 times, 2 minutes) and dried in air.
Пример 11. Гибридизация меченного биотином олигонуклеотида и визуализация нанесенных точек.Example 11. Hybridization of biotin-labeled oligonucleotide and visualization of the printed points.
На поверхность ДНК-чипа, полученного согласно примеру 4, наносили смесь продуктов ПЦР, меченных биотином, в концентрации мкмоль/л в 5 мкл × SSC буфера следующего состава: 150 ммоль/л NaCl, 15 ммоль/л цитрата натрия, рН 7.0. Продукты ПЦР содержали последовательность, комплементарную последовательности иммобилизованного по примеру 2 олигонуклеотида. Проводили инкубацию во влажной атмосфере при 40°С в течение 1 часа, отмывали дистиллированной водой (2 раза по 2 минуты), наносили раствор конъюгата стрептавидин-пероксидаза в концентрации моль/л в буфере PBS следующего состава: 1.7 ммоль/л КН2PO4, 5.2 ммоль/л Na2HPO4, 150 ммоль/л NaCl, рН 7.4 и инкубировали во влажной атмосфере в течение 30 минут. Отмывку несвязавшегося конъюгата проводили буфером PBS в течение 2 минут, а затем раствором 0,5М NaCl, PBS в течение 10 минут. Для "проявления" нанесенных точек чип затем обрабатывали раствором 0.5М диметиламинобензидина, содержащим 0.1% пероксида водорода. При этом в тех местах, где был успешно иммобилизован олигонуклеотид, в течение нескольких минут появлялось коричневое окрашивание.On the surface of the DNA chip obtained according to example 4, a mixture of biotin-labeled PCR products was applied at a concentration of μmol / L in 5 μl × SSC buffer of the following composition: 150 mmol / L NaCl, 15 mmol / L sodium citrate, pH 7.0. PCR products contained a sequence complementary to the sequence of the oligonucleotide immobilized in Example 2. Conducted incubation in a humid atmosphere at 40 ° C for 1 hour, washed with distilled water (2 times 2 minutes), applied a solution of streptavidin-peroxidase conjugate in a concentration of mol / L in PBS buffer of the following composition: 1.7 mmol / L KH 2 PO 4 , 5.2 mmol / L Na 2 HPO 4 , 150 mmol / L NaCl, pH 7.4 and incubated in a humid atmosphere for 30 minutes. The unbound conjugate was washed with PBS buffer for 2 minutes and then with a solution of 0.5 M NaCl, PBS for 10 minutes. To “show” the applied points, the chip was then treated with a solution of 0.5 M dimethylaminobenzidine containing 0.1% hydrogen peroxide. Moreover, in those places where the oligonucleotide was successfully immobilized, brown staining appeared within a few minutes.
На фиг.4-8 приведены результаты гибридизации на олигонуклеотидном микрочипе, полученном по вышеприведенной методике, для разных условий модификации поверхности полиметилметакрилата. Сигнал меньшей интенсивности и большей неравномерности окраски - на фиг. 4, соответствующий одностадийной обработке полимера спиртовой щелочью.Figure 4-8 shows the results of hybridization on an oligonucleotide microchip obtained by the above method, for different conditions of surface modification of polymethylmethacrylate. A signal of lower intensity and greater color unevenness is shown in FIG. 4, corresponding to a one-step treatment of the polymer with alcohol alkali.
Приведенные результаты демонстрируют эффективность описанного метода иммобилизации олигонуклеотидов на полимерной поверхности.The above results demonstrate the effectiveness of the described method of immobilization of oligonucleotides on a polymer surface.
Предлагаемый способ позволяет приготовлять ДНК-чипы различного формата как для научных исследований, так и для медицинских тестов, тестов для проверки качества продукции и т.д. Форма чипа может представлять собой плоский слайд, или на поверхности могут быть выполнены лунки с глубиной от 0.5 до 10 мм прямоугольной, круглой, овальной или другой формы. Причем модификация поверхности слайда может быть проведена как на всей поверхности, так и только в лунках. ДНК-чип может быть выполнен методом отливки или штамповки в форме плашки с числом лунок от 1 до 100. ДНК-чип может быть также изготовлен другими известными способами, используемыми при изготовлении плашек из других полимеров. Например, ДНК-чип формируют в виде пластиковых планшетов, гранул, оптических волокон.The proposed method allows the preparation of DNA chips of various formats for both scientific research and medical tests, tests to verify product quality, etc. The shape of the chip can be a flat slide, or holes with a depth of 0.5 to 10 mm of a rectangular, round, oval or other shape can be made on the surface. Moreover, the modification of the surface of the slide can be carried out both on the entire surface, and only in the wells. The DNA chip can be made by casting or stamping in the form of a die with the number of holes from 1 to 100. The DNA chip can also be made by other known methods used in the manufacture of dies from other polymers. For example, a DNA chip is formed in the form of plastic tablets, granules, optical fibers.
Описанный способ модификации может быть также использован при приготовлении гранул, волокон для применения при изготовлении биосенсоров, медицинских приборов, диагностических наборов.The described modification method can also be used in the preparation of granules, fibers for use in the manufacture of biosensors, medical devices, diagnostic kits.
Способ обеспечивает прочное связывание олигонуклеотида с подложкой: промывание ДНК-чипов буфером 5×SSC в течение часа не приводит к заметному уменьшению интенсивности сигнала.The method provides strong binding of the oligonucleotide to the substrate: washing the DNA chips with 5 × SSC buffer for an hour does not lead to a noticeable decrease in signal intensity.
Промышленная применимостьIndustrial applicability
Предлагаемый способ приготовления ДНК-чипов обладает простотой и воспроизводимостью, позволяет получать ДНК-чипы с заданной поверхностной плотностью иммобилизованных олигонуклеотидных зондов.The proposed method for the preparation of DNA chips has simplicity and reproducibility, allows you to get DNA chips with a given surface density of immobilized oligonucleotide probes.
ЛитератураLiterature
1. Buchardt, et al. Polymer modification. US Patent 5,077,344 December 31,1991.1. Buchardt, et al. Polymer modification. US Patent 5,077,344 December 31,1991.
2. Roger M.S. Methacrylate polymer coating composition modified with an alkylenimine. US Patent 3,290,416, Dec. 6, 1966.2. Roger M.S. Methacrylate polymer coating composition modified with an alkylenimine. US Patent 3,290,416, Dec. 6, 1966.
3. F.Fixe, M.Dufva, P.Telleman and С.В.V.Christensen, Functionalization of poly(methyl methacrylate) (PMMA) as a substrate for DNA microarrays, Nucleic Acids Research, 2004, Vol.32, No.1.3. F. Fixe, M. Dufva, P. Telleman and C. B. V. Christensen, Functionalization of poly (methyl methacrylate) (PMMA) as a substrate for DNA microarrays, Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, No. .one.
4. Henry. A.C., Tutt J.J., Galloway. M., Davidson. Y.Y., McWhorter, C.S., Soper, S.A. and McCarley, R.L. (2000) Surface modification of poly(methyl methacrylate) used in the fabrication ofmicroanalytical devices. Anal. Chem., 72, 5331-5337.4. Henry. A.C., Tutt J.J., Galloway. M., Davidson. Y. Y., McWhorter, C.S., Soper, S.A. and McCarley, R.L. (2000) Surface modification of poly (methyl methacrylate) used in the fabrication ofmicroanalytical devices. Anal. Chem., 72, 5331-5337.
5. Bulmus. V., Ayhan. H. and Piskin, E. (1997) Modified PMMA monosize microbeads for glucose oxidase immobilizatiоп. Chem. Eng. J., 65, 71-76.5. Bulmus. V., Ayhan. H. and Piskin, E. (1997) Modified PMMA monosize microbeads for glucose oxidase immobilizatiop. Chem. Eng. J., 65, 71-76.
6. Holmberg et al. Poly I: C covalently bonded to polymer for diagnostic purposes. US Patent 4,767,701, August 30, 1988.6. Holmberg et al. Poly I: C covalently bonded to polymer for diagnostic purposes. US Patent 4,767,701, August 30, 1988.
7. Химическая Энциклопедия, том 2, с.287, M., "СЭ", 1990.7. Chemical Encyclopedia, Volume 2, p.287, M., "SE", 1990.
Claims (18)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005125776/13A RU2315114C2 (en) | 2005-08-15 | 2005-08-15 | Method for preparing dna-chips (variants) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005125776/13A RU2315114C2 (en) | 2005-08-15 | 2005-08-15 | Method for preparing dna-chips (variants) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2005125776A RU2005125776A (en) | 2007-02-20 |
| RU2315114C2 true RU2315114C2 (en) | 2008-01-20 |
Family
ID=37863229
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2005125776/13A RU2315114C2 (en) | 2005-08-15 | 2005-08-15 | Method for preparing dna-chips (variants) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2315114C2 (en) |
-
2005
- 2005-08-15 RU RU2005125776/13A patent/RU2315114C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| FIXE F et al. One-step immobilization of aminated and thiolated DNA onto poly(methylmethacrylate) (PMMA) substrates.Lab Chip. 2004 Jun;4(3):191-5. * |
| LIU Y, RAUCH CB. DNA probe attachment on plastic surfaces and microfluidic hybridization array channel devices with sample oscillation. Anal Biochem. 2003 Jun 1;317(1):76-84. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2005125776A (en) | 2007-02-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4608107B2 (en) | Immobilization of unmodified biopolymers on acyl fluoride activated substrates | |
| US8168399B2 (en) | Supports for assaying analytes and methods of making and using thereof | |
| US6528264B1 (en) | Polymer support for DNA immobilization | |
| US8563477B2 (en) | Modified molecular arrays | |
| JP4307380B2 (en) | Biochip produced by gelation reaction on chip substrate | |
| JP2002544508A5 (en) | ||
| JP5588430B2 (en) | Surface and method for label independent detection | |
| US6734012B2 (en) | Low fluorescence nylon/glass composites for micro-analytical diagnostic applications | |
| JP3883539B2 (en) | Method for producing hydrogel biochip using radial polyethylene glycol derivative having epoxy group | |
| US20050100905A1 (en) | Novel method for production of dna biochips and applications thereof | |
| US20070004027A1 (en) | Method for manufacturing a biosensor element | |
| US20060252074A1 (en) | Immobilization and reaction matrix for biosensors | |
| RU2315114C2 (en) | Method for preparing dna-chips (variants) | |
| US20040191815A1 (en) | Array having oligonucleotides on a metal substrate | |
| DE60208946T2 (en) | Reactive carrier for the determination of DNA fragments | |
| KR20030020232A (en) | A method of preparing a hydrogel biochip by using satar-like PEG derivatives | |
| JP4225888B2 (en) | Analysis chip and preparation method thereof. | |
| CN113150680B (en) | Chip coating, preparation method and application thereof | |
| CN104805509A (en) | Carboxyl-modified gene chip substrate and preparation method thereof | |
| WO2023240090A1 (en) | Enhancing clustering efficiency and kinetics | |
| CN1435488A (en) | Plastic substrate useful for making bio-chip | |
| CA3182910A1 (en) | Incorporation and imaging mixes | |
| CN116446055A (en) | Preparation method and application of substrate with high-density reaction sites | |
| JP2001178442A (en) | Method for immobilizing dna fragment on surface of solid phase carrier and dna chip | |
| AU6943700A (en) | Methods of immobilizing ligands on solid supports and apparatus and methods of use therefor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20090816 |