RU2314816C2 - Биотрансплантат, содержащий ядросодержащие клетки костного мозга, в том числе преддифференцированные в эндотелиальном и кардиомиоцитарном направлении, способ его получения (варианты) и способ лечения сердечной недостаточности (варианты) - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биофармакологии и касается приготовления биотранспланта, содержащего пластик неадгезивные клетки костного мозга, варианты их преддифференцировки в эндотелиальном и кардиомиоцитарном направлении, и способа лечения хронической сердечной недостаточности. Биотрансплантат для лечения хронической сердечной недостаточности, характеризующийся тем, что он содержит ядросодержащие клетки костного мозга, в том числе преддифференцированные в эндотелиальном и кардимиоцитарном направлении. Описаны варианты способа получения предлагаемых биотрансплантатов. Предложен способ лечения сердечной недостаточности, характеризующийся тем, что предложенные биотрансплантаты вводят в нативную и/или стенозированную коронарную артерию и/или аорто- коронарный шунт соответственно в виде суспензии в физиологическом растворе, и/или внутривенно капельно, и/или интрамиокардиально во время традиционных хирургических вмешательствах на открытом сердце. Изобретение обеспечивает повышение эффективности лечения. 8 н. и 2 з.п. ф-лы.

Description

Изобретение относится к области приготовления биотранспланта, содержащего пластик неадгезивные клетки костного мозга, варианты их преддифференцировки в эндотелиальном и кардиогенном направлении и способа лечения хронической сердечной недостаточности.

Хроническая сердечная недостаточность - это синдром, развивающийся в результате различных заболеваний сердечно-сосудистой системы, приводящих к снижению насосной функции сердца (хотя и не всегда), дисбалансу между гемодинамической потребностью организма и возможностями сердца, хронической гиперактивации нейрогормональных систем, и проявляющийся одышкой, сердцебиением, повышенной утомляемостью, ограничением физической активности и избыточной задержкой жидкости в организме.

Развитие современных методов терапии привело к уменьшению доли острых нарушений кровообращения, таких как инфаркт миокарда и инсульт, в структуре смертности населения в развитых странах. В 21-м веке на лидирующую позицию в этом важном демографическом показателе вышла сердечная недостаточность (СН). В России в настоящее время сердечную недостаточность имеют более 8 млн. пациентов, у 10% из которых она является осложнением дилатационной кардиомиопатии.

Синдром ХСН может осложнять течение практически всех заболеваний сердечно-сосудистой системы. Но главными причинами ХСН, составляющими более половины всех случаев, являются ишемическая (коронарная) болезнь сердца (ИБС) и артериальная гипертония (АГ) или сочетание этих заболеваний. Данные Фремингемского исследования свидетельствуют:

- главной причиной ХСН является коронарная (ишемическая) болезнь сердца - по 40% у мужчин и женщин;

- на втором месте идет AT - 37% у женщин и 30% у мужчин.

Главная идея в современной тактике лечения больного с ХСН - это попытка начать терапию как можно раньше, на самых начальных стадиях болезни, чтобы достичь максимально возможного успеха и предотвратить прогрессирование процесса. Идеальный итог терапии - возвратить пациента к нормальной жизни, обеспечивая ее высокое качество.

Основными целями при лечении ХСН являются:

устранение симптомов заболевания - одышки, сердцебиения, повышенной утомляемости и задержки жидкости в организме;

защита органов-мишеней от поражения (сердце, почки, мозг, сосуды, мускулатура);

улучшение качества жизни;

уменьшение числа госпитализаций;

улучшение прогноза (продление жизни).

Сегодня, несмотря на внедрение новых методов терапии, летальность пациентов с ХСН сравнима с таковой при онкологических заболеваниях (раке легких, простаты, а у больных III-IV ФК со смертностью при раке желудка).

В основе всех современных методов лечения патологии сердца лежат восстановление кровоснабжения сердца, хирургическое ремоделирование его полостей. У пациентов с критическим снижением массы жизнеспособного миокарда вследствие диффузного некроза и/или апоптоза ни хирургические, ни тем более терапевтические мероприятия неэффективны, поскольку регенерационные свойства сердца весьма ограничены. Кардиомиоциты не обладают значимой пролиферативной активностью, при повреждении миокарда преобладают фибропластические реакции стромы, которые необратимы. Поэтому имеется необходимость в разработке принципиально новых подходов к лечению пациентов с СН. В подобных случаях альтернативным методом лечения может стать применение методов клеточной трансплантации с целью стимуляции неоангиогенеза, создания новых сократительных элементов путем имплантации в миокард стволовых/прогениторных клеток для улучшения перфузии, восстановления функции и/или стимуляция регенерации собственных кардиомиоцитов.

В экспериментальных исследованиях последних лет было показано, что трансплантация клеток различного фенотипа (эмбриональные кардиомиоциты, миобласты, взрослые продифференцированные стромальные клетки костного мозга и др.) положительно влияют на сократительную функцию миокарда. При этом было показано, что привнесенные в миокард клетки длительно переживают, пролиферируют и дифференцируются в миокарде после трансплантации, выделяют различные биоактивные вещества: ростовые факторы, цитокины и др. Основные эффекты от имплантации клеток выражаются в индукции репаративных процессов в месте повреждения, ограничении роста зоны ИМ, улучшении механических свойств рубцово-измененной мышцы сердца, улучшении васкуляризации миокарда путем стимуляции неоангиогенеза, при этом достоверно улучшается перфузия миокарда. В последние годы исследователи стали придавать особое значение такому источнику стволовых и прогениторных клеток, как костный мозг. Экспериментальные исследования подтвердили эффективность применения клеток костного мозга в восстановлении функции пораженного миокарда.

Экспериментальные исследования послужили основанием для развития клеточной кардиомиопластики в клинической медицине. С 2001 г. начались ограниченные клинические исследования по интракоронарному и интрамиокардиальному введению различных клеточных популяций как за рубежом (Humano et al. 2001, Strauer et al. 2002, Assmuss et al. 2002, Wolert et al. 2003, Brehm et al. 2003, Schachinger et al. 2004, Kuethe, 2005 и др.), так и в России (В.И.Шумаков и соавт., 2003, Л.А.Бокерия и соавт., 2004). Во всех работах продемонстрирована клиническая эффективность и безопасность этих методов лечения.

Задачей настоящего изобретения является получение биотрансплантата для наиболее эффективного (комплексного) воздействия на миокард человека и разработка наиболее эффективного способа лечения хронической сердечной недостаточности.

Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенная общим изобретательским замыслом.

Биотрансплантат для лечения хронической сердечной недостаточности, содержащий ядросодержащие клетки костного мозга (ЯСККМ). В основу получения ЯСККМ положена стандартная методика забора костного мозга, выделение из костно-мозговой взвеси (КМВ) различных фракций ЯСККМ и их криоконсервирование.

Одним из источников получения клеток человека является КМВ, полученная путем пункции заднего гребня подвздошной кости. Эксфузия КМВ выполняется в соответствии с утвержденной методикой, Инструкцией по заготовке аутологичного костного мозга от больных для клинического применения - Минздрав, №14/2 от 08.01.1980 г, методическими рекомендациями «Трансплантация костного мозга при острой лучевой болезни человека» - Минздрав от 03.11.1986 г., приказ «О внедрении в практику здравоохранения трансплантации костного мозга» - Минздрав, №31 от 25.02.1991 г.

Доставка КМВ в лабораторию производится в стерильном полимерном контейнере, содержащем антикоагулянт (обычно гепарин) строго с соблюдением асептики и температурного режима: контейнер с костномозговой взвесью помещают в транспортный герметично закрывающийся изотермический контейнер (+2 - +4 градуса С); длительность транспортировки составляет не более 2 часов.

Процессинг КМВ в лаборатории осуществляется в соответствии с рекомендациями «Инструкции по контролю стерильности консервированной крови, ее компонентов, препаратов консервированного костного мозга, кровезаменителей и консервирующих растворов» - Минздрав № И-42-4-85 от 01.01.1986 г.

Источником ЯСККМ может служить костный мозг, полученный у взрослого донора, в том числе для аутологичной трансплантации, в качестве фетального материала используется костный мозг, полученный из плодов при искусственном прерывании беременности на сроках гестации 17-20 недель.

Предложен способ получения биотрансплантата для лечения хронической сердечной недостаточности, заключающийся в том, что аспират костномозговой взвеси наслаивают на разделяющий градиент Ficoll-Hypaque, центрифугируют, интерфазу с ядросодержащими клетками собирают и ресуспендируют в гипотоническом буферном растворе для окончательной элиминации эритроцитов. Центрифугируют, гемолизированный супернатант удаляют.

Полученный клеточный осадок подвергают дальнейшему процессингу.

Клетки ресуспендируют в ростовой среде IMDM (Gibco, Grand Island), содержащей 0,58 г/л глютамина, 10% FBS (HyClone, USA), инсулин 0,4 мкМ, гентамицин 50 мкг/мл, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) 25 нг/мл и интерлейкин-3 (IL-3) 10 нг/мл (Sigma, USA) и HEPES 25 mM, высевают на чашки Петри (10⁶ клеток на см²) и культивируют при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO₂ и при 95% влажности, 7 суток.

Также используется криозащитный раствор, состоящий из трех ингредиентов - ДМСО, очищенного человеческого альбумина и среды RPMI (в пропорции: 1:4:5), который добавляют к клеточной взвеси в эквивалентном соотношении 1:1 (в конечной концентрации ДМСО - 5%).

После размораживания на водяной бане при температуре +41°С получают сохранность КОЕ-ГМ более 94%.

С целью повышения эффективности выделения ядросодержащих элементов, клеток CD 34+/CD45+, КОЕ-ГМ, КОЕ-ГЭММ в качестве седиментирующего средства используется 10% гидроксиэтилкрахмал (ГЭК).

Для этого смешивается 10% раствор ГЭК с пуповинной/плацентарной кровью в соотношении 1:1. Седиментация эритроцитов происходит в течение 25 минут, после чего супернатант собирается пипеткой, а оставшаяся клеточная взвесь подвергается повторной седиментации.

Супернатант, выделенный после осаждения эритроцитов, дважды отмывается от седиментирующего вещества (ГЭК) в среде RPMI 1640 путем центрифугирования с частотой оборотов 1500/мин в течение 10 минут. Клеточный осадок собирается пипеткой и оценивается примесь остаточных эритроцитов.

Допускается примесь эритроцитов в концентрате СК не более 5%.

После завершения этапа культивирования пластик-адгезивные ЯСК дважды отмывают от среды с сывороткой с помощью раствора Хэнкса без Mg2+и Са2+. Затем в культуру вносят раствора Хэнкса без Mg2+ и Са2+, содержащий 0,25% раствор трипсина, и инкубируют 5 мин при 37°С в условиях медленного перемешивания. После инактивации трипсина в растворе Хэнкса, содержащем 10% фетальную бычью сыворотку, клетки повторно центрифугируют и ресуспендируют в свежей порции раствора Хэнкса. ЯСК, выделенные методом магнитной сепарации, также центрифугируют и ресуспендируют в растворе Хэнкса.

Далее во всех случаях производят подсчет полученных клеток в камере Горяева и оценку их жизнеспособности по окрашиванию трипановым синим. Клетки центрифугируют и разводят в физиологическом растворе хлорида натрия или 6% растворе гидроксиэтилкрахмала (ГЭК) в концентрации 10⁷-10⁸ клеток/мл, получая готовый препарат аутологичных ЯСК, который хранится при +4°С до введения (не более 3 часов). Если препарат за это время не использован, то он подлежит утилизации.

При необходимости клеточную суспензию криоконсервируют в среде, содержащей бычью эмбриональную сыворотку не менее 50% и 7% диметилсульфоксида с концентраций клеток 10⁶ клеток/мл. Охлаждение проводят в программном замораживателе со скоростью 1 градус в минуту до 80°С, затем криопробирки переносят на хранение в парах жидкого азота.

Размораживание криоконсервированных МСК производится непосредственно перед трансплантацией в водяной бане при температуре 37-40°С до момента перехода замороженного материала в жидкую фазу. В дальнейшем клетки центрифугируют и ресуспендируют в 5 мл 0,9% физиологического раствора NaCl или 6% ГЭК. Затем процедуру центрифугирования повторяют.

Предложен биотрансплантат, содержащий ЯСККМ, преддифференцированные в эндотелиальном направлении.

Предложен способ получения преддиферинцированных в эндотелиальном направлении ЯСККМ. Ядросодержащие клетки костного мозга, выделенные по предложенному методу центрифугирования в градиенте фиколла (или другим методом), ресуспендируют в специализированной ростовой среде EndoCult^tm (StemCells Technologies) и высевают на 6-луночные планшеты, обработанные фибронектином по 5 миллионов на лунку. Через 48 ч не прикрепившиеся клетки собирают и переносят в 24-луночный планшет в концентрации 0,5 миллиона клеток на лунку. Через 3 дня наблюдают образование колоний, которые оценивают и подсчитывают. Колонии характеризуются более круглыми клетками в центре и вытянутыми по периферии и представляют собой раннюю стадию роста колониеобразующих единиц - (CFU-EC). Принадлежность клеток к эндотелиальной линии подтверждается иммунохимическим окрашиванием с антителами к фактору Виллебранда, рецептору 2 VEGF, CD31.

Ядросодержащие клетки костного мозга суспендируют в среде Х vivo-15 (BioWhittaker), содержащей дополнительно 1 нг\мл hVEGF, 0,1 мМ atorvastatin (Pfizer) и 20% собственной сыворотки пациента. Клетки высевают в плотности 6,4×10⁵ на мм² на чашки, покрытые фибронектином. Через 3 дня культивирования клетки снимают с подложки 0,5 мМ ЭДТА, отмывают дважды и ресуспендируют в конечном объеме среды X-vivo 10. Полученная клеточная суспензия содержит гетерогенную популяцию, более 90% которой составляют эндотелиальные прогениторные клетки.

Биотрансплантат для лечения хронической сердечной недостаточности, содержащий мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга (ММСК), полученные из фетального или донорского материала, при этом ткань дезагрегируют; далее культивируют в виде прикрепленных колоний в ростовой среде, содержащей эмбриональную телячью сыворотку и глутамин, затем неоднократно пассируют в низкой плотности с изменением состава среды, а культивирование ведут, избегая накопления в культуре клеток зрелой стромы.

В качестве фетального материала используют костный мозг 17-20 недель на сроках гестации.

В качестве донорского материала используют костный мозг, который забирают у пациента для последующей аутотрансплантации и аллотрансплантации.

Предложен способ получения биотрансплантата для лечения хронической сердечной недостаточности, заключающийся в том, что ММСК выращивают в виде прикрепленных колоний на ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, селектированной для выращивания клеток в низкой плотности, 2 мМ глутамина, 10 мкг/мл трансферрина, 1 мкг/мл инсулина, 10 нг/мл фактора роста фибробластов -2 и 8U/мл гепарина, при этом отбирают плотные колонии мелких клеток (диаметром 7-1 - мкм) с большим количеством митозов, а выращивание колоний ведут из плотности 10-50 клеток на см², при этом используют ММСК с преимущественной способностью к миогенной дифференцировке, выделенный из фетальных (костный мозг) тканей человека, и ММСК с преимущественной способностью к миогенной дифференцировке, выделенный из тканей пациента - костный мозг.

Предложен биотрансплантат, содержащий мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, преддиференцированные в кадриомиоцитарном направлении.

Для дифференцировки в кардиомиогенном направлении на третьи сутки в культуральную среду вносят 5-азацитидин ("Sigma", USA) в концентрации 6 мкмоль/л. 5-азацитидин способствует деметилированию участков ДИК, благодаря чему в клетках открываются для транскрипции различные группы генов, в том числе ответственные за дифференцировку клеток в кардиомиогенном направлении. Через сутки инкубации среду полностью заменяют на среду IMDM ("Gibco", USA), без 5-азацитидина, содержащую 10% бычьей эмбриональной сыворотки ("HyClone", USA), инсулин 0,4 мкМ/л, основной фактор роста фибробластов (bFGF) 20 нг/мл ("Sigma", USA).

Сроки культивирования составляют 4-6 недель.

Для определения кардиомиогенной дифференцировки определяют наличие в клетках кардиоспецифического белка тропонина I, для этого используют 3- и 6-недельные культуры. Для выявления в клетках тропонина I используют иммуногистохимический методы с использованием антител, меченных FITC.

Способ лечения хронической сердечной недостаточности заключается в том, что ранее указанные биотрансплантаты вводят в нативную и/или стенозированную коронарную артерию и/или аортокоронарный шунт соответственно в виде суспензии в физиологическом растворе с концентрацией клеточных элементов 1-15 млн. клеток на 1 кг веса пациента.

Трансплантацию осуществляют в стационаре, в условиях стерильной рентгеноперационной путем введения гомогенной взвеси клеток в «заинтересованные» нативные коронарные артерии и/или аортокоронарные шунты. Клеточный биотрансплантат перемешивают с 40 мл физиологического раствора. В процессе выполнения процедуры необходимо постоянное перемешивание суспензии для поддержания клеток во взвешенном состоянии. Доступ к коронарным артериям и/или аортокоронарным шунтам осуществляется по стандартной методике через бедренную или подкрыльцовую артерию с использованием катетеров Judkins и Sones. После выполнения коронаро- и/или шунтографии по стандартной методике оценивается объем миокарда левого желудочка, кровоснабжаемого каждым из коронарных сосудов и/или аортокоронарных шунтов. Распределение общего количества клеток для введения в каждый из коронарных сосудов и/или аортокоронарных шунтов производится прямо пропорционально этому объему. Введение клеток осуществляют стерильным 50 мл шприцом с помощью инфузомата с объемной скоростью 100 мл/ч. Введение клеточного трансплантата осуществляется в 2 этапа:

1. Первый этап - установка катетера в устье коронарной артерии.

2. Второй этап - собственно введение клеточной взвеси с помощью инфузомата с объемной скоростью 100 мл/ч.

Окончание процедуры не отличается от таковой при рутинной коронарографии.

В течение 24 часов после операции пациента наблюдают в отделении интенсивной терапии с мониторингом витальных функций и анализом нарушений ритма сердца.

Способ лечения хронической сердечной недостаточности, характеризующийся тем, что предложенные биотрансплантаты вводят внутривенно капельно. Необходимое количество клеток разводится в физиологическом растворе. Устанавливается трансфузионная система, ничем не отличающаяся от традиционной, и под наблюдением врача-трансфузиолога проводится медленное капельное введение полученного раствора биотрансплантата.

Способ лечения хронической сердечной недостаточности, характеризующийся тем, что интрамиокардиальное введение клеточного трансплантата при различных сердечно-сосудистых заболеваниях сопровождающихся сердечной недостаточностью показано во время традиционных хирургических вмешательствах на открытом сердце. Клеточный биотрансплантат вводят на заключительном этапе операции путем множественных инъекций (30-50) инсулиновым шприцем по 0,1-0,2 мл клеточной суспензии. При диффузных формах поражения миокарда клеточный трансплантат равномерно распределяют по стенке левого желудочка. При очаговом поражении миокарда область введения определяют на основании данных коронарографии, ЭхоКГ, сцинтиграфии как область ишемизированного, но жизнеспособного миокарда. Окончание операции не отличается от таковой при стандартном вмешательстве на открытом сердце. Процедура ведения трансплантата должна сопровождаться обязательным мониторированием электрокардиограммы.

Окончание процедуры не отличается от такового после рутинной коронарографии.

В течение 16 часов после операции пациента наблюдают в отделении интенсивной терапии с мониторингом электрокардиограммы и артериального давления. Выписка на 7-е сутки с рекомендацией контрольного осмотра через 1 месяц.

Проведение клеточной терапии при различных сердечно-сосудистых заболеваниях целесообразно применять как в моноварианте, так и в сочетании с традиционными хирургическими методами лечения, такими как чрескожная транслюменальная баллонная ангиопластика, аортокоронарное шунтирование, вентрикулопластика, протезирование клапанов, имплантации экстракардиального каркаса и др.

Эффективность предложенного способа оценена в рандоминизированном исследовании. Диагноз у всех пациентов устанавливался на момент операции и формулировался как хроническая сердечная недостаточность 26 функционального класса (3-4 класса по NYHA). В период проведения исследования все пациенты получали стабильную медикаментозную терапию средними терапевтическими дозами ингибиторов АПФ, β-адреноблокаторами, диуретиками.

На протяжении всего исследования пациенты не получали иммуносупрессивной терапии.

В контрольную группу включены пациенты с аналогичным диагнозом, с хронической сердечной недостаточностью 2б функционального класса, получающие соответствующую стабильную медикаментозную терапию.

Всем пациентам проводили динамическое обследование: общий анализ крови, мочи, биохимический анализ крови, ЭКГ, ЭхоКГ, ангиокардиография, в том числе по методике Centrline.

В раннем периоде наблюдения ни у одного из пациентов не наблюдалось каких-либо реакций, побочных эффектов или осложнений, связанных с процедурой.

Через 1-3 месяца после имплантации все пациенты отмечали улучшение самочувствия, объективно наблюдалось улучшение общего состояния, повышение толерантности к физическим нагрузкам, уменьшение одышки, периферических отеков, гепатомегалии, при инструментальном обследовании выявлено незначительное уменьшение объемов сердца, размеров зон гипокинетичного миокарда, увеличение ФВ левого желудочка. В контрольной группе, в условиях стабильной медикаментозной терапии, состояние и клинико-лабораторные показатели пациентов не изменились или отмечалась отрицательная динамика.

Claims (10)

1. Биотрансплантат для лечения хронической сердечной недостаточности, характеризующийся тем, что он содержит ядросодержащие клетки костного мозга, полученного у взрослого донора или из плодов на сроках гестации 17-20 недель, при этом для повышения эффективности выделения ядросодержащих элементов, клеток CD 34+/CD45+, КОЕ-ГМ, КОЕ-ГЭММ используют гидроксиэтилкрахмал (ГЭК), который смешивают с субстратом в соотношении 1:1.

2. Способ получения биотрансплантата для лечения хронической сердечной недостаточности, характеризующийся тем, что аспират костномозговой взвеси наслаивают на разделяющий градиент Ficoll-Hypaque, центрифугируют, интерфазу с ядросодержащими клетками собирают и ресуспендируют в гипотоническом буферном растворе для элиминации эритроцитов, центрифугируют, гемолизированный супернатант удаляют, далее клетки ресуспендируют в ростовой среде IMDM (Gibco, Grand Island), содержащей 0,58 г/л глютамина, 10% FBS (HyClone, USA), инсулин 0,4 мкМ, гентамицин 50 мкг/мл, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) 25 нг/мл и интерлейкин-3 (IL-3) 10 нг/мл и HEPES 25 мМ и культивируют из расчета - 10⁶ клеток/см² при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO₂ и при 95% влажности, 7 суток, затем для повышения эффективности выделения ядросодержащих элементов, клеток CD 34+/CD45+, КОЕ-ГМ, КОЕ-ГЭММ 10% гидроксиэтилкрахмал (ГЭК) смешивают с пуповинной/плацентарной кровью в соотношении 1:1 и проводят седиментацию эритроцитов в течение 25 мин, далее супернатант собирают, а оставшуюся клеточную взвесь подвергают повторной седиментации, супернатант, выделенный после осаждения эритроцитов, дважды отмывают в среде RPMI 1640 путем центрифугирования с частотой оборотов 1500/мин в течение 10 мин и клеточный осадок отделяют.

3. Биотрансплантат для лечения хронической сердечной недостаточности, характеризующийся тем, что он содержит ядросодержащие клетки костного мозга преддифференцированные в эндотелиальном направлении путем ресуспендирования клеток в ростовой среде EndoCult^tm, обработки фибронектином, ресуспендирования в среде Х vivo-15, содержащей hVEGF.

4. Способ получения биотрансплантата для лечения хронической сердечной недостаточности, характеризующийся тем, что ядросодержащие клетки костного мозга ресуспендируют в ростовой среде EndoCult^tm и высевают на 6-луночные планшеты, обработанные фибронектином по 5 миллионов на лунку, через 48 ч не прикрепившиеся клетки собирают и переносят в 24-луночный планшет в концентрации 0,5 миллиона клеток на лунку, через 3 дня после образования колоний клеток эндотелиальной линии, ядросодержащие клетки костного мозга суспендируют в среде Х vivo-15 (BioWhittaker), содержащей дополнительно 1 нг/мл hVEGF, 0,1 мМ atorvastatm (Pfizer) и 20% собственной сыворотки пациента и высевают в плотности 6,4·10⁵ на мм² на чашки, покрытые фибронектином, через 3 дня культивирования клетки снимают 0,5 мМ ЭДТА, отмывают дважды и ресуспендируют в конечном объеме среды X-vivo 10.

5. Биотрансплантат для лечения хронической сердечной недостаточности, характеризующийся тем, что он содержит ядросодержащие клетки костного мозга преддифференцированные в кардиомиоцитарном направлении путем культивирования клеток в среде с добавлением 5-азацитидина с последующим инкубированием в среде, содержащей основной фактор роста фибробластов (bFGF).

6. Способ получения биотрансплантата для лечения хронической сердечной недостаточности, характеризующийся тем, что на третьи сутки культивирования в среду вносят 5-азацитидин в концентрации 6 мкмоль/л, сутки инкубируют, далее среду заменяют на среду, содержащую 10% бычьей эмбриональной сыворотки, инсулин 0,4 мкМ/л, основной фактор роста фибробластов (bFGF) 20 нг/мл, культивируют 4-6 недель до кардиомиогенной дифференцировки.

7. Способ лечения хронической сердечной недостаточности, характеризующийся тем, что биотрансплантат по п.1, и/или 3, и/или 5 вводят в нативную и/или стенозированную коронарную артерию и/или аорто-коронарный шунт в виде суспензии.

8. Способ по п.7, где биотрансплантат вводят внутривенно капельно.

9. Способ лечения хронической сердечной недостаточности, характеризующийся тем, что биотрансплантат по п.1, и/или 3, и/или 5 вводят интрамиокардиально во время традиционных хирургических вмешательствах на открытом сердце, при этом клеточный биотрансплантат вводят на заключительном этапе операции путем множественных инъекций (30-50) по 0,1-0,2 мл клеточной суспензии.

10. Способ по пп.7 и 9, где ядросодержащие клетки костного мозга, в том числе преддифференцированные в эндотелиальном и кардиогенном направлении вводят в физиологическом растворе, или инфуколе.