RU2302460C1 - RECOMBINANT PLASMID DNA pBi101-IL18 ENCODING HUMAN INTERLEUKIN-18 SYNTHESIS IN TRANSGENIC PLANTS - Google Patents
RECOMBINANT PLASMID DNA pBi101-IL18 ENCODING HUMAN INTERLEUKIN-18 SYNTHESIS IN TRANSGENIC PLANTS Download PDFInfo
- Publication number
- RU2302460C1 RU2302460C1 RU2005133963/13A RU2005133963A RU2302460C1 RU 2302460 C1 RU2302460 C1 RU 2302460C1 RU 2005133963/13 A RU2005133963/13 A RU 2005133963/13A RU 2005133963 A RU2005133963 A RU 2005133963A RU 2302460 C1 RU2302460 C1 RU 2302460C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- human
- pbi101
- dna
- plasmid
- genome
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генетической инженерии высших растений, и может быть использовано для создания растительных продуцентов интерлейкина-18 (ИЛ-18) человека. Трансгенные растения-продуценты ИЛ-18 человека могут быть использованы для пероральной доставки ИЛ-18 к слизистым тонкого кишечника, а также для выделения ИЛ-18 в чистом виде для фармакологии. Известно, что ИЛ-18 является перспективным противоопухолевым препаратом, так как обладает непосредственным цитотоксическим эффектом по отношению к раковым клеткам, за счет индукции апоптоза, стимулирует продукцию других цитокинов, играющих ключевую роль при уничтожении опухоли, а также повышает цитотоксичность Т-киллеров и NK-клеток по отношению к раковым клеткам (Dinarello С. // METHODS. 1999, V.19, Р.121-122). ИЛ-18 повышает антигенпредставляющие способности макрофагов и может использоваться как адъювант при иммунизации вакцинами. Особый интерес представляет использование ИЛ-18 в качестве мукозного адъюванта при иммунизации животного организма «съедобными вакцинами».The invention relates to the field of biotechnology, in particular to the genetic engineering of higher plants, and can be used to create plant producers of human interleukin-18 (IL-18). Transgenic plants producing human IL-18 can be used for oral delivery of IL-18 to the mucous membranes of the small intestine, as well as for isolation of IL-18 in its pure form for pharmacology. It is known that IL-18 is a promising antitumor drug, since it has a direct cytotoxic effect in relation to cancer cells, by inducing apoptosis, it stimulates the production of other cytokines, which play a key role in the destruction of the tumor, and also increases the cytotoxicity of T-killers and NK- cells in relation to cancer cells (Dinarello C. // METHODS. 1999, V.19, P.121-122). IL-18 increases the antigen presenting ability of macrophages and can be used as an adjuvant for immunization with vaccines. Of particular interest is the use of IL-18 as a mucosal adjuvant for immunization of the animal organism with “edible vaccines”.
Известна рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая синтез зрелой формы ИЛ-18 человека в клетках E.coli, сконструированная на основе бактериального экспрессирующего вектора рКК223-3 (Ushio S., Namba M., Okura Т. et al. // The J. Immunol. 1996, V.156, P.4274-4279). Вектор обеспечивает высокий уровень продукции ИЛ-18 в бактериях. Однако в прокариотических клетках не происходит правильной укладки полипептидной цепи ИЛ-18, вследствие чего белок накапливается в виде нерастворимых внутриклеточных агрегатов. Для дальнейшего превращения рекомбинантного белка в растворимую и биологически активную форму требуются дорогостоящие и длительные процедуры рефолдинга. Другим недостатком прокариотических систем экспрессии является возможная контаминация целевого белка бактериальными токсинами.Known recombinant plasmid DNA encoding the synthesis of a mature form of human IL-18 in E. coli cells, constructed on the basis of the bacterial expression vector pKK223-3 (Ushio S., Namba M., Okura T. et al. // The J. Immunol. 1996, V.156, P.4274-4279). Vector provides a high level of production of IL-18 in bacteria. However, in prokaryotic cells, the correct folding of the IL-18 polypeptide chain does not occur, as a result of which the protein accumulates in the form of insoluble intracellular aggregates. To further convert the recombinant protein into a soluble and biologically active form, expensive and lengthy refolding procedures are required. Another disadvantage of prokaryotic expression systems is the possible contamination of the target protein with bacterial toxins.
Наиболее близкой к заявляемой плазмиде - прототипом, является рекомбинантная плазмидная ДНК pBin/hIL-18, в которой нуклеотидная последовательность про-ИЛ-18 встроена в экспрессионный вектор pBin438, под контроль двойного промотора 35S вируса мозаики цветной капусты (Zhang В., Yang Y.H., Lin Y.M. et al. // Biotechnol Lett., 2003, V.25, P.1629-1635). Известная плазмида pBin/hIL-18 размером 14 т.п.н. содержит:Closest to the claimed plasmid, the prototype is the recombinant plasmid DNA pBin / hIL-18, in which the nucleotide sequence of pro-IL-18 is inserted into the expression vector pBin438, under the control of the double promoter of the 35S cauliflower mosaic virus (Zhang B., Yang YH, Lin YM et al. // Biotechnol Lett., 2003, V.25, P.1629-1635). Known plasmid pBin / hIL-18 size 14 TPN contains:
- BamHI-SalI фрагмент ДНК плазмиды pCI-18, размером 0,58 т.п.н., кодирующий проИЛ-18 человека, а также сайты рестрикции, регуляторные участки, генетические маркеры.- BamHI-SalI DNA fragment of the plasmid pCI-18, size 0.58 TPN, encoding human IL-18, as well as restriction sites, regulatory sites, genetic markers.
- ДНК векторной плазмиды pBin438 размером 13,5 т.п.н- DNA vector plasmid pBin438 size 13.5 TPN
Основной недостаток данной плазмидной ДНК заключаются в том, что в качестве переносимого гена в ней содержится последовательность ДНК, кодирующая биологически неактивный предшественник ИЛ-18 человека (проИЛ-18) с молекулярным весом 24 кДа. Кроме того, в известной плазмидной ДНК закодирован белок, не содержащий какого-либо участка, обладающего высоким сродством к известным хроматографическим сорбентам, что затрудняет возможность выделения такого белка методами аффинной хроматографии.The main disadvantage of this plasmid DNA is that it contains a DNA sequence encoding a biologically inactive human precursor IL-18 (pro-IL-18) with a molecular weight of 24 kDa. In addition, a protein that does not contain any region with a high affinity for known chromatographic sorbents is encoded in a known plasmid DNA, which makes it difficult to isolate such a protein by affinity chromatography.
Технической задачей изобретения является создание рекомбинантной плазмидной ДНК, обеспечивающей продукцию зрелой биологически активной формы ИЛ-18 человека в трансгенных растениях.An object of the invention is the creation of recombinant plasmid DNA that provides the production of a mature biologically active form of human IL-18 in transgenic plants.
Поставленная задача достигается новой сконструированной плазмидной ДНК pBi101-IL18 размером 15 т.п.н., обеспечивающей перенос целевой последовательности ДНК в геном растений и экспрессию гена ИЛ-18 человека. Способ конструирования заключается в клонировании участка кДНК гена ИЛ-18 человека в плазмиде рЕТ15b+ совместно с нуклеотидной последовательностью шести аминокислот гистидина и сайта гидролиза ферментом тромбином. На следующем этапе фрагмент ДНК, состоящий из нуклеотидной последовательности полигистидина, тромбинового сайта и ИЛ-18 человека переносят в плазмиду pAVA321 по сайтам рестрикции NcoI/BglII. Плазмида pAVA321 содержит функциональные элементы, необходимые для экспрессии целевого гена в растении. На заключительном этапе клонирования Sail-BamHI фрагмент плазмидной ДНК pAVA321, содержащий ген ИЛ-18 человека под управлением растительных элементов экспрессии, субклонируют в полилинкер Т-ДНК области бинарной векторной плазмиды pBi101. В результате получают рекомбитнантную плазмидную ДНК pBi101-IL18 размером 15 т.п.н., обеспечивающую перенос целевой последовательности ДНК в геном растений и экспрессию гена ИЛ-18 человека.The task is achieved by the newly designed plasmid DNA pBi101-IL18 with a size of 15 kb, which ensures the transfer of the target DNA sequence to the plant genome and expression of the human IL-18 gene. The method of construction consists in cloning a cDNA region of the human IL-18 gene in plasmid pET15b + together with the nucleotide sequence of six amino acids of histidine and the hydrolysis site of the thrombin enzyme. In the next step, a DNA fragment consisting of the nucleotide sequence of polyhistidine, a thrombin site and human IL-18 is transferred to the pAVA321 plasmid at the NcoI / BglII restriction sites. Plasmid pAVA321 contains the functional elements necessary for expression of the target gene in a plant. At the final stage of Sail-BamHI cloning, the pAVA321 plasmid DNA fragment containing the human IL-18 gene under the control of plant expression elements is subcloned into the T-DNA polylinker of the binary vector plasmid pBi101 region. The result is a recombinant plasmid DNA pBi101-IL18 with a size of 15 kb, which ensures the transfer of the target DNA sequence to the plant genome and expression of the human IL-18 gene.
Плазмида состоит из следующих элементов:The plasmid consists of the following elements:
- ДНК векторной плазмиды pBi101 размером 13,9 т.п.н;- DNA of the vector plasmid pBi101 size 13.9 TPN;
- NdeI-BamHI/BglII фрагмента ДНК, являющегося участком кДНК гена ИЛ-18 человека;- NdeI-BamHI / BglII DNA fragment, which is a portion of the cDNA of the human IL-18 gene;
- NcoI-NdeI фрагмента плазмиды рЕТ15b;- NcoI-NdeI fragment of plasmid pET15b;
- 5'UTR области из генома вируса гравировки табака;- 5'UTR region from the genome of the virus of tobacco engraving;
- Двойного 35S CaMV промотора из генома вируса мозаики цветной капусты;- Double 35S CaMV promoter from the cauliflower mosaic virus genome;
- 3'UTR области из генома вируса мозаики цветной капусты.- 3'UTR region from the cauliflower mosaic virus genome.
Физическая карта плазмиды pBi101-IL18 с указанием генетических маркеров приведена на фиг.1, где 6xHis - последовательность ДНК, кодирующая шесть аминокислотных остатков гистидина; Trs - последовательность ДНК, кодирующая сайт узнавания ферментом тромбином; IL-18 - нуклеотидная последовательность зрелой формы ИЛ-18 человека; 35SCaMV - двойной промотор гена 35S РНК вируса мозаики цветной капусты; TL - лидерная последовательность трансляции из генома вируса гравировки табака; TcaMV - терминатор гена 35S РНК вируса мозаики цветной капусты; LB, RB - левая и правая границы Т-ДНК области; PNOS - промотор гена нопалинсинтетазы из Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens; NPTII-ген неомицинфосфотрансферазыII; TNOS - терминатор гена нопалинсинтетазы; В-Glue - нуклеотидная последовательность β-глюкуронидазы E.coli.A physical map of plasmid pBi101-IL18 with genetic markers is shown in figure 1, where 6xHis is the DNA sequence encoding the six amino acid residues of histidine; Trs is the DNA sequence encoding the recognition site by the thrombin enzyme; IL-18 is the nucleotide sequence of the mature form of human IL-18; 35SCaMV - double promoter of the 35S RNA gene of the cauliflower mosaic virus; TL is the leader sequence of translation from the genome of the virus of tobacco engraving; TcaMV - Terminator of the 35S RNA gene of the cauliflower mosaic virus; LB, RB — left and right borders of the T-DNA region; PNOS — promoter of the nopalin synthetase gene from the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid; NPTII gene of neomycin phosphotransferase II; TNOS - terminator of the nopalin synthetase gene; B-Glue is the nucleotide sequence of E. coli β-glucuronidase.
Отличие полученной рекомбинантной плазмидной ДНК от прототипа состоит в использовании нуклеотидной последовательности химерного белка, состоящего из безлидерной (зрелой) формы ИЛ-18 человека, N-концевого пептида из шести аминокислот гистидина и сайта гидролиза ферментом тромбином между ними. Использование такой последовательности ДНК в качестве целевого гена позволит получать растения-продуценты биологически активного ИЛ-18 человека, а также сделает возможным выделение рекомбинантного ИЛ-18 в чистом виде из растений методами металл-хелатной аффинной хроматографии.The difference between the obtained recombinant plasmid DNA and the prototype consists in using the nucleotide sequence of the chimeric protein, which consists of the leaderless (mature) form of human IL-18, the N-terminal peptide of six amino acids histidine, and the hydrolysis site of the enzyme thrombin between them. The use of such a DNA sequence as the target gene will make it possible to obtain plants producing biologically active human IL-18, and will also make it possible to isolate recombinant IL-18 in pure form from plants by metal chelate affinity chromatography.
Сущность изобретения поясняется следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.
Пример 1. Конструирование плазмиды pBi101-IL18.Example 1. Construction of the plasmid pBi101-IL18.
10 мкг ДНК плазмиды pBluescriptSK-IL18, содержащей фрагмент кДНК ИЛ-18 человека, обрабатывали рестриктазами FauNDI (100 е.а.) и BamHI (100 е.а.) в течение 1 часа при 37°С в 50 мкл буфера, содержащего 10 mM Tris-HCl рН 7.6; 10 mM MgCl2; 50 mM NaCl; 1 mM DTT. Гидролизат разделяли электрофорезом в 1,5% агарозном геле, гель окрашивали раствором бромистого этидия в воде (1 мкг/мл) и фрагмент ДНК размером 460 п.н. выделяли из геля методом сорбции ДНК на силикагеле.10 μg of DNA of plasmid pBluescriptSK-IL18 containing the human IL-18 cDNA fragment was treated with restriction enzymes FauNDI (100 ea) and BamHI (100 ea) for 1 hour at 37 ° C in 50 μl of buffer containing 10 mM Tris-HCl pH 7.6; 10 mM MgCl 2 ; 50 mM NaCl; 1 mM DTT. The hydrolyzate was separated by electrophoresis in a 1.5% agarose gel, the gel was stained with a solution of ethidium bromide in water (1 μg / ml) and a 460 bp DNA fragment. isolated from the gel by DNA sorption on silica gel.
10 мкг ДНК плазмиды рЕТ15b гидролизовали рестриктазами FauNDI (100 е.а.) и BamHI (100 е.а.) 1 час при 37°С в 50 мкл буфера, содержащего 10 mM Tris-HCl рН 7.6; 10 mM MgCl2; 50 mM NaCl; 1 mM DTT. Реакционную смесь разделяли электрофорезом в 1,5% агарозном геле, гель окрашивали раствором бромистого этидия в воде (1 мкг/мл) и фрагмент ДНК размером 5700 п.н. выделяли из геля методом сорбции ДНК на силикагеле.10 μg of pET15b plasmid DNA was hydrolyzed with restriction enzymes FauNDI (100 ea) and BamHI (100 ea) for 1 hour at 37 ° C in 50 μl of buffer containing 10 mM Tris-HCl pH 7.6; 10 mM MgCl 2 ; 50 mM NaCl; 1 mM DTT. The reaction mixture was separated by electrophoresis in a 1.5% agarose gel, the gel was stained with a solution of ethidium bromide in water (1 μg / ml) and a DNA fragment 5700 bp in size. isolated from the gel by DNA sorption on silica gel.
Смешивали 0.03 мкг FauNDI - BamHI фрагмента плазмиды рЕТ15b и 3 мкг FauNDI-BamHI фрагмента плазмиды pBluescriptSK-IL18, содержащего нуклеотидную последовательность ИЛ-18 человека, в 10 мкл буфера, содержащего 50 mM Tris-HCl рН 7.8; 10 mM MgCl2; 10 mM DTT; 1 mM АТР; 25 mkg/ml BSA. К смеси добавляли 100 е.а ДНК-лигазы фага Т4 и инкубировали 10 часов при 4°С. 5 мкл лигазной смеси использовали для трансформации компетентных клеток E.coli штамма XLBlue. Трансформанты высевали на чашку с LB-агаром, содержащем 100 мкг/мл ампициллина. Клоны, несущие рекомбинантные плазмиды со встроенным геном, отбирали методом ПЦР анализа ДНК отдельных колоний E.coli с праймерами на нуклеотидную последовательность ИЛ-18 человека. Плазмидные ДНК двух клонов из десяти отобранных для анализа, давших сигнал ПЦР, соответствующий по длине нуклеотидной последовательности ИЛ-18 человека, дополнительно анализировали с помощью гидролиза рестриктазами FauNDI и BamHI и последующим разделением продуктов гидролиза гель-электрофорезом в 1,5% агарозе. В результате рестрикционного анализа подтверждена встройка ИЛ-18 в обоих отобранных плазмидах.0.03 μg FauNDI - BamHI fragment of plasmid pET15b and 3 μg FauNDI-BamHI fragment of plasmid pBluescriptSK-IL18 containing the nucleotide sequence of human IL-18 were mixed in 10 μl of buffer containing 50 mM Tris-HCl pH 7.8; 10 mM MgCl 2 ; 10 mM DTT; 1 mM ATP; 25 mkg / ml BSA. 100 ea of T4 phage DNA ligase was added to the mixture and incubated for 10 hours at 4 ° C. 5 μl of the ligase mixture was used to transform competent cells of E. coli strain XLBlue. Transformants were plated on a LB agar plate containing 100 μg / ml ampicillin. Clones carrying recombinant plasmids with an integrated gene were selected by PCR DNA analysis of individual E. coli colonies with primers for the IL-18 human nucleotide sequence. Plasmid DNA of two of the ten clones selected for analysis that gave a PCR signal corresponding to the length of the IL-18 nucleotide sequence was further analyzed by restriction enzymes FauNDI and BamHI and subsequent separation of the hydrolysis products by gel electrophoresis in 1.5% agarose. The restriction analysis confirmed the insertion of IL-18 in both selected plasmids.
Bsp19I - BamHI фрагмент одной из таких плазмид (pET15b-IL18) использовался для конструирования плазмиды pAVA321-IL18. С этой целью 2 мкг ДНК плазмиды pAVA321 обрабатывали рестриктазами Bsp19I (100 е.а.) и BglII (100 е.а.) 1 час при 37°С в 50 мкл буфера, содержащего 50 mM Tris-HCl рН 7.6; 10 mM MgCl2; 100 mM NaCl; 1 mM DTT. 10 мкг плазмиды pET15b-IL18 гидролизовали рестриктазами Bsp19I (100 е.а.) и BamHI (100 е.а.) в буфере того же состава. Продукты гидролиза разделяли в 1,5% агарозном геле. Выделяли фрагменты ДНК размером 4 т.п.н. и 540 п.н. из плазмид pAVA321 и pET15b-IL18 соответственно, как описано выше. 0,1 мкг фрагмента плазмидной ДНК pAVA321 и 0,5 мкг фрагмента из вектора pET15b-IL18 смешивали в 10 мкл лигазного буфера и обрабатывали ДНК-лигазой, как описано выше. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E.coli штамма XLBlue, трансформанты высевали на чашки с LB-агаром, содержащие 100 мкг/мл ампицилина. Клоны, несущие рекомбинантные плазмиды со встроеным геном ИЛ-18 человека отбирали ПЦР-анализом. Плазмидную ДНК одного клона, давшего положительный ПЦР-сигнал, анализировали с помощью гидролиза рестриктазами Bsp19I и BamHI и последующим разделением продуктов гидролиза гель-электрофорезом в 1,5% агарозе.The Bsp19I - BamHI fragment of one of these plasmids (pET15b-IL18) was used to construct the plasmid pAVA321-IL18. To this end, 2 μg of DNA of plasmid pAVA321 was treated with restriction enzymes Bsp19I (100 ea) and BglII (100 ea) for 1 hour at 37 ° C in 50 μl of buffer containing 50 mM Tris-HCl pH 7.6; 10 mM MgCl 2 ; 100 mM NaCl; 1 mM DTT. 10 μg of plasmid pET15b-IL18 was digested with restriction enzymes Bsp19I (100 ea) and BamHI (100 ea) in a buffer of the same composition. The hydrolysis products were separated on a 1.5% agarose gel. 4 kb DNA fragments were isolated. and 540 bp from plasmids pAVA321 and pET15b-IL18, respectively, as described above. 0.1 μg of the pAVA321 plasmid DNA fragment and 0.5 μg of the fragment from pET15b-IL18 vector were mixed in 10 μl of ligase buffer and treated with DNA ligase as described above. The competent cells of E. coli strain XLBlue were transformed with a ligase mixture, transformants were plated on LB agar plates containing 100 μg / ml ampicillin. Clones carrying recombinant plasmids with an integrated human IL-18 gene were selected by PCR analysis. Plasmid DNA of one clone giving a positive PCR signal was analyzed by restriction enzyme digestion with Bsp19I and BamHI and subsequent separation of hydrolysis products by gel electrophoresis in 1.5% agarose.
По аналогичной схеме клонирования SalI - BamHI фрагмент ДНК из плазмиды pAVA321-IL18 был перенесен в полилинкерную область плазмиды pBi 101.Using a similar SalI - BamHI cloning scheme, the DNA fragment from plasmid pAVA321-IL18 was transferred to the polylinker region of plasmid pBi 101.
Пример 2. Получение моноинсерционных трансгенных растений.Example 2. Obtaining mono-insertion transgenic plants.
Полученной плазмидной ДНК pBi101-IL18 трансформировали клетки Agrobacterium tumefaciens (штамм LBA4404). Трансформацию растений табака Nicotiana tabacum (линии SRI) проводили методом кокультивации листовых дисков с суспензией клеток агробактерий, как описано в (Horsch R., Fry J., Hoffman N. et al. // Plant Molecular Biology Manual. Dordrecht. Kluwer Academic Publishers. 1988, P. A5/1-A5/9). Полученные регенеранты выращивали на среде Мурашиге и Скуга (МС) (Murasige Т., Skoog F. // Physiol. Plant. 1962, V.15, Р.473-497), содержащей 250 мг/л клафорана и 50 мг/л канамицина.The obtained plasmid DNA pBi101-IL18 was transformed with Agrobacterium tumefaciens cells (strain LBA4404). Transformation of tobacco plants Nicotiana tabacum (SRI line) was performed by cocultivation of leaf disks with a suspension of agrobacterial cells, as described in (Horsch R., Fry J., Hoffman N. et al. // Plant Molecular Biology Manual. Dordrecht. Kluwer Academic Publishers. 1988, P. A5 / 1-A5 / 9). The obtained regenerants were grown on Murashige and Skoog medium (MS) (Murasige T., Skoog F. // Physiol. Plant. 1962, V.15, P.473-497) containing 250 mg / l of claforan and 50 mg / l of kanamycin .
После самоопыления растений-регенерантов Т0 анализировали соотношение устойчивых и неустойчивых к антибиотику растений T1 поколения на среде с канамицином. Для этого семена T1 поколения стерилизовали 10%-ным раствором гипохлорита натрия и 96° этанолом по стандартной методике и высевали на чашки со средой МС с добавлением 100 мг/л канамицина. Чашки инкубировали две недели при 25°С со стандартным световым режимом (16 часов свет, 8 часов темнота) и подсчитывали соотношение белых и зеленых проростков. Показано, что это соотношение близко к 3:1 у 6 из 30 проанализированных линий. Для дальнейших исследований были отобраны только T1 растения, среди которых наблюдалось достоверное расщепление 3:1 по признаку канамицинустойчивости.After self-pollination of T 0 regenerated plants, the ratio of T 1 generation resistant and antibiotic-resistant plants on an environment with kanamycin was analyzed. For this, T 1 generation seeds were sterilized with 10% sodium hypochlorite solution and 96 ° ethanol according to the standard method and were sown on plates with MS medium with the addition of 100 mg / l kanamycin. The cups were incubated for two weeks at 25 ° C with standard light conditions (16 hours of light, 8 hours of darkness) and the ratio of white and green seedlings was calculated. It is shown that this ratio is close to 3: 1 in 6 out of 30 analyzed lines. For further studies, only T 1 plants were selected, among which there was a reliable 3: 1 cleavage on the basis of kanamycin resistance.
Наличие нуклеотидной последовательности ИЛ-18 человека в геномах отобранных растений подтверждали методом ПЦР с праймерами на нуклеотидную последовательность ИЛ-18. Моноинсерционность растений дополнительно анализировали блот-гибридизацией HindIII - гидролизатов геномных ДНК растений с 32Р меченым фрагментом кДНК ИЛ-18 человека на нитроцеллюлозной мембране.The presence of the nucleotide sequence of human IL-18 in the genomes of selected plants was confirmed by PCR with primers for the nucleotide sequence of IL-18. The mono-insertion of plants was additionally analyzed by blot hybridization of HindIII - plant genomic DNA hydrolysates with 32 P labeled human IL-18 cDNA fragment on a nitrocellulose membrane.
Анализ уровня экспрессии ИЛ-18 человека у трансгенных растений проводили методом Вестерн-блоттинга с применением поликлональных антител кролика, специфичных к ИЛ-18 человека. В качестве вторичных антител использовали козьи антитела к IgG2 кролика, коньюгированные с щелочной фосфатазой. Для детекции ферментативной активности щелочной фосфатазы использовали набор хемилюминесцентных реактивов Immunstar (BioRad, США). При приготовлении материала для Вестерн-блоттинга суммарный белок из 0,3 г листьев табака экстрагировали в 1 мл Буфера 1 (50 мМ Tris-HCl pH 8.0, 500 мМ NaCl, 0.1% Tween-20, 5 мМ β-МЕ, 1 мМ PMSF). Концентрацию белка в экстрактах определяли методом Бредфорда. Экстракты пропускали через микроколонки с 20 мкл Ni-NTA агарозы. В качестве промывочного раствора использовали буфер 1 с добавлением имидазола до концентрации 20 мМ. После 3-кратной промывки белок с колонок элюировали в 150 мкл буфера 1 с добавлением имидазола до концентрации 150 мМ. Для анализа использовали 75 мкл приготовленного элюата (30 нг белка).The analysis of the level of expression of human IL-18 in transgenic plants was carried out by Western blotting using rabbit polyclonal antibodies specific for human IL-18. Goat antibodies to rabbit IgG 2 conjugated with alkaline phosphatase were used as secondary antibodies. To detect the enzymatic activity of alkaline phosphatase, the Immunstar chemiluminescent reagent kit (BioRad, USA) was used. When preparing Western blot material, a total protein of 0.3 g of tobacco leaves was extracted in 1 ml of Buffer 1 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 0.1% Tween-20, 5 mM β-ME, 1 mM PMSF ) The protein concentration in the extracts was determined by the Bradford method. The extracts were passed through microcolumns with 20 μl of Ni-NTA agarose. Buffer 1 with the addition of imidazole to a concentration of 20 mM was used as a washing solution. After washing 3 times, the protein from the columns was eluted in 150 μl of buffer 1 with the addition of imidazole to a concentration of 150 mM. For analysis, 75 μl of the prepared eluate (30 ng protein) was used.
На фиг.2 представлены результаты Вестерн-блоттинга двух независимых моноинсерционных трансгенных растений табака, где 7 и 15 - элюаты из экстрактов трансгенных растений №7 и №15 соответственно; Н - элюат из экстракта нетрансгенного растения; К+ - элюат из экстракта нетрансгенного растения с добавленным рекомбинантным ИЛ-18 человека, полученным из клеток E.coli, до концентрации 0,01% суммарного белка (400 нг/мл экстракта); Б - 700 нг рекомбинантного ИЛ-18 человека, полученного из клеток E.coli. Молярная масса ИЛ-18 человека, содержащего полигистидиновую последовательность и сайт гидролиза ферментом тромбином составляет 20 кДа, что характерно именно для зрелой формы.Figure 2 presents the results of Western blotting of two independent mono-insertion transgenic tobacco plants, where 7 and 15 are eluates from extracts of transgenic plants No. 7 and No. 15, respectively; H — eluate from an extract of a non-transgenic plant; K + - eluate from the extract of a non-transgenic plant with added recombinant human IL-18, obtained from E. coli cells, to a concentration of 0.01% of the total protein (400 ng / ml of extract); B - 700 ng of recombinant human IL-18, obtained from E. coli cells. The molar mass of human IL-18 containing a polyhistidine sequence and the site of hydrolysis with the thrombin enzyme is 20 kDa, which is typical for the mature form.
Таким образом, у обоих растений показано присутствие белка, соответствующего по молекулярной массе и иммунологическим свойствам ИЛ-18 человека, полученному из клеток E.coli. В качестве положительного контроля использовали элюат, полученный из экстракта нетрансгенного растения с добавленным бактериальным ИЛ-18 человека до концентрации 0,01% суммарного белка. Сравнив интенсивности полос на дорожках 7, 15 и К, можно заключить, что содержание рекомбинантного белка у проанализированных растений составило более 0,01% суммарного белка или в пересчете на сырой вес растения - 1,3 мг/кг.Thus, the presence of a protein corresponding to the molecular weight and immunological properties of human IL-18 obtained from E. coli cells was shown in both plants. An eluate obtained from an extract of a non-transgenic plant with added human bacterial IL-18 to a concentration of 0.01% of the total protein was used as a positive control. By comparing the intensities of the bands in
Пример 3. Исследование биологической активности рекомбинантного растительного химерного ИЛ-18 человекаExample 3. The study of the biological activity of recombinant plant chimeric human IL-18
При приготовлении материала для анализа биологической активности суммарный белок из 0,3 г листьев табака экстрагировали в 1 мл Буфера 1 (50 мМ Tris-HCl pH 8.0, 500 мМ NaCl 0.1% Tween-20, 5 мМ β-ME, 1 мМ PMSF). Концентрацию белка в экстрактах определяли методом Бредфорда. Экстракты пропускали через микроколонки с 20 мкл Ni-NTA агарозы. В качестве промывочного раствора использовали буфер 1 с добавлением имидазола до концентрации 20 мМ. После 3-кратной промывки белок с колонок элюировали в 150 мкл буфера 1 с добавлением имидазола до концентрации 150 мМ. Элюат диализовали против 50 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7.4) с 0.15 М соляной кислоты. Для анализа использовали 10 мкл приготовленного элюата.When preparing material for the analysis of biological activity, a total protein of 0.3 g of tobacco leaves was extracted in 1 ml of Buffer 1 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl 0.1% Tween-20, 5 mM β-ME, 1 mM PMSF) . The protein concentration in the extracts was determined by the Bradford method. The extracts were passed through microcolumns with 20 μl of Ni-NTA agarose. Buffer 1 with the addition of imidazole to a concentration of 20 mM was used as a washing solution. After washing 3 times, the protein from the columns was eluted in 150 μl of buffer 1 with the addition of imidazole to a concentration of 150 mM. The eluate was dialyzed against 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) with 0.15 M hydrochloric acid. For analysis, 10 μl of the prepared eluate was used.
Для изучении биологической активности рекомбинантного растительного ИЛ-18 человека исследовалось его влияние на спонтанную и стимулированную продукцию TNFα и IFNγ. Мононуклеарную фракцию клеток периферической крови получали у здоровых доноров методом центрифугирования в градиенте плотности фиколла. Количественное определение TNFα и IFNγ проводили методом электрохемилюминисценции. Для получения калибровочных кривых использовали рекомбинантные TNFα и IFNγ человека (R&D Systems, UK). Поликлональные и моноклональные антитела получены из Pepro Tech, Inc. (NJ, USA). Культивирование мононуклеарных клеток периферической крови человека в присутствии КонА (10 мкг/мл) или полученного элюата (10 мкл) приводит к достоверному повышению уровня продукции TNFα и IFNγ, совместная стимуляция клеток КонА и элюата усиливает эту продукцию. Данные по индукции TNFα (24 ч инкубации) и IFNγ (48 ч инкубации) в мононуклеарных клетках человека представлены в таблице. To study the biological activity of recombinant human plant IL-18, its effect on spontaneous and stimulated production of TNFα and IFNγ was studied. The mononuclear fraction of peripheral blood cells was obtained from healthy donors by centrifugation in a density gradient of ficoll. Quantitative determination of TNFα and IFNγ was performed by electrochemiluminescence. Recombinant human TNFα and IFNγ (R&D Systems, UK) were used to obtain calibration curves. Polyclonal and monoclonal antibodies are obtained from Pepro Tech, Inc. (NJ, USA). The cultivation of human peripheral blood mononuclear cells in the presence of ConA (10 μg / ml) or the resulting eluate (10 μl) leads to a significant increase in the level of production of TNFα and IFNγ, the combined stimulation of ConA cells and the eluate enhances this production. The data on the induction of TNFα (24 hr incubation) and IFNγ (48 hr incubation) in human mononuclear cells are presented in the table.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что элюат, обогащенный в отношении содержания рекомбинантного белка, несущего полигистидиновую последовательность, способен стимулировать синтез TNFα и IFNγ в мононуклеарной фракции человека при костимуляции Con А, что характерно для биологической активности зрелой формы интерелейкина 18 человека.The results obtained indicate that the eluate enriched with respect to the content of the recombinant protein carrying the polyhistidine sequence is capable of stimulating the synthesis of TNFα and IFNγ in the human mononuclear fraction during co-stimulation with Con A, which is characteristic of the biological activity of the mature form of
Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о том, что сконструированная плазмидная ДНК pBi101-IL18 обеспечивает перенос нуклеотидной последовательности химерного ИЛ-18 человека в геномную ДНК растений и продукцию зрелой формы интерлейкина 18 человека, обладающей биологической активностью.Thus, the data presented indicate that the constructed plasmid DNA pBi101-IL18 provides the transfer of the nucleotide sequence of the chimeric human IL-18 to the genomic DNA of plants and the production of the mature form of
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005133963/13A RU2302460C1 (en) | 2005-11-02 | 2005-11-02 | RECOMBINANT PLASMID DNA pBi101-IL18 ENCODING HUMAN INTERLEUKIN-18 SYNTHESIS IN TRANSGENIC PLANTS |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005133963/13A RU2302460C1 (en) | 2005-11-02 | 2005-11-02 | RECOMBINANT PLASMID DNA pBi101-IL18 ENCODING HUMAN INTERLEUKIN-18 SYNTHESIS IN TRANSGENIC PLANTS |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2302460C1 true RU2302460C1 (en) | 2007-07-10 |
Family
ID=38316678
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2005133963/13A RU2302460C1 (en) | 2005-11-02 | 2005-11-02 | RECOMBINANT PLASMID DNA pBi101-IL18 ENCODING HUMAN INTERLEUKIN-18 SYNTHESIS IN TRANSGENIC PLANTS |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2302460C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2503460C2 (en) * | 2007-11-07 | 2014-01-10 | Дженентек Инк. | Using antimicrobial polypeptide for treating microbial disorders |
| US10087227B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-10-02 | Genentech, Inc. | Nucleic acids encoding IL-22 Fc fusion proteins |
-
2005
- 2005-11-02 RU RU2005133963/13A patent/RU2302460C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ZHANG В, et al «Expression and production of bioactive human interleukin-18 in transgenic tobacco plants», Biotechnol Lett. 2003, 25(19): 1629-1635. * |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2503460C2 (en) * | 2007-11-07 | 2014-01-10 | Дженентек Инк. | Using antimicrobial polypeptide for treating microbial disorders |
| US10087227B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-10-02 | Genentech, Inc. | Nucleic acids encoding IL-22 Fc fusion proteins |
| US10160793B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-12-25 | Genentech, Inc. | Methods of treating inflammatory bowel disease using IL-22 Fc fusion proteins |
| US10544198B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-01-28 | Genentech, Inc. | Methods of accelerating or improving wound healing using IL-22 FC fusion proteins |
| US10584155B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-03-10 | Genentech, Inc. | Pharmaceutical compositions of IL-22 Fc fusion proteins |
| US11130791B2 (en) | 2013-03-15 | 2021-09-28 | Genentech, Inc. | Methods for treating metabolic syndrome using IL-22 Fc fusion proteins |
| US11136365B2 (en) | 2013-03-15 | 2021-10-05 | Genentech, Inc. | Methods for preventing or treating cardiovascular conditions using il-22 fc fusion proteins |
| US11155591B2 (en) | 2013-03-15 | 2021-10-26 | Genentech, Inc. | Methods of treating acute pancreatitis using IL-22 fc fusion proteins |
| US11332507B2 (en) | 2013-03-15 | 2022-05-17 | Genentech, Inc. | IL-22 Fc fusion proteins |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10730925B2 (en) | Chimeric polypeptides, polynucleotides encoding same, cells expressing same and methods of producing same | |
| TWI460270B (en) | Bacterial Toxin Vaccine | |
| EP0429478B1 (en) | Expression cassette for plants | |
| US20110002950A1 (en) | Pig edema disease vaccine | |
| Zhang et al. | Expression and production of bioactive human interleukin-18 in transgenic tobacco plants | |
| JPH04229182A (en) | Novel signal sequence | |
| RU2302460C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pBi101-IL18 ENCODING HUMAN INTERLEUKIN-18 SYNTHESIS IN TRANSGENIC PLANTS | |
| US20180291084A1 (en) | Chimeric polypeptides, polynucleotides encoding same, cells expressing same and methods of producing same | |
| US8802931B2 (en) | Salt resistant transgenic plants | |
| JP2002518055A (en) | Plant selectable marker and plant transformation method | |
| KR102446646B1 (en) | Transgenic tomato fruits for high expression of brazzein and method for producing thereof | |
| JPH07213185A (en) | Plant improved in content of amino acid containing sulfur and method for improvement | |
| JP4228072B2 (en) | Artificial synthetic gene encoding avidin | |
| Tarasenko et al. | Expression of the nucleotide sequence for the M2e peptide of avian influenza virus in transgenic tobacco plants | |
| KR102125714B1 (en) | DEMETER gene from Arabidopsis thaliana for regulating regeneration efficiency of plant and uses thereof | |
| KR100628023B1 (en) | Recombinant Surface Antigen Derived from Sporozoites of Pathogens Responsible for Coccidiosis and Vaccines Comprising the Same | |
| JP2003116385A (en) | Transgenic plant containing gene encoding japanese b encephalitis vaccine | |
| Beisenov et al. | Тransplastomic tobacco plants producing the hydrophilic domain of the sheep pox virus coat protein L1R | |
| RU2374321C2 (en) | Method of growing transgenic carrot plants, which produce human interleukin-10 | |
| KR20050027838A (en) | Recombinant human growth hormone expressed in plants | |
| KR0149216B1 (en) | Envelope gene of pepper mild mottle virus | |
| JP2023136614A (en) | Method for producing hedgehog protein using plant | |
| KR0160009B1 (en) | 54-kda replicase gene of korean-type pepper mild mottle virus and expression vector comprising same | |
| WO2004005343A1 (en) | Production of transformed plants expressing thyroid stimulating hormone receptor | |
| KR20050028129A (en) | Bovine lactoferricin expressed in plants |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20171103 |