RU2295535C2 - Recombinant placental growth factor and method for production thereof - Google Patents
Recombinant placental growth factor and method for production thereof Download PDFInfo
- Publication number
- RU2295535C2 RU2295535C2 RU2004126688/13A RU2004126688A RU2295535C2 RU 2295535 C2 RU2295535 C2 RU 2295535C2 RU 2004126688/13 A RU2004126688/13 A RU 2004126688/13A RU 2004126688 A RU2004126688 A RU 2004126688A RU 2295535 C2 RU2295535 C2 RU 2295535C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- stage
- plgf
- buffer
- solution
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Данное изобретение относится к способу экстракции и очистки рекомбинантного плацентарного фактора роста из генетически модифицированных клеток.This invention relates to a method for the extraction and purification of recombinant placental growth factor from genetically modified cells.
Уровень техникиState of the art
Плацентарный фактор роста (PLGF) является гомодимерным гликопротеином со структурой, сходной со структурой фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). Полная полинуклеотидная последовательность, кодирующая белок PLGF, была описана Maglione and Persico в патенте ЕР-В-550519 (WO-A-92/06194), притязающем на приоритет по итальянской заявке от 27.09.1990 года. Альтернативные процессы сплайсинга РНК PLGF дают три гомологичные формы плацентарного фактора роста, а именно PLGF-1, PLGF-2 и PLGF-3, имеющие различные полипептидные последовательности, и все они описаны в литературе.Placental growth factor (PLGF) is a homodimeric glycoprotein with a structure similar to that of vascular endothelial growth factor (VEGF). The complete polynucleotide sequence encoding the PLGF protein was described by Maglione and Persico in patent EP-B-550519 (WO-A-92/06194), claiming priority according to the Italian application of 09/27/1990. Alternative PLGF RNA splicing processes produce three homologous forms of placental growth factor, namely PLGF-1, PLGF-2, and PLGF-3 having different polypeptide sequences, and all are described in the literature.
Вышеуказанный патент описывает также способ получения фактора PLGF, предусматривающий использование индуцибельной прокариотической системы экспрессии, характеризующейся клетками-хозяевами, модифицированными экспрессирующим вектором, в который встроен ген PLGF человека под контролем индуцибельного (прямо или опосредованно) промотора. После индукции экспрессии PLGF подходящим активатором эти клетки инкубируют, выделяют и подвергают лизису.The above patent also describes a method for producing the PLGF factor, comprising the use of an inducible prokaryotic expression system characterized by host cells modified with an expression vector into which a human PLGF gene is inserted under the control of an inducible (directly or indirectly) promoter. After induction of PLGF expression by a suitable activator, these cells are incubated, isolated and lysed.
Полученный таким образом неочищенный лизат является сложной смесью белков, содержащей низкие количества экспрессированного белка PLGF и имеющей низкую удельную активность. Действительно, в известном способе, экспрессию этого белка индуцируют в культурах, содержащих низкую плотность клеток, как это очевидно из низкой оптической плотности в момент индукции, которая находится между 0,2 и 0,6 OD при 600 нм. Кроме того, способ, описанный в предыдущем документе, не содержит дополнительных стадий очистки экспрессированного белка. По этой причине лизаты, полученные в соответствии с заявкой WO-A-92/06194, являются непригодными, как таковые, для прямого использования в получении лекарственных средств.The crude lysate thus obtained is a complex protein mixture containing low amounts of expressed PLGF protein and having low specific activity. Indeed, in the known method, the expression of this protein is induced in cultures containing low cell density, as is evident from the low optical density at the time of induction, which is between 0.2 and 0.6 OD at 600 nm. In addition, the method described in the previous document does not contain additional stages of purification of the expressed protein. For this reason, the lysates obtained in accordance with the application WO-A-92/06194, are unsuitable, as such, for direct use in obtaining medicines.
Более сложный способ очистки того же самого плацентарного фактора рассматривается Maglione et al. in "Il Farmaco" 55 (2000), pages 165-167. Однако описание способа дает только простое перечисление известных применимых способов без описания их условий и экспериментальных деталей, которые являются существенными для получения белка PLGF с чистотой и в количестве, необходимых для фармацевтического применения.A more complex method for purification of the same placental factor is considered by Maglione et al. in "Il Farmaco" 55 (2000), pages 165-167. However, the description of the method provides only a simple listing of known applicable methods without describing their conditions and experimental details that are essential for obtaining PLGF protein with the purity and amount necessary for pharmaceutical use.
Целью данного изобретения является обеспечение нового способа экстракции и очистки рекомбинантного PLGF, экспрессируемого в бактериальных клетках, позволяющего получать PLGF высокого уровня чистоты и с выходами, подходящими для промышленного применения в получении лекарственных средств.The aim of this invention is the provision of a new method of extraction and purification of recombinant PLGF expressed in bacterial cells, allowing to obtain PLGF of high purity and in yields suitable for industrial use in the manufacture of medicines.
Следующей целью данного изобретения является получение белка PLGF по существу в активной форме (с чистотой, большей, чем 98,5%), то есть, состоящего из димерных (не менее чем на 70%) и мультимерных форм и содержащего остаточное количество мономерной формы (малоактивной или неактивной) в количестве, не большем, чем 1,5%.The next objective of this invention is to obtain PLGF protein essentially in active form (with a purity greater than 98.5%), that is, consisting of dimeric (not less than 70%) and multimeric forms and containing a residual amount of monomeric form ( inactive or inactive) in an amount not greater than 1.5%.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Данное изобретение основано на идентификации последовательности способов очистки, особенно подходящих для экстракции и очистки PLGF человека, экспрессируемого в бактериальных клетках. Данное изобретение дополнительно основано на определении оптимальных рабочих условий в отношении отдельных способов и в отношении химико-физических свойств вещества, которое должно быть очищено.The present invention is based on the identification of a sequence of purification methods particularly suitable for the extraction and purification of human PLGF expressed in bacterial cells. The present invention is further based on the determination of optimal operating conditions in relation to individual methods and in relation to the chemical-physical properties of the substance to be purified.
Затем, целью данного изобретения является способ экстракции и очистки рекомбинантного плацентарного фактора роста (PLGF), экспрессируемого с использованием индуцибельной прокариотической системы экспрессии, предусматривающей стадии: I) ферментации бактериальных клеток, II) экстракции и очистки телец включения, III) ренатурации экспрессированного белка, IV) ионообменной хроматографии, V) обращенно-фазовой хроматографии и, при необходимости, VI) конечные стадии ультрафильтрации, приготовления готовой формы и лиофилизации. Согласно этому способу, стадию ферментации (стадию I) осуществляют до получения высокой плотности бактерий в среде, как это показывает высокая оптическая плотность в данной среде, перед проведением стадии индукции. Стадия (II) предусматривает лизис бактерий, разрушение ДНК и выделение телец включения. Ренатурацию экспрессированного белка (стадия III) получают солюбилизацией телец включения в денатурирующем буфере и превращением, по меньшей мере, частично, экспрессированного белка в димерную форму. Наконец, в стадии (IV и (V) димерные и мультимерные формы экспрессированного белка отделяют от мономерной формы и выделяют в чистой форме, подлежащей последующей ультрафильтрации и лиофилизации в присутствии обычных добавок для лиофилизации и приготовления готовой формы.Then, the aim of the present invention is a method for extraction and purification of recombinant placental growth factor (PLGF) expressed using an inducible prokaryotic expression system, comprising the steps of: I) fermenting bacterial cells, II) extracting and purifying inclusion bodies, III) renaturation of the expressed protein, IV ) ion-exchange chromatography, V) reverse phase chromatography and, if necessary, VI) the final stages of ultrafiltration, preparation of the finished form and lyophilization. According to this method, the fermentation step (step I) is carried out until a high density of bacteria in the medium is obtained, as shown by the high optical density in the given medium, before the induction step. Stage (II) involves the lysis of bacteria, the destruction of DNA and the isolation of inclusion bodies. Renaturation of the expressed protein (stage III) is obtained by solubilizing the inclusion bodies in denaturing buffer and converting, at least partially, the expressed protein to a dimeric form. Finally, in steps (IV and (V), the dimeric and multimeric forms of the expressed protein are separated from the monomeric form and isolated in a pure form, which is subject to subsequent ultrafiltration and lyophilization in the presence of conventional additives for lyophilization and preparation of the finished form.
Особой целью данного изобретения является вышеуказанный способ экстракции и очистки белка PLGF человеческого происхождения, но он по существу является также пригодным для PLGF-1 животного происхождения.A particular objective of this invention is the above method of extraction and purification of PLGF protein of human origin, but it is essentially also suitable for PLGF-1 animal origin.
Заявленный способ выгодным образом позволяет получать высокие выходы экспрессированного белка, в 30-50 раз более высокие, чем выходы, получаемые в соответствии со способом, описанном в предшествующем уровне техники. Кроме того, заявляемый способ позволяет получать высокоочищенный белок с высокой удельной активностью и в по существу димерной форме.The claimed method advantageously allows to obtain high yields of expressed protein, 30-50 times higher than the yields obtained in accordance with the method described in the prior art. In addition, the inventive method allows to obtain highly purified protein with high specific activity and in essentially dimeric form.
Следующей целью данного изобретения является активный плацентарный фактор роста, получаемый с использованием способа данного изобретения, не содержащий какого-либо остаточного белка или другого бактериального загрязнителя и содержащий остатки мономерной формы в количестве, не более чем 1,5%.The next objective of this invention is an active placental growth factor, obtained using the method of the present invention, not containing any residual protein or other bacterial contaminant and containing monomeric form residues in an amount of not more than 1.5%.
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
Фиг.1: Эта фигура показывает результаты, полученные электрофорезом в ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях, при мониторинге стадии I. Pre1 и Рre2 представляют прединдукционные контроли, приготовленные следующим образом. Незадолго перед индукцией берут приблизительно 0,064 единиц оптической плотности при 600 нм (OD600) и разбавляют в 5 раз водой. Из этого разведения берут 20 мкл, которые добавляют к 20 мкл восстанавливающего буфера и подвергают кипячению. 20 мкл этого последнего раствора наносят на гель для электрофореза в ДСН-ПААГ. Post1 и Post2 представляют пост-индукционные контроли, приготовленные, как описано выше. М обозначает смесь маркеров молекулярной массы. В пост-индукционных дорожках (Post1 и Post2) отмечена полоса непосредственно над маркером молекулярной массы 14,3, по существу отсутствующая в прединкубационных дорожках (Pre1 и Рre2), соответствующая белку PLGF-1, экспрессируемому и сегрегируемому в составе телец включения.Figure 1: This figure shows the results obtained by SDS-PAGE electrophoresis under reducing conditions while monitoring Step I. Pre1 and Pre2 represent pre-induction controls prepared as follows. Shortly before induction, approximately 0.064 absorbance units at 600 nm (OD600) were taken and diluted 5 times with water. From this dilution, 20 μl was taken, which was added to 20 μl of reduction buffer and boiled. 20 μl of this last solution is applied to an SDS-PAGE gel for electrophoresis. Post1 and Post2 represent post-induction controls prepared as described above. M denotes a mixture of molecular weight markers. In the post-induction paths (Post1 and Post2), a band immediately above the molecular weight marker 14.3 was observed, which is essentially absent in the pre-incubation paths (Pre1 and Pre2), corresponding to the PLGF-1 protein expressed and segregated in inclusion bodies.
Фиг.2: Эта фигура показывает хроматограмму мониторинга анионообменной хроматографии на смоле Q-Sepharose Fast Flow. Х-ось показывает объем элюции (мл), у-ось показывает единицы оптической плотности (OD). Первый пик элюции, полученный элюцией при 20% буфера В (200 мМ NaCl), соответствует белку PLGF-1 в по существу димерной форме, но он содержит примеси и мономерную форму. Следующий пик, элюируемый при 100% буфера В (1М NaCl), содержит удаляемые примеси.Figure 2: This figure shows a chromatogram for monitoring anion exchange chromatography on Q-Sepharose Fast Flow resin. The x-axis shows the volume of elution (ml), the y-axis shows units of optical density (OD). The first elution peak obtained by elution with 20% buffer B (200 mM NaCl) corresponds to the PLGF-1 protein in essentially dimeric form, but it contains impurities and a monomeric form. The next peak, eluting with 100% buffer B (1M NaCl), contains removable impurities.
Фиг.3: Эта фигура показывает хроматограмму мониторинга первой стадии элюции при обращенно-фазовой хроматографии на смоле RP Source 30. Х-ось показывает объем элюции (мл), у-ось показывает единицы оптической плотности (OD). Первый относительно высокий пик соответствует различным примесям, которые не связываются со смолой. Второй пик элюции соответствует белку PLGF в мономерной форме, элюированному при изократических условиях (экспериментально обнаруживаемый при приблизительно 10-15% буфера В).Figure 3: This figure shows a chromatogram for monitoring the first stage of elution by reverse phase chromatography on
Фиг.4: Эта фигура показывает хроматограмму мониторинга второй стадии элюции при обращенно-фазовой хроматографии на смоле RP Source 30. Х-ось показывает объем элюции (мл), у-ось показывает единицы оптической плотности (OD). Пик элюции соответствует белку PLGF в димерной-мультимерной форме.Figure 4: This figure shows a chromatogram for monitoring the second stage of elution by reverse phase chromatography on
Фигура 5: Эта фигура показывает результаты, полученные при электрофорезе в ДСН-ПААГ, при конечном мониторинге всего процесса. Prerefol и Postrefol представляют контроли перед ренатурацией и после ренатурации экспрессированного белка (стадия III). QFF представляет пик, элюированный со смолы Q-Sepharose Fast Flow, содержащий этот белок в основном в димерной форме. Mon представляет пик, соответствующий мономерной форме. Dim представляет пик, элюированный на второй подстадии обращенно-фазовой хроматографии на смоле RP Source 30. Обращается внимание на то, что перед ренатурацией экспрессируемый белок находится в основном в мономерной форме. После ренатурации часть белка находится в димерной форме. Последующая очистка при помощи хроматографии на QFF и RF 30 позволяет получить белок PLGF с высокой степенью чистоты.Figure 5: This figure shows the results obtained by electrophoresis in SDS-PAGE, with the final monitoring of the whole process. Prerefol and Postrefol present controls before and after renaturation of the expressed protein (stage III). QFF is a peak eluted from Q-Sepharose Fast Flow resin, containing this protein mainly in dimeric form. Mon represents the peak corresponding to the monomeric form. Dim represents a peak eluted in the second step of reverse phase chromatography on
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Генетическая модификация бактериальных клеток-хозяев описана Maglione et al. в предыдущем патенте ЕР-В-0050519 (WO-A-92/06194). Для этой цели бактериальные клетки трансформируют введением экспрессирующего вектора, содержащего вставку, соответствующую гену человека, кодирующему фактор PLGF-1. Полная последовательность этого гена известна в литературе, и она является легко доступной. Плазмида, содержащая такую последовательность, депонирована в АТСС под инвентарным номером АТСС №40892. Экспрессию осуществляют под контролем системы РНК-полимеразы фага Т7 и ее индуцируют IPTG (изопропил-β-D-тиогалактопиранозидом).Genetic modification of bacterial host cells is described by Maglione et al. in the previous patent EP-B-0050519 (WO-A-92/06194). For this purpose, bacterial cells are transformed by the introduction of an expression vector containing an insert corresponding to the human gene encoding the PLGF-1 factor. The complete sequence of this gene is known in the literature and is readily available. A plasmid containing such a sequence is deposited in ATCC under ATCC accession number 40892. Expression is controlled by the T7 phage RNA polymerase system and is induced by IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside).
Тем не менее, могут быть использованы другие индуцируемые прокариотические системы экспрессии. Примеры таких систем, доступных в продаже, представлены ниже.However, other inducible prokaryotic expression systems may be used. Examples of such systems available commercially are presented below.
1) Системой экспрессии pBAD (In vitrogen BV), где синтез белка ставят под контроль промотора araBAD, и синтез может быть индуцирован в различных штаммах Е.coli арабинозой.1) The pBAD expression system (In vitrogen BV), where protein synthesis is placed under the control of the araBAD promoter, and synthesis can be induced in various E. coli strains with arabinose.
2) Системой экспрессии Т7 (In vitrogen BV или Promega), где синтез белка регулируется промотором РНК-полимеразы фага Т7 и синтез может быть индуцирован лактозой или ее аналогами (IPTG). В этом случае требуется использование производных Е.coli типа DE3 (B121(DE3) или JM109(DE3)), а именно содержащих копию гена РНК-полимеразы фага Т7, помещенной под контроль индуцируемого лактозой промотора.2) T7 expression system (In vitrogen BV or Promega), where protein synthesis is regulated by the T7 phage RNA polymerase promoter and synthesis can be induced by lactose or its analogues (IPTG). In this case, the use of E. coli derivatives of type DE3 (B121 (DE3) or JM109 (DE3)) is required, namely, containing a copy of the T7 phage RNA polymerase gene placed under the control of the lactose-induced promoter.
3) Системой экспрессии trc (In vitrogen BV), где синтез белка помещают под контроль гибридного промотора trp. Такой промотор был получен слиянием промотора trp и промотора lac, и синтез может быть индуцирован в различных штаммах Е.coli лактозой или ее аналогами (IPTG).3) trc expression system (In vitrogen BV), where protein synthesis is placed under the control of the trp hybrid promoter. Such a promoter was obtained by fusion of the trp promoter and the lac promoter, and synthesis can be induced in various strains of E. coli with lactose or its analogues (IPTG).
4) Системой экспрессии tac (Amersham biosciences), где синтез белка помещают под контроль промотора tac. В этой системе синтез белка индуцируют в штаммах Е.coli lacIq (типа JM105) лактозой или ее аналогами (IPTG).4) The tac expression system (Amersham biosciences), where protein synthesis is placed under the control of the tac promoter. In this system, protein synthesis is induced in strains of E. coli lacIq (type JM105) with lactose or its analogues (IPTG).
5) Системой экспрессии PL, где синтез белка помещают под контроль промотора PL, и синтез может быть индуцирован добавлением триптофана. В этом случае требуется использование производных Е.coli (GI724), содержащих копию кодирующего гена для cI-репрессора фага лямбда, помещенного под контроль индуцируемого триптофаном промотора.5) The P L expression system, where protein synthesis is placed under the control of the PL promoter, and synthesis can be induced by the addition of tryptophan. In this case, the use of E. coli derivatives (GI724) containing a copy of the coding gene for the lambda phage cI repressor placed under the control of the tryptophan-induced promoter is required.
Стадия I: Ферментация и индукцияStage I: Fermentation and Induction
Первая стадия заявленного способа состоит в ферментации функционально-модифицированного бактериального штамма, эквивалентного штамму, описанному в предыдущем Европейском патенте (см. выше). В предпочтительном варианте этот микроорганизм является производным Escherichia coli, модифицированным экспрессионной плазмидой, содержащей ген PLGF человека. Предпочтительным является микроорганизм, названный [B12(DE3)pLysS PLGF-1], полученный интеграцией в коммерчески доступный штамм [B12(DE3)pLysS] (Promega Corporation USA) гена PLGF-1 человека. Однако данное изобретение не ограничивается фактором PLGF-1 человека, но относится также к фактору животного происхождения (обезьяны, мыши, кролика и т.д.). Данное изобретение не ограничивается также использованием производного Е.coli, a включает в себя использование любого прокариотического микроорганизма, восприимчивого к генетической модификации и способного экспрессировать гетерологичные белки в форме телец включения.The first stage of the claimed method consists in the fermentation of a functionally modified bacterial strain, equivalent to the strain described in the previous European patent (see above). In a preferred embodiment, the microorganism is a derivative of Escherichia coli modified with an expression plasmid containing the human PLGF gene. A microorganism named [B12 (DE3) pLysS PLGF-1] obtained by integration into the commercially available strain [B12 (DE3) pLysS] (Promega Corporation USA) of the human PLGF-1 gene is preferred. However, this invention is not limited to the human PLGF-1 factor, but also relates to a factor of animal origin (monkeys, mice, rabbits, etc.). The invention is not limited to the use of a derivative of E. coli, but includes the use of any prokaryotic microorganism susceptible to genetic modification and capable of expressing heterologous proteins in the form of inclusion bodies.
Штаммы, используемые в качестве инокулята в способе данного изобретения, хранят перед их использованием в лиофилизированной форме для сохранения их экспрессионной способности. При использовании этот лиофилизированный материал переводят опять в форму раствора с использованием подходящего буфера.The strains used as inoculum in the method of the present invention are stored in lyophilized form before use to maintain their expression ability. In use, this lyophilized material is reconverted to the solution form using a suitable buffer.
Хотя имеется большой диапазон культуральных сред, доступных на рынке, которые могут эффективно использоваться, стадию ферментации в соответствии с данным изобретением предпочтительно проводят в среде, не содержащей какого-либо материала животного или человеческого происхождения во избежание любого риска инфекции. Дрожжевые экстракты (Difco), добавляемые с одним или несколькими подходящими антибиотиками, представляют наиболее подходящее средство для этого способа. В предпочтительном варианте используют среду, которая была получена смешиванием в стерильных условиях первого раствора (А), содержащего дрожжевые экстракты, глицерин и сульфат аммония, со вторым раствором (В), содержащим фосфатный буфер. Затем эту смесь объединяют с ампициллином и хлорамфениколом или эквивалентными антибиотиками. Подходящие концентрации антибиотиков равны 50-300 мкг/мл ампициллина, предпочтительно 100-200 мкг/мл, и 10-100 мкг/мл хлорамфеникола, предпочтительно 30-40 мкг/мл.Although there is a wide range of culture media available on the market that can be used efficiently, the fermentation step of the invention is preferably carried out in an environment that does not contain any material of animal or human origin to avoid any risk of infection. Yeast extracts (Difco) added with one or more suitable antibiotics are the most suitable remedy for this method. In a preferred embodiment, a medium is used that has been prepared by sterile mixing of the first solution (A) containing yeast extracts, glycerin and ammonium sulfate with a second solution (B) containing phosphate buffer. This mixture is then combined with ampicillin and chloramphenicol or equivalent antibiotics. Suitable antibiotic concentrations are 50-300 μg / ml ampicillin, preferably 100-200 μg / ml, and 10-100 μg / ml chloramphenicol, preferably 30-40 μg / ml.
Стадии ферментации может предшествовать стадия прединокулята, где лиофилизированный микроорганизм суспендируют в среде и подвергают последовательным стадиям инкубирования и разбавления, нацеленным на то, чтобы иметь в культуре оптимальное количество клеток микроорганизма. Предпочтительно, микроорганизм инкубируют в течение одной ночи при 37°С, затем разбавляют и снова инкубируют в течение нескольких часов. Затем выбранный объем прединокулята центрифугируют, суспендируют снова в культуральном растворе, обогащенном ампициллином, и инокулируют в ферментационный сосуд для стадии ферментации.The fermentation step may be preceded by a pre-inoculum step, where the lyophilized microorganism is suspended in the medium and subjected to successive incubation and dilution steps aimed at having the optimal number of microorganism cells in the culture. Preferably, the microorganism is incubated for one night at 37 ° C, then diluted and incubated again for several hours. Then, the selected volume of the pre-inoculum is centrifuged, resuspended in a culture solution enriched in ampicillin, and inoculated into a fermentation vessel for the fermentation step.
Ферментацию проводят в описанной выше среде, дополненной ампициллином и хлорамфениколом, при температуре, подходящей для данного микроорганизма, обычно при приблизительно 37°С, в присутствии процентного содержания растворенного O2, относительно насыщения воздухом, от 20% до 40%, предпочтительно 30%. рН во время ферментации поддерживают при нейтральной или слабокислой величинах (6,4-7,4). Кроме того, поскольку процесс ферментации протекает при перемешивании, предпочтительно должны использоваться противовспенивающие средства (пеногасители).Fermentation is carried out in the medium described above, supplemented with ampicillin and chloramphenicol, at a temperature suitable for the microorganism, usually at about 37 ° C, in the presence of a percentage of dissolved O 2 relative to air saturation, from 20% to 40%, preferably 30%. The pH during fermentation is maintained at neutral or slightly acidic values (6.4-7.4). In addition, since the fermentation process proceeds with stirring, antifoaming agents (antifoam agents) should preferably be used.
Протекание ферментации сопровождается увеличением оптической плотности среды. По этой причине оптическая плотность является параметром, используемым в соответствии с данным изобретением для мониторинга степени протекания ферментации. Особенно подходящим является снятие показаний при 600 нм.The course of fermentation is accompanied by an increase in the optical density of the medium. For this reason, optical density is a parameter used in accordance with this invention to monitor the degree of progression of fermentation. Particularly suitable is a reading at 600 nm.
Существенным признаком данного изобретения является высокая плотность клеток, достигаемая в культуре в момент индукции экспрессии. Оптические плотности при 600 нм (OD600) 1-50 могут достигаться благодаря использованию культуральной среды данного изобретения. Однако предпочтительными являются плотности, более высокие, чем 18, для получения высоких уровней продуктивности, типичных для заявленного способа. Плотности между 16 и 20 являются особенно предпочтительными для индукции продуцирующего бактериального штамма и получения оптимальных результатов. Таким образом, ферментацию поддерживают при вышеуказанных условиях, пока не будут достигнуты такие величины оптической плотности, затем приступают к индукции экспрессии белка.An essential feature of this invention is the high cell density achieved in the culture at the time of expression induction. Optical densities at 600 nm (OD600) 1-50 can be achieved by using the culture medium of this invention. However, densities higher than 18 are preferred to obtain high levels of productivity typical of the claimed process. Densities between 16 and 20 are particularly preferred for inducing a producing bacterial strain and obtaining optimal results. Thus, fermentation is maintained under the above conditions until such optical density values are reached, then they proceed to induce protein expression.
Любой агент или любое химико-физическое условие, способные индуцировать в клетках используемого микроорганизма аппарат экспрессии гетерологичного белка, могут быть использованы выгодным образом. В конкретном случае, когда используют бактериальный штамм BL21(DE3)pLysS, модифицированный экспрессионной плазмидой, содержащей промотор фага Т7, экспрессию индуцируют лактозой или ее производными, такими как изопропил-β-тиогалактопиранозид (IPTG), в подходящей концентрации, а именно, приблизительно 1 мМ. Продолжительность индукции может варьироваться по необходимости. Хорошие результаты получают в течение периодов нескольких часов, предпочтительно 3-4 ч; в оптимальном процессе индукцию поддерживают в течение 3 ч и 20 мин с использованием процентного содержания растворенного О2 приблизительно 10%.Any agent or any chemical-physical condition capable of inducing a heterologous protein expression apparatus in the cells of the microorganism used can be advantageously used. In a specific case, when the bacterial strain BL21 (DE3) pLysS is used, modified with an expression plasmid containing the T7 phage promoter, expression is induced by lactose or its derivatives, such as isopropyl-β-thiogalactopyranoside (IPTG), at a suitable concentration, namely, approximately 1 mm. The duration of induction may vary as needed. Good results are obtained over periods of several hours, preferably 3-4 hours; in an optimal process, induction is maintained for 3 hours and 20 minutes using a percentage of dissolved O 2 of approximately 10%.
Пробы клеток берут до и после индукции и подвергают аналитическим способам контроля, таким как электрофорез в ДСН-ПААГ, для определения результата индукции.Cell samples are taken before and after induction and subjected to analytical control methods, such as SDS-PAGE electrophoresis, to determine the result of induction.
Когда экспрессия белка достигает желаемых уровней, культуру центрифугируют и клетки перемещают на следующую стадию.When protein expression reaches the desired levels, the culture is centrifuged and the cells are transferred to the next stage.
Стадия II: Экстракция и очисткаStage II: Extraction and purification
Экспрессируемый гетерологичный белок в бактериальной клетке сегрегирует внутри самой клетки в форме телец включения. Таким образом, способ данного изобретения обеспечивает проведение лизиса этих клеток, разрушения экстрагированного материала нуклеиновых кислот (ДНК) и извлечения и промывания этих телец включения.The expressed heterologous protein in the bacterial cell segregates within the cell itself in the form of inclusion bodies. Thus, the method of this invention provides for the lysis of these cells, the destruction of the extracted material of nucleic acids (DNA) and the extraction and washing of these inclusion bodies.
Клетки промывают, хотя это и не является обязательным, и суспендируют в растворах, содержащих эмульгирующие агенты в подходящей концентрации, предпочтительно Тритон Х100 в концентрациях 0,5-1%, затем их подвергают лизису клеточной мембраны. Процесс лизиса может осуществляться посредством замораживания/оттаивания, с использованием пресса Френча, обработки ультразвуком или других подобных известных способов. Однако предпочтительным способом для бактериального штамма BL21(DE3)pLysS является способ замораживания/оттаивания, который в наиболее предпочтительном варианте повторяют, по меньшей мере, в течение двух последовательных циклов. После механического лизиса стадию лизиса продолжают в течение нескольких минут в лизирующем растворе при комнатной температуре при перемешивании.Cells are washed, although not required, and suspended in solutions containing emulsifying agents in a suitable concentration, preferably Triton X100 in concentrations of 0.5-1%, then they are subjected to lysis of the cell membrane. The lysis process can be carried out by freezing / thawing, using a French press, sonication or other similar known methods. However, the preferred method for the bacterial strain BL21 (DE3) pLysS is the freeze / thaw method, which is most preferably repeated for at least two consecutive cycles. After mechanical lysis, the lysis step is continued for several minutes in a lysis solution at room temperature with stirring.
Высвобождение в среду для лизиса телец включения сопровождается высвобождением различных компонентов и клеточных веществ микроорганизма, прежде всего нуклеиновых материалов. Эти вещества могли бы мешать последующему процессу очистки белка или подвергнуть его риску. Таким образом, суспензию/раствор, полученные посредством лизиса, подвергают разрушению такого нуклеинового материала, в частности ДНК, с использованием ферментативных агентов, таких как ДНКаза (природная или рекомбинантная, такая как бензоназа), химических агентов, таких как дезоксихолевая кислота, или физико-механических агентов, таких как обработка ультразвуком или интенсивное перемешивание посредством лопастей (ножей), например, в миксере. Разрушение ДНК, проводимое, например, в миксере, проводят на лизированных клетках, ресуспендированных в подходящих объемах промывочных растворов, содержащих хелатообразователи и детергенты, например ЭДТА и Тритон X100. Предпочтительно, его повторяют в течение нескольких циклов, предпочтительно 2, чередующихся со стадиями разбавления в промывочном растворе, центрифугирования и отбрасывания супернатанта для удаления компонентов и клеточных веществ из фракции, содержащей тельца включения.The release of inclusion bodies into the lysis medium is accompanied by the release of various components and cellular substances of the microorganism, primarily nucleic materials. These substances could interfere with the subsequent protein purification process or put it at risk. Thus, the suspension / solution obtained by lysis is subjected to the destruction of such nucleic material, in particular DNA, using enzymatic agents such as DNase (natural or recombinant, such as benzonase), chemical agents, such as deoxycholic acid, or physico- mechanical agents, such as sonication or vigorous mixing by means of blades (knives), for example, in a mixer. DNA destruction, carried out, for example, in a mixer, is carried out on lysed cells resuspended in suitable volumes of washing solutions containing chelating agents and detergents, for example EDTA and Triton X100. Preferably, it is repeated for several cycles, preferably 2, alternating with the steps of dilution in the wash solution, centrifugation and discarding the supernatant to remove components and cellular substances from the fraction containing inclusion bodies.
Стадия III: Ренатурация (повторная укладка) белкаStage III: Renaturation (re-laying) protein
Затем фракцию, содержащую очищенные тельца включения PLGF-1, солюбилизируют в денатурирующем буфере, содержащем известные денатурирующие агенты, такие как мочевина, изотиоцианат гуанидина, гидрохлорид гуанидина. Предпочтительно, раствор денатурирующего агента является раствором мочевины в денатурирующей концентрации, например, 8М. Для ускорения процесса солюбилизации эта фракция может быть подвергнута гомогенизации или обработке ультразвуком. После солюбилизации телец включения раствор разбавляют тем же самым денатурирующим буфером до получения оптической плотности, измеряемой при 280 нм, приблизительно 0,8 (OD280 0,8). Затем этот раствор дополнительно разбавляют буфером для разбавления до OD280 0,5. Подходящие растворы для разбавления содержат соли и полиэтиленгликоль (ПЭГ) и имеют щелочной рН (приблизительно 8). Ренатурацию белка PLGF-1 в разбавленном растворе получают добавлением к этому раствору подходящих концентраций окислительных/восстановительных пар с последующим инкубированием в течение 10-30 ч, предпочтительно 18-20 ч при температуре 10°С-30°С, предпочтительно 20°С, при перемешивании. Примерами таких пар являются: цистин/цистеин, цистамин/цистеамин, 2-гидроксиэтилдисульфид/2-меркаптоэтанол. Предпочтительным примером окислительной/восстановительной пары является глутатион в его окисленной и восстановленной формах, соответственно в концентрациях 0,1 мМ - 2,5 мМ (предпочтительно 0,5 мМ) и 0,25 мМ - 6,25 мМ (предпочтительно 1,25 мМ). Посредством ренатурации белок PLGF-1, экспрессируемый по существу в мономерной форме, частично переводится в димерную форму (фиг.5).The fraction containing purified PLGF-1 inclusion bodies is then solubilized in a denaturing buffer containing known denaturing agents such as urea, guanidine isothiocyanate, guanidine hydrochloride. Preferably, the denaturing agent solution is a urea solution in a denaturing concentration, for example, 8M. To speed up the solubilization process, this fraction can be homogenized or sonicated. After solubilization of the inclusion bodies, the solution is diluted with the same denaturing buffer until the optical density, measured at 280 nm, is approximately 0.8 (OD280 0.8). Then this solution is further diluted with dilution buffer to OD280 0.5. Suitable dilution solutions contain salts and polyethylene glycol (PEG) and have an alkaline pH (approximately 8). Renaturation of PLGF-1 protein in a dilute solution is obtained by adding to this solution suitable concentrations of oxidation / reduction pairs, followed by incubation for 10-30 hours, preferably 18-20 hours, at a temperature of 10 ° -30 ° C, preferably 20 ° C, stirring. Examples of such pairs are: cystine / cysteine, cystamine / cysteamine, 2-hydroxyethyl disulfide / 2-mercaptoethanol. A preferred example of an oxidation / reduction pair is glutathione in its oxidized and reduced forms, respectively, at concentrations of 0.1 mM - 2.5 mM (preferably 0.5 mM) and 0.25 mM - 6.25 mM (preferably 1.25 mM ) By renaturation, the PLGF-1 protein expressed essentially in the monomeric form is partially converted to the dimeric form (FIG. 5).
Стадия IV: анионообменная хроматографияStage IV: Anion Exchange Chromatography
Раствор, полученный на предыдущей стадии, предпочтительно прошедший центрифугирование и/или фильтрование и содержащий белок в основном в мономерной и частично димерной форме, наносят на анионообменную смолу для обогащения этой смеси димерной формой и для очистки его от бактериальных примесей. Любой коммерчески доступный носитель, пригодный для анионообменной хроматографии, может быть также использован в той мере, при какой его свойства емкости, нагрузки и скорости тока являются сходными с этими свойствами смолы Q Sepharose Fast Flow (Amersham biosciences), не говоря уже о его пригодности для промышленного процесса. В предпочтительном варианте используют смолу с высокой скоростью тока, например, Q Sepharose Fast Flow (Amersham biosciences) или ее эквивалент. Смолу промывают и уравновешивают растворами, имеющими низкую ионную силу. Пример такого раствора включает в себя этаноламин-HCl рН 8,5 с низким содержанием соли или без соли. Тот же самый раствор может быть использован для нанесения абсорбции и промывания белковой смеси, которая должна быть очищена. Применяемые смолы позволяют наносить большие объемы раствора белка с отношениями нанесенный объем/объем колонки, варьирующими от 1:1 до 10:1. Отношения об./об., близкие к 10:1, являются предпочтительными, так как они позволяют оптимизировать использование колонки. Однако следует избегать более высоких отношений, чем 10:1, так как, вследствие насыщения адсорбционной емкости этого матрикса, они приводят к большой потере димерной формы этого белка.The solution obtained in the previous step, preferably subjected to centrifugation and / or filtration and containing the protein mainly in monomeric and partially dimeric form, is applied to the anion exchange resin to enrich this mixture with the dimeric form and to clean it of bacterial impurities. Any commercially available carrier suitable for anion exchange chromatography can also be used to the extent that its capacitance, load and current velocity properties are similar to those of Q Sepharose Fast Flow resin (Amersham biosciences), not to mention its suitability for industrial process. In a preferred embodiment, a resin with a high current rate is used, for example, Q Sepharose Fast Flow (Amersham biosciences) or its equivalent. The resin is washed and equilibrated with solutions having a low ionic strength. An example of such a solution includes ethanolamine-HCl pH 8.5 with low salt content or without salt. The same solution can be used to apply the absorption and wash the protein mixture that needs to be cleaned. The resins used make it possible to apply large volumes of protein solution with the applied volume / column volume ratios ranging from 1: 1 to 10: 1. V / v ratios close to 10: 1 are preferred since they optimize column usage. However, higher ratios than 10: 1 should be avoided, since, due to saturation of the adsorption capacity of this matrix, they lead to a large loss of the dimeric form of this protein.
Тогда как белок PLGF-1 в мономерной форме уже фильтруется на стадиях промывания при низкой ионной силе, элюцию димерной и мультимерной форм получают увеличением ионной силы исходного раствора. Такое увеличение получают смешиванием уравновешивающего раствора с увеличивающимися и заранее определенными в процентах количествами второго раствора, содержащего 1М NaCl. В предпочтительном варианте белок в димерной форме элюируют растворами, содержащими 15-25% 1М раствора NaCl, что соответствует концентрации NaCl 150-250 мМ. В наилучшем варианте этот белок элюируют в изократических условиях при концентрации NaCl 200 мМ. Элюцию различных форм автоматически регистрируют путем измерения оптической плотности при 280 нм (фиг. 2). Затем собранные фракции, содержащие белок PLGF-1 в димерной форме, контролируют электрофорезом в ДСН-ПААГ (фиг.5). Предпочтительно, весь процесс хроматографии проводят автоматически с использованием компьютеризованной системы, работающей под контролем подходящей программы, например, Software FPCL Director system (Amersham biosciences).While PLGF-1 protein in monomeric form is already filtered at the washing stages at low ionic strength, elution of the dimeric and multimeric forms is obtained by increasing the ionic strength of the initial solution. This increase is obtained by mixing a balancing solution with increasing and predetermined percentages of a second solution containing 1 M NaCl. In a preferred embodiment, the protein in dimeric form is eluted with solutions containing 15-25% of a 1 M NaCl solution, which corresponds to a NaCl concentration of 150-250 mM. In the best case, this protein is eluted under isocratic conditions at a NaCl concentration of 200 mM. Elution of various forms is automatically recorded by measuring the optical density at 280 nm (Fig. 2). Then, the collected fractions containing the PLGF-1 protein in dimeric form were monitored by SDS-PAGE electrophoresis (Fig. 5). Preferably, the entire chromatography process is carried out automatically using a computerized system that is controlled by a suitable program, for example, the Software FPCL Director system (Amersham biosciences).
Стадия V: Обращенно-фазовая хроматографияStage V: Reverse phase chromatography
Фракции, полученные на предыдущей стадии, содержащие белок PLGF-1, обогащенный активными формами, собирают, разбавляют подходящим буфером и наносят на обращенно-фазовую хроматографическую колонку для дополнительной очистки этого белка в активной форме. Количество наносимого раствора соответствует OD280 4,5-5,5 на миллилитр хроматографического матрикса. Такие количества должны рассматриваться как максимальные количества.The fractions obtained in the previous step containing the PLGF-1 protein enriched in active forms are collected, diluted with a suitable buffer and applied to a reverse phase chromatographic column to further purify the protein in active form. The amount of solution applied corresponds to OD280 4.5-5.5 per milliliter of chromatographic matrix. Such quantities should be considered as maximum quantities.
Любой коммерчески доступный хроматографический матрикс, подходящий для предполагаемого применения, может быть использован в той мере, в которой его свойства адсорбционной емкости и скорости тока являются совместимыми с требованиями данного процесса. В предпочтительном варианте используют смолу, имеющую такие размеры гранул, которые гарантируют наилучшую эксплуатацию адсорбционной способности вместе с легкостью упаковки самой колонки. Примерами таких матриксов являются смолы RP Source 15 или RP Source 30 (Amersham biosciences). Все растворы для уравновешивания, нанесения, промывания смолы и элюции являются водно-органическими растворами, содержащими различные процентные количества органического растворителя. Примерами таких растворов являются растворы, содержащие этанол, метанол или ацетонитрил. Предпочтительно, используют водно-органические растворы, содержащие увеличивающиеся процентные количества этанола. В варианте данного изобретения смешивают подходящие количества двух буферных растворов, первый из которых содержит буфер А, т.е. 40% этанол и 0,1% ТФУ (трифторуксусную кислоту), а последний содержит буфер В, т.е. 70% этанол и 0,1% ТФУ.Any commercially available chromatographic matrix suitable for the intended application can be used to the extent that its adsorption capacity and current rate properties are compatible with the requirements of this process. In a preferred embodiment, a resin having granule sizes such as to guarantee the best exploitation of adsorption capacity along with ease of packing of the column itself is used. Examples of such matrices are RP Source 15 or
Затем белковый материал, нанесенный на смолу и должным образом промытый, элюируют с использованием процесса элюции, включающего в себя две последовательные стадии, в которых используют элюирующие растворы, содержащие увеличивающийся градиент органического растворителя. Первую стадию выполняют в условиях возрастающего градиента органического растворителя до получения пика элюции мономерной формы. Такой градиент получают добавлением буфера В к буферу А в процентах от 4% до 40%, с увеличением доли буфера В на 3% на каждый элюированный колоночный объем. Как только появляется пик элюции, соответствующий мономерной форме белка, элюцию продолжают в изократических условиях до истощения пика элюции мономерной формы. Установленные таким образом изократические условия делают возможным наибольшее возможное разделение хроматографических пиков, соответствующих двум мономерной и димерной формам, и далее наилучшее получаемое разделение для процесса промышленного, а не аналитического типа. Вторую стадию проводят снова в условиях увеличивающегося градиента органического растворителя до полной элюции белка в основном в димерной форме. На этой второй стадии градиент получают добавлением буфера В к буферу А в процентном количестве от 10% до 100%, с увеличением доли буфера В на 40,9% на каждый элюированный колоночный объем. Элюцию различных форм белка PLGF-1 регистрируют автоматически путем измерения оптической плотности при 280 нм (фиг.3 и фиг.4). Затем собранные фракции, содержащие белок PLGF-1 в основном в димерной форме, контролируют электрофорезом в ДСН-ПААГ (фигура 5). Предпочтительно, весь процесс обращенно-фазовой хроматографии проводят автоматически с использованием компьютеризованной системы, работающей под контролем подходящей программы, например, Software FPCL Director system (Amersham biosciences).Then, the protein material deposited on the resin and properly washed is eluted using an elution process that includes two successive steps in which elution solutions containing an increasing gradient of an organic solvent are used. The first stage is carried out under conditions of an increasing gradient of an organic solvent until a peak of elution of the monomeric form is obtained. Such a gradient is obtained by adding buffer B to buffer A as a percentage from 4% to 40%, with an increase in the proportion of buffer B by 3% for each eluted column volume. As soon as the elution peak corresponding to the monomeric form of the protein appears, the elution is continued under isocratic conditions until the elution peak of the monomer form is depleted. The isocratic conditions established in this way make possible the greatest possible separation of chromatographic peaks corresponding to two monomeric and dimeric forms, and then the best obtained separation for a process of industrial rather than analytical type. The second stage is carried out again under conditions of an increasing gradient of the organic solvent until the protein is completely eluted mainly in the dimeric form. In this second step, a gradient is obtained by adding buffer B to buffer A in a percentage of 10% to 100%, with a 40.9% increase in the proportion of buffer B for each eluted column volume. Elution of various forms of PLGF-1 protein is recorded automatically by measuring the optical density at 280 nm (FIG. 3 and FIG. 4). Then the collected fractions containing the PLGF-1 protein mainly in the dimeric form are monitored by SDS-PAGE electrophoresis (Figure 5). Preferably, the entire reverse phase chromatography process is carried out automatically using a computerized system operating under the supervision of a suitable program, for example, the Software FPCL Director system (Amersham biosciences).
Результаты электрофореза показывают, что белок PLGF-1, полученный на второй стадии обращенно-фазовой хроматографии, является высокоочищенной активной формой, а именно, он содержит белок в димерной и частично мультимерной форме, но по существу не содержит какого-либо загрязнения мономерной формой. Полученный таким образом продукт содержит не менее, чем 98,5%, активной формы, предпочтительно не менее, чем 99,5%, где не менее чем 70%, находится в димерной форме. Остаток мономерной формы составляет не более чем 1,5%. Этот белок в активной форме получают в средних количествах 160 мг на литр бактериальной культуры. Чистый белок, полученный в соответствии с описанным выше способом, может быть подвергнут дополнительным стадиям обработки, таким как ультрафильтрация на мембране. В этом случае продукт фильтруют на мембране, имеющей предел пропускания по молекулярной массе более низкий, чем 30 кДа, или равный 30 кДа, и его подвергают диафильтрации против подкисленной ТФУ воды до получения коэффициента разбавления 1:106. Полученный таким образом конечный продукт может быть должным образом составлен в смесь с добавками для лиофилизации и лиофилизирован для сохранения его наилучшей биологической активности.Electrophoresis results show that the PLGF-1 protein obtained in the second stage of reverse phase chromatography is a highly purified active form, namely, it contains the protein in dimeric and partially multimeric form, but essentially does not contain any contamination of the monomeric form. Thus obtained product contains not less than 98.5%, active form, preferably not less than 99.5%, where not less than 70%, is in dimeric form. The remainder of the monomeric form is not more than 1.5%. This protein in active form is obtained in average quantities of 160 mg per liter of bacterial culture. Pure protein obtained in accordance with the method described above can be subjected to additional processing steps, such as ultrafiltration on the membrane. In this case, the product is filtered on a membrane having a molecular weight transmittance lower than 30 kDa or equal to 30 kDa, and it is diafiltered against acidified TFA water to obtain a dilution ratio of 1: 106. The final product thus obtained can be properly mixed with lyophilization additives and lyophilized to maintain its best biological activity.
Далее данное изобретение описывается с использованием примеров, имеющих, однако, только иллюстративные, а не ограничительные цели.The invention will now be described using examples having, however, only illustrative and not restrictive purposes.
Пример 1: ФерментацияExample 1: Fermentation
Следующая процедура относится к способу ферментации и индукции генетически модифицированного микроорганизма (MOGM) [B12(DE3)pLysS PLGF-1] в ферментационном сосуде с использованием 1 мМ IPTG.The following procedure relates to a method for fermentation and induction of a genetically modified microorganism (MOGM) [B12 (DE3) pLysS PLGF-1] in a fermentation vessel using 1 mM IPTG.
Материалы:Materials:
Раствор SBM, содержащий:SBM solution containing:
Раствор А (на 1 л)Solution A (per 1 L)
Раствор В (10 X) (на 100 мл)Solution B (10 X) (per 100 ml)
Растворы А и В автоклавируют по отдельности и смешивают перед использованием в стерильных условиях. Альтернативно, растворы А и В смешивают и фильтруют в стерильных условиях.Solutions A and B are autoclaved separately and mixed before use under sterile conditions. Alternatively, solutions A and B are mixed and filtered under sterile conditions.
200 мМ IPTG (200X) получают растворением 5 г чистого вещества в 100 мл дистиллированной воды. Раствор фильтруют с использованием фильтров 0,22 мкм, делят на аликвоты и замораживают при -20°С.200 mM IPTG (200X) is prepared by dissolving 5 g of pure material in 100 ml of distilled water. The solution is filtered using 0.22 μm filters, divided into aliquots and frozen at -20 ° C.
Используемым пеногасителем является Antifoam 0-10 (несиликоновый) фирмы Sigma, Cat A-8207.The antifoam used is Antifoam 0-10 (non-silicone) from Sigma, Cat A-8207.
Используемым бактериальным штаммом является [B12(DE3)pLysS PLGF-1 WCB] (working cell bank).The bacterial strain used is [B12 (DE3) pLysS PLGF-1 WCB] (working cell bank).
Прединокулят: Берут пробирку с лифилизированным генетически модифицированным микроорганизмом (MOGM) и суспендируют в 1 мл SBM +100 мкг/мл ампициллина +34 мкг/мл хлорамфеникола.Preinoculum: Take a tube with a lyfilized genetically modified microorganism (MOGM) tube and suspend it in 1 ml SBM +100 μg / ml ampicillin +34 μg / ml chloramphenicol.
Эту суспензию разбавляют в 30 мл SBM +100 мкг/мл ампициллина +34 мкг/мл хлорамфеникола.This suspension is diluted in 30 ml SBM +100 μg / ml ampicillin +34 μg / ml chloramphenicol.
Суспензию инкубируют при 37°С в течение одной ночи (O/N). На следующий день 30 мл ночной (O/N) культуры разбавляют в 800 мл SBM +100 мкг/мл ампициллина +34 мкг/мл хлорамфеникола и этот объем разделяют на 4 колбы Эрленмейера на 1 л, причем каждая содержит 200 мл.The suspension is incubated at 37 ° C for one night (O / N). The next day, 30 ml of overnight (O / N) culture was diluted in 800 ml of SBM +100 μg / ml ampicillin +34 μg / ml chloramphenicol and this volume was divided into 4 Erlenmeyer flasks per 1 l, each containing 200 ml.
Содержимое каждой колбы инкубируют при 37°С в течение 24 ч. Содержимое 4 колб смешивают и снимают показатели OD600 после разбавления 1/20 в воде (50 мкл +950 мкл воды).The contents of each flask are incubated at 37 ° C for 24 hours. The contents of 4 flasks are mixed and the OD600 values are taken after
Затем установленный объем прединокулята центрифугируют в течение 10 минут при 7500×g при 4°С в стерильных пробирках.Then the set volume of the preinoculum is centrifuged for 10 minutes at 7500 × g at 4 ° C in sterile tubes.
Затем бактерии ресуспендируют в 20 мл SBM +200 мкг/мл ампициллина +10 мкг/мл хлорамфеникола на каждый литр ферментации путем перемешивания при 420 об/мин при комнатной температуре в течение 20 мин. Одновременно готовят ферментационный сосуд и калибруют кислородные датчики.Then the bacteria are resuspended in 20 ml SBM +200 μg / ml ampicillin + 10 μg / ml chloramphenicol for each liter of fermentation by stirring at 420 rpm at room temperature for 20 minutes. At the same time, a fermentation vessel is prepared and oxygen sensors are calibrated.
Кислородные датчики калибруют при температуре 37°С при 0% путем насыщения азотом, затем при 100% путем насыщения воздухом без пеногасителя при перемешивании при 600 об/мин.Oxygen sensors are calibrated at 37 ° C at 0% by saturation with nitrogen, then at 100% by saturation with air without antifoam while stirring at 600 rpm.
Ферментацию проводят в следующих экспериментальных условиях:Fermentation is carried out under the following experimental conditions:
Среда: SBM +200 мкг/мл ампициллина +10 мкг/мл хлорамфениколаMedium: SBM +200 μg / ml ampicillin +10 μg / ml chloramphenicol
Температура: 37°СTemperature: 37 ° C
% растворенного О2: 30% (относительно насыщения воздухом)% dissolved O 2 : 30% (relative to air saturation)
рН: 6,4-7,4pH: 6.4-7.4
Пеногаситель: разбавленный 1:10 в воде; сильное перемешивание перед его добавлением в количествах 140 мкл на 750 мл среды.Antifoam: diluted 1:10 in water; vigorous stirring before adding it in quantities of 140 μl per 750 ml of medium.
Индукция:Induction:
Индукцию проводят в следующих экспериментальных условиях:Induction is carried out under the following experimental conditions:
OD600 индукции: 16-20.OD600 induction: 16-20.
Индуцирующий агент: IPTG в конечной концентрации 1 мМ.Inducing agent: IPTG at a final concentration of 1 mM.
% растворенного О2: 10% (относительно насыщения воздухом).% dissolved O 2 : 10% (relative to air saturation).
Продолжительность индукции: 3 ч и 20 мин.Duration of induction: 3 hours and 20 minutes.
Непосредственно перед индукцией отбирают 20 мкл бактерий, добавляют в 80 мкл воды и хранят для контроля прединдукции.Immediately prior to induction, 20 μl of bacteria was collected, added to 80 μl of water and stored to control pre-induction.
В момент индукции добавляют IPTG до конечной концентрации 1 мМ.At the time of induction, IPTG is added to a final concentration of 1 mM.
Процентное содержание растворенного O2 доводят до 10%.The percentage of dissolved O 2 was adjusted to 10%.
В конце индукции измеряют конечные показатели OD600 и измеряют общий объем.At the end of induction, the final OD600 values are measured and the total volume is measured.
Затем отбирают 10 мкл бактерий, добавляют в 90 мкл воды и хранят для постиндукционного контроля.Then, 10 μl of bacteria was collected, added to 90 μl of water and stored for post-induction control.
Индукцию контролируют при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ путем нанесения 20 мкл двух предварительно прокипяченных образцов.Induction is monitored by SDS-PAGE by electrophoresis by applying 20 μl of two pre-boiled samples.
Затем среду, содержащую индуцированные бактерии, центрифугируют при 7500×g в течение 10 мин или при 3000×g в течение 25 мин при 4°С и супернатант отбрасывают.Then, the medium containing the induced bacteria is centrifuged at 7500 × g for 10 min or at 3000 × g for 25 min at 4 ° C and the supernatant is discarded.
Результаты: Результаты индукции контролируют электрофорезом в ДСН-ПААГ, как показано на фиг.1.Results: Induction results are monitored by SDS-PAGE electrophoresis, as shown in FIG.
Пример 2: Экстракция и очистка телец включения.Example 2: Extraction and purification of inclusion bodies.
Следующая процедура относится к получению и повторной укладке (рефолдингу) телец включения PLGF-1. Посредством повторной укладки бактериальный белок PLGF-1 частично возвращают обратно в димерную форму.The following procedure relates to the production and re-laying (refolding) of inclusion bodies of PLGF-1. By re-folding, the bacterial protein PLGF-1 is partially returned back to the dimeric form.
Материал:Material:
Миксер с подходящей емкостью.Mixer with suitable capacity.
Лизирующий раствор: 1 мМ MgSO4+20 мМ Трис-HCl рН 8+1% Тритон X100.Lysis solution: 1 mM MgSO 4 +20 mM Tris-
Промывочный раствор: 0,5% Тритон X100+10 мМ ЭДТА рН 8.Wash Solution: 0.5% Triton X100 + 10
BD (денатурирующий буфер): 8 М мочевина, 50 мМ Трис рН 8, 20 мМ этилендиамин.BD (denaturing buffer): 8 M urea, 50
Растворение и доведение до объема в Н2О.Dissolution and bringing to volume in H 2 O.
Окисленный глутатион 200х: 100 мМ в Н2O.Oxidized Glutathione 200x: 100 mM in H 2 O.
Восстановленный глутатион 200х: 250 мМ в Н2О.Reduced glutathione 200x: 250 mM in H 2 O.
Буфер для разбавления: 600 мкМ (конечная концентрация) ПЭГ 4000 (2,4 г/л), 50 мМ Трис-HCl рН 8, 20 мМ NaCl.Dilution buffer: 600 μM (final concentration) PEG 4000 (2.4 g / l), 50 mM Tris-
Пеногаситель: Antifoam O-10 (несиликоновый) фирмы Sigma.Defoamer: Antifoam O-10 (non-silicone) by Sigma.
Получение телец включения PLGF-1.Obtaining Taurus inclusion PLGF-1.
Лизирующий и промывочный растворы уравновешивают при комнатной температуре (RT).Lysis and wash solutions are equilibrated at room temperature (RT).
Проводят два цикла замораживания/оттаивания при -80/37°С.Spend two cycles of freezing / thawing at -80 / 37 ° C.
Осадок бактерий лизируют в 1 мл лизирующего раствора на каждые 450 OD600 бактерий.Bacterial sediment is lysed in 1 ml of lysis solution for every 450 OD600 of bacteria.
Затем инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин при перемешивании (250 об/мин).Then incubated at room temperature for 30 min with stirring (250 rpm).
Этот раствор выливают в миксер с подходящей емкостью и добавляют количество промывочного раствора 3 мл на каждые добавленные 450 OD600 бактерий.This solution was poured into a mixer with a suitable container and a 3 ml wash solution was added for every 450 OD600 bacteria added.
Если необходимо, добавляют 0,4 мкл неразбавленного пеногасителя на каждый миллилитр пробы.If necessary, add 0.4 μl of undiluted antifoam per milliliter of sample.
Раствор перемешивают при максимальной скорости в течение 1 мин или до тех пор, пока проба не станет гомогенной.The solution is stirred at maximum speed for 1 min or until the sample becomes homogeneous.
Затем содержимое миксера переносят в контейнер с подходящей емкостью и добавляют 6,5 мл промывочного раствора на каждые 450 OD600 бактерий. Его инкубируют в течение 45 минут при комнатной температуре при перемешивании.The contents of the mixer are then transferred to a container with a suitable container and 6.5 ml of washing solution is added for every 450 OD600 of bacteria. It is incubated for 45 minutes at room temperature with stirring.
Полученную таким образом суспензию центрифугируют при 13000×g в течение 45 мин при 25°С и супернатант отбрасывают.The suspension thus obtained was centrifuged at 13,000 × g for 45 minutes at 25 ° C. and the supernatant was discarded.
Осевший осадок ресуспендируют в 4 мл промывочного раствора на каждые 450 OD600 бактерий и цикл в миксере повторяют второй раз.The settled precipitate was resuspended in 4 ml of washing solution for every 450 OD600 of bacteria and the cycle in the mixer was repeated a second time.
Эту суспензию переносят в контейнер с подходящей емкостью, разбавляют 6,5 мл промывочного раствора на каждые 450 OD600 и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре при перемешивании.This suspension is transferred to a container with a suitable container, diluted with 6.5 ml of washing solution for every 450 OD600 and incubated for 30 minutes at room temperature with stirring.
Затем повторяют центрифугирование при указанных выше условиях и супернатант отбрасывают.Then centrifugation is repeated under the above conditions and the supernatant is discarded.
Пример 3: Ренатурация белкаExample 3: Protein Renaturation
Тельца включения солюбилизируют в 7 мл денатурирующего буфера BD (содержащего 8М мочевину) и дополнительно разбавляют BD до получения OD280 0,8. Затем добавляют 0,6 объема буфера для разбавления для доведения конечной концентрации мочевины до 5М.Inclusion bodies are solubilized in 7 ml of BD denaturing buffer (containing 8M urea) and further diluted with BD to obtain an OD280 of 0.8. Then add 0.6 volumes of dilution buffer to bring the final urea concentration to 5M.
После этого добавляют 1/200 объема восстановленного глутатиона 200х (конечная концентрация 1,25 мМ) и 1/200 объема окисленного глутатиона 200х (конечная концентрация 0,5 мМ). Отбирают образец объемом 15 мкл для контроля (Prerefol) и затем этот раствор инкубируют при 20°С в течение 18-20 ч при перемешивании.Then add 1/200 volume of reduced glutathione 200x (final concentration of 1.25 mm) and 1/200 volume of oxidized glutathione 200x (final concentration of 0.5 mm). A sample volume of 15 μl was taken for control (Prerefol) and then this solution was incubated at 20 ° C for 18-20 hours with stirring.
В конце инкубирования среду центрифугируют в течение 10 минут при 20°С, 10000×g, фильтруют при помощи фильтров 0,45 или 0,8 мкм и отбирают пробу объемом 15 мкл для контроля (Postrefol).At the end of the incubation, the medium is centrifuged for 10 minutes at 20 ° C, 10,000 × g, filtered with 0.45 or 0.8 μm filters and a 15 μl sample is taken for control (Postrefol).
Результаты: Пробы по 15 мкл растворов перед повторной укладкой и после повторной укладки анализируют электрофорезом в ДСН-ПААГ (фиг.5).Results: Samples of 15 μl of solutions before re-laying and after re-laying are analyzed by SDS-PAGE by electrophoresis (Fig. 5).
Пример 4: Анионообменная хроматографияExample 4: Anion Exchange Chromatography
Следующая процедура относится к первой стадии очистки белка PLGF-1 после повторной укладки. После нанесения пробы на колонку будет наблюдаться высокая потеря неадсорбированного мономера PLGF-1. Нанесенное количество не должно превышать 10 объемов этой колонки, так как это могло бы вызывать значительную потерю димера PLGF-1.The following procedure relates to the first stage of purification of PLGF-1 protein after re-folding. After applying the sample to the column, a high loss of the non-adsorbed PLGF-1 monomer will be observed. The applied amount should not exceed 10 volumes of this column, since this could cause a significant loss of the PLGF-1 dimer.
Элюцию проводят в изократических условиях при 20% буфера В (см. ниже), что соответствует концентрации NaCl 200 мМ. Элюированный пик все еще содержит глутатион, использованный для повторной укладки, который вносит приблизительно 50% OD280.Elution is carried out under isocratic conditions at 20% buffer B (see below), which corresponds to a NaCl concentration of 200 mM. The eluted peak still contains re-styling glutathione, which contributes approximately 50% of OD280.
Материал и параметры:Material and parameters:
Система FPLC (жидкостная экспресс-хроматография белков): применяемая от фирмы Amersham biosciences, управляемая программой, называемой FPLC Director.FPLC (Rapid Liquid Protein Chromatography) system: Amersham biosciences software, managed by a program called FPLC Director.
Параметры регистрации:Registration Options:
УФ: Длина волны =280 нм; верхнее значение шкалы =2.UV: Wavelength = 280 nm; upper scale value = 2.
Температура: 20°С (минимум 15, максимум 25).Temperature: 20 ° С (minimum 15, maximum 25).
Смола: Q-Sepharose Fast Flow (Amersham biosciences).Resin: Q-Sepharose Fast Flow (Amersham biosciences).
Объем колонки/высота колонки: Объем: 1/10 объема образца, который должен быть нанесен; высота: между 13 и 16 см.Column volume / column height: Volume: 1/10 of the volume of the sample to be applied; height: between 13 and 16 cm.
Уравновешивание: 2 колоночных объема (КО) буфера В, затем 1,5 КО буфера А.Balancing: 2 column volumes (KO) of buffer B, then 1.5 KO of buffer A.
Образец: Ренатурированный, центрифугированный и/или отфильтрованный PLGF-1. Нанесение не более чем 10 КО.Sample: Renatured, centrifuged and / or filtered PLGF-1. Application no more than 10 KO.
Буфер А: 20 мМ этаноламин-HCl рН 8,5. Буфер В: Буфер А+1М NaCl.Buffer A: 20 mM ethanolamine-HCl pH 8.5. Buffer B: Buffer A + 1M NaCl.
Скорость нанесения: 1 см/мин (максимальная скорость, испытанная на малых колонках =1,887 см/мин; минимальная испытанная скорость =0,5 см/мин).Application speed: 1 cm / min (maximum speed tested on small columns = 1,887 cm / min; minimum tested speed = 0.5 cm / min).
Скорость элюции: 1 см/мин (максимальная скорость, испытанная на малых колонках =1,887 см/мин; минимальная испытанная скорость =0,5 см/мин).Elution rate: 1 cm / min (maximum speed tested on small columns = 1.887 cm / min; minimum tested speed = 0.5 cm / min).
Промывка после нанесения: 1,5 КО с 0% буфера В.Rinse after application: 1.5 KOs with 0% Buffer B.
Собранный пик: Пик, элюированный при изократических условиях при 20% буфера В, сходящий приблизительно в 3 КО.Collected peak: Peak eluted under isocratic conditions at 20% buffer B, converging at approximately 3 KO.
Конечная промывка: 2 КО при 100% В.Final flushing: 2 KO at 100% B.
Процедура:Procedure:
Пик, элюированный при изократических условиях при 20% буфера В, собирают, затем к нему добавляют 0,271 объема воды, 0,0045 объема ТФУ и 0,225 объема этанола. Таким путем проба разбавляется в 1,5 раза и содержит 15% этанол и 0,3% ТФУ. Добавление этих двух веществ облегчает связывание PLGF-1 с обращенно-фазовой колонкой (см. пример 5).The peak eluted under isocratic conditions at 20% buffer B was collected, then 0.271 volumes of water, 0.0045 volumes of TFA and 0.225 volumes of ethanol were added thereto. In this way, the sample is diluted 1.5 times and contains 15% ethanol and 0.3% TFU. The addition of these two substances facilitates the binding of PLGF-1 to a reversed-phase column (see Example 5).
Результаты: Стадию хроматографии непрерывно контролируют путем регистрации оптической плотности при 280 нм, как показано на фиг.2.Results: The chromatography step is continuously monitored by recording optical density at 280 nm, as shown in FIG.
Чистоту выделенного белкового материала анализируют с использованием электрофореза в ДСН-ПААГ (фиг.5).The purity of the isolated protein material was analyzed using SDS-PAGE electrophoresis (FIG. 5).
Пример 5: Обращенно-фазовая хроматографияExample 5: Reverse phase chromatography
Следующая процедура может быть проведена со смолой RP Source со средним диаметром частиц 15 микрон или 30 микрон. Однако смола RP Source 30 микрон, хотя и не приводит к какому-либо изменению в процессе очистки, делает возможным экономное сбережение самой смолы (приблизительно на 50%), большую легкость процедуры набивки колонки и более низкое противодавление.The following procedure can be carried out with RP Source resin with an average particle diameter of 15 microns or 30 microns. However, the RP Source resin of 30 microns, although it does not lead to any change in the cleaning process, makes it possible to economically save the resin itself (by approximately 50%), the ease of filling the column and the lower back pressure.
Эта процедура относится ко второй фазе очистки белка PLGF-1 после пропускания его через смолу QFF. Во время нанесения пробы наблюдают высокую оптическую плотность, которая соответствует неадсорбируемому пику глутатиона, который не связывается с этой смолой. Эта процедура состоит из двух подстадий, причем первую, называемую RPCmon, используют для удаления большей части мономерного компонента PLGF-1, тогда как последнюю используют для элюции по существу димерного компонента этого белка, и ее называют RPCdim.This procedure refers to the second phase of purification of PLGF-1 protein after passing it through a QFF resin. During application of the sample, a high optical density is observed, which corresponds to the non-adsorbed peak of glutathione, which does not bind to this resin. This procedure consists of two substages, the former, called RPCmon, used to remove most of the monomeric component of PLGF-1, while the latter is used to elute the essentially dimeric component of this protein, and it is called RPCdim.
Первая подстадия (RPCmon)First Sub-Stage (RPCmon)
Материал и параметры:Material and parameters:
Система FPLC: от фирмы Amersham biosciences, управляемая программой, называемой FPLC Director.FPLC system: from Amersham biosciences, managed by a program called FPLC Director.
Параметры регистрации:Registration Options:
УФ: Длина волны =280 нм; полная шкала =0,05.UV: Wavelength = 280 nm; full scale = 0.05.
Температура: 20°С (минимум 15, максимум 25).Temperature: 20 ° С (minimum 15, maximum 25).
Смола: Reverse Phase Source 30 (Amersham biosciences).Resin: Reverse Phase Source 30 (Amersham biosciences).
Объем колонки/высота колонки: Объем: 1/5-1/6 общего OD280 образца, который должен быть нанесен; высота: между 27 и 33 см.Column volume / column height: Volume: 1 / 5-1 / 6 of the total OD280 of the sample to be applied; height: between 27 and 33 cm.
Уравновешивание: 2 колоночных объема (КО) буфера В, затем 1,5 КО буфера А.Balancing: 2 column volumes (KO) of buffer B, then 1.5 KO of buffer A.
Образец: PLGF-1, полученный на предыдущей стадии (пример 4), разбавленный в 1,5 раза и содержащий 15% этанол и 0,3% ТФУ. Максимальное нанесение: 4,5-5,5 OD280 на мл смолы.Sample: PLGF-1 obtained in the previous step (Example 4), diluted 1.5 times and containing 15% ethanol and 0.3% TFA. Maximum application: 4.5-5.5 OD280 per ml resin.
Буфер А: 40% этанол +0,1% ТФУ.Buffer A: 40% ethanol + 0.1% TFA.
Буфер В: 70% этанол +0,1% ТФУ.Buffer B: 70% ethanol + 0.1% TFA.
Скорость нанесения: 1,887 см/мин.Application speed: 1,887 cm / min.
Скорость элюции: 1,887 см/мин.Elution Rate: 1.887 cm / min.
Промывка после нанесения: 1,5 КО с 4% буфера В.Rinse after application: 1.5 KO with 4% buffer B.
Пик мономеров: Градиент в пределах от 4 до 40% буфера В в 12 КО (3% буфера В/КО). Непосредственно после начала элюции пика, при достижении OD280 25% от полной шкалы, элюцию продолжают с использованием изократических условий с использованием концентрации буфера В, достигнутой в этот момент до завершения элюции этого пика (приблизительно 2,5-3,5 КО).Monomer peak: Gradient ranging from 4 to 40% of buffer B in 12 KOs (3% of B / KO buffer). Immediately after the start of peak elution, when OD280 reaches 25% of full scale, elution is continued using isocratic conditions using the concentration of buffer B reached at this point until the elution of this peak is complete (approximately 2.5-3.5 KOs).
ОперацииOperations
Берут подходящее количество раствора, соответствующего пику "мономера", и концентрируют для контроля (mon на фиг.5).A suitable amount of the solution corresponding to the peak of the "monomer" was taken and concentrated for control (mon in FIG. 5).
Вторая подстадия (RPCdim)Second Sub-Stage (RPCdim)
Материал и параметры:Material and parameters:
Без повторного уравновешивания этой колонки, а с использованием простого изменения диапазона шкалы УФ-монитора до величины 2, пропускают градиент в пределах от 10 до 100% буфера В в 2,2 КО (40,9% буфера В/КО).Without re-balancing this column, and using a simple change in the range of the UV monitor scale to 2, a gradient is passed in the range from 10 to 100% of buffer B at 2.2 KO (40.9% of the B / KO buffer).
Операции:Operations:
Берут фракции, соответствующие пику "Dimer". Фиг.4 иллюстрирует этот пример. Фракции собирают и измеряют объем и оптическую плотность при 280 нм.The fractions corresponding to the peak "Dimer" are taken. 4 illustrates this example. Fractions are collected and volume and optical density are measured at 280 nm.
Общий выход (выраженный в мг), полученный перед лиофилизацией, рассчитывают умножением OD280 на объем и на разбавление. Средняя величина этого выхода равна 164 мг чистого PLGF-1 на литр бактериальной культуры со стандартным отклонением 23,21. Она может быть также выражена в мг на 1000 OD600 ферментированных бактерий, что дает 5,58 мг чистого PLGF-1 на каждые 1000 OD600 ферментированных бактерий со стандартным отклонением 0,8.The total yield (expressed in mg) obtained before lyophilization is calculated by multiplying OD280 by volume and dilution. The average value of this yield is 164 mg of pure PLGF-1 per liter of bacterial culture with a standard deviation of 23.21. It can also be expressed in mg per 1000 OD600 of fermented bacteria, giving 5.58 mg of pure PLGF-1 for every 1000 OD600 of fermented bacteria with a standard deviation of 0.8.
Полученный таким образом раствор димера хранят при -20°С до ультрадиафильтрации и лиофилизации. Образец такого раствора подвергают электрофорезу в ДСН-ПААГ, как показано на фиг.5.The dimer solution thus obtained was stored at −20 ° C. until ultrafiltration and lyophilization. A sample of such a solution is subjected to SDS-PAGE electrophoresis, as shown in FIG.
Claims (27)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004126688/13A RU2295535C2 (en) | 2002-02-05 | 2002-02-05 | Recombinant placental growth factor and method for production thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004126688/13A RU2295535C2 (en) | 2002-02-05 | 2002-02-05 | Recombinant placental growth factor and method for production thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2004126688A RU2004126688A (en) | 2005-06-10 |
| RU2295535C2 true RU2295535C2 (en) | 2007-03-20 |
Family
ID=35834264
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2004126688/13A RU2295535C2 (en) | 2002-02-05 | 2002-02-05 | Recombinant placental growth factor and method for production thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2295535C2 (en) |
-
2002
- 2002-02-05 RU RU2004126688/13A patent/RU2295535C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BIOTECHNOLOGY PROGRESS, vol.13, no.3, 1997, p.249-257. * |
| FARMACO, SOCIETA CHIMICA ITALIANA, PAVIA, IT, vol.55, 2000, p.165-167. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2004126688A (en) | 2005-06-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ikeda et al. | Human transforming growth factor type. beta. 2: production by a prostatic adenocarcinoma cell line, purification, and initial characterization | |
| Hansson et al. | Single–Step Recovery of a Secreted Recombinant Protein by Expanded Bed Adsorption | |
| US6399333B1 (en) | Process for producing erythropoietin containing no animal proteins | |
| US6632635B1 (en) | Methods of refolding proteins | |
| US5446024A (en) | Purification of insulin-like growth factor | |
| US7744862B2 (en) | Production process of recombinant placental growth factor | |
| CA2079781A1 (en) | Method to purify basic fibroblast growth factor | |
| EP1304381A2 (en) | Process for producing hydrophobic polypeptides, proteins or peptides | |
| EP0949335B2 (en) | Process for preparing purified dimer of bone-derived factor | |
| Miller et al. | Recombinant bovine rhodanese: purification and comparison with bovine liver rhodanese | |
| CA1339757C (en) | Production of purified biologically active, bacterially produced recombinant human csf-1 | |
| RU2295535C2 (en) | Recombinant placental growth factor and method for production thereof | |
| CN115873095A (en) | Purification method of recombinant human bone morphogenetic protein-2 dimer | |
| PL206761B1 (en) | Production process of recombinant placental growth factor | |
| CN117164696B (en) | Production method of recombinant human bone morphogenetic protein-2 mature peptide dimer | |
| AU707719B2 (en) | Process for protein refolding by means of buffer exchange using a continuous stationary phase capable of separating proteins from salt | |
| US7811793B2 (en) | Process for preparing purified active monomer of bone-derived factor | |
| CN118165095A (en) | Separation and purification method of recombinant human keratin | |
| MXPA99005882A (en) | Process for preparing purified dimer of bone-derived factor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150206 |