Claims (28)
1. Способ экстракции и очистки рекомбинантного плацентарного фактора роста (PLGF) в димерной и мультимерной активной форме, содержащей не более чем 1,5% мономерной формы, полученного экспрессией в индуцибельной системе экспрессии в модифицированных прокариотических клетках, предусматривающий следующие стадии: I) ферментацию прокариотических клеток, II) экстракцию и очистку телец включения, III) ренатурацию экспрессированного белка, IV) ионообменную хроматографию, V) обращенно-фазовую хроматографию, характеризующийся тем, что стадию (I) проводят до получения высокой оптической плотности культуральной среды от 14 до 50 при 600 нм (OD600 14-50) с последующей индукцией; тем, что стадия (II) предусматривает лизис клеток культуры, разрушение ДНК и выделение телец включения; тем, что на стадии (III) тельца включения солюбилизируютт в денатурирующем буфере и экспрессированный белок превращают, по меньшей мере, частично, опять в димерную форму; тем, что на стадии (IV) димерную и мультимерную формы экспрессированного белка отделяют от мономерной формы анионообменной хроматографией и тем, что на стадии (V) димерную и мультимерную формы экспрессированного белка дополнительно отделяют от мономерной формы обращенно-фазовой хроматографией с двумя последовательными стадиями элюции с увеличивающимся градиентом органического растворителя, разделенными стадией элюции при изократических условиях и, наконец, выделяют.1. A method for the extraction and purification of recombinant placental growth factor (PLGF) in a dimeric and multimeric active form containing not more than 1.5% of the monomeric form obtained by expression in an inducible expression system in modified prokaryotic cells, comprising the following stages: I) fermentation of prokaryotic cells, II) extraction and purification of inclusion bodies, III) renaturation of the expressed protein, IV) ion exchange chromatography, V) reverse phase chromatography, characterized in that stage (I) is carried out to obtain a high optical density of the culture medium from 14 to 50 at 600 nm (OD600 14-50), followed by induction; the fact that stage (II) provides for the lysis of the cells of the culture, the destruction of DNA and the isolation of inclusion bodies; the fact that in step (III) the inclusion bodies are solubilized in a denaturing buffer and the expressed protein is converted, at least partially, again into a dimeric form; the fact that at the stage (IV) the dimeric and multimeric forms of the expressed protein are separated from the monomeric form by anion exchange chromatography and the fact that at the stage (V) the dimeric and multimeric forms of the expressed protein are further separated from the monomeric form by reverse phase chromatography with two successive stages of elution with increasing gradient of organic solvent, separated by an elution step under isocratic conditions and finally isolated.
2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что плацентарный фактор роста (PLGF) является PLGF-1 человека или животного.2. The method according to claim 1, characterized in that the placental growth factor (PLGF) is PLGF-1 human or animal.
3. Способ по п.1 или 2, характеризующийся тем, что прокариотические клетки являются бактериальными клетками.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the prokaryotic cells are bacterial cells.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадию I проводят в среде, позволяющей получать высокую плотность бактерий на ферментационной стадии и не содержащей никакого материала животного или человеческого происхождения.4. The method according to claim 1, characterized in that stage I is carried out in an environment that allows to obtain a high density of bacteria in the fermentation stage and does not contain any material of animal or human origin.
5. Способ по п.4, характеризующийся тем, что стадию I проводят в среде, содержащей один или более селективных агентов, дрожжевой экстракт, глицерин и соли аммония.5. The method according to claim 4, characterized in that stage I is carried out in an environment containing one or more selective agents, yeast extract, glycerin and ammonium salts.
6. Способ по п.1, характеризующийся тем, что индуцибельной системой экспрессии является система экспрессии Т7.6. The method according to claim 1, characterized in that the inducible expression system is a T7 expression system.
7. Способ п.3, характеризующийся тем, что бактериальные клетки являются штаммом, происходящим из Е.coli.7. The method of claim 3, characterized in that the bacterial cells are a strain originating from E. coli.
8. Способ по п.7, характеризующийся тем, что бактериальный штамм является штаммом Е.coli {BL21(DE3)pLysS}.8. The method according to claim 7, characterized in that the bacterial strain is a strain of E. coli {BL21 (DE3) pLysS}.
9. Способ по п.6, характеризующийся тем, что экспрессию индуцируют с использованием лактозы, изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (IPTG) или функционально эквивалентных аналогов.9. The method according to claim 6, characterized in that the expression is induced using lactose, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) or functionally equivalent analogues.
10. Способ по п.1, характеризующийся тем, что оптическая плотность культуры в момент индукции равна 14-30 OD при 600 нм (14-30 OD600), предпочтительно 16-20 (16-20 OD600).10. The method according to claim 1, characterized in that the optical density of the culture at the time of induction is equal to 14-30 OD at 600 nm (14-30 OD600), preferably 16-20 (16-20 OD600).
11. Способ по п.1, характеризующийся тем, что стадия I предусматривает предварительную стадию прединокуляции.11. The method according to claim 1, characterized in that stage I provides a preliminary stage of preinoculation.
12. Способ по п.1, характеризующийся тем, что в стадии II лизис клеток осуществляют посредством замораживания/оттаивания, с использованием пресса Френча или других эквивалентных способов.12. The method according to claim 1, characterized in that in stage II, the lysis of cells is carried out by freezing / thawing, using a French press or other equivalent methods.
13. Способ по п.1, характеризующийся тем, что на стадии II разрушение ДНК проводят с использованием ДНКазы, полученной экстрагированием или рекомбинантного происхождения, предпочтительно бензоназы, или химико-механическим воздействием.13. The method according to claim 1, characterized in that in stage II, DNA destruction is carried out using DNAse obtained by extraction or recombinant origin, preferably benzonase, or by chemical-mechanical action.
14. Способ по п.1, характеризующийся тем, что на стадии II разрушение ДНК проводят с использованием миксера.14. The method according to claim 1, characterized in that in stage II, the destruction of DNA is carried out using a mixer.
15. Способ по п.1, характеризующийся тем, что на стадии II тельца включения выделяют с использованием, по меньшей мере, двух циклов центрифугирования и промывания в подходящем буфере.15. The method according to claim 1, characterized in that at stage II the inclusion bodies are isolated using at least two centrifugation and washing cycles in a suitable buffer.
16. Способ по п.1, характеризующийся тем, что на стадии III тельца включения солюбилизируют в денатурирующем буфере, содержащем мочевину, изотиоцианат гуанидина, гидрохлорид гуанидина или любой другой денатурирующий агент, и при необходимости гомогенизируют или обрабатывают ультразвуком.16. The method according to claim 1, characterized in that, in stage III, the inclusion bodies are solubilized in a denaturing buffer containing urea, guanidine isothiocyanate, guanidine hydrochloride or any other denaturing agent, and, if necessary, homogenized or sonicated.
17. Способ по п.1, характеризующийся тем, что на стадии III, после солюбилизации телец включения, раствор разбавляют и белковый материал ренатурируют добавлением к этому раствору окислительных/восстановительных агентов и инкубированием в течение 10-30 ч, предпочтительно 18-20 ч при температуре 10-30°С, предпочтительно 20°С при перемешивании.17. The method according to claim 1, characterized in that in stage III, after the solubilization of the inclusion bodies, the solution is diluted and the protein material is renatured by the addition of oxidizing / reducing agents to this solution and incubation for 10-30 hours, preferably 18-20 hours at a temperature of 10-30 ° C, preferably 20 ° C with stirring.
18. Способ по п.17, характеризующийся тем, что раствор разбавляют до получения оптической плотности при 280 нм (OD280) от 0,01 до 2, предпочтительно 0,5; тем, что окислительными/восстановительными агентами являются восстановленный глутатион и окисленный глутатион в таких соотношениях и концентрациях, которые делают возможным максимальное образование димерной формы.18. The method according to 17, characterized in that the solution is diluted to obtain an optical density at 280 nm (OD280) from 0.01 to 2, preferably 0.5; the fact that the oxidizing / reducing agents are reduced glutathione and oxidized glutathione in such proportions and concentrations that make possible the maximum formation of the dimeric form.
19. Способ по п.1, характеризующийся тем, что на стадии IV раствор, полученный на предыдущей стадии, наносят на анионообменную колонку при соотношении нанесенный объем/объем колонки 1:1-10:1.19. The method according to claim 1, characterized in that in stage IV the solution obtained in the previous stage is applied to the anion-exchange column with a ratio of applied volume / column volume of 1: 1-10: 1.
20. Способ по п.19, характеризующийся тем, что соотношение нанесенный объем/объем колонки равно 10:1.20. The method according to claim 19, characterized in that the ratio of the applied volume / column volume is 10: 1.
21. Способ по п.19, характеризующийся тем, что белок элюируют буфером этаноламин-HCl с NaCl и что белок в мономерной форме содержится в основном во фракциях, содержащих материал, не связанный со смолой, тогда как этот белок в димерной форме содержится в основном в последующих фракциях, элюируемых при концентрации NaCl 150-250 мМ.21. The method according to claim 19, characterized in that the protein is eluted with ethanolamine-HCl buffer with NaCl and that the protein in monomeric form is contained mainly in fractions containing material not associated with the resin, while this protein in the dimeric form is contained mainly in subsequent fractions eluted with a NaCl concentration of 150-250 mM.
22. Способ по п.21, характеризующийся тем, что на стадии V раствор, элюированный на предыдущей стадии при концентрации NaCl 150-250 нМ, разбавляют и наносят на обращенно-фазовую хроматографическую колонку в количестве, соответствующем оптической плотности 4,4-5,5 OD при 280 нм на мл смолы.22. The method according to item 21, characterized in that in stage V, the solution eluted in the previous stage at a NaCl concentration of 150-250 nM is diluted and applied to a reverse phase chromatographic column in an amount corresponding to an optical density of 4.4-5, 5 OD at 280 nm per ml resin.
23. Способ по п.22, характеризующийся тем, что первую стадию элюции проводят при условиях увеличивающегося градиента органического растворителя, пока не появляется пик элюции мономерной формы ее продолжают при изократических условиях до истощения пика элюции мономерной формы; и тем, что вторую стадию проводят при условиях увеличивающегося градиента органического растворителя до полной элюции этого белка в основном в димерной форме.23. The method according to p. 22, characterized in that the first stage of elution is carried out under conditions of an increasing gradient of the organic solvent, until the peak of elution of the monomeric form appears; it is continued under isocratic conditions until the peak of elution of the monomer form is exhausted; and the fact that the second stage is carried out under conditions of an increasing gradient of an organic solvent until the protein is completely eluted mainly in dimeric form.
24. Способ по п.23, характеризующийся тем, что буфер для элюции содержит этанол, метанол или ацетонитрил.24. The method according to item 23, wherein the elution buffer contains ethanol, methanol or acetonitrile.
25. Способ по п.23, характеризующийся тем, что буфер для элюции является водно-спиртовым раствором, содержащим увеличивающиеся процентное количество этанола.25. The method according to item 23, wherein the elution buffer is a water-alcohol solution containing an increasing percentage of ethanol.
26. Способ по п.22, характеризующийся тем, что обращенно-фазовую хроматографию проводят на смоле, имеющей частицы со средним диаметром 30 мкм.26. The method according to item 22, wherein the reverse phase chromatography is carried out on a resin having particles with an average diameter of 30 μm.
27. Способ по п.1, предусматривающий дополнительную стадию ультрафильтрации с последующим лиофилизацией в присутствии или в отсутствие подходящих добавок.27. The method according to claim 1, comprising an additional step of ultrafiltration, followed by lyophilization in the presence or absence of suitable additives.
28. Плацентарный фактор роста в активной форме, получаемый при помощи способа по любому из пунктов 1-27, характеризующийся тем, что он является очищенным от примесей штамма-хозяина и что он содержит мономерную форму в процентном количестве не более, чем 1,5%, и что он находится по существу в димерной и мультимерной форме.28. The placental growth factor in active form, obtained using the method according to any one of paragraphs 1-27, characterized in that it is purified from impurities of the host strain and that it contains a monomeric form in a percentage of not more than 1.5% and that it is essentially in dimeric and multimeric form.