RU2290442C2

RU2290442C2 - Method for in vivo transformation of animal testicle stem cells

Info

Publication number: RU2290442C2
Application number: RU2005107579/13A
Authority: RU
Inventors: Инна Петровна Новгородова (RU); Инна Петровна Новгородова; Натали Анатольевна Зиновьева (RU); Наталия Анатольевна Зиновьева; Лев Константинович Эрнст (RU); Лев Константинович Эрнст
Original assignee: Всероссийский государственный научно-исследовательский институт животноводства (ВИЖ)
Priority date: 2005-03-21
Filing date: 2005-03-21
Publication date: 2006-12-27
Also published as: RU2005107579A

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: claimed method includes injection of vector construct pX-RSVhGH encoding human growth hormone or pX-Ins, encoding human insulin into parenchyma of 8-9-week rabbit males. Transformation effectiveness of gene constructs is determined by immunohystochemical kit Novocastra (Sigma, USA).

EFFECT: method for genetic transformation of rabbit testicle stem cells with increased effectiveness.

3 dwg, 1 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии, а именно к способам трансформации стволовых клеток семенников (СКС) кроликов in vivo путем введения в них чужеродного генетического материала в виде векторных систем.The invention relates to biotechnology, in particular to genetic engineering, and in particular to methods of transforming stem cells of testes (SCS) of rabbits in vivo by introducing into them foreign genetic material in the form of vector systems.

Известно много способов генетической трансформации клеток семенников. Большинство из них относится к трансформации клеток в культуре, либо к получению трансгенных животных. Так, например, в качестве перспективного приема введения чДНК в половые клетки используют метод электропорации, основанный на воздействии внешнего электрического поля, способствующего образованию в клеточной мембране кратковременных пор, через которые экзогенная ДНК проникает в клетку (Баранов B.C., Гапала И., Грияч П. и др. Включение макромолекул в половые клетки самцов мышей при помощи электропорации и диметилсульфоксида // Цитология и генетика. - 1990. - Т.24. - №3. - С.3-7; Кузнецов А.В., В.Е.Ерохин. Проникновение экзогенной ДНК в компетентные сперматозоиды Mytilus Galloprovincialis Lam. // Экология моря. - 2001. - В.56. - С.76-79; Yu Z., Guo R., Ge Y. et al. Gene expression profiles in different stages of mouse spermatogenic cells during spermatogenesis // Biol. Reprod. - 2003. -V.69(1). - P.37-47). Этот метод позволяет использовать общую физическую природу прохождения электрических импульсов через все биологические мембраны и дает возможность ввести чДНК в клетки любого видового и тканевого происхождения. Для трансфекции клеток часто используют плазмиду pCMVlacZ, содержащую бактериальный ген lacZ E.coli. Выбор этого вектора обуславливается простотой выявления его экспрессии в клетках. При введении чДНК с помощью электропорации в зрелые спермии мыши было выявлено, что незрелые формы сперматогенного эпителия способны включать меченую чДНК под влиянием электрошока. При кратковременном воздействии электрического тока с параметрами 400 В и 500 мкФ эффективность трансфекции СКС оказывается низкой и составляет только 1,3%. К недостаткам метода электропорации также следует отнести необходимость наличия специального оборудования.Many methods are known for the genetic transformation of testis cells. Most of them relate to the transformation of cells in culture, or to the production of transgenic animals. For example, an electroporation method based on the action of an external electric field that promotes the formation of short-term pores in the cell membrane through which exogenous DNA penetrates the cell is used as a promising method for introducing hDNA into germ cells (Baranov BC, Gapala I., Griyach P. et al. Inclusion of macromolecules in the germ cells of male mice using electroporation and dimethyl sulfoxide // Cytology and Genetics. - 1990. - T. 24. - No. 3. - P.3-7; Kuznetsov A.V., V.E. Erokhin: Penetration of Exogenous DNA into Competent Sperms Atozoids of Mytilus Galloprovincialis Lam. // Ecology of the Sea. - 2001. - B.56. - P.76-79; Yu Z., Guo R., Ge Y. et al. Gene expression profiles in different stages of mouse spermatogenic cells during spermatogenesis // Biol. Reprod. - 2003. -V.69 (1) .- P.37-47). This method allows using the general physical nature of the passage of electrical impulses through all biological membranes and makes it possible to introduce cDNA into cells of any species and tissue origin. Plasmid pCMVlacZ containing the bacterial E. coli lacZ gene is often used to transfect cells. The choice of this vector is determined by the simplicity of detecting its expression in cells. With the introduction of cDNA by electroporation into mature mouse sperm, it was revealed that immature forms of spermatogenic epithelium are capable of incorporating labeled cDNA under the influence of electroshock. With a short-term exposure to an electric current with parameters of 400 V and 500 μF, the SCS transfection efficiency is low and amounts to only 1.3%. The disadvantages of the electroporation method also include the need for special equipment.

Известен способ генетической трансформации путем введения генетического материала в семенники животных in vitro посредством липосомального транспорта генов (Bachiller D., Schellander К., Peli J. et al. Liposome-mediated DNA uptake by sperm cells // Mol. Reprod. Dev. - 1991. -V.30(3). - P. 194-200). В качестве вектора для переноса экзогенной ДНК были извлечены стволовые клетки из семенников животных и проведены манипуляции с ними in vitro (инкубирование с липосомами, содержащими плазмидную ДНК). После получения трансгенной спермы искусственно осеменили самок. В результате установлено, что трансген передавался F1 поколению кроликов. Среди недостатков липосомального транспорта генов следует отметить цитотоксичность липосом, а также отсутствие, в большинстве случаев, интеграции трансгенов (до 0,8%).A known method of genetic transformation by introducing genetic material into the testes of animals in vitro by liposomal gene transport (Bachiller D., Schellander K., Peli J. et al. Liposome-mediated DNA uptake by sperm cells // Mol. Reprod. Dev. - 1991 .-V.30 (3) .- P. 194-200). As a vector for transfer of exogenous DNA, stem cells were extracted from the testes of animals and manipulated in vitro (incubation with liposomes containing plasmid DNA). After receiving the transgenic sperm, the females were artificially inseminated. As a result, it was found that the transgene was passed on to the F1 generation of rabbits. Among the disadvantages of liposomal gene transport, it should be noted the cytotoxicity of liposomes, as well as the absence, in most cases, of transgene integration (up to 0.8%).

В качестве прототипа был взят метод опосредованной ретровирусной трансфекции половых клеток семенников взрослых хрячков (Nagano М., Shinohara Т., Avarbock M.R., Brinster R.L. Retrovirus-mediated gene delivery into male germ line stem cells // FEBS Lett. - 2000. - V.475(1). - P.7-10). Способ включает инъецирование репортерного гена lac Z непосредственно в семенники и последующее определение эффективности трансформации генной конструкции. При помощи ПЦР анализа было установлено, что одна из 300 стволовых клеток сперматогоний содержала трансген. Экспрессия репортерного гена lacZ наблюдалась в семенниках самцов более 6 месяцев. Недостаток указанного способа состоит в том, что при трансформации клеток сперматогенного эпителия были использованы взрослые животные, имеющие пониженное число стволовых клеток сперматогоний, что значительно ухудшало результат.As a prototype, the method of mediated retroviral transfection of germ cells of testicles of adult boars was taken (Nagano M., Shinohara T., Avarbock MR, Brinster RL Retrovirus-mediated gene delivery into male germ line stem cells // FEBS Lett. - 2000. - V. 475 (1) .- P.7-10). The method involves injecting the lac Z reporter gene directly into the testes and then determining the efficiency of transformation of the gene construct. Using PCR analysis, it was found that one of the 300 stem cells of spermatogonia contained a transgene. Expression of the lacZ reporter gene was observed in the testes of males for more than 6 months. The disadvantage of this method is that in the transformation of spermatogenous epithelial cells, adult animals were used, having a reduced number of spermatogonia stem cells, which significantly worsened the result.

При создании настоящего изобретения задача заключалась в разработке способа генетической трансформации стволовых клеток семенников кроликов in vivo с использованием опосредованного ретровирусами переноса генов.When creating the present invention, the task was to develop a method for the genetic transformation of stem cells of rabbit testes in vivo using retrovirus-mediated gene transfer.

Технический результат предлагаемого изобретения достигается тем, что предложен способ трансформации стволовых клеток семенников кроликов in vivo, включающий инъецирование векторных систем непосредственно в семенники и определение эффективности трансформации генных конструкций, отличающийся тем, что для трансформации используют 8-9-недельных самцов кроликов, которым в паренхиму семенника инъецируют векторную конструкцию pX-RSVhGH, кодирующую гормон роста человека, или pX-Ins, кодирующую инсулин человека, а эффективность трансформации определяют при помощи иммуногистохимического набора Novocastra (Sigma, США).The technical result of the invention is achieved by the fact that the proposed method of transformation of stem cells of testes of rabbits in vivo, including the injection of vector systems directly into the testes and determining the efficiency of transformation of gene constructs, characterized in that for the transformation use 8-9-week-old male rabbits, which in the parenchyma the testis is injected with the pX-RSVhGH vector construct encoding human growth hormone or pX-Ins encoding human insulin, and the transformation efficiency is determined they are revealed using the Novocastra immunohistochemical kit (Sigma, USA).

Схема используемых генных конструкций, приведена на фигуре 1. При этом RSV - промотор вируса саркомы Рауса; SV - промотор ранних генов вируса SV40; neo - ген неомицинфосфотрансферазы из транспозона Тп5 (где В - BamHI, Е - EcoRI, S - Sad, SI - SalI, X - Xhol) (фиг.1).The scheme of the used gene constructs is shown in Figure 1. At the same time, RSV is the promoter of the Routh sarcoma virus; SV - promoter of the early genes of the SV40 virus; neo is the neomycin phosphotransferase gene from the transposon Tn5 (where B is BamHI, E is EcoRI, S is Sad, SI is SalI, X is Xhol) (Fig. 1).

Пример. Трансформированные стволовые клетки сперматогонии на гистосрезах выявляли путем применения следующих процедур.Example. Transformed spermatogonia stem cells on histosections were detected using the following procedures.

Изучали морфологию семенников разновозрастных групп самцов-кроликов в возрасте от 10 дней до 6 месяцев (с интервалом 7-14 дней при убое или кастрации) путем исследований гистосрезов семенных канальцев с целью выявления возраста с максимальным числом сперматогний для проведения биоинженерных манипуляций.We studied the morphology of testes of different age groups of male rabbits aged 10 days to 6 months (with an interval of 7-14 days for slaughter or castration) by examining histological sections of the seminiferous tubules in order to determine the age with the maximum number of spermatogonia for bioengineering manipulations.

На основании полученных результатов проводили трансфекцию клеток сперматогенного эпителия кроликов in vivo в возрастной период 8-9 недель путем множественного введения (5-8 инъекций на семенник) генных конструкций в паренхиму семенников. Для генетической трансформации половых клеток семенников кроликов in vivo сформировали группы животных в зависимости от используемой генной конструкции (pX-Ins - ген инсулина человека под контролем промотора цитомегаловируса и pX-RSVhGH - ген гормона роста человека под контролем промотора вируса саркомы Рауса) и типа ретровирусного препарата. Для каждой из используемых генных конструкций были сформированы две опытные группы: 1-я - введение клеток-упаковщиц, 2-я - введение культуральной жидкости (n=3 для каждой опытной группы). Клетки-упаковщицы и культуральную жидкость инъецировали в количестве соответственно 1 млн и 0,5 мл (1×10⁵) на семенник.Based on the results, transfection of rabbit spermatogenous epithelium cells was carried out in vivo in the age period of 8–9 weeks by multiple injection (5–8 injections per testis) of gene constructs into the testis parenchyma. Groups of animals were formed in vivo for the genetic transformation of germ cells of rabbit testes in accordance with the used gene construct (pX-Ins is the human insulin gene under the control of the cytomegalovirus promoter and pX-RSVhGH is the human growth hormone gene under the control of the Routh sarcoma virus promoter) and the type of retroviral drug . For each of the used gene constructs, two experimental groups were formed: 1st — introduction of packer cells, 2nd — introduction of culture fluid (n = 3 for each experimental group). Packing cells and culture fluid were injected in amounts of 1 million and 0.5 ml (1 × 10 ⁵ ), respectively, per testis.

Через 7 и 14 дней после инъекции от животных при кастрации или убое отбирали пробы тканей семенников для анализа наличия трансформированных клеток. Экспрессию рекомбинантных генов на срезах тканей семенников кроликов определяли иммуногистохимическим методом при помощи набора Novocastra (Sigma, США). Выполняли анализ 20-и гистологических срезов (толщиной 4-5 мкм) с интервалом 50 мкм и определяли частоту генетической трансформации генных конструкций. Клетки, синтезирующие рекомбинантный вирус, окрашивались в красно-коричневый цвет.7 and 14 days after the injection, testis tissue samples were taken from animals during castration or slaughter to analyze the presence of transformed cells. Expression of recombinant genes on tissue sections of testes of rabbits was determined by immunohistochemical method using a Novocastra kit (Sigma, USA). An analysis of 20 histological sections (4-5 μm thick) with an interval of 50 μm was performed and the frequency of genetic transformation of gene constructs was determined. Cells synthesizing the recombinant virus were stained red-brown.

Обработку полученных данных проводили на микроскопе «Opton» (Германия, объектив х40, окуляр х15) с использованием системы цифровой визуализации изображений (ООО «Система для микроскопии и анализа»).Processing of the obtained data was carried out on an Opton microscope (Germany, lens x40, eyepiece x15) using a digital image visualization system (LLC System for Microscopy and Analysis).

Использование данного метода позволило показать успешную трансформацию клеток сперматогоний при использовании обоих генных конструкций.Using this method allowed us to show successful transformation of spermatogonia cells using both gene constructs.

Среднее значение частоты интеграции генной конструкции, содержащей гормон роста человека (число трансформированных сперматогоний к общему числу сперматогоний в трансформированных семенных канальцах, выраженное в процентах) при использовании культуры клеток, составило 3,1±0,1%. Эффективность генетической трансформации клеток семенников кролика in vivo (отношение числа трансформированных сперматогоний к общему их числу на срезе) при использовании рекомбинантного вектора pX-RSVhGH на 7 день после инъекции достигала 2,7·10^-3.The average value of the integration frequency of the gene construct containing human growth hormone (the number of transformed spermatogonia to the total number of spermatogonia in the transformed seminiferous tubules, expressed as a percentage) using a cell culture was 3.1 ± 0.1%. The efficiency of the genetic transformation of rabbit testis cells in vivo (the ratio of the number of transformed spermatogonia to the total number per section) when using the recombinant vector pX-RSVhGH on the 7th day after injection reached 2.7 · 10 ^-3 .

Частота интеграции генной конструкции, содержащей ген инсулина человека (pX-Ins), при трансформации клеток семенников кроликов in vivo составила 3,5±0,1 и 3,4±0,1 соответственно при использовании клеток-упаковщиц и культуральной жидкости. Эффективность трансформации клеток семенников кроликов первой группы при использовании клеток-упаковщиц на 7 день составила 2,3·10^-3 и была в 3,1 раза выше, по сравнению с показателями, полученными при инъекции культуральной жидкости. На 14 день после инъекции, частота генетической трансформации при использовании клеток-упаковщиц составила 4,1·10^-3, что было 2,7 раз выше по сравнению с использованием супернатанта.The integration frequency of the gene construct containing the human insulin gene (pX-Ins) during in vivo transformation of rabbit testis cells was 3.5 ± 0.1 and 3.4 ± 0.1, respectively, using packer cells and culture fluid. The efficiency of transformation of testis cells of rabbits of the first group when using packaging cells on day 7 was 2.3 · 10 ^-3 and was 3.1 times higher compared to the parameters obtained by injection of culture fluid. On the 14th day after the injection, the frequency of genetic transformation using packer cells was 4.1 · 10 ^-3 , which was 2.7 times higher compared to the use of the supernatant.

На фигуре 2-3 показана возможность эффективной трансформации СКС кролика при использовании генных конструкций pX-RSVhGH и pX-Ins (фиг.2-3). При этом на фигуре 2 в семенном канальце заметны три сперматогония, трансформированных генной конструкцией pX-RSVhGH (клетки указаны стрелками). На фигуре 3 в семенном канальце представлены два сперматогония, трансформированных генной конструкцией pX-Ins (клетки указаны стрелками). Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение: объектив х40, окуляр х10.Figure 2-3 shows the possibility of effective transformation of the SCS of the rabbit using pX-RSVhGH and pX-Ins gene constructs (Fig.2-3). Moreover, in figure 2, three spermatogonia transformed with the pX-RSVhGH gene construct are visible in the seminiferous tubule (cells are indicated by arrows). Figure 3 shows two spermatogonia transformed with the pX-Ins gene construct in the seminiferous tubule (cells are indicated by arrows). Hematoxylin-eosin stain. Magnification: x40 lens, x10 eyepiece.

Таким образом, при использовании генной конструкции pX-RSVbGH трансформированными оказались одна из 2500 клеток, в то время как при использовании генной конструкции pX-Ins - одна из 434 клеток.Thus, using the pX-RSVbGH gene construct, one of 2500 cells was transformed, while using the pX-Ins gene construct, one of 434 cells.

Полученные результаты подтверждают возможность успешной трансформации клеток семенников кролика in vivo с использованием ретровирусных генных конструкций, при этом эффективность генетической трансформации клеток семенников кроликов зависит от генной конструкции, типа используемого препарата и времени после инъекции в семенники.The results confirm the possibility of successful transformation of rabbit testis cells in vivo using retroviral gene constructs, and the effectiveness of genetic transformation of rabbit testis cells depends on the gene construct, the type of preparation used and the time after injection into the testes.

Предложенный способ может быть использован в экспериментальной медицине и ветеринарии, в том числе для генетической трансформации стволовых клеток сперматогоний с целью получения трансгенных животных.The proposed method can be used in experimental medicine and veterinary medicine, including for genetic transformation of stem cells of spermatogonia in order to obtain transgenic animals.

Claims

In vivo method for transforming stem cells of rabbit testis in vivo, including injecting vector systems directly into the testes and determining the efficiency of transformation of gene constructs, characterized in that 8-9-week-old male rabbits are used for transformation, which are injected with the pX-RSVhGH vector construct encoding the testis parenchyma encoding human growth hormone, or pX-InS, encoding human insulin, and transformation efficiency is determined using the Novocastra immunohistochemical kit (Sigma, USA).