RU2286391C2 - Method for biological isolation of pathogenic pasteurellas for storing and followed application - Google Patents
Method for biological isolation of pathogenic pasteurellas for storing and followed application Download PDFInfo
- Publication number
- RU2286391C2 RU2286391C2 RU2004122269/13A RU2004122269A RU2286391C2 RU 2286391 C2 RU2286391 C2 RU 2286391C2 RU 2004122269/13 A RU2004122269/13 A RU 2004122269/13A RU 2004122269 A RU2004122269 A RU 2004122269A RU 2286391 C2 RU2286391 C2 RU 2286391C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- optimum
- isolated
- pasteurellas
- pasteurella
- death
- Prior art date
Links
Landscapes
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Предлагаемое изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и предназначено для получения и сохранения патогенных штаммов пастерелл, а также в целях эпизоотологии и эпидемиологии пастереллезов и близких к ним заболеваний.The present invention relates to the field of microbiology and biotechnology and is intended to obtain and preserve pathogenic pasteurellum strains, as well as for the epizootology and epidemiology of pasteurellosis and related diseases.
Пастереллы - аэробы или факультативные анаэробы, оптимально культивируются при температуре 37°С и рН 7,2-7,4 в виде коккобактерии, в неоптимальных условиях полиморфны, вариабельны, в естественных условиях спонтанно ослабляют и восстанавливают свою вирулентность, вызывают заболевание птиц и млекопитающих, включая человека (Н.М.Никифорова, 1962; И.В.Домарадский, 1971; В.Л.Семиотрочев и др., 1985). Микроб проявляет себя от крайне ослабленного при пастереллоносительстве до сильновирулентного возбудителя болезни в регионах с теплым и умеренным климатом, чаще в период дождей и резких колебаний температуры воздуха, и патогенетически особенно опасен для птиц, так как обычно вызывает опустошительные эпизоотии, нанося чрезвычайный ущерб (Г.Л.Пустовит, 1965; Е.И.Буткин, 1972). От безысходности в такой ситуации большинство исследователей склонны утверждать причиной в основе развития пастереллеза различные предрасполагающие факторы, особенно метеофакторы, прежде всего температуру и влажность окружающей среды, снижающие естественную резистентность макроорганизма. Однако в связи с естественной резистентностью птиц реальная ситуация в развитии пастереллеза совершенно противоположная. Как ни странно, с внезапным появлением и очень быстрым ("молниеносным") развитием заболевания обычно первыми гибнут самые активные, упитанные и сильные птицы. Издавна так называемый "парадокс вирулентности" возбудителя пастереллеза, когда в природе восприимчивые организмы заражаются легко и быстро, а в экспериментах при естественных путях инфицирования далеко не всегда возможно вызвать заболевание (П.В.Сизов, 1931; Е.И.Буткин, 1972), не находит точного объяснения. При этом известно, что утрата ила же восстановление вирулентности и, как правило, капсулы, капсульного антигена (К-антигена), а также иммуногенности пастерелл сопровождается диссоциацией их микробной клетки, выявляемой по изменению колоний (S-, М-, R- формы и SR- или RS- переходные формы) (G.R.Carter, Е.Annau, 1953; G.R.Carter, C.H.Rigland, 1953; G.R.Carter, 1957; A.H.Борисенкова, 1979). Условия этого процесса, особенно по части восстановления биологических свойств пастерелл, почти не изучены. Однако в целях изготовления качественных биопрепаратов получение и сохранение контрольно-производственных штаммов пастерелл по морфологии и вирулентности является задачей первостепенной важности. Поэтому микроорганизмы пассируют через восприимчивый организм (обычно по источнику происхождения бактерий) путем инъекции и сохраняют лиофилизированными ("Вет. препараты", М., 1981. С.238). Но и при этом штаммы бактерий значительно не соответствуют своему стандарту биологических свойств по паспорту. Из-за сложности и слабой изученности свойств возбудителя пастереллеза эта задача по-прежнему решается эмпирически, в связи с чем и безуспешно.Pasteurella - aerobes or facultative anaerobes, are optimally cultivated at a temperature of 37 ° C and pH 7.2-7.4 in the form of coccobacteria, under non-optimal conditions, are polymorphic, variable, in vivo spontaneously weaken and restore their virulence, cause disease in birds and mammals, including humans (N.M. Nikiforova, 1962; I.V. Domaradsky, 1971; V.L. Semiotrochev et al., 1985). The microbe manifests itself from extremely weakened during pasteure carriage to a highly virulent pathogen in regions with a warm and temperate climate, often during rains and sharp fluctuations in air temperature, and is pathogenetically especially dangerous for birds, since it usually causes devastating epizootics, causing extreme damage (G. L.Pustovit, 1965; E.I. Butkin, 1972). Because of hopelessness in such a situation, most researchers are inclined to state various predisposing factors as the basis for the development of pasteurellosis, especially meteofactors, primarily environmental temperature and humidity, which reduce the natural resistance of a macroorganism. However, due to the natural resistance of birds, the real situation in the development of pasteurellosis is completely opposite. Oddly enough, with the sudden appearance and very fast ("lightning") development of the disease, the most active, well-fed and strong birds are usually the first to die. The so-called "virulence paradox" of the causative agent of pasteurellosis has long been known, when susceptible organisms become infected easily and quickly in nature, and in experiments with natural pathways of infection it is far from always possible to cause a disease (P.V. Sizov, 1931; E.I. Butkin, 1972) , does not find an exact explanation. It is known that the loss of silt, however, restores virulence and, as a rule, capsule, capsular antigen (K-antigen), as well as the immunogenicity of pasteurella, is accompanied by dissociation of their microbial cell, detected by a change in colonies (S-, M-, R-form and S R - or R S - transitional forms) (GRCarter, E. Annau, 1953; GRCarter, CHRigland, 1953; GRCarter, 1957; AHBorisenkova, 1979). The conditions of this process, especially with regard to the restoration of the biological properties of pasteurellas, have hardly been studied. However, in order to produce high-quality biological products, obtaining and preserving control and production strains of pasteurellae in morphology and virulence is a task of paramount importance. Therefore, microorganisms are passaged through a susceptible organism (usually according to the source of the origin of the bacteria) by injection and kept lyophilized ("Vet. Preparations", M., 1981. P.238). But even so, bacterial strains do not significantly correspond to their standard of biological properties according to the passport. Due to the complexity and poorly studied properties of the causative agent of pasteurellosis, this problem is still solved empirically, and therefore unsuccessfully.
В предыдущей работе, заключающейся в повышении точности условий выявления и выделения пастерелл (Патент РФ №2005790 от 15.01.1994 г., Патент РФ №2051970 от 10.01.1996 г.), в объяснении феномена биполярности пастерелл (Ж. "Доклады Россельхозакадемии", 1996. №5. С.32-35), в установлении условий повышения (восстановления) вирулентности пастерелл (Патент РФ №2123531 от 20.12.1998 г.), а также в разработке вакцины для профилактики пастереллёза птиц и способа ее получения (Патент РФ №2199341 от 27.02.2003 г.), показана взаимосвязанная инфекционная природа пастерелл в капсульном и бескапсульном вариантах микробной клетки в зависимости от температуры окружающей среды. Морфо- и термолабильность пастерелл, путь заражения восприимчивого организма и температура окружающей среды играют главную роль в проявлении патогенных свойств микроба и в развитии заболевания. В этом и заключается принцип восстановления биологических свойств у пастерелл. Поскольку микроб в биологическом цикле своего развития адаптируется от ярко выраженного аэроба без капсулы в организме при септицемии до факультативного анаэроба в выраженной капсуле в трупе птицы, обособление сильновирулентных с выраженной инвазивностью пастерелл попарно ("биполярно") в выраженную капсулу является показателем стандартизации любого патогенного штамма пастерелл. Достоверность воспроизведения этого показателя достигается в результате выполнения стандарта условий биопробы в зависимости от пути и способа заражения, температуры окружающей среды, массы тела павшего, время вскрытия трупа после смерти, а также от органа или же, точнее, от глубины точки изоляции микроба из остывающего тела трупа. При этом изоляция биологически полноценной (стандартизированной) микробной клетки пастерелл из трупа должна быть выполнена своевременно. Поскольку для лабораторной практики вышеизложенное является неизвестным, важные проблемные вопросы пока еще решаются необъективно.In the previous work, which consists in increasing the accuracy of the conditions for the identification and isolation of pasteurellas (RF Patent No. 20055790 of January 15, 1994, RF Patent No. 2051970 of January 10, 1996), in explaining the phenomenon of bipolarity of pasteurellas (J. "Reports of the Russian Agricultural Academy, 1996. No. 5. P.32-35), in establishing the conditions for increasing (restoring) the virulence of pasteurellas (RF Patent No. 2123531 dated 12/20/1998), as well as in the development of a vaccine for the prevention of bird pasteurellosis and its production method (RF Patent No. 2199341 dated 02.27.2003), the interconnected infectious nature of pasteurells in capsule and beskap is shown ulnom embodiments, microbial cells as a function of ambient temperature. The morphological and thermal labileness of pasteurellae, the pathway of infection of the susceptible organism, and ambient temperature play a major role in the manifestation of the pathogenic properties of the microbe and in the development of the disease. This is the principle of restoring the biological properties of pasteurellas. Since the microbe in its biological cycle adapts from a pronounced aerobic without a capsule in the body during septicemia to an optional anaerobic in a pronounced capsule in a bird’s corpse, the isolation of pasteurellos strongly virulent with pronounced invasiveness in pairs (“bipolar”) into a pronounced capsule is an indicator of standardization of any pathogenic strain . The reliability of the reproduction of this indicator is achieved as a result of fulfilling the standard of bioassay conditions, depending on the path and method of infection, ambient temperature, body weight of the fallen, autopsy time after death, as well as on the organ or, more precisely, on the depth of the isolation point of the microbe from the cooling body the corpse. At the same time, isolation of a biologically complete (standardized) microbial pasteurell cell from the corpse should be done in a timely manner. Since the foregoing is unknown for laboratory practice, important problematic issues are still being addressed biased.
Существующий норматив условий пассажа штаммов пастерелл через восприимчивый организм для последующей лиофилизации бактерий не представляет возможность получения и сохранения патогенных микроорганизмов идентичными исходным по морфологии и вирулентности (инвазивности). Известные способы хранения патогенных пастерелл также недостаточно результативны.The existing norm of conditions for the passage of pasteurellum strains through a susceptible organism for subsequent lyophilization of bacteria does not represent the possibility of obtaining and maintaining pathogenic microorganisms identical to the initial ones in morphology and virulence (invasiveness). Known methods for storing pathogenic pasteurellas are also not sufficiently effective.
Лиофилизация - известный, общепризнанный, безусловно надежный и эффективный способ хранения микроорганизмов. Однако, что же касается пастерелл со свойственной им термолабильностью, то действие низкой температуры, как одно из условий этого способа, блокирует их инвазивность. И, поэтому, такой микробной клеткой пастерелл вызвать заражение восприимчивого организма при инфицировании на слизистую верхних дыхательных путей ("ворота инфекции") не всегда представляется возможным, а если часть зараженных и гибнет, то значительно в поздние сроки биопробы. Регидратированные из лиофилизированного состояния пастереллы не способны внедряться через первичные естественные барьеры восприимчивого организма и только при инъекции, минуя существенную часть защитных сил, проявляют патогенность. Следовательно, существенным недостатком лиофилизации пастерелл для хранения и, затем, применения бактерий является блокирование их термолабильной микробной клетки по свойству инвазивности действием низкой температуры как неотъемлемой составляющей этого способа. Лиофилизация, как способ хранения микроорганизмов, не всегда и не везде является доступной, так как для ее осуществления необходимо специальное оборудование и, соответственно, его квалифицированное обслуживание.Lyophilization is a well-known, recognized, certainly reliable and effective way to store microorganisms. However, with regard to pasteurellas with their characteristic thermolability, the effect of low temperature, as one of the conditions of this method, blocks their invasiveness. And, therefore, it is not always possible to cause infection of the susceptible organism with infection of the upper respiratory tract (“infection gates”) with such a microbial pasteurellum cell, and if some of the infected people die, then significantly later in the bioassay. Pasteurellas rehydrated from the lyophilized state are not able to invade through the primary natural barriers of the susceptible organism and only when injected, bypassing a significant part of the defenses, are pathogenic. Therefore, a significant disadvantage of lyophilization of pasteurellas for storage and, then, the use of bacteria is the blocking of their thermolabile microbial cells by invasiveness by the action of low temperature as an integral component of this method. Lyophilization, as a way of storing microorganisms, is not always and not always available, as its implementation requires special equipment and, accordingly, its qualified service.
Сохранение пастерелл по морфологии и вирулентности (инвазивности) является проблемным вопросом и зависит от условий биологической изоляции их микробной клетки. Первые попытки сохранить микроб "холеры кур" (возбудителя пастереллёза) идентичным исходному предприняты Луи Пастером (1860). Ученый изолировал возбудитель болезни от кислорода атмосферного воздуха, запаивая пробирку с культурой бактерий на курином бульоне, и отмечал о сохранении его вирулентным. В связи с этой работой Ф.Р.Писковой и З.Н.Кравченко (1965) сообщили, что культуры пастерелл, выращенные на 1%-ной пептонной воде под вазелиновым маслом, продолжительно жизнеспособны и иммуногенны и, причем, в сохранении этих свойств меньшее значение представляют содержание в питательной среде сывороток крови, их концентрация и принадлежность крови тому или иному виду животных. Обе работы по целесообразности сохранения пастерелл путем изоляции от атмосферного воздуха в условиях анаэробиоза существенно не отличаются и в качестве принципиально близких взяты за прототип. Существенным недостатком этих способов является неполная изоляция пастерелл от окружающей среды в условиях анабиоза. Бактерии, являясь нестрогими аэробами, продолжая культивироваться в качестве факультативного анаэроба, постепенно размножаются и диссоциируют, соответственно утрачивая свои биологические свойства. Согласно учению Луи Пастера о направленной изменчивости патогенных микроорганизмов задача по ослаблению биологических свойств пастерелл давно решена, тогда как противоположная задача - по восстановлению и сохранению их идентичными исходным в условиях, близких к природным, - оказывается весьма сложной и пока еще не решена. Поэтому патогенные штаммы пастерелл получают и поддерживают (сохраняют) в лабораторных условиях недостаточно качественными по состоянию выраженности биологических свойств.Preservation of pasteurellas by morphology and virulence (invasiveness) is a problematic issue and depends on the conditions of biological isolation of their microbial cells. The first attempts to keep the microbe of "chicken cholera" (the causative agent of pasteurellosis) identical to the original were made by Louis Pasteur (1860). The scientist isolated the pathogen from atmospheric oxygen, sealed a test tube with a culture of bacteria on chicken broth, and noted that it remained virulent. In connection with this work, F.R. Piskova and Z.N. Kravchenko (1965) reported that pasteurell cultures grown in 1% peptone water under paraffin oil are viable and immunogenic for a long time, and, to a lesser extent, preserve these properties the value is represented by the content in the nutrient medium of blood serums, their concentration and blood belonging to one or another type of animal. Both works on the advisability of preserving pasteurellas by isolation from atmospheric air under conditions of anaerobiosis do not differ significantly and are taken as a prototype in principle close ones. A significant drawback of these methods is the incomplete isolation of pasteurella from the environment under suspended animation. Bacteria, being non-strict aerobes, continuing to be cultivated as an optional anaerobic, gradually multiply and dissociate, correspondingly losing their biological properties. According to the teachings of Louis Pasteur on the directed variability of pathogenic microorganisms, the task of weakening the biological properties of pasteurellas has long been solved, while the opposite task of restoring and keeping them identical to the initial ones under conditions close to natural ones is very difficult and has not yet been solved. Therefore, pathogenic pasteurellum strains are obtained and maintained (maintained) under laboratory conditions, insufficiently qualitative in terms of the severity of biological properties.
Задачей изобретения является получение и сохранение патогенных штаммов пастерелл идентичными исходным по морфологии и вирулентности (инвазивности) путем повышения точности условий выполнения пассажа бактерий через восприимчивый организм и биологической изоляции их от окружающей среды в условия анабиоза.The objective of the invention is to obtain and maintain pathogenic strains of pasteurellus identical to the original ones in morphology and virulence (invasiveness) by increasing the accuracy of the conditions for the passage of bacteria through a susceptible organism and their biological isolation from the environment under suspended animation.
Поставленная задача достигается тем, что восприимчивый организм установленной массы тела заражают на слизистую верхних дыхательных путей и с момента гибели его труп остывает при 15...25 (оптимум 20)°С окружающей среды. С 3 по 4 час после смерти труп вскрывают и сразу же берут кровь из сердца. В крови выявляют изолировавшиеся попарно ("биполярно") в выраженную капсулу пастереллы. Одновременно пастереллы изолируют от питательного субстрата путем центрифугирования и разведений в физиологическом растворе (рН 7,0) в виде морфологически одинаковых, капсулированных коккобактерий, обособленных поодиночке вследствие распада биполярной структуры микроба в жидкой фазе. Коккобактерии в собственной капсуле, полученные в качестве факультативного анаэроба и способные при культивировании давать рост колоний только S-формы, сохраняют в состоянии анабиоза в физиологическом растворе при температуре 20°С в течение 10 суток (оптимум) идентичными исходным по инвазивности или же в жидкой питательной среде при температуре 5°С (оптимум) длительно заблокированными по инвазивности без доступа атмосферного воздуха в наполненных, запаянных и горизонтально расположенных пастеровских пипетках к моменту использования.The task is achieved by the fact that a susceptible organism of a fixed body weight is infected on the mucous membrane of the upper respiratory tract and from the moment of death its corpse cools at 15 ... 25 (optimum 20) ° С of the environment. From 3 to 4 hours after death, the corpse is opened and blood is immediately taken from the heart. Isolated in pairs (“bipolar”) in a pronounced pasteurella capsule is detected in the blood. At the same time, pasteurella is isolated from the nutrient substrate by centrifugation and dilutions in physiological saline (pH 7.0) in the form of morphologically identical, encapsulated coccobacteria isolated separately due to the decay of the microbial bipolar structure in the liquid phase. Coccobacteria in their own capsule, obtained as an optional anaerobic and capable of cultivating only S-form colonies during cultivation, remain in suspended animation in physiological saline at a temperature of 20 ° C for 10 days (optimum) identical to the initial ones in invasiveness or in liquid nutrient medium at a temperature of 5 ° C (optimum), permanently blocked by invasiveness without access to atmospheric air in filled, sealed and horizontally located Pasteur pipettes by the time of use.
Существенным отличием является то, что восприимчивый организм установленной массы тела заражают на слизистую верхних дыхательных путей и с момента гибели его труп остывает при 15...25 (оптимум 20)°С окружающей среды. С 3 по 4 час после смерти труп вскрывают и сразу же берут кровь из сердца. В крови выявляют изолировавшиеся попарно ("биполярно") в выраженную капсулу пастереллы. Одновременно пастереллы изолируют от питательного субстрата путем центрифугирования и разведений в физиологическом растворе (рН 7,0) в виде морфологически одинаковых, капсулированных коккобактерий, обособленных поодиночке вследствие распада биполярной структуры микроба в жидкой фазе. Коккобактерии в собственной капсуле, полученные в качестве факультативного анаэроба и способные при культивировании давать рост колоний только S-формы, сохраняют в состоянии анабиоза в физиологическом растворе при температуре 20°С в течение 10 суток (оптимум) идентичными исходным по инвазивности или же в жидкой питательной среде при температуре 5°С (оптимум) длительно заблокированными по инвазивности без доступа атмосферного воздуха в наполненных, запаянных и горизонтально расположенных пастеровских пипетках к моменту использования.A significant difference is that the susceptible organism of the established body weight is infected on the mucous membrane of the upper respiratory tract and from the moment of death its corpse cools at 15 ... 25 (optimum 20) ° С of the environment. From 3 to 4 hours after death, the corpse is opened and blood is immediately taken from the heart. Isolated in pairs (“bipolar”) in a pronounced pasteurella capsule is detected in the blood. At the same time, pasteurella is isolated from the nutrient substrate by centrifugation and dilutions in physiological saline (pH 7.0) in the form of morphologically identical, encapsulated coccobacteria isolated separately due to the decay of the microbial bipolar structure in the liquid phase. Coccobacteria in their own capsule, obtained as an optional anaerobic and capable of cultivating only S-form colonies during cultivation, remain in suspended animation in physiological saline at a temperature of 20 ° C for 10 days (optimum) identical to the initial ones in invasiveness or in liquid nutrient medium at a temperature of 5 ° C (optimum), permanently blocked by invasiveness without access to atmospheric air in filled, sealed and horizontally located Pasteur pipettes by the time of use.
В работе целесообразно придерживаться определенного стандарта по массе тела восприимчивого организма, по способу заражения его на слизистую верхних дыхательных путей и заражающему материалу, по температурным параметрам и экспозиции.In the work, it is advisable to adhere to a certain standard according to the body weight of a susceptible organism, according to the method of its infection on the mucous membrane of the upper respiratory tract and the infecting material, according to temperature parameters and exposure.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретенияInformation confirming the possibility of carrying out the invention
В исследованиях применяли типичный возбудитель пастереллёза птиц Pasteurella multocida A:I серовара как наиболее распространенный и повсеместно вызывающий заболевание (по нашим данным в 89% случаев эпизоотии). В частности, использовали коллекционированные в разное время и из разных регионов штаммы: Х-73 - эталонный из коллекции Хеддлестоуна, №55, №115, №712, №915, №1931 - контрольно-производственные из коллекции ВГНКИ ветпрепаратов и пять вирулентных полевых. Свойства этих микроорганизмов изучали посредством световой микроскопии, биологической пробы, культивирования на плотной и в жидкой питательных средах, изоляции в физиологическом растворе и в жидкой питательной среде. В качестве наиболее восприимчивой к заражению пастереллами лабораторной биомодели использовали организм голубя массой тела 300-350 г. Препараты для микроскопии окрашивали по Гинсу, Романовскому-Гимза, Граму.The studies used the typical causative agent of pasteurellosis of birds Pasteurella multocida A: I serovar as the most common and ubiquitous disease (according to our data, in 89% of cases of epizootics). In particular, strains collected at different times and from different regions were used: X-73 — reference from the Heddlestone collection, No. 55, No. 115, No. 712, No. 915, No. 1931 — control and production from the VGNKI collection of veterinary preparations and five virulent field ones. The properties of these microorganisms were studied by means of light microscopy, biological samples, cultivation in solid and liquid nutrient media, isolation in physiological saline and in liquid nutrient medium. An organism of a pigeon weighing 300-350 g was used as the most susceptible laboratory biomodel to pasteurell infection. Microscopic preparations were stained according to Gins, Romanovsky-Giemsa, Gram.
Пример 1Example 1
Готовили биологически полноценную микробную клетку пастерелл для изоляции от окружающей среды. С этой целью изучаемые микроорганизмы соответственно стандартизировали путем пассажа через восприимчивый организм при определенных условиях. В качестве восприимчивого организма использовали голубя массой тела 300-350 г. Организм установленной массы тела заражали остывшей бульонной культурой капсулированных пастерелл первой генерации 10-часового возраста (9 ч при 37 и 1 ч при 20±1°С, объем 5 мл) в дозе 0,3 мл интраназально - по полдозы в обе ноздри на слизистую носовой и ротоглоточной полостей. Каждого зараженного содержали и с момента гибели его труп остывал при 15...25 (оптимум 20±1)°С окружающей среды. С 3 по 4 ч после смерти труп вскрывали, сразу же брали кровь из сердца и в крови выявляли выражено капсулированные, биполярные, сильновирулентные (с выраженной инвазивностью) пастереллы. Эти результаты аналогичны описанным в предыдущих работах: Патент РФ №2051970 от 10.01.1996 г. и Патент РФ №2123531 от 20.12.1998 г. Микроорганизмы в таком качестве морфологических и вирулентных свойств в крови из сердца павшего считали стандартизированными и биологически полноценными для изоляции от окружающей среды. Полную капсуляцию пастерелл решено использовать как биологический результат их собственной изоляции, сохраняющий свойства микробной клетки в качестве факультативного анаэроба в условиях анабиоза.A biologically complete microbial pasteurella cell was prepared for isolation from the environment. To this end, the studied microorganisms were respectively standardized by passage through a susceptible organism under certain conditions. A pigeon weighing 300-350 g was used as a susceptible organism. The organism of the established body weight was infected with a cooled broth culture of encapsulated pasteurellas of the first generation of 10 hours of age (9 hours at 37 and 1 hour at 20 ± 1 ° C, volume 5 ml) in a dose 0.3 ml intranasally - half a dose in both nostrils on the mucosa of the nasal and oropharyngeal cavities. Each infected person was kept and from the moment of death his corpse cooled down at 15 ... 25 (optimum 20 ± 1) ° С of the environment. From 3 to 4 hours after death, the corpse was opened, blood was immediately taken from the heart, and encapsulated, bipolar, highly virulent (with pronounced invasiveness) pasteurella were revealed in the blood. These results are similar to those described in previous works: RF Patent No. 2051970 dated 01/10/1996 and RF Patent No. 2123531 dated 12/20/1998. Microorganisms as such morphological and virulent properties in the blood from the heart of the fallen were considered standardized and biologically complete for isolation from the environment. It was decided to use the full encapsulation of pasteurellas as a biological result of their own isolation, preserving the properties of the microbial cell as an optional anaerobic under conditions of suspended animation.
Пример 2Example 2
Биологически полноценную по морфологии и вирулентности микробную клетку пастерелл, подготовленную согласно примеру 1, изолировали от окружающего питательного субстрата и атмосферного воздуха. Для этого трупы зараженных голубей, остывшие при 20±1°С окружающей среды, вскрывали через 3 ч после смерти и из крови сердца изолировали от питательного субстрата выражено капсулированные, биполярные, сильновирулентные (с выраженной инвазивностью) пастереллы на равный по температуре физиологический раствор (20±1°C; рН 7,0). Брали 0,2 мл (4 капли) инфицированной крови и вносили в 1,8 мл физраствора, содержимое встряхивали в течение 1 мин и центрифугировали при 1500 об/мин 5 мин. Надосадочную жидкость считали изолятом биологически полноценных пастерелл из крови в разведении 10 и использовали для приготовления последующих 10-кратных разведений его на физрастворе в рабочем объеме 5 мл, соответственно высевая по 0,5 мл и в жидкую питательную среду объемом по 4,5 мл. Пастереллы в разведениях 10-2, 10-3 и 10-4 на физрастворе и в жидкой питательной среде соответственно изолировали по 0,5-1,0 мл в пастеровские пипетки (предварительно оплавленные по форме ампул с истонченными промежутками или концами в виде капилляров), заполняя по объему, насасывая резиновой грушей, герметично запаивая концы над пламенем огня, дополнительно парафинируя конец последней пайки и горизонтально располагая для изучения на сохранность биологических свойств микробной клетки. Морфологически это были грамотрицательные, капсулированные, одинаковые коккобактерии, обособленные поодиночке вследствие распада биполярной структуры микроба в жидкой фазе, как и описано в предыдущих работах: Патент РФ №2005790 от 15.01.1994 г. и Патент РФ №2051970 от 10.01.1996 г. Все изолированные микроорганизмы давали при культивировании на плотной питательной среде рост колоний только S-формы. Результаты культивирования 10-кратных разведений изолятов пастерелл в жидкой питательной среде при 37±1°С через 15-24 ч свидетельствовали о характерном росте культуры бактерий первой генерации (нежное равномерное помутнение, чуть с голубовато-бирюзовый оттенком на естественном свету, при встряхивании в виде так называемых "муаровых волн", со специфическим запахом) по разведение 10-7, изредка - по разведение 10-6 или 10-8. В пересчете на исходную концентрацию микроба в крови на момент его изоляции, исходя из роста культуры пастерелл по предельному разведению 10-7, определено около 20 млн м.к./мл, а его изолятов в разведениях 10-2, 10-3 и 10-4 - 200, 20 и 2 тыс. м.к./мл соответственно. При этом микроорганизмы в качестве остывшей бульонной культуры капсулированных бактерий первой генерации 10-часового возраста (9 ч при 37 и 1 ч при 20±1°С), приготовленной путем посева 0,5 мл изолята пастерелл из разведения 10-3 (10 тыс. м.к.) в жидкую питательную среду объемом 4,5 мл, в дозе 0,3 мл (около 300 млн. м.к.) соответственно при введении внутримышечно и интраназально вызывали гибель голубей в течение 10-14 ч. Вышеизложенные результаты культурально-морфологических и биологических исследований микроорганизмов, установленные на дату изоляции их микробной клетки, обозначили исходными (контрольными) по отношению к определяемым при последующем изучении изолятов бактерий в зависимости от условий хранения.Biologically full in morphology and virulence, the pasteurellus microbial cell prepared according to Example 1 was isolated from the surrounding nutrient substrate and atmospheric air. For this, the corpses of infected pigeons, cooled at 20 ± 1 ° С of the environment, were opened 3 hours after death, and encapsulated, bipolar, highly virulent (with pronounced invasiveness) pasteurella into physiological saline equal in temperature was opened from the blood of the heart from the nutrient substrate (20 ± 1 ° C; pH 7.0). 0.2 ml (4 drops) of infected blood was taken and added to 1.8 ml of saline, the contents were shaken for 1 min and centrifuged at 1500 rpm for 5 min. The supernatant was considered an isolate of biologically complete pasteurellas from blood at a dilution of 10 and was used to prepare subsequent 10-fold dilutions of it on physiological saline in a working volume of 5 ml, respectively, sowing 0.5 ml each and in a 4.5 ml liquid nutrient medium. Pasteurella at dilutions of 10 -2 , 10 -3 and 10 -4 on saline and in a liquid nutrient medium, respectively, were isolated from 0.5-1.0 ml in Pasteur pipettes (previously fused in the form of ampoules with thinned gaps or ends in the form of capillaries) filling by volume, sucking in with a rubber bulb, hermetically sealing the ends above the flame of fire, additionally waxing the end of the last soldering and horizontally placing the biological properties of the microbial cell for study. Morphologically, these were gram-negative, encapsulated, identical coccobacteria, isolated separately due to the decay of the bipolar structure of the microbe in the liquid phase, as described in previous works: RF Patent No. 20055790 dated January 15, 1994 and RF Patent No. 2051970 dated January 10, 1996 All isolated microorganisms gave only S-form colonies when cultured on a solid nutrient medium. The results of culturing 10-fold dilutions of pasteurella isolates in a liquid nutrient medium at 37 ± 1 ° C after 15-24 hours indicated a characteristic growth of the culture of bacteria of the first generation (gentle uniform turbidity, slightly with a bluish-turquoise tint in natural light, when shaken as the so-called "moire waves", with a specific smell) at a dilution of 10 -7 , occasionally at a dilution of 10 -6 or 10 -8 . In terms of the initial concentration of the microbe in the blood at the time of its isolation, based on the growth of the pasteurella culture according to the maximum dilution of 10 -7 , about 20 million MK / ml were determined, and its isolates in dilutions of 10 -2 , 10 -3 and 10 -4 - 200, 20 and 2 thousand cubic meters / ml, respectively. At the same time, microorganisms as a cooled broth culture of encapsulated bacteria of the first generation of 10 hours of age (9 hours at 37 and 1 hour at 20 ± 1 ° C), prepared by inoculating 0.5 ml of pasteurella isolate from a 10 -3 dilution (10 thousand MK) in a liquid nutrient medium with a volume of 4.5 ml, at a dose of 0.3 ml (about 300 million MK), respectively, when administered intramuscularly and intranasally, death of pigeons was caused within 10-14 hours. The above results were cultural -morphological and biological studies of microorganisms established at the date of isolation of their microorganisms obnoy cells, designated baseline (control) relative to determined the subsequent study bacterial isolates depending on storage conditions.
Пример 3Example 3
Микробную клетку пастерелл, биологически подготовленную и изолированную согласно примерам 1 и 2, изучали на жизнеспособность в зависимости от условий хранения: 1) при анаэробиозе в физиологическом растворе соответственно при 20 и 5±1°С окружающей среды; 2) при анаэробиозе в жидкой питательной среде соответственно при 20 и 5±1°С окружающей среды. В каждом конкретном случае контрольного анализа микробную клетку изолята пастерелл, осевшую по внутренней поверхности запаянной пастеровской пипетки (ампулы), переводили во взвесь путем вращения ампулы между ладонями рук. Затем удостоверялись в герметичности укупорки ампулы, обломив ее конец первой пайки, опустив, при этом, другой (парафинированный) в стерильную пробирку Флоринского. Если содержимое ампулы не истекало, то изолят пастерелл считали хранившимся без доступа атмосферного воздуха (в условиях анаэробиоза). Перевернув ампулу, направив ее вскрытый конец в эту же пробирку, содержимое извлекали, оно истекало, если нарушали целостность запаянного противоположного (парафинированного), обламывая его. Жизнеспособность изолятов пастерелл идентифицировали культурально-морфологически. Содержимое из ампул высевали по 0,5 мл на плотную питательную среду в чашки Петри и в 4,5 мл жидкой питательной среды, культивировали при 37±1°С 15-24 ч. Отличие культурально-морфологических свойств микроба от его исходных (контрольных), описанных в примере 2, или же отсутствие роста культуры бактерий свидетельствовало о влиянии условий хранения на жизнеспособность микробной клетки изолятов пастерелл. Напротив, микробную клетку изолятов пастерелл, дающую при культивировании на плотной питательной среде рост колоний S-формы, отождествляли, по жизнеспособности идентичной исходной. Герметично укупоренные изоляты пастерелл выражено сохранялись жизнеспособными, тогда как в случае доступа атмосферного воздуха они диссоциировали и сравнительно быстрее отмирали. Характерно, что в верхнем уровне жидкой питательной среды уже в 3-4 ч культивирования при 37±1°C было заметно размножение пастерелл в виде слабого помутнения, которое постепенно, равномерно распространялось вниз на весь ее объем к 7-8 ч роста культуры бактерий. Изоляты пастерелл в физрастворе без доступа атмосферного воздуха при 20 и 5±1°С окружающей среды были жизнеспособны 10-15 и 3-5 суток соответственно. Так, хранящиеся при 20±1°С давали при культивировании на плотной питательной среде рост колоний S-формы идентично исходным (контрольным). В то же время хранящиеся при 5±1°C окружающей среды частично диссоциировали и в тех же условиях культивирования давали рост колоний S-, М- и R- формы. При культивировании таких изолятов пастерелл в жидкой питательной среде происходило помутнение ее наглядно больше, чем было исходное (контрольное). При этом на естественном свету цвет культуры диссоциированных пастерелл был с голубовато-желтоватым оттенком, тогда как при оценке исходной (контрольной) культуры пастерелл - с голубовато-бирюзовым оттенком. При каждом хранении изолятов пастерелл окончание периода их жизнеспособности проявлялось крайне ослабленным свойством культивироваться и последующим полным отмиранием микробной клетки в течение 24 ч, в связи с чем бактериологические посевы на плотную и в жидкую питательные среды оставались стерильными. В итоге было очевидным, что жизнеспособность биологически полноценной микробной клетки пастерелл в условиях изоляции от атмосферного воздуха и питательного субстрата зависит и от температуры окружающей жидкой среды.The microbial pasteurella cell, biologically prepared and isolated according to examples 1 and 2, was studied for viability depending on storage conditions: 1) during anaerobiosis in physiological saline at 20 and 5 ± 1 ° С, respectively; 2) with anaerobiosis in a liquid nutrient medium, respectively, at 20 and 5 ± 1 ° C of the environment. In each specific case of the control analysis, the microbial cell of the pasteurellus isolate, which settled on the inner surface of the sealed Pasteur pipette (ampoule), was transferred into suspension by rotating the ampoule between the palms of the hands. Then they made sure that the ampoule was sealed, breaking off the end of the first soldering, lowering, at the same time, the other (waxed) into the Florinsky sterile tube. If the contents of the ampoule did not expire, then the pasteurella isolate was considered stored without access to atmospheric air (under anaerobiosis). Turning the ampoule over, sending its open end to the same test tube, the contents were removed, it expired if the integrity of the sealed opposite (waxed) was broken, breaking it off. The viability of the pasteurell isolates was identified culturally-morphologically. The contents of the ampoules were sown in 0.5 ml per dense nutrient medium in Petri dishes and in 4.5 ml of liquid nutrient medium, cultivated at 37 ± 1 ° C for 15-24 hours. The difference between the cultural and morphological properties of the microbe from its initial (control) described in example 2, or the lack of growth of the culture of bacteria testified to the influence of storage conditions on the viability of the microbial cell of pasteurella isolates. On the contrary, the microbial cell of pasteurella isolates, which, when cultured on a solid nutrient medium, grows S-form colonies, was identified by the same viability as the original. The hermetically sealed pasteurella isolates were pronouncedly viable, while in the event of atmospheric access, they dissociated and died off relatively faster. It is characteristic that in the upper level of the liquid nutrient medium already at 3-4 hours of cultivation at 37 ± 1 ° C, the reproduction of pasteurellas was noticeable in the form of slight turbidity, which gradually uniformly spread down to its entire volume by 7-8 hours of bacterial culture growth. Pasteurella isolates in saline without atmospheric air at 20 and 5 ± 1 ° C of the environment were viable for 10-15 and 3-5 days, respectively. So, stored at 20 ± 1 ° C, when cultured on a solid nutrient medium, the growth of S-form colonies was identical to the initial (control) one. At the same time, the environments stored at 5 ± 1 ° C partially dissociated and under the same cultivation conditions gave rise to colonies of S-, M- and R-forms. During the cultivation of such pasteurell isolates in a liquid nutrient medium, its turbidity was visibly greater than the initial (control) one. Moreover, in natural light, the color of the culture of dissociated pasteurellas was with a bluish-yellowish tint, while when assessing the initial (control) culture of pasteurellas with a bluish-turquoise hue. With each storage of pasteurellus isolates, the end of their viability period was manifested by the extremely weakened ability to cultivate and the subsequent complete death of the microbial cell within 24 hours, in connection with which the bacteriological culture on solid and liquid nutrient media remained sterile. As a result, it was obvious that the viability of a biologically complete microbial pasteurella cell under isolation from atmospheric air and a nutrient substrate also depends on the temperature of the surrounding liquid medium.
Таким образом, биологически полноценная микробная клетка пастерелл, обособленная в капсуле, сохраняет культурально-морфологические свойства идентичными исходным в условиях без атмосферного воздуха, питательного субстрата и при 20±1°С (оптимум) окружающей жидкой среды (например, в физиологическом растворе не изменяется к моменту использования в течение 10 суток).Thus, a biologically complete microbial pasteurellum cell, isolated in a capsule, maintains the cultural and morphological properties identical to the initial ones in conditions without atmospheric air, a nutrient substrate and at 20 ± 1 ° С (optimum) the surrounding liquid medium (for example, in physiological saline does not change to time of use within 10 days).
Изоляты пастерелл в жидкой питательной среде без культивирования и без доступа атмосферного воздуха соответственно при 20 и 5±1°С окружающей среды еще более существенно отличались жизнеспособностью и, причем, прямо противоположно хранящимся в физрастворе. Так, у хранившихся при 20±1°C в связи с размножением их микробной клетки в течение 2-3 суток происходило легкое помутнение среды и в ампулах через 5-7 суток формировался слизистый осадок из диссоциированных микробных клеток, которые при контрольном анализе культивирования обычно давали рост колоний М- и R- форм, а на 10-15 сутки хранения - рост колоний R-формы и, затем, полностью отмирали. Напротив, хранившиеся в состоянии анабиоза при 5±1°С в жидкой питательной среде, при полной прозрачности ее в ампулах, в случае культивирования давали идентично исходным (контрольным) рост колоний S-формы и сохранялись жизнеспособными в течение 3 месяцев (срок наблюдений). Если температурный режим хранения изолятов пастерелл изменялся или же колебался на 5°С и более, то эти бактерии диссоциировали и при контрольном анализе культивирования давали рост колоний М- и R-форм, отмирая по мере доминирования последней. В итоге было очевидным, что биологически полноценная микробная клетка пастерелл, обособленная в капсуле, длительно сохраняется в жидкой питательной среде в состоянии анабиоза без доступа атмосферного воздуха и при стабильной температуре, например 5±1°С, окружающей среды.Pasteurella isolates in a liquid nutrient medium without cultivation and without access to atmospheric air, respectively, at 20 and 5 ± 1 ° C of the environment were even more significantly different in viability and, moreover, directly opposite to those stored in saline. So, in those stored at 20 ± 1 ° C, due to the multiplication of their microbial cell for 2-3 days, a slight turbidity of the medium occurred and in ampoules after 5-7 days a mucous precipitate was formed from dissociated microbial cells, which usually gave the growth of the colonies of M- and R-forms, and on 10-15 days of storage - the growth of colonies of the R-form and, then, completely died off. On the contrary, stored in a state of suspended animation at 5 ± 1 ° C in a liquid nutrient medium, with full transparency in ampoules, in the case of cultivation, they gave identical initial (control) growth of S-form colonies and remained viable for 3 months (observation period). If the temperature regime of storage of pasteurella isolates changed or fluctuated by 5 ° C or more, then these bacteria dissociated and, in the control analysis of cultivation, gave rise to colonies of M- and R-forms, dying as the latter dominated. As a result, it was obvious that the biologically complete microbial pasteurellum cell, isolated in the capsule, is stored for a long time in a liquid nutrient medium in a state of suspended animation without access to atmospheric air and at a stable temperature, for example 5 ± 1 ° С, of the environment.
Таким образом, биологически полноценная микробная клетка пастерелл в капсуле, изолированная из крови сердца в жидкую питательную среду и некультивированной введенная без доступа атмосферного воздуха и при 5±1°С окружающей среды в состояние анабиоза, длительно сохраняет культурально-морфологические свойства идентичными исходным (культивируется в S-форме колонии; срок наблюдений 3 месяца).Thus, a biologically complete microbial pasteurellus cell in a capsule, isolated from the blood of the heart into a liquid nutrient medium and uncultivated, introduced without atmospheric air and at 5 ± 1 ° C of the environment into a state of suspended animation, for a long time maintains the cultural and morphological properties identical to the initial ones (cultivated in S-shaped colony; observation period 3 months).
Пример 4Example 4
Микробную клетку пастерелл, биологически подготовленную и изолированную согласно примерам 1 и 2, изучали на вирулентность в зависимости от условий хранения: 1) при анаэробиозе в физиологическом растворе соответственно при 20 и 5±1°С окружающей среды; 2) при анаэробиозе в жидкой питательной среде соответственно при 20 и 5±1°С окружающей среды. С этой целью удостоверялись в герметичности укупорки ампул и извлекали их содержимое, как описано в примере 3. Микроорганизмы непосредственно из ампул в дозе около 10000 м.к./0,5 мл предварительно за сутки выверенных жизнеспособными из конкретного разведения (например, из разведения 10-3), и в качестве остывшей бульонной культуры капсулированных бактерий первой генерации 10-часового возраста (9 ч при 37 и 1 ч при 20±1°С), приготовленной как и в примере 2, в дозе около 300 млн. м.к./0,3 мл изучали на вирулентность соответственно при введении внутримышечно и интраназально. Внутримышечно вводили всю дозу в одну точку грудной мышцы, а интраназально - по полдозы в обе ноздри на слизистую носовой и ротоглоточной полостей. Микробную клетку изолятов пастерелл идентифицировали вирулентной по гибели зараженных в течение 48 ч (срок наблюдений). В каждом конкретном случае контрольного анализа все жизнеспособные изоляты пастерелл, дающие при культивировании рост колоний S- и М-форм, при введении внутримышечно вызывали гибель голубей в течение 10-30 ч, а в R-форме по росту колоний были авирулентны. Изоляты пастерелл в физрастворе при 5±1°С и в жидкой питательной среде при 20±1°C в течение 2-5 суток диссоциировали и, как утратившие исходные биологические свойства, в последующем не изучались. Характерно, что исходную S-форму колоний при культивировании и вирулентность не изменяли только изоляты пастерелл, изначально сохраняющиеся без доступа атмосферного воздуха в физрастворе при 20±1°С в течение 10 суток и в жидкой питательной среде при 5±1°С в течение 3 месяцев (срок наблюдений). Эти микроорганизмы непосредственно из ампул и в качестве бульонной культуры капсулированных бактерий при внутримышечном введении вызывали гибель голубей в течение 10-14 ч. В итоге было очевидным, что микробная клетка изолятов пастерелл идентична исходной по вирулентности и, по-прежнему, дает при культивировании рост колоний S-формы, если сохраняется в состоянии анабиоза. Однако при внутримышечном заражении восприимчивого организма точно установить и объяснить зависимость вирулентности изолятов пастерелл от условий их подготовки и хранения, даже при явной диссоциации микробной клетки, не представлялось возможным. Напротив, при заражении голубей на слизистую верхних дыхательных путей наблюдали выраженную зависимость вирулентности микроорганизмов от температуры окружающей среды. Так, микробная клетка изолятов пастерелл в состоянии анабиоза, хранящаяся без доступа атмосферного воздуха в физрастворе при 20±1°С в течение 10 суток, непосредственно из ампул введенная интраназально, вызывала гибель голубей в течение 18-24 ч. Эти же микроорганизмы в качестве приготовленной бульонной культуры капсулированных бактерий, дающих рост колоний S-формы, при введении интраназально были также вирулентными - вызывали гибель голубей в течение 10-14 ч идентично исходным (контрольным). В то же время микробная клетка изолятов пастерелл в состоянии анабиоза, хранящаяся также без доступа атмосферного воздуха, но в жидкой питательной среде при 5±1°С в течение 3 месяцев (срок наблюдений), являясь выражено патогенной при внутримышечном введении непосредственно из ампул, не вызывала гибель птиц при инфицировании интраназально. Однако эти же микроорганизмы в качестве молодой бульонной культуры бактерий, капсулированных при 20±1°C в течение 1 ч (оптимум), при введении интраназально уже проявляли вирулентность, но менее выражено - вызывали гибель голубей в течение 24-48 ч. В итоге было очевидным, что неоптимальная температура окружающей среды значительно влияет на инвазивностъ пастерелл, лишая их возможности реализовать свою патогенностъ при естественном пути заражения восприимчивого организма - на слизистую верхних дыхательных путей. Это объясняется тем, что вирулентная микробная клетка пастерелл вместе со своим ферментом инвазивности гиалуронидазой в капсуле блокируются собственной же капсулой из-за ее уплотнения по консистенции под действием температуры окружающей среды ниже от оптимальной. Кроме того, в зависимости от температуры окружающей среды не менее существенное значение для хранения микробной клетки пастерелл представляет и сам питательный субстрат. Если бактерии хранить в состоянии анабиоза, например при 5±1°С окружающей среды, то капсула и питательный субстрат играют консервирующую и защитную роль. Однако при благоприятной температуре, например, при 20±1°С окружающей среды, причем, даже в условиях анаэробиоза, результат прямо противоположный. Микроб, являясь факультативным анаэробом, но не введенный в состояние анабиоза, усваивает через активную по инвазивности капсулу питательный субстрат и постепенно диссоциирует, соответственно утрачивая и капсулу с ферментом патогенности гиалуронидазой, и другие свои биологически ценные исходные свойства. Если же биологически полноценную капсулированную микробную клетку пастерелл, подготовленную согласно примеру 1, изолировать от питательного субстрата в условия анаэробиоза на физраствор при 20±1°С (оптимум) окружающей среды, то в создавшихся стабильных условиях анабиоза бактерии сохраняются уже идентичными исходным и, причем, с выраженным свойством инвазивности при заражении птиц на слизистую верхних дыхательных путей. Поэтому в целях получения биологически полноценной микробной клетки пастерелл следует воспроизводить и изолировать ее согласно примерам 1 и 2. Такую микробную клетку можно сохранять идентичной исходной к моменту использования без доступа атмосферного воздуха на физиологическом растворе при 20±1°С окружающей среды не более 10 суток (оптимум). Этого срока обычно достаточно, чтобы согласно цели и задач выполнить полезную работу с биологически полноценной, стандартизированной микробной штамма пастерелл (например, размножить и лиофилизировать правильно изолированный микроорганизм, или же вывести его из лиофилизированного состояния в полную биологическую активность, приготовить антиген или вакцину, поставить биопробу или же провести ряд научных исследований). Вместе с тем биологически полноценную микробную клетку пастерелл, обособленную в капсуле, введенную в состояние анабиоза без доступа атмосферного воздуха при 5±1°С в жидкой питательной среде, можно сохранять заблокированной по инвазивности для птиц при заражении на слизистую верхних дыхательных путей, но длительно продолжающей быть патогенной при инъекции (3 месяца, срок наблюдений).The microbial pasteurella cell, biologically prepared and isolated according to examples 1 and 2, was studied for virulence depending on storage conditions: 1) with anaerobiosis in physiological saline at 20 and 5 ± 1 ° C, respectively; 2) with anaerobiosis in a liquid nutrient medium, respectively, at 20 and 5 ± 1 ° C of the environment. For this purpose, the capsules were sealed for tightness and their contents were extracted as described in Example 3. Microorganisms directly from the ampoules at a dose of about 10,000 m.c./0.5 ml previously verified viable from a specific dilution (for example, from dilution 10 -3 ), and as a cooled broth culture of encapsulated bacteria of the first generation of 10 hours of age (9 hours at 37 and 1 hour at 20 ± 1 ° C), prepared as in example 2, at a dose of about 300 million m ./0.3 ml was studied for virulence, respectively, when administered intramuscularly and intranasally. The entire dose was intramuscularly injected at one point of the pectoral muscle, and intranasally - at half dose into both nostrils on the mucous membrane of the nasal and oropharyngeal cavities. The microbial cell of the pasteurella isolates was identified as virulent by the death of the infected within 48 hours (observation period). In each specific case of the control analysis, all viable pasteurellum isolates giving rise to cultivation of S- and M-form colonies upon intramuscular administration caused death of pigeons within 10-30 hours, and in the R-form, the growth of colonies was avirulent. Pasteurella isolates in saline at 5 ± 1 ° C and in a liquid nutrient medium at 20 ± 1 ° C for 2-5 days dissociated and, having lost their original biological properties, were not subsequently studied. It is characteristic that the initial S-form of the colonies during cultivation and virulence were not changed only by pasteurella isolates, which initially remained without atmospheric air in saline at 20 ± 1 ° С for 10 days and in a liquid nutrient medium at 5 ± 1 ° С for 3 months (observation period). These microorganisms directly from ampoules and as a broth culture of encapsulated bacteria when administered intramuscularly caused the death of pigeons within 10-14 hours. As a result, it was obvious that the microbial cell of the pasteurella isolates is identical to the original virulence and, as before, gives rise to colony growth during cultivation S-form, if stored in a state of suspended animation. However, with intramuscular infection of a susceptible organism, it was not possible to accurately determine and explain the dependence of the virulence of pasteurella isolates on the conditions of their preparation and storage, even with the obvious dissociation of the microbial cell. On the contrary, when pigeons were infected on the mucosa of the upper respiratory tract, a pronounced dependence of the virulence of microorganisms on the ambient temperature was observed. Thus, the microbial cell of pasteurella isolates in a state of suspended animation, stored without atmospheric air in saline at 20 ± 1 ° C for 10 days, introduced intranasally directly from the ampoules, caused the death of the pigeons within 18-24 hours. The same microorganisms as prepared the broth culture of encapsulated bacteria, giving rise to the growth of S-form colonies, when administered intranasally was also virulent - they caused the death of pigeons within 10-14 hours identical to the initial ones (control). At the same time, the microbial cell of pasteurella isolates in a state of suspended animation, also stored without access to atmospheric air, but in a liquid nutrient medium at 5 ± 1 ° C for 3 months (observation period), being pathogenic when administered intramuscularly directly from ampoules, does not caused the death of birds upon infection intranasally. However, these same microorganisms as a young broth culture of bacteria encapsulated at 20 ± 1 ° C for 1 h (optimum), when introduced intranasally, already showed virulence, but less pronounced - they caused the death of pigeons within 24-48 hours. it is obvious that non-optimal ambient temperature significantly affects the invasiveness of pasteurellas, depriving them of the opportunity to realize their pathogenicity in the natural way of infection of a susceptible organism - on the mucosa of the upper respiratory tract. This is due to the fact that the virulent microbial cell of pasteurell, together with its hyaluronidase invasive enzyme in the capsule, is blocked by its own capsule due to its compaction in consistency under the influence of ambient temperature below the optimum. In addition, depending on the ambient temperature, the nutrient substrate itself is no less important for the storage of the microbial cell pasteurell. If bacteria are stored in a state of suspended animation, for example, at 5 ± 1 ° C of the environment, then the capsule and nutrient substrate play a preservative and protective role. However, at a favorable temperature, for example, at 20 ± 1 ° C of the environment, moreover, even under conditions of anaerobiosis, the result is exactly the opposite. The microbe, being an optional anaerobic, but not brought into a state of suspended animation, assimilates the nutrient substrate through the capsule, which is active in invasiveness, and gradually dissociates, correspondingly losing the capsule with the pathogenicity enzyme hyaluronidase and its other biologically valuable initial properties. If the biologically full-fledged encapsulated microbial cell of pasteurella prepared according to Example 1 is isolated from the nutrient substrate under conditions of anaerobiosis in saline at 20 ± 1 ° С (optimal) environment, then under the created stable conditions of anabiosis, the bacteria remain identical to the initial ones and, moreover, with a pronounced invasive property during infection of birds on the mucosa of the upper respiratory tract. Therefore, in order to obtain a biologically complete microbial cell, pasteurella should be reproduced and isolated according to examples 1 and 2. Such a microbial cell can be kept identical to the original one at the time of use without access to atmospheric air in physiological saline at 20 ± 1 ° С for no more than 10 days ( optimum). This period is usually enough to carry out useful work with a biologically complete, standardized microbial strain of pasteurella according to the goals and objectives (for example, to multiply and lyophilize a properly isolated microorganism, or to remove it from the lyophilized state to full biological activity, prepare an antigen or vaccine, and put a biological test or conduct a series of scientific studies). At the same time, a biologically full-fledged microbial cell of pasteurell, isolated in a capsule, entered into a state of suspended animation without access to atmospheric air at 5 ± 1 ° C in a liquid nutrient medium, can be kept blocked by invasiveness for birds during infection on the mucosa of the upper respiratory tract, but for a long time be pathogenic by injection (3 months, observation period).
Пример 5Example 5
Изучали микробную клетку эталонного штамма пастерелл Х-73 на культурально-морфологические свойства и заражающую эффективность в зависимости от способа хранения: 1) в состоянии анаэробиоза - на курином бульоне без доступа атмосферного воздуха по способу Л.Пастера (1880); 2) в состоянии анаэробиоза - на 1%-ной пептонной воде под вазелиновым маслом по способу Ф.Р.Пискового и З.Н.Кравченко (1965); 3) в состоянии анабиоза - сухая (лиофилизированная) под вакуумом по общепринятому способу; 4) в состоянии анабиоза - биологически изолированная в собственной капсуле, при 20±1°С в физрастворе без доступа атмосферного воздуха по заявляемому способу; 5) в состоянии анабиоза - биологически изолированная в собственной капсуле, при 5±1°С в жидкой питательной среде без доступа атмосферного воздуха по заявляемому способу. Микробную клетку пастерелл, в каждом конкретном случае контрольного анализа, изучали в 10-суточном сроке хранения. Бактерии из условий хранения в пробирке или ампуле высевали в жидкую и на плотную питательные среды, культивировали при 37±1°С в течение 24 ч и сравнивали по культурально-морфологическим свойствам. Микробные образцы, соответственно способу хранения исходной микробной клетки, в качестве остывшей бульонной культуры капсулированных бактерий 10-часового возраста (9 ч при 37 и 1 ч при 20±1°С) проверяли на вирулентность в зависимости от способа заражения голубей - внутримышечно или интраназально. Технически заражение выполняли, как и в примере 4. Бактерии идентифицировали вирулентными по гибели зараженных птиц в течение 48 ч (срок наблюдений). Вместе с тем, исходные свойства микробной клетки пастерелл (рост колоний только S-формы на плотной и нежный голубовато-бирюзовый рост в жидкой питательных средах при культивировании и вирулентность с оценкой по инвазивности и скорости гибели зараженных через 10-14 ч), приведенные в примере 2, служили контрольными.We studied the microbial cell of the reference pasteurell X-73 strain for cultural-morphological properties and infection efficiency depending on the storage method: 1) in the state of anaerobiosis - on chicken broth without atmospheric air using the method of L. Pasteur (1880); 2) in the state of anaerobiosis - in 1% peptone water under liquid paraffin according to the method of F.R. Piskovy and Z.N. Kravchenko (1965); 3) in a state of suspended animation - dry (lyophilized) under vacuum according to the generally accepted method; 4) in a state of suspended animation - biologically isolated in its own capsule, at 20 ± 1 ° C in saline without access to atmospheric air according to the claimed method; 5) in a state of suspended animation - biologically isolated in its own capsule, at 5 ± 1 ° C in a liquid nutrient medium without access to atmospheric air according to the claimed method. The microbial cell of pasteurellus, in each case of the control analysis, was studied in a 10-day shelf life. Bacteria from storage conditions in a test tube or ampoule were seeded in liquid and solid nutrient media, cultured at 37 ± 1 ° C for 24 hours, and compared according to cultural morphological properties. Microbial samples, corresponding to the method of storing the original microbial cell, as a cooled broth culture of 10-hour-old encapsulated bacteria (9 hours at 37 and 1 hour at 20 ± 1 ° C) were tested for virulence, depending on the method of pigeon infection, intramuscularly or intranasally. Technically, infection was performed, as in Example 4. Bacteria were identified as virulent by the death of infected birds within 48 hours (observation period). At the same time, the initial properties of the pasteurellum microbial cell (growth of S-form colonies only on dense and gentle bluish-turquoise growth in liquid culture media during cultivation and virulence with an estimate of the invasiveness and death rate of infected after 10-14 hours), shown in the example 2, served as control.
Пастереллы, являясь факультативными анаэробами, культивировались без доступа атмосферного воздуха, причем даже при температуре окружающей среды значительно ниже от оптимальной. Так, микробная клетка пастерелл в состоянии анаэробиоза по 1- и 2-му способам хранения медленно культивировалась в контрольных посевах без доступа атмосферного воздуха, в темноте, при 15-23°С окружающей среды. Бактерии, слабо усваивая питательный субстрат, постепенно в течение 3-4 суток размножались, затем частично изменялись (диссоциировали) и уже на 10-е сутки хранения давали при культивировании в контрольном посеве колонии М-формы, тогда как изначально исходной (контрольной) была только S-форма колоний. Аналогично и культура пастерелл, значительно быстрее выращенная в аэробных условиях при оптимальной температуре окружающей среды (37±1°С), после чего хранящаяся по 1- и 2-му способам без доступа атмосферного воздуха, на 10-е сутки уже тоже содержала диссоциированные микробные клетки, дающие при культивировании в контрольном посеве колонии только М-формы. При этом, как правило, микробные образцы в качестве бульонной культуры пастерелл вызывали гибель голубей при инъекции (например, внутримышечно). Зараженные гибли через 13-16 ч. В то же время эти бактерии при введении интраназально вызывали гибель голубей крайне изредка и не ранее чем через 30 ч.Pasteurella, being facultative anaerobes, was cultivated without access to atmospheric air, and even at ambient temperature it was much lower than optimal. Thus, the microbial cell of pasteurella in the state of anaerobiosis according to the 1st and 2nd storage methods was slowly cultivated in control crops without access to atmospheric air, in the dark, at 15-23 ° C of the environment. Bacteria, poorly assimilating the nutrient substrate, multiplied gradually over 3-4 days, then partially changed (dissociated), and already on the 10th day of storage were given during cultivation in the control inoculum of the M-colony colony, whereas the initial (control) was only S-shape colonies. Similarly, the pasteurella culture, grown much faster under aerobic conditions at the optimum ambient temperature (37 ± 1 ° C), after which it was stored according to the 1st and 2nd methods without access to atmospheric air, already on the 10th day also contained dissociated microbial cells giving only M-forms when cultured in a control culture of a colony. In this case, as a rule, microbial samples as a broth culture of pasteurells caused the death of pigeons upon injection (for example, intramuscularly). The infected died within 13-16 hours. At the same time, these bacteria, when administered intranasally, caused the death of pigeons extremely rarely and not earlier than after 30 hours.
Микробная клетка пастерелл по 3- и 5-му способам хранения, в отличие от хранящейся по другим изучаемым способам, сохранялась в состоянии анабиоза, вызванного под влиянием низкой температуры окружающей среды при стабильном режиме. Бактерии на 10-е сутки хранения были близки к исходным (контрольным). Однако эти бактерии при культивировании на плотной питательной среде давали рост колоний, близких к колониям S-формы исходного (контрольного) роста, и при этом по цвету уже с оттенком несколько подобным, как и у колонии М-формы. Также и при культивировании в жидкой питательной среде рост этих бактерий несколько отличался от исходного. Бульонная культура этих бактерий уже была менее прозрачная и несколько с голубовато-желтоватым оттенком в отличие от исходной (контрольной), которая нежнее, прозрачнее и с голубовато-бирюзовым оттенком на естественном свету. При этом изучаемые микробные образцы в качестве бульонной культуры пастерелл при введении внутримышечно вызывали гибель голубей через 10-12, а при введении интраназально - через 24-48 ч. Однако были случаи, когда при введении культуры пастерелл интраназально голуби не гибли в течение 48 и, даже, 72 ч (срок наблюдений).According to the 3rd and 5th storage methods, the pasteurella microbial cell, unlike that stored by other studied methods, remained in a state of suspended animation caused by the influence of low ambient temperature under stable conditions. Bacteria on the 10th day of storage were close to the original (control). However, when cultured on a solid nutrient medium, these bacteria gave rise to colonies close to the S-form colonies of the initial (control) growth, and at the same time the color was already somewhat shade similar to that of the M-form colony. Also, when cultured in a liquid nutrient medium, the growth of these bacteria was somewhat different from the initial one. The broth culture of these bacteria was already less transparent and somewhat bluish-yellowish in contrast to the original (control), which is more tender, transparent and with a bluish-turquoise hue in natural light. Moreover, the studied microbial samples as a broth culture of pasteurella when administered intramuscularly caused the death of pigeons after 10-12, and when administered intranasally after 24-48 hours. However, there were cases when the introduction of the culture of pasteurell intranasally did not die within 48 and, even 72 hours (observation period).
Микробная клетка пастерелл по 4-му способу хранения, в отличие от хранящейся по всем другим изучаемым способам, сохранилась в состоянии анабиоза без влияния низкой температуры окружающей среды, являясь биологически изолированной от питательного субстрата и атмосферного воздуха в собственной капсуле на физиологическом растворе при 20±1°С (оптимум) окружающей среды. Бактерии на 10-е сутки хранения давали при культивировании в контрольном посеве рост колоний только S-формы идентично исходным (контрольным). Рост этих бактерий в жидкой питательной среде был тоже идентичен исходному (контрольному). При этом микробный образец в качестве бульонной культуры пастерелл с весьма выраженной заражающей эффективностью как при внутримышечном, так и при интраназальном введении вызывал гибель голубей через 9-13 ч с разницей в 1-2 ч. При многократном проведении культурально-морфологических и биологических исследований результаты были аналогичными.According to the 4th storage method, the pasteurella microbial cell, unlike that stored in all other studied methods, was preserved in a state of suspended animation without the influence of low ambient temperature, being biologically isolated from the nutrient substrate and atmospheric air in its own capsule in physiological saline at 20 ± 1 ° C (optimum) of the environment. Bacteria on the 10th day of storage gave, when cultured in a control crop, the growth of only S-form colonies was identical to the initial (control). The growth of these bacteria in a liquid nutrient medium was also identical to the initial (control) one. At the same time, a microbial sample as a pasteurella broth culture with a very pronounced infectious efficiency both with intramuscular and intranasal administration caused the death of pigeons after 9-13 hours with a difference of 1-2 hours. With repeated cultural, morphological and biological studies, the results were similar.
Таким образом, хранение пастерелл в состоянии анабиоза является эффективным лабораторным опытом сохранения их биологических свойств. Биологически полноценная микробная клетка пастерелл, полученная в виде обособленной в выраженной капсуле коккобактерии и в качестве факультативного анаэроба, сохраняется в условиях анабиоза идентичной исходной в зависимости от температуры окружающей среды. Патогенные штаммы пастерелл характеризуются идентичными исходным по росту колоний S-формы на плотной питательной среде и по вирулентности (инвазивности) при заражении восприимчивого организма на слизистую верхних дыхательных путей.Thus, storage of pasteurells in a state of suspended animation is an effective laboratory experience in preserving their biological properties. A biologically full-fledged microbial cell of pasteurell obtained in the form of a coccobacteria isolated in a pronounced capsule and as an optional anaerobic is preserved under conditions of suspended animation identical to the initial one depending on the ambient temperature. Pathogenic pasteurellum strains are characterized by identical initial ones in the growth of S-form colonies on a dense nutrient medium and in virulence (invasiveness) when a susceptible organism is infected on the mucosa of the upper respiratory tract.
Вышеизложенные результаты исследований в пяти приведенных примерах, подтверждающих возможность осуществления изобретения, многократно воспроизведены и использованы в целях разработки и применения метода биологического контроля иммуногенности вакцин против пастереллёза птиц, отличающегося большей объективностью постановки биопробы по заражению птиц, близко к природному. Исходя из установленного, предлагаемый способ содержит существенные отличия научно-практического значения и может быть использован в микробиологии, биотехнологии, эпизоотологии, эпидемиологии, а также в условиях современной биологической промышленности.The above research results in the five examples cited confirming the possibility of carrying out the invention were repeatedly reproduced and used to develop and apply a method for biological control of the immunogenicity of vaccines against bird pasteurellosis, which is more objective in setting up a biological test for bird infection, close to natural. Based on the established, the proposed method contains significant differences of scientific and practical value and can be used in microbiology, biotechnology, epizootology, epidemiology, as well as in modern biological industry.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004122269/13A RU2286391C2 (en) | 2004-07-19 | 2004-07-19 | Method for biological isolation of pathogenic pasteurellas for storing and followed application |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004122269/13A RU2286391C2 (en) | 2004-07-19 | 2004-07-19 | Method for biological isolation of pathogenic pasteurellas for storing and followed application |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2004122269A RU2004122269A (en) | 2006-01-27 |
| RU2286391C2 true RU2286391C2 (en) | 2006-10-27 |
Family
ID=36047194
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2004122269/13A RU2286391C2 (en) | 2004-07-19 | 2004-07-19 | Method for biological isolation of pathogenic pasteurellas for storing and followed application |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2286391C2 (en) |
-
2004
- 2004-07-19 RU RU2004122269/13A patent/RU2286391C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ветеринарные препараты, под ред. ОСИДЗЕ Д.Ф., М., Колос, 1981, с.238. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2004122269A (en) | 2006-01-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Welshimer | Isolation of Listeria monocytogenes from vegetation | |
| Welshimer | Survival of Listeria monocytogenes in soil | |
| Thorley | A Simplified Method for the Isolation of Bacteroides nodusus from Ovine Foot‐rot and Studies on its Colony Morphology and Serology | |
| Cohen | The bacteriology of abscess of the lung and methods for its study | |
| CN108904796B (en) | Rabbit hemorrhagic disease virus baculovirus vector, pasteurella multocida disease bivalent inactivated vaccine and preparation method thereof | |
| Bryant | The isolation and characteristics of a spirochete from the bovine rumen | |
| Gibbs et al. | The interaction in vitro between human polymorphonuclear leukocytes and Neisseria gonorrhoeae cultivated in the chick embryo. | |
| JPS60176580A (en) | Culture of freeze drying microorgansim | |
| Hoppe | Methods for isolation of Bordetella pertussis from patients with whooping cough | |
| Wainwright et al. | History of microbiology | |
| Takahashi et al. | Relation of colonial morphologies in soft agar to morphological and biological properties of the K-9 strain of Klebsiella pneumoniae and its variants | |
| RU2286391C2 (en) | Method for biological isolation of pathogenic pasteurellas for storing and followed application | |
| US4472378A (en) | Live vaccine for the prevention of salmonellosis in water fowl, a process for making and applying the same | |
| Symington | Improved transport system for Neisseria gonorrhoeae in clinical specimens | |
| HANSON et al. | The Biology and Morphology of Crithidia acanthocephali n. sp., Leptomonas leptoglossi n. sp., and Blastocrithidia euschisti n. sp. | |
| Boileau et al. | Lyophilization of Bdellovibrio bacteriovorus 109J for Long‐Term Storage | |
| CN105031636B (en) | A kind of Aeromonas hydrophila and Aeromonas veronii bivalent inactivated vaccine and preparation method | |
| RU2286390C2 (en) | Method for bird inoculation with pasteurellosis excitant for biological test version | |
| Welsch | Evidence for the occurrence of true lysogeny among actinomycetes | |
| RU2445367C2 (en) | Method for standartisation of control seed strain pasteurella multocida | |
| Mushin et al. | Studies on Pasteurella gallinarum | |
| RU2818959C1 (en) | Pasteurella multocida "pm - b" bacterium strain for manufacture of biopreparations for specific prevention of pasteurellosis (hemorrhagic septicemia) in cattle caused by serogroup b pasteurella | |
| RU2717535C1 (en) | Method for extracting pure culture of pasteurellosis activator pasteurella multocida | |
| US3843451A (en) | Microorganism production | |
| EA032485B1 (en) | Dry living camel plague vaccine |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20100720 |