RU2272072C1 - Method for isolation of nucleic acids - Google Patents

Method for isolation of nucleic acids Download PDF

Info

Publication number
RU2272072C1
RU2272072C1 RU2004126133/13A RU2004126133A RU2272072C1 RU 2272072 C1 RU2272072 C1 RU 2272072C1 RU 2004126133/13 A RU2004126133/13 A RU 2004126133/13A RU 2004126133 A RU2004126133 A RU 2004126133A RU 2272072 C1 RU2272072 C1 RU 2272072C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
dna
sorbent
buffer solution
tris
solution containing
Prior art date
Application number
RU2004126133/13A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Павел Петрович Лактионов (RU)
Павел Петрович Лактионов
Светлана Николаевна Тамкович (RU)
Светлана Николаевна Тамкович
Елена Юрьевна Рыкова (RU)
Елена Юрьевна Рыкова
Валентин Викторович Власов (RU)
Валентин Викторович Власов
Original Assignee
Павел Петрович Лактионов
Валентин Викторович Власов
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Павел Петрович Лактионов, Валентин Викторович Власов filed Critical Павел Петрович Лактионов
Priority to RU2004126133/13A priority Critical patent/RU2272072C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2272072C1 publication Critical patent/RU2272072C1/en

Links

Images

Landscapes

  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

FIELD: biotechnology, molecular biology, biochemistry.
SUBSTANCE: invention proposes a method for isolation of nucleic acids that involves adsorption of nucleic acids from a sample on fiberglass sorbent treated preliminary with hydrofluoric acid followed by washing out a sorbent from impurities on non-nucleotide nature and elution of nucleic acid being the adsorption process is carried out in the presence of a chaotropic agent. Using the invention provides the enhanced yield of the end product and to decrease duration of process of isolation of nucleic acids. Invention can be used in medicine.
EFFECT: improved isolating method.
10 cl, 2 dwg, 7 ex

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии, а именно к способу выделения и очистки дезоксирибонуклеиновых (ДНК) и рибонуклеиновых (РНК) кислот из биологических жидкостей и иных образцов.The invention relates to the field of biotechnology and molecular biology, and in particular to a method for the isolation and purification of deoxyribonucleic (DNA) and ribonucleic (RNA) acids from biological fluids and other samples.

Получение высокоочищенных нуклеиновых кислот (НК) является важной проблемой в молекулярной биологии. Для получения НК из биологических жидкостей используют такие методы, как центрифугирование в градиенте CsCl2, гельфильтрацию, обработку фенолом и осаждение спиртом. Эти методы отличаются длительностью, многостадийностью и трудоемкостью.The production of highly purified nucleic acids (NKs) is an important problem in molecular biology. To obtain NK from biological fluids, methods such as CsCl 2 gradient centrifugation, gel filtration, phenol treatment, and alcohol precipitation are used. These methods are distinguished by their duration, multi-stage and laboriousness.

Наиболее распространенным способом выделения НК является способ, включающий обработку биологической жидкости фенолом с последующим осаждением выделенного целевого продукта спиртом [1]. Недостатками данного способа являются длительность выделения НК (не менее 3,5 ч в связи с переосаждением целевого продукта), неудобство работы с фенолом и хлороформом, а также низкий выход низкомолекулярного продукта (25-50%).The most common way to isolate NK is a method involving the treatment of biological fluid with phenol, followed by precipitation of the selected target product with alcohol [1]. The disadvantages of this method are the duration of the allocation of NK (not less than 3.5 hours due to reprecipitation of the target product), the inconvenience of working with phenol and chloroform, as well as the low yield of low molecular weight product (25-50%).

Известен способ выделения РНК, путем смешивания гомогенизованного в 4 М растворе гуанидин тиоцианата (ГТЦ) образца с водонасыщенным фенолом с формированием монофазного раствора [2]. После добавления хлороформа происходит разделение фаз: РНК находится в водной фазе, тогда как ДНК и белки ассоциированы с интерфазой и органической фазой. Недостатками данного способа являются длительность выделения РНК (около 3 ч), многостадийность процесса, неудобство работы с фенолом и хлороформом, а также низкий выход низкомолекулярного продукта (7%).A known method of RNA isolation, by mixing a sample homogenized in a 4 M solution of guanidine thiocyanate (GTZ) with water-saturated phenol with the formation of a monophasic solution [2]. After the addition of chloroform, phase separation occurs: RNA is in the aqueous phase, while DNA and proteins are associated with the interphase and the organic phase. The disadvantages of this method are the duration of RNA isolation (about 3 hours), the multi-stage process, the inconvenience of working with phenol and chloroform, as well as the low yield of low molecular weight product (7%).

Известен способ выделения ДНК из клинических образцов с использованием мелкодисперсного мешированного (стандартизованного по размеру) стекла [3]. Способ заключается в том, что ДНК адсорбируют из буферного раствора, содержащего 4 М ГТЦ, 0,1 М ЭДТА (рН 8,0) в течение 10 мин., затем отделяют силикатный сорбент центрифугированием (30 сек при 1000 g), промывают силикатный сорбент дважды буфером для адсорбции, дважды 70% этанолом и один раз ацетоном. Силикатный сорбент сушат в течение 10 мин при 56°С, а затем элюируют ДНК инкубацией с буфером, содержащим 10 мМ трис-HCl, 10 мМ ЭДТА (рН 8.0) (ТЕ-буфер) при нагревании до 56°С в течение 10 мин.A known method of DNA extraction from clinical samples using finely divided mixed (standardized in size) glass [3]. The method consists in the fact that DNA is adsorbed from a buffer solution containing 4 M GTZ, 0.1 M EDTA (pH 8.0) for 10 minutes, then the silicate sorbent is separated by centrifugation (30 sec at 1000 g), the silicate sorbent is washed twice with adsorption buffer, twice with 70% ethanol and once with acetone. The silicate sorbent is dried for 10 min at 56 ° С, and then the DNA is eluted by incubation with a buffer containing 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA (pH 8.0) (TE buffer) while heating to 56 ° С for 10 min.

Недостатками данного способа являются длительность выделения ДНК (30-40 мин), низкая сорбционная емкость силикатного сорбента (на 1 мг мешированного мелкодисперсного стекла адсорбируется 0,5 мкг ДНК). Данный способ позволяет выделять ДНК длиной более 40 т.п.н., при этом удается элюировать с силикатного сорбента не более 40-50% ДНК в связи с тем, что 50-60% адсорбированной ДНК необратимо связывается с мешированным мелкодисперсным стеклом. Таким образом, выход ДНК длиной не менее 40 т.п.н. составляет от 40 до 50%.The disadvantages of this method are the duration of DNA extraction (30-40 min), low sorption capacity of the silicate sorbent (0.5 μg of DNA is adsorbed per 1 mg of mixed fine glass). This method allows to isolate DNA with a length of more than 40 TPN, while it is possible to elute from the silicate sorbent no more than 40-50% of the DNA due to the fact that 50-60% of the adsorbed DNA is irreversibly bound to the mixed fine glass. Thus, a DNA yield of at least 40 kbp makes up from 40 to 50%.

Известен способ выделения ДНК из биологических жидкостей на силикатном сорбенте, обработанном азотной кислотой [4]. Для этого мелкодисперсное стекло обрабатывают в течение часа концентрированной HNO3, затем отмывают водой, адсорбцию ДНК на данное стекло и элюцию с силикатного сорбента осуществляют в условиях вышеописанного аналога.A known method of DNA extraction from biological fluids on a silicate sorbent treated with nitric acid [4]. To do this, finely dispersed glass is treated with concentrated HNO 3 for one hour, then washed with water, the adsorption of DNA to this glass and elution from the silicate sorbent are carried out under the conditions of the analogue described above.

Недостатками данного способа являются длительность выделения ДНК (30-40 мин), низкая сорбционная емкость силикатного сорбента (на 1 мг мелкодисперсного стекла адсорбируется 0,5 мкг ДНК). Данный способ позволяет выделять ДНК длиной более 40 т.п.н., при этом удается элюировать с силикатного сорбента не более 40-50% в связи с тем, что 50-60% адсорбированной ДНК необратимо связывается с мелкодисперсным стеклом. Таким образом, выход ДНК длиной не менее 40 т.п.н. составляет от 40 до 50%.The disadvantages of this method are the duration of DNA extraction (30-40 min), low sorption capacity of the silicate sorbent (0.5 μg of DNA is adsorbed per 1 mg of fine glass). This method allows DNA to be isolated with a length of more than 40 kb, while it is possible to elute from the silicate sorbent no more than 40-50% due to the fact that 50-60% of the adsorbed DNA irreversibly binds to fine glass. Thus, a DNA yield of at least 40 kbp makes up from 40 to 50%.

Известен способ выделения НК, включающий адсорбцию НК на аэросиле (А-300) в среде хаотропного агента, отделение сорбента и связанной с ним ДНК, элюцию ДНК с аэросила и очистку целевого продукта. Аэросил вносят в раствор, содержащий НК до конечной концентрации 0,3-0,6%, при этом для выделения однонитевой ДНК и РНК используют среду с содержанием 0,5-2 М ГТЦ, а для выделения двунитевой ДНК используют среду с содержанием 4 М ГТЦ [5]. Недостатками данного способа являются его длительность и трудоемкость.A known method of separating NK, including adsorption of NK on Aerosil (A-300) in a chaotropic agent, separation of the sorbent and its associated DNA, elution of DNA from Aerosil and purification of the target product. Aerosil is introduced into a solution containing NK to a final concentration of 0.3-0.6%, while a medium with a content of 0.5-2 M GTZ is used to isolate single-stranded DNA and RNA, and a medium with a content of 4 M is used to isolate double-stranded DNA GTZ [5]. The disadvantages of this method are its duration and complexity.

Наиболее близким к заявляемому способу-прототипу является способ выделения НК, включающий смешивание исходного образца с буферным раствором, содержащим хаотропный агент, адсорбцию НК путем фильтрации полученной смеси через стекловолокнистый сорбент (фильтр GF/F), промывание сорбента и связанной с ним НК, элюцию НК и очистку целевого продукта [6]. При этом для выделения ДНК к 50 мкл образца, ресуспендированного в 50 мМ трис-HCl, рН 8.0, 10 мМ ЭДТА, добавляют 350 мкл 4 М ГТЦ, содержащим 2% саркозила, и наносят на фильтр GF/F, центрифугируют 2-3 мин, промывают центрифугированием 1 раз 400 мкл 4 М ГТЦ (без саркозила), 2 раза по 400 мкл 80%-ным изопропанолом, высушивают фильтры при 37°С в течение 10 мин, ДНК элюируют 100 мкл воды. Для выделения РНК к 300 мкл образца добавляют 100 мкл 4 МГТЦ, инкубируют при 70°С в течение 2-3 мин, переносят на фильтр GF/F, центрифугируют 5-10 с, промывают центрифугированием 2 раза 1 М ГТЦ (по 400 мкл), 2 раза 80%-ным изопропанолом, высушивают фильтры при 37°С в течение 10 мин, РНК элюируют 50 мкл воды.Closest to the claimed prototype method is a method of separating NK, including mixing the initial sample with a buffer solution containing a chaotropic agent, adsorption of NK by filtering the mixture through a glass fiber sorbent (filter GF / F), washing the sorbent and associated NK, elution of NK and purification of the target product [6]. Moreover, to isolate DNA, 350 μl of 4 M GTZ containing 2% sarcosyl is added to 50 μl of a sample resuspended in 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA, and applied to a GF / F filter, centrifuged for 2-3 min , washed by centrifugation 1 time with 400 μl of 4 M GTZ (without sarcosyl), 2 times with 400 μl of 80% isopropanol, the filters were dried at 37 ° C for 10 min, DNA was eluted with 100 μl of water. To isolate RNA, 300 μl of 4 MHC are added to 300 μl of the sample, incubated at 70 ° C for 2-3 minutes, transferred to a GF / F filter, centrifuged for 5-10 s, washed by centrifugation 2 times with 1 M GTZ (400 μl each) 2 times with 80% isopropanol, the filters are dried at 37 ° C for 10 min, RNA is eluted with 50 μl of water.

Недостатками прототипа являются ограниченные функциональные возможности способа, недостаточный выход целевого продукта из-за низкой сорбционной емкости сорбента. Данный способ позволяет выделять только высокомолекулярную НК, при этом удается элюировать с фильтра не более 40-50% высокомолекулярной НК в связи с тем, что 50-60% адсорбированной НК необратимо связывается с носителем. Таким образом, выход высокомолекулярной НК составляет от 40 до 50%, а НК с низкой молекулярной массой выделяется значительно менее эффективно.The disadvantages of the prototype are the limited functionality of the method, insufficient yield of the target product due to the low sorption capacity of the sorbent. This method allows you to select only high molecular weight NK, while it is possible to elute from the filter no more than 40-50% of high molecular weight NK due to the fact that 50-60% of the adsorbed NK irreversibly binds to the carrier. Thus, the yield of high molecular weight nanocrystals is from 40 to 50%, and nanocrystals with a low molecular weight are released much less efficiently.

Технической задачей изобретения является повышение выхода целевого продукта, уменьшение длительности процесса, повышение функциональных возможностей способа за счет возможности выделять молекулы НК заданной длины.An object of the invention is to increase the yield of the target product, reduce the duration of the process, increase the functionality of the method due to the ability to isolate NK molecules of a given length.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, который заключается в адсорбции НК на заранее обработанном плавиковой кислотой стекловолокнистом сорбенте в буферном растворе, содержащем хаотропный агент, промывке сорбента от биополимеров ненуклеотидной природы и последующей элюции НК раствором, содержащим ионы бикарбоната и ЭДТА, либо дистиллированной водой, либо буферными растворами с концентрацией не более 0,1 М. В результате полученный супернатант представляет собой раствор очищенной НК, пригодной для молекулярно-биологических исследований без дополнительных стадий очистки и концентрирования.The task is achieved by the proposed method, which consists in adsorption of nanocrystals on a glass fiber sorbent pre-treated with hydrofluoric acid in a buffer solution containing a chaotropic agent, washing the sorbent from non-nucleotide biopolymers and subsequent elution of the nanocrystals with a solution containing bicarbonate and EDTA ions, either with distilled water or with buffer solutions with a concentration of not more than 0.1 M. As a result, the resulting supernatant is a solution of purified NK, suitable for molecular biological further studies without additional purification and concentration steps.

Заявляемый способ включает следующие последовательные стадии:The inventive method includes the following sequential stages:

1. Предварительная обработка стекловолокнистого сорбента (СВС) 0,1-7% плавиковой кислотой в течение 1-6 ч с последующей отмывкой и высушиванием обработанного СВС (ОСВС). Полученный ОСВС набивают в наконечник для дозатора объемом 100-1000 мкл (получают фильтр); либо запекают стекловату в пресс-форме при температуре более 500°С в течение 5-30 минут, затем формируют диски при помощи высечки, которые затем вставляют в пробирки в качестве фильтровальной перегородки (второй вариант фильтра). В качестве стекловолокнистых материалов используют стекловату из стекла марки М20, стекловату из нейтрального стекла, минеральную стекловату из базальтового стекловолокна, содержащие в качестве основного компонента двуокись кремния.1. Pre-treatment of glass fiber sorbent (SHS) with 0.1-7% hydrofluoric acid for 1-6 hours, followed by washing and drying of the treated SHS (WWS). The obtained OSVS is filled into the tip for a dispenser with a volume of 100-1000 μl (receive a filter); or bake glass wool in a mold at a temperature of more than 500 ° C for 5-30 minutes, then form disks using die-cutting, which are then inserted into test tubes as a filter septum (second filter option). As fiberglass materials, glass wool from M20 brand glass, glass wool from neutral glass, mineral glass wool from basalt glass fiber containing silicon dioxide as the main component are used.

2. Выделение НК из биологических жидкостей адсорбцией на ОСВС путем фильтрации образца через данный сорбент в буферном растворе, содержащем хаотропный агент, при этом выделение ДНК длиной 500 п.н. и более проводят в буферном растворе, содержащем 4,5 М ГТЦ, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-ацетат, рН 6.4; выделение ДНК длиной 50-500 п.н. проводят в буферном растворе, содержащем 4,5 М ГТЦ, 20-70% этанол, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-ацетат, рН 6.4, а выделение РНК проводят в буферном растворе, содержащем 1 М ГТЦ, 20-70% изопропанол, 20 мМ ЭДТА, 1,3 мМ диэтилпирокарбонат (ДЭПК), 10 мМ трис-ацетат, рН 4.5.2. Isolation of NK from biological fluids by adsorption on an SIA by filtering a sample through a given sorbent in a buffer solution containing a chaotropic agent, and the isolation of DNA with a length of 500 bp and more carried out in a buffer solution containing 4.5 M GTZ, 20 mm EDTA, 10 mm Tris-acetate, pH 6.4; DNA isolation with a length of 50-500 bp carried out in a buffer solution containing 4.5 M GTZ, 20-70% ethanol, 20 mm EDTA, 10 mm Tris-acetate, pH 6.4, and the selection of RNA is carried out in a buffer solution containing 1 M GTZ, 20-70% isopropanol, 20 mM EDTA, 1.3 mM diethyl pyrocarbonate (DEPC), 10 mM Tris-acetate, pH 4.5.

3. Промывание ОСВС и связанной с ним НК сначала дважды рабочим буферным раствором для сорбции ДНК или РНК (содержащим 4,5 М ГТЦ, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-ацетат, рН 6.4 для выделения ДНК длиной 500 п.н. и более; 4,5 М ГТЦ, 20-70% этанол, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-HCl, рН 6.4 для выделения ДНК длиной 50-500 п.н. и более; либо 1 М ГТЦ, 20 мМ ЭДТА, 1,3 мМ диэтилпирокарбонат (ДЭПК), 10 мМ трис-ацетат, рН 4.5 для выделения РНК) и дважды буферным раствором, содержащим 60-80% этанол, 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 8.0;3. The washing of the SIA and associated NK with a double working buffer solution for sorption of DNA or RNA (containing 4.5 M GTZ, 20 mM EDTA, 10 mM Tris-acetate, pH 6.4 for DNA isolation with a length of 500 bp or more ; 4.5 M GTZ, 20-70% ethanol, 20 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 6.4 to isolate DNA with a length of 50-500 bp or more; or 1 M GTZ, 20 mM EDTA, 1, 3 mM diethyl pyrocarbonate (DEPC), 10 mM Tris-acetate, pH 4.5 to isolate RNA) and twice with a buffer solution containing 60-80% ethanol, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0;

4. Элюцию НК с ОСВС буферным раствором, содержащим 5-50 мМ ионов бикарбоната (НСО3-), 5-10 мМ ЭДТА, рН 8.0-10.0 (преимущественный вариант), либо дистиллированной водой, либо другими буферными растворами с концентрацией не более 0,1 М.4. Elution of NK with SISF buffer solution containing 5-50 mM bicarbonate ions (HCO 3 - ), 5-10 mM EDTA, pH 8.0-10.0 (preferred option), or with distilled water, or other buffer solutions with a concentration of not more than 0 ,1M.

Для фильтрации образца через ОСВС и его промывки могут быть использованы следующие виды фильтрации: фильтрование под давлением, вакуумная фильтрация или фильтрация при помощи центрифугирования.The following types of filtration can be used for filtering a sample through an SIA and washing it: pressure filtration, vacuum filtration, or centrifugal filtration.

Время выделения НК данным способом составляет 10 минут. Способ обеспечивает выделение НК длиной от 100 п.н. до высокомолекулярных фракций из биологических образцов с высокой эффективностью и не зависит от концентрации НК в образце.The time of allocation of NK by this method is 10 minutes. The method provides the selection of NK from a length of 100 bp to high molecular fractions from biological samples with high efficiency and does not depend on the concentration of NK in the sample.

В табл. 1 представлены данные по элюции Р32-радиоактивно-меченой ДНК (длиной от 100 до 200 п.н.) и Р32-радиоактивно-меченой РНК (100 н.) различными элюентами. Из табл.1 видно, что элюция НК, связанных с ОСВС, буфером, содержащим ионы бикарбоната и ЭДТА более эффективна, чем ТЕ-буфером и не зависит от количества адсорбированной ДНК. На фиг.1 изображен электрофорез ДНК в 1% агарозном геле, содержащем 0,0003% бромистого этидия. С первой по четвертую дорожку нанесены разведения исходного маркера длины ДНК М13 (от 100 н.п. о 955 н.п.) (Сибэнзим, Новосибирск). На дорожки с пятой по восьмую - нанесены разведения маркера длины ДНК М13, после выделения М13 ДНК адсорбцией на ОСВС заявляемым способом. Из фиг.1 видно, что предложенный способ позволяет выделять как низкомолекулярные, так и высокомолекулярные фрагменты ДНК. На фиг.2 изображен электрофорез РНК, выделенной различными способами: 1 - заявляемым способом, 2 - при помощи обработки фенолом. РНК выделяли из клеток линии А431. Из фиг.2 видно, что заявляемый способ позволяет более эффективно выделять как низкомолекулярные, так и высокомолекулярные фрагменты РНК.In the table. 1 shows the data on the elution of P 32 -radio-labeled DNA (length from 100 to 200 bp) and P 32 -radio-labeled RNA (100 n) with various eluents. From table 1 it is seen that the elution of NK associated with OSVS, a buffer containing bicarbonate and EDTA ions is more effective than a TE buffer and does not depend on the amount of adsorbed DNA. Figure 1 shows the electrophoresis of DNA in a 1% agarose gel containing 0.0003% ethidium bromide. From the first to the fourth track, dilutions of the initial marker of the length of the M13 DNA (from 100 bp to 955 bp) were plotted (Sibenzim, Novosibirsk). On tracks from fifth to eighth, dilutions of the M13 DNA length marker are plotted, after the M13 DNA was isolated by adsorption on the SISF by the claimed method. Figure 1 shows that the proposed method allows you to select both low molecular weight and high molecular weight DNA fragments. Figure 2 shows the electrophoresis of RNA isolated in various ways: 1 - by the claimed method, 2 - by treatment with phenol. RNA was isolated from A431 cells. Figure 2 shows that the inventive method allows more efficient to isolate both low molecular weight and high molecular weight RNA fragments.

В табл.2 представлены данные по извлечению Р 32-радиоактивно-меченой ДНК (длиной от 1000 до 100 п.н.) и Р32-радиоактивно-меченой РНК (длиной 100 н.), внесенных в плазму крови человека предложенным способом. В табл.3 представлены данные по выделению РНК из клеток линии А 431 при помощи обработки фенолом [1], при помощи гуанидин-фенольной экстракции [3], а также по выделению РНК путем фильтрации через ОСВС предложенным способом. Из обеих таблиц видно, что заявляемый способ обеспечивает практически количественное выделение НК из биологических жидкостей за существенно меньшее время.Table 2 presents the data on the extraction of P 32 radio-labeled DNA (length from 1000 to 100 bp) and P 32- radio-labeled RNA (length 100 N.) introduced into human blood plasma by the proposed method. Table 3 presents the data on the isolation of RNA from cells of the A 431 line by treatment with phenol [1], by means of guanidine-phenol extraction [3], as well as on the isolation of RNA by filtration through SIA proposed method. From both tables it can be seen that the inventive method provides almost quantitative selection of NK from biological fluids in significantly less time.

Определяющими отличительными признаками предлагаемого способа, по сравнению с прототипом, являются:The defining hallmarks of the proposed method, compared with the prototype, are:

1) В качестве сорбента используют стекловолокно (содержащее в качестве основного компонента двуокись кремния), обработанное 0.1-7% раствором плавиковой кислоты в течение 1-6 часов, что позволяет увеличить рабочую поверхность и сорбционную емкость последнего. ОСВС связывает как низкомолекулярные, так и высокомолекулярные фрагменты НК. Из таблицы 2 видно, что емкость ОСВС в 10 раза выше, чем необработанного СВС. Более высокомолекулярные фрагменты ДНК ОСВС связывает более эффективно (данные не представлены).1) As a sorbent, glass fiber (containing silicon dioxide as the main component) is used, treated with 0.1-7% hydrofluoric acid solution for 1-6 hours, which allows to increase the working surface and sorption capacity of the latter. OSVS binds both low molecular weight and high molecular weight fragments of NK. From table 2 it can be seen that the capacity of the SIA is 10 times higher than that of untreated SHS. The higher molecular weight DNA fragments of the SISF binds more efficiently (data not shown).

2) Для выделения ДНК длиной 500 п.н. и более используют буферный раствор, содержащий 4,5 М ГТЦ, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-ацетат, рН 6.4, для выделения ДНК длиной 50-500 п.н. используют буферный раствор, содержащий 4,5 М ГТЦ, 20-70% этанол, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-ацетат, рН 6.4, а для выделения РНК - 1 М ГТЦ, 20 мМ ЭДТА, 1,3 мМ диэтилпирокарбонат (ДЭПК), 10 мМ трис-ацетат, рН 4.5, что позволяет обеспечить количественное выделение НК заданной длины.2) For DNA isolation with a length of 500 bp and more use a buffer solution containing 4.5 M GTZ, 20 mm EDTA, 10 mm Tris-acetate, pH 6.4, for DNA extraction with a length of 50-500 bp use a buffer solution containing 4.5 M GTZ, 20-70% ethanol, 20 mM EDTA, 10 mM Tris-acetate, pH 6.4, and to isolate RNA - 1 M GTZ, 20 mM EDTA, 1.3 mM diethyl pyrocarbonate (DEPC ), 10 mM Tris-Acetate, pH 4.5, which allows for quantitative extraction of NK of a given length.

При этом промывку сорбента осуществляют под давлением, с использованием вакуумной фильтрации или при помощи центрифугирования, что обеспечивает выделение НК более быстрым, технологичным и воспроизводимым способом. Промывка сорбента буферным раствором для сорбции ДНК или РНК, а затем буферным раствором, содержащим 60-80% этанол, 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 8.0 обеспечивает эффективное удаление примесей ненуклеотидной природы, отсутствие потерь НК, связанных с сорбентом. Благодаря этому выделенные НК пригодны для молекулярно-биологических исследований без дополнительных стадий очистки.In this case, the sorbent is washed under pressure, using vacuum filtration or by centrifugation, which ensures the separation of nanocrystals in a faster, more technologically advanced and reproducible way. Washing the sorbent with a buffer solution for sorption of DNA or RNA, and then with a buffer solution containing 60-80% ethanol, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 ensures the effective removal of impurities of a non-nucleotide nature and the absence of NC losses associated with the sorbent. Due to this, the isolated nanocrystals are suitable for molecular biological studies without additional purification steps.

При этом элюцию связанных с сорбентом НК преимущественно осуществляют обработкой ОСВС буферным раствором, содержащим 5-50 мМ ионов бикарбоната, 5-10 мМ ЭДТА, рН 8.0-10.0, что позволяет более быстро и количественно отделять от сорбента НК.In this case, the elution of nanoparticles associated with the sorbent is predominantly carried out by treating the SISF with a buffer solution containing 5–50 mM bicarbonate ions, 5–10 mM EDTA, pH 8.0–10.0, which allows more rapid and quantitative separation from the sorbent.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.The invention is illustrated by the following examples of specific performance of the method.

Пример 1Example 1

Для адсорбции ДНК проводят предварительную обработку СВС на основе нейтрального стекловолокна плавиковой кислотой с концентрацией 3,5% на качалке в течение 4 ч, ОСВС высушивают при 200°С в течение 1 ч. В чашку Петри с отмытыми физиологическим раствором клетками человеческой эпидермальной карциномы А431 добавляют 0,5 мл смеси, содержащей 4,5 М ГТЦ, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-ацетат рН 6.4, тщательно ресуспендируют и наносят на ОСВС, набитый в наконечник дозатора объемом 100-1000 мкл. Затем при помощи дозатора продавливают (фильтруют) нанесенную на ОСВС смесь, обеспечивая таким образом адсорбцию ДНК на ОСВС и одновременное удаление смеси, не содержащей ДНК. ОСВС промывают от примесей ненуклеотидной природы дважды буферным раствором, содержащим 4,5 М ГТЦ, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-ацетат рН 6.4, а затем дважды буферным раствором, содержащим 20% этанола, 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl рН 8.0. Элюируют ДНК с ОСВС буферным раствором, содержащим 50 мМ NaHCO3, 5 мМ ЭДТА при рН 10.0 в течение 2 мин. После центрифугирования при 10000 g в течение 1 мин собирают супернатант, содержащий ДНК, рН раствора нейтрализуют 1/10 объема 100 мМ трис-HCl, рН 7.1.For DNA adsorption, a preliminary treatment of SHS based on neutral glass fiber with hydrofluoric acid with a concentration of 3.5% on a shaker for 4 hours is carried out, the SISF is dried at 200 ° C for 1 hour. Human epidermal carcinoma A431 cells are added to a Petri dish with physiological saline washed 0.5 ml of a mixture containing 4.5 M GTZ, 20 mM EDTA, 10 mM Tris-Acetate pH 6.4, are carefully resuspended and applied to the SIA, filled into the dispenser tip with a volume of 100-1000 μl. Then, with the help of a dispenser, the mixture deposited on the SISF is squeezed (filtered), thereby ensuring the adsorption of DNA on the SISC and the simultaneous removal of the mixture containing no DNA. SIAs are washed from impurities of a non-nucleotide nature twice with a buffer solution containing 4.5 M GTZ, 20 mm EDTA, 10 mm Tris-acetate pH 6.4, and then twice with a buffer solution containing 20% ethanol, 100 mm NaCl, 10 mm Tris-HCl pH 8.0. Elute the DNA with the SISF buffer solution containing 50 mM NaHCO 3 , 5 mM EDTA at pH 10.0 for 2 min. After centrifugation at 10,000 g for 1 min, the supernatant containing DNA was collected, the pH of the solution was neutralized with 1/10 volume of 100 mM Tris-HCl, pH 7.1.

Для оценки полноты выделения ДНК заявляемым способом были проведены сравнительные эксперименты по выделению ДНК путем ее осаждения трихлоруксусной кислотой и адсорбцией кислотонерастворимой фракции на нейлоновых фильтрах. Для этого клетки человеческой эпидермальной карциномы А431 выращивали на среде с Н3-тимидином. Н3-меченую ДНК выделяли из одинакового количества (106) клеток предлагаемым способом адсорбции на ОСВС и стандартным способом адсорбции ДНК на нейлоновых фильтрах. Для выделения ДНК на фильтре аликвоту клеток (106) переносили на 0,2 мкм нейлоновый фильтр, промывали 0,15 M NaCl и фиксировали 5% трихлоруксусной кислотой. Радиоактивность ДНК, выделенной различными способами, измеряли на β-сцинтиляционном счетчике RacBeta 1211. Было установлено, что радиоактивность H3-меченой ДНК, выделенной различными способами, была одинаковой. Таким образом, было показано, что предлагаемый способ обеспечивает количественное выделение ДНК. Содержание ДНК в пробе определяли при помощи измерения флуоресценции образцов в комплексе с Hoechst 32258. Флуоресценцию комплексов ДНК с Hoechst 32258 измеряли на флуориметре Hitachi MPF4 при длине волны возбуждения 350-360 нм и испускания 480-495 нм [5]. Для построения калибровочных кривых был использован стандартный раствор фрагментированной ДНК из тимуса теленка в концентрациях 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 нг/мл. Данным способом из 2×106 клеток линии А 431 было выделено 10 мкг ДНК. Время выделения ДНК из образцов данным способом составляет 8-10 мин. Емкость стекла по связыванию ДНК составляет до 2,3 мкг ДНК на 1 мг ОСВС.To assess the completeness of DNA extraction by the claimed method, comparative experiments were performed on the extraction of DNA by precipitation with trichloroacetic acid and adsorption of an acid-insoluble fraction on nylon filters. For this, cells of human epidermal carcinoma A431 were grown on a medium with H 3 -thymidine. H 3 -labeled DNA was isolated from the same number (10 6 ) of cells by the proposed adsorption method on the SIA and the standard method of DNA adsorption on nylon filters. To isolate DNA on the filter, an aliquot of cells (10 6 ) was transferred to a 0.2 μm nylon filter, washed with 0.15 M NaCl and fixed with 5% trichloroacetic acid. The radioactivity of DNA isolated by various methods was measured on a RacBeta 1211 β-scintillation counter. It was found that the radioactivity of H 3 -labeled DNA isolated by various methods was the same. Thus, it was shown that the proposed method provides a quantitative selection of DNA. The DNA content in the sample was determined by measuring the fluorescence of the samples in complex with Hoechst 32258. The fluorescence of DNA complexes with Hoechst 32258 was measured on a Hitachi MPF4 fluorimeter at an excitation wavelength of 350-360 nm and emission of 480-495 nm [5]. To construct the calibration curves, we used a standard solution of fragmented DNA from calf thymus at concentrations of 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 ng / ml. In this way, 10 μg of DNA was isolated from 2 × 10 6 cells of line A 431. The time of DNA extraction from samples by this method is 8-10 minutes. The DNA binding capacity of the glass is up to 2.3 μg DNA per 1 mg SBS.

Пример 2Example 2

Для адсорбции ДНК проводили предварительную обработку стекловаты из стекла марки М20 инкубированием с 7% плавиковой кислотой на качалке в течение 2 часов, отмывали, затем запекали в пресс-форме при 600°С в течение 15 мин, формировали диск необходимого диаметра при помощи высечки и помещали его в пробирку (получали фильтр с перегородкой из ОСВС).For DNA adsorption, M20 glass wool was pretreated by incubation with 7% hydrofluoric acid on a rocking chair for 2 hours, washed, then baked in a mold at 600 ° C for 15 minutes, a disk of the required diameter was formed by die cutting and placed it in a test tube (received a filter with a partition from the SIS).

В чашку Петри с отмытыми физиологическим раствором клетками добавляли 0,5 мл смеси, содержащей 4,5 М ГТЦ, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-ацетат, рН 6.4, тщательно ресуспендировали и затем наносили на ОСВС. Затем образцы центрифугировали 1 мин при 300 g. ОСВС промывали дважды буферным раствором, содержащим 4,5 М ГТЦ, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-ацетат, рН 6.4, а затем дважды буферным раствором, содержащим 60% этанола, 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 8.0. Элюировали ДНК с ОСВС 5 мМ NaHCO3, 10 мМ ЭДТА при рН 8.0 в течение 2 мин. После центрифугирования при 10000 g 1 мин собирали супернатант, содержащий ДНК, рН раствора нейтрализовали 1/10 объема 100 мМ трис-HCl, рН 7.1. Время выделения ДНК из образцов данным способом составляет 8-10 мин.0.5 ml of a mixture containing 4.5 M GTZ, 20 mM EDTA, 10 mM Tris-acetate, pH 6.4 was added to a Petri dish with washed saline cells, carefully resuspended and then applied to the SIS. Then the samples were centrifuged for 1 min at 300 g. The SIA was washed twice with a buffer solution containing 4.5 M GTZ, 20 mM EDTA, 10 mM Tris-acetate, pH 6.4, and then twice with a buffer solution containing 60% ethanol, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0. DNA was eluted with an SIA of 5 mM NaHCO 3 , 10 mM EDTA at pH 8.0 for 2 min. After centrifugation at 10,000 g for 1 min, the supernatant containing DNA was collected, the pH of the solution was neutralized by 1/10 volume of 100 mM Tris-HCl, pH 7.1. The time of DNA extraction from samples by this method is 8-10 minutes.

Пример 3Example 3

К 0,5 мл плазмы крови человека добавляли 1 мл смеси, содержащей 4,5 М ГТЦ, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-ацетат, рН 6.4, тщательно ресуспендировали и затем наносили на ОСВС, полученный аналогично примеру 1. Процедуру выделения и определения концентрации ДНК при помощи флуоресценции комплексов ДНК с Hoechst 32258 проводили аналогично примерам 1 и 2. Концентрация ДНК в плазме крови здоровых доноров составила 20 нг/мл плазмы.To 0.5 ml of human blood plasma was added 1 ml of a mixture containing 4.5 M GTZ, 20 mM EDTA, 10 mM Tris-acetate, pH 6.4, carefully resuspended and then applied to the SIA obtained analogously to example 1. Procedure for isolation and determination DNA concentrations using fluorescence of DNA complexes with Hoechst 32258 were carried out analogously to examples 1 and 2. The concentration of DNA in the blood plasma of healthy donors was 20 ng / ml plasma.

Пример 4Example 4

Для адсорбции РНК проводили предварительную обработку базальтового стекловолокна 0,4%-ной плавиковой кислотой на качалке в течение 3 ч, затем ОСВС запекали в пресс-форме при 650°С в течение 10 мин, высекали диски необходимого диаметра и помещали их в пробирки. Для выделения РНК были использованы клетки человеческой эпидермальной карциномы А431. Клетки культивировали в среде ДМЕМ, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки в атмосфере 5% CO2 при 37°С. Для диссоциации выращенных клеток использовали 0.25% раствор трипсина. После нейтрализации трипсина, клетки переносили в пробирки и осаждали центрифугированием при 2500 g в течение 5 мин. Осажденные клетки ресуспендировали в 20 мкл физиологического раствора и добавляли 60 мкл лизис-буфера, содержащего 0.6% Nonidet P40, 50 мМ трис-HCl, 0.15 М NaCl, 5 мМ NaF, 1 мМ PMSF, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ Na3MoO4. Клетки инкубировали 15 мин и центрифугировали в течение 10 мин при 14000 об/мин (центрифуга Eppendorf5410) для разделения мембранно-цитозольной и ядерной фракции. Супернатант, содержащий мембранно-цитозольную фракцию, переносили в другие пробирки и добавляли 1 мл буфера, содержащего 1 М ГТЦ, 2 мМ ДЭПК, 20% изопропанол, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-ацетат рН 4.5. Смесь интенсивно перемешивали на вортексе 10 сек и затем наносили на ОСВС. Для фильтрации образца через сорбент и отмывки сорбента была использована фильтрация под давлением. Супернатант удаляли, сорбент промывали дважды буферным раствором, содержащим 1 М ГТЦ, 20 мМ ЭДТА, 2 мМ ДЭПК, 10 мМ трис-ацетат рН 4.5, 20% изопропанол, а затем дважды буферным раствором, содержащим 80% этанола, 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 8.0. Элюировали РНК с ОСВС буферным раствором, содержащим 40 мМ NaHCO3,, 7 мМ ЭДТА, рН 9.0, в течение 2 мин. После центрифугирования при 10000 g в течение 1 мин, собирали супернатант, содержащий РНК, раствор нейтрализовали 1/10 объема 100 мМ трис-HCl до рН 7.1.For RNA adsorption, basalt fiberglass was pretreated with 0.4% hydrofluoric acid on a shaker for 3 hours, then the SISF was baked in a mold at 650 ° C for 10 min, disks of the required diameter were cut out and placed in test tubes. Cells of human epidermal carcinoma A431 were used to isolate RNA. Cells were cultured in DMEM containing 10% fetal calf serum in an atmosphere of 5% CO 2 at 37 ° C. A 0.25% trypsin solution was used to dissociate the grown cells. After neutralizing trypsin, the cells were transferred to tubes and pelleted by centrifugation at 2500 g for 5 min. The precipitated cells were resuspended in 20 μl of physiological saline and 60 μl of lysis buffer containing 0.6% Nonidet P40, 50 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 5 mM NaF, 1 mM PMSF, 2 mM EDTA, 1 mM Na 3 MoO 4 was added. . Cells were incubated for 15 min and centrifuged for 10 min at 14,000 rpm (Eppendorf5410 centrifuge) to separate the membrane-cytosolic and nuclear fractions. The supernatant containing the membrane-cytosolic fraction was transferred to other tubes and 1 ml of buffer containing 1 M GTZ, 2 mM DEPC, 20% isopropanol, 20 mM EDTA, 10 mM Tris-acetate pH 4.5 was added. The mixture was vortexed vigorously for 10 seconds and then applied to the SIS. Pressure filtration was used to filter the sample through the sorbent and wash the sorbent. The supernatant was removed, the sorbent was washed twice with a buffer solution containing 1 M GTZ, 20 mM EDTA, 2 mM DEPC, 10 mM Tris-acetate pH 4.5, 20% isopropanol, and then twice with a buffer solution containing 80% ethanol, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0. RNA with SISF was eluted with a buffer solution containing 40 mM NaHCO 3 , 7 mM EDTA, pH 9.0, for 2 min. After centrifugation at 10,000 g for 1 min, the supernatant containing RNA was collected, the solution was neutralized by 1/10 volume of 100 mM Tris-HCl to pH 7.1.

Содержание РНК в пробе определяли спектрофотометрически. В результате из 1×106 клеток линии А 431 было выделено 28 мкг РНК. Время приготовления образца с последующим выделением РНК составило 20 мин.The RNA content in the sample was determined spectrophotometrically. As a result, 28 μg of RNA was isolated from 1 × 10 6 cells of the A 431 line. The sample preparation time with subsequent RNA isolation was 20 min.

Пример 5Example 5

Для адсорбции РНК проводили предварительную обработку нейтрального стекловолокна 0,1%-ной плавиковой кислотой инкубированием на качалке в течение 6 ч. Сорбент изготавливали запеканием в пресс-форме при 550°С в течение 20 мин. Обработку клеток линии А-431 для получения мембранно-цитозольной фракции осуществляли аналогично примеру 4. Далее супернатант, содержащий мембранно-цитозольную фракцию, переносили в другие пробирки, добавляли 1 мл буфера, содержащего 1 М ГТЦ, 2 мМ ДЭПК, 20 мМ ЭДТА, 70% изопропанол, 10 мМ трис-ацетат рН 4.5. Смесь интенсивно перемешивали на вортексе 10 сек и затем наносили на ОСВС. Для фильтрации образца через сорбент и отмывки сорбента была использована вакуумная фильтрация. ОСВС промывали дважды буферным раствором, содержащим 1 М ГТЦ, 2 мМ ДЭПК, 20 мМ ЭДТА, 40% изопропанол, 10 мМ трис-ацетат рН 4.5, а затем дважды буферным раствором, содержащим 75% этанола, 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 8.0. Элюировали РНК с ОСВС дистиллированной водой в течение 5 мин. После центрифугирования при 10000 g в течение 1 мин собирали супернатант, содержащий РНК.To adsorb RNA, neutral glass fiber was pretreated with 0.1% hydrofluoric acid by incubation on a rocking chair for 6 hours. The sorbent was made by baking in a mold at 550 ° C for 20 min. The processing of A-431 cells to obtain a membrane-cytosolic fraction was carried out analogously to example 4. Next, the supernatant containing the membrane-cytosolic fraction was transferred to other tubes, 1 ml of buffer containing 1 M GTZ, 2 mM DEPC, 20 mM EDTA, 70 was added % isopropanol, 10 mM Tris-acetate pH 4.5. The mixture was vortexed vigorously for 10 seconds and then applied to the SIS. Vacuum filtration was used to filter the sample through the sorbent and wash the sorbent. The SIA was washed twice with a buffer solution containing 1 M GTZ, 2 mM DEPC, 20 mM EDTA, 40% isopropanol, 10 mM Tris-Acetate pH 4.5, and then twice with a buffer solution containing 75% ethanol, 100 mM NaCl, 10 mM Tris- HCl, pH 8.0. RNA was eluted with SISR with distilled water for 5 minutes. After centrifugation at 10,000 g for 1 min, the supernatant containing RNA was collected.

Содержание РНК в пробе определяли спектрофотометрически. В результате из 1×106 клеток линии А 431 было выделено 20 мкг РНК. Время выделения РНК из супернатанта, содержащего мембранно-цитозольную фракцию, составило 10 мин.The RNA content in the sample was determined spectrophotometrically. As a result, 20 μg of RNA was isolated from 1 × 10 6 cells of the A 431 line. The time for RNA isolation from the supernatant containing the membrane-cytosolic fraction was 10 min.

Пример 6Example 6

К 0,2 мл плазмы крови человека добавляли 2 мл буферного раствора, содержащего 1 М ГТЦ, 2 мМ ДЭПК, 20 мМ ЭДТА, 70% изопропанол, 10 мМ трис-ацетат рН 4.5. Смесь интенсивно перемешивали на вортексе 10 сек и наносили на ОСВС. Процедуру выделения РНК проводили аналогично примерам 4 и 5. Содержание РНК в пробе определяли при помощи измерения флуоресценции образцов в комплексе с SYBR Green II. Флуоресценцию комплексов РНК с SYBR Green измеряли на флуориметре Bio-Rad при длине волны возбуждения 490 нм и испускания 520 нм [5].To 0.2 ml of human blood plasma was added 2 ml of a buffer solution containing 1 M GTZ, 2 mM DEPC, 20 mM EDTA, 70% isopropanol, 10 mM Tris-acetate pH 4.5. The mixture was vortexed vigorously for 10 seconds and applied to the SIA. The RNA isolation procedure was carried out similarly to examples 4 and 5. The RNA content in the sample was determined by measuring the fluorescence of the samples in combination with SYBR Green II. The fluorescence of RNA complexes with SYBR Green was measured on a Bio-Rad fluorimeter at an excitation wavelength of 490 nm and emission of 520 nm [5].

Пример 7Example 7

Для адсорбции ДНК длиной 100 п.н. проводили предварительную обработку СВ С на основе нейтрального стекловолокна инкубированием с 0,1%-ной плавиковой кислотой на качалке в течение 2 ч. ОСВС высушивали при 200°С в течение 1 ч. Продукты ПЦР-реакции разгоняли в 1% агарозном геле, содержащим 0,0003% бромистого этидия, затем визуализировали ДНК под УФ-излучателем и вырезали искомый фрагмент ДНК длиной 100 п.н. Кусочек агарозы помещали в пробирку и инкубировали в течение 10 мин при 65°С. К расплавленной агарозе (0,1 мл) добавляли 1 мл смеси, содержащей 4.5 М ГТЦ, 20 мМ ЭДТА, 70% этанол, 10 мМ трис-ацетат, рН 6.4, тщательно ресуспендировали и наносили на ОСВС, набитый в наконечник дозатора объемом 100-1000 мкл. Затем нанесенную на ОСВС смесь продавливали при помощи дозатора. ОСВС промывали дважды буферным раствором, содержащим 4.5 М ГТЦ, 20 мМ ЭДТА, 50% этанол, 10 мМ трис-ацетат, рН 6.4, а затем дважды буферным раствором, содержащим 80% этанола, 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 8.0. Элюировали ДНК с ОСВС при помощи ТЕ-буфера в течение 2 мин. После центрифугирования при 10000 g в течение 1 мин собирали супернатант, содержащий ДНК.For DNA adsorption of 100 bp in length preliminarily processed neutral carbon fiber based CB С by incubation with 0.1% hydrofluoric acid on a rocking chair for 2 hours. The SIA was dried at 200 ° C for 1 hour. The PCR reaction products were dispersed in a 1% agarose gel containing 0 , 0003% ethidium bromide, then DNA was visualized under a UV emitter and the desired DNA fragment of 100 bp was cut out. A piece of agarose was placed in a test tube and incubated for 10 min at 65 ° C. To molten agarose (0.1 ml) was added 1 ml of a mixture containing 4.5 M GTZ, 20 mM EDTA, 70% ethanol, 10 mM Tris-acetate, pH 6.4, carefully resuspended and applied to the SIA filled in a 100- dispenser tip 1000 μl Then, the mixture deposited on the SISF was pressed through with a dispenser. The SIA was washed twice with a buffer solution containing 4.5 M GTZ, 20 mm EDTA, 50% ethanol, 10 mm Tris-acetate, pH 6.4, and then twice with a buffer solution containing 80% ethanol, 100 mm NaCl, 10 mm Tris-HCl, pH 8.0. DNA with SIA was eluted with a TE buffer for 2 minutes. After centrifugation at 10,000 g for 1 min, the supernatant containing DNA was collected.

Использование предлагаемого способа позволит, по сравнению с прототипом:Using the proposed method will allow, in comparison with the prototype:

- уменьшить расход носителя; удешевить процесс выделения НК;- reduce media consumption; reduce the cost of the allocation of NK;

- увеличить эффективность выделения НК в 10 раз за счет эффективной сорбции и элюции адсорбированной на носителе НК;- increase the efficiency of NC extraction by 10 times due to the effective sorption and elution of the adsorbed NC on the carrier;

- повысить функциональные возможности способа за счет обеспечения возможности выделения как низкомолекулярных, так и высокомолекулярных фрагментов НК, а также НК заданной длины;- to increase the functionality of the method by providing the ability to highlight both low molecular weight and high molecular weight fragments of NK, as well as NK of a given length;

- уменьшить время процедуры выделения до 8-10 мин;- reduce the time of the isolation procedure to 8-10 minutes;

- увеличить чувствительность ПЦР - и ОТ - ПНР - диагностических систем за счет связывания низкомолекулярных фрагментов НК;- increase the sensitivity of PCR - and RT - PNR - diagnostic systems due to the binding of low molecular weight fragments of NK;

- обеспечить возможность использования предложенного способа для количественного определения концентрации НК в биологических жидкостях;- to provide the possibility of using the proposed method for the quantitative determination of the concentration of NK in biological fluids;

- уменьшить количество биологического материала, используемого для выделения НК с целью последующей амплификации или иного исследования.- reduce the amount of biological material used to isolate NK for the purpose of subsequent amplification or other research.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИINFORMATION SOURCES

1. Short protocols in molecular biology. Third edition. Wiley, 1995.1. Short protocols in molecular biology. Third edition. Wiley, 1995.

2. Chomezynski P., Mackey K. Single-step method of total RNA isolation by acid Guanidine-Phenol extraction // Organelles and cellular structures. 1996. V.10. P.221-224.2. Chomezynski P., Mackey K. Single-step method of total RNA isolation by acid Guanidine-Phenol extraction // Organelles and cellular structures. 1996. V.10. P.221-224.

3. Beld M., Sol С., Goudsmit Fractionation of nucleic acids into single-stranded and double-stranded forms //Nucl. Acids Res. 1996. V.24. P.2618-2619.3. Beld M., Sol C., Goudsmit Fractionation of nucleic acids into single-stranded and double-stranded forms // Nucl. Acids Res. 1996. V.24. P.2618-2619.

4. Short protocols in molecular biology. Third edition. Wiley, 1995.4. Short protocols in molecular biology. Third edition. Wiley, 1995.

5. Патент РФ №2119954, кл. С 12 N 15/10, С 07 Н 21/04, опубл. 10.10.98.5. RF patent No. 2119954, cl. C 12 N 15/10, C 07 H 21/04, publ. 10/10/98.

6. Грибанов О., Щербаков А., Перевозчикова И., Гусев А. Использование аэросила и фильтров GF/F для очистки фрагментов ДНК, ДНК плазмид и РНК // Биохимия 1996. Т.61. С.10.6. Gribanov O., Scherbakov A., Perevozchikova I., Gusev A. Use of aerosil and GF / F filters to clean DNA fragments, plasmid DNA and RNA // Biochemistry 1996. V.61. S.10.

Таблица 1Table 1 Количество НК, внесенное в пробу, нг/млThe number of NK introduced into the sample, ng / ml Процент извлеченной НК, нг/млThe percentage of extracted NK, ng / ml ОСВСWWS СВСSHS Элюция 50 мМ NaHCO3, 5 мМ ЭДТА, рН 8.0Elution 50 mM NaHCO 3 , 5 mM EDTA, pH 8.0 Элюция 0,01 М ТЕ-буферомElution 0.01 M TE buffer Элюция 0,01 М ТЕ-буферомElution 0.01 M TE buffer ДНКDNA 1010 8282 4848 -- 2525 8585 4848 15fifteen 50fifty 8484 50fifty 1717 100one hundred 8686 5151 1616 200200 8787 5353 1717 РНКRNA 1010 7575 4040 -- 2525 7777 4141 -- 50fifty 7979 4444 15fifteen 100one hundred 8080 4949 14fourteen 200200 8181 50fifty 15fifteen Таблица 2table 2 Стекловолокнистый сорбентFiberglass sorbent Не обработанныйNot processed Обработанный 0.1-7% HFTreated 0.1-7% HF 1 ч1 hour 2 ч2 h 3 ч3 h 4 ч4 h 5 ч5 h 6 ч6 h ДНКDNA 8±38 ± 3 82±582 ± 5 84±584 ± 5 83±483 ± 4 85±485 ± 4 87±387 ± 3 86±386 ± 3 РНКRNA 7±57 ± 5 76±576 ± 5 78±578 ± 5 79±679 ± 6 77±577 ± 5 80±680 ± 6 78±578 ± 5 Таблица 3Table 3 Способ выделенияAllocation Method Время выделения (часы)Allocation time (hours) Эффективность выделения РНКRNA isolation efficiency Низкомолекулярная 32Р-меченая РНК (100н.),%Low molecular weight 32 P-labeled RNA (100n.),% Высокомолекулярная РНК, выделенная из 106 клеток, % (мкг)High molecular weight RNA isolated from 10 6 cells,% (μg) ФенольныйPhenolic 4four 2525 81 (26)81 (26) Фенол-гуанидиновыйPhenol-guanidine 2,52,5 77 39 (13)39 (13) На ОСВСOn the SIA 0,20.2 5555 100 (28)100 (28)

Claims (8)

1. Способ выделения нуклеиновых кислот, включающий смешивание образца с буферным раствором, содержащим хаотропный агент, адсорбцию нуклеиновых кислот на стекловолокнистом сорбенте, промывку его от примесей ненуклеотидной природы и элюцию нуклеиновых кислот, отличающийся тем, что сорбент предварительно обрабатывают 0,1-7,0% раствором плавиковой кислоты в течение 1-6 ч.1. A method for isolating nucleic acids, comprising mixing a sample with a buffer solution containing a chaotropic agent, adsorption of nucleic acids on a glass fiber sorbent, washing it from impurities of a non-nucleotide nature, and eluting the nucleic acids, characterized in that the sorbent is pre-treated with 0.1-7.0 % hydrofluoric acid solution for 1-6 hours 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для выделения ДНК длиной 50-500 п.н. адсорбцию последней проводят в буферном растворе, содержащем 4,5 М ГТЦ, 20-70% этанол, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-ацетата, рН 6,4.2. The method according to claim 1, characterized in that for the isolation of DNA with a length of 50-500 bp the adsorption of the latter is carried out in a buffer solution containing 4.5 M GTZ, 20-70% ethanol, 20 mm EDTA, 10 mm Tris-acetate, pH 6.4. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для выделения ДНК длиной 500 п.н. и более адсорбцию последней проводят в буферном растворе, содержащем 4,5 М ГТЦ, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-ацетата, рН 6,4.3. The method according to claim 1, characterized in that for the isolation of DNA with a length of 500 bp and more, the adsorption of the latter is carried out in a buffer solution containing 4.5 M GTZ, 20 mm EDTA, 10 mm Tris-acetate, pH 6.4. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что для выделения РНК адсорбцию последней проводят в буферном растворе, содержащем 1М ГТЦ, 20-70% изопропанол, 20 мМ ЭДТА, 1,3 мМ ДЭПК, 10 мМ трис-ацетата, рН 4,5.4. The method according to claim 1, characterized in that for the isolation of RNA, the adsorption of the latter is carried out in a buffer solution containing 1 M GTZ, 20-70% isopropanol, 20 mm EDTA, 1.3 mm DEPC, 10 mm Tris-acetate, pH 4 ,5. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве стекловолокнистого сорбента используют стекловату из стекла марки М20, стекловату из нейтрального стекла, минеральную стекловату из базальтового стекловолокна, содержащие в качестве основного компонента двуокись кремния.5. The method according to claim 1, characterized in that glass fiber sorbent is used glass wool from glass brand M20, glass wool from neutral glass, mineral glass wool from basalt glass fiber containing silicon dioxide as the main component. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что промывку сорбента осуществляют под давлением, под вакуумом или при помощи центрифугирования.6. The method according to claim 1, characterized in that the washing of the sorbent is carried out under pressure, under vacuum or by centrifugation. 7. Способ по п.1, отличающийся тем, что промывку сорбента от примесей ненуклеотидной природы проводят сначала дважды рабочим буферным раствором для сорбции ДНК или РНК, а затем дважды буферным раствором, содержащим 60-80% этанол, 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 8.07. The method according to claim 1, characterized in that the washing of the sorbent from impurities of non-nucleotide nature is carried out first twice with a working buffer solution for sorption of DNA or RNA, and then twice with a buffer solution containing 60-80% ethanol, 100 mm NaCl, 10 mm Tris -HCl, pH 8.0 8. Способ по п.1, отличающийся тем, что элюцию нуклеиновых кислот преимущественно осуществляют буферным раствором, содержащим 5-50 мМ ионов бикарбоната, 5-10 мМ ЭДТА при рН 8,0-10,0, или дистиллированной водой, или разбавленными буферными растворами с молярностью не более 0,1.8. The method according to claim 1, characterized in that the elution of nucleic acids is preferably carried out with a buffer solution containing 5-50 mM bicarbonate ions, 5-10 mM EDTA at pH 8.0-10.0, or with distilled water, or diluted buffer solutions with a molarity of not more than 0.1.
RU2004126133/13A 2004-08-26 2004-08-26 Method for isolation of nucleic acids RU2272072C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2004126133/13A RU2272072C1 (en) 2004-08-26 2004-08-26 Method for isolation of nucleic acids

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2004126133/13A RU2272072C1 (en) 2004-08-26 2004-08-26 Method for isolation of nucleic acids

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2272072C1 true RU2272072C1 (en) 2006-03-20

Family

ID=36117249

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2004126133/13A RU2272072C1 (en) 2004-08-26 2004-08-26 Method for isolation of nucleic acids

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2272072C1 (en)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2585232C1 (en) * 2015-05-06 2016-05-27 Общество с ограниченной ответственностью "БиоСилика" Method of extracting micro-rna from biological fluids
RU2603098C1 (en) * 2015-12-04 2016-11-20 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) Method for extracting circulating dna from plasma or blood serum
RU2679353C2 (en) * 2013-03-14 2019-02-07 Вм. Ригли Джр. Компани Methods of detecting and quantifying nucleic acids within malleable polymers
RU2724506C1 (en) * 2019-08-23 2020-06-23 Алексей Юрьевич Дробышев Method for dna recovery from bone material
EP3821979A1 (en) * 2019-11-18 2021-05-19 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG Enhanced process for sorting cells with a microfabricated valve

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ГРИБАНОВ О., ЩЕРБАКОВ А., ПЕРЕВОЗЧИКОВА И., ГУСЕВ А. Использование аэросила и фильтров GE/F для очистки фрагментов ДНК, ДНК плазмид и РНК // Биохимия, 1996, т.61, с.10. *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2679353C2 (en) * 2013-03-14 2019-02-07 Вм. Ригли Джр. Компани Methods of detecting and quantifying nucleic acids within malleable polymers
RU2585232C1 (en) * 2015-05-06 2016-05-27 Общество с ограниченной ответственностью "БиоСилика" Method of extracting micro-rna from biological fluids
RU2603098C1 (en) * 2015-12-04 2016-11-20 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) Method for extracting circulating dna from plasma or blood serum
RU2724506C1 (en) * 2019-08-23 2020-06-23 Алексей Юрьевич Дробышев Method for dna recovery from bone material
EP3821979A1 (en) * 2019-11-18 2021-05-19 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG Enhanced process for sorting cells with a microfabricated valve

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7264927B2 (en) Isolation and purification of nucleic acids
DE4321904B4 (en) Method for chromatographic purification and separation of nucleic acid mixtures
EP1851313B1 (en) Method for isolating nucleic acids, wherein the nucleic acids are immobilised on a matrix at elevated temperatures
US20090043087A1 (en) DNA purification and recovery from high particulate and solids samples
EP2283026B1 (en) Method for concentrating and isolating biomolecules or viruses
AU2002333673A1 (en) Isolation and purification of nucleic acids
EP1674571A2 (en) Use of paramagnetic material in the purification and manipulation of nucleic acids
JPH0515373A (en) Method for extracting and purifying human genome dna
JP2006311803A (en) Method for purifying nucleic acid and tool for purifying nucleic acid
JP2007124952A (en) Method and tool for purifying nucleic acid
KR20100001827A (en) Nucleic acid extraction method
EP1771242B1 (en) Method for efficient isolation of nucleic acids
JP2006083114A (en) Method for extracting nucleic acid, and method for separating nucleic acid
CN102676503A (en) Method for quickly extracting DNA (deoxyribonucleic acid)
US8586350B2 (en) Mechanism of separating and purifying DNA and the like
RU2272072C1 (en) Method for isolation of nucleic acids
US8691559B2 (en) Micro channel, device for recovering nucleic acid and method for recovering nucleic acid
RU2232768C2 (en) Method for isolating deoxyribonucleic acids
RU2232810C1 (en) Method for isolating ribonucleic acids
CN108866042B (en) Extraction method of trace RNA
JPH11196869A (en) Isolation of liponucleic acid
Dehqonboeva et al. METHODS FOR ISOLATING NUCLEIC ACIDS

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20140827