RU226161U1

RU226161U1 - Искусственный нервный кондуит с наполнителем из волокнистого наноматериала

Info

Publication number: RU226161U1
Application number: RU2023120827U
Authority: RU
Inventors: Ольга Юрьевна Антонова; Игорь Леонидович Канев; Ольга Юрьевна Кочеткова; Елена Вадимовна Райхман
Original assignee: ООО "Нейрографт"
Filing date: 2023-08-09
Publication date: 2024-05-23

Abstract

Полезная модель относится к медицине и нанобиотехнологии и может быть использована в нейрохирургии для оперативного лечения протяженных повреждений периферических нервов, а также в качестве in vitro модели для изучения процессов регенерации нервной ткани в условиях, имитирующих структуру внеклеточного матрикса. Искусственный нервный кондуит выполнен в виде полой трубки из микропористого полилактид-ко-гликолида с наполнителем, представляющим собой пучки параллельных нейлоновых нановолокон двух типов, отличающихся диаметром волокна. Структура кондуита обеспечивает ускоренный и направленный рост отростков нейронов, а также быструю миграцию и пролиферацию клеток нервной ткани.

Description

Полезная модель относится к медицине и нанобиотехнологии и может быть использована в нейрохирургии для оперативного лечения протяженных повреждений периферических нервов, а также в качестве in vitro модели для изучения процессов регенерации нервной ткани в условиях, имитирующих структуру внеклеточного матрикса.

Травматическое повреждение периферических нервов приводит к стойкому снижению функции нерва, при этом полное восстановление происходит только в 10% случаев. В основном это связано с низким потенциалом для регенерации поврежденного аксона, а также с необходимостью обеспечения направленного роста аксона от проксимального конца волокна к дистальному. Стоит отметить, что прямое сшивание концов нерва можно выполнять только в случае протяженности дефекта менее 5 мм. Протяженный диастаз необходимо замещать кондуитом либо аутотрансплантатом. В последнее время особое развитие получила методика замещения посттравматического диастаза кондуитом [1]. Согласно клиническим рекомендациям ассоциации нейрохирургов России, для уменьшения образования рубцовых сращений нервного ствола с окружающими тканями рекомендуется использование ограничивающих биодеградируемых материалов, например полиоксибутирата, не вызывающих в дальнейшем реакцию окружающих тканей.

Искусственный нервный кондуит (ИНК) или искусственный нервный графт представляет собой цилиндрический биосовместимый имплантат (проводник), предназначенный для осуществления направленного роста аксонов внутри него. Имплантация кондуитов используется для восстановления посттравматических протяженных дефектов нервов, обеспечивая направленную регенерацию нервных волокон между дистальным и проксимальным краями дефекта. В настоящее время представлено большое разнообразие конструкций и материалов, пригодных для замещения протяженных дефектов периферических нервов [2-5]. Однако большинство зарегистрированных в качестве медицинских изделий ИНК представляют собой полые полимерные кондуиты из биорезобируемых (например Neurotube - Synovis Micro Companies Alliance Inc., США; NeuraGen - Integra Life Sciences Corp., США) и нерезорбируемых (SaluTunnel Nerve Protector - SalumedicaTM L.C.C., США) полимеров без внутреннего наполнителя, поэтому разработка новых конструкций биорезорбируемых нервных имплантов, реализующих возможность использования наполнителя, стимулирующего регенерацию нервной ткани сохраняет актуальность для нейрохирургии и тканевой инженерии.

Комбинированный кондуит состоит из внешней цилиндрической полой трубки, обеспечивающей механическую фиксацию соединяемых концов нерва, и внутреннего наполнителя, стимулирующего ускоренный и направленный рост нервной ткани. Внешняя стенка кондуита также выполняет барьерную функцию, защищая нервный ствол от образования Рубцовых сращений с окружающими тканями. Материал внешней части ИНК должен обеспечивать возможность стерилизации и иметь достаточную механическую прочность для хирургической имплантации, при этом сохраняя гибкость, необходимую для обеспечения подвижности поврежденной конечности и предотвращения компрессии нерва. Одним из самых популярных биоразлагаемых сополимеров является полилактид-ко-гликолид (ПЛГК), который широко используется в фармацевтической промышленности, а также в тканевой инженерии. Ранее было продемонстрировано, что кондуиты, изготовленные из ПЛГК (соотношение кислот 50:50), ускоряют регенерацию аксонов [6]. К преимуществам данного материала можно отнести возможность контроля скорости биодеградации за счет варьирования процентного соотношения полимолочной и полигликолиевой кислот в сополимере. Микропоры во внешней стенке ИНК обеспечивают обмен питательными веществами по всей длине канала и даже делают возможной инфильтрацию кровеносных сосудов, как это наблюдается с аутотрансплантатами. Оптимальный размер пор в стенке кондуита для обеспечения достаточной диффузии по разным данным составляет 5-30 мкм [7,8]. Пористые ИНК с размером пор более 10 мм делают возможным проникновение не нервных клеток в просвет кондуита. Внешняя стенка предлагаемой конструкции ИНК выполнена из микропористого ПЛГК толщиной 0,1-0,3 мм с размером пор 4-6 мкм.

Микрофотография структуры внешней стенки кондуита и распределение размеров пор представлено в дополнительных материалах

фиг. 1. А-Б - ультраструктурная характеристика материала внешней стенки. А - микрофотография поверхности внешней стенки, полученная с помощью сканирующей электронной микроскопии; Б - распределение диаметров пор. Диаметр и длина внешней стенки определяются диаметром поврежденного нерва и величиной дефекта.

Внутренний наполнитель кондуита должен обеспечивать ускоренный рост поврежденных аксонов, а также иметь регулярную ориентацию структурных компонентов, служащую направляющим элементом для роста нервных отростков, обеспечивающим соединение проксимального и дистального конца нерва. Архитектура и топография наполнителя кондуита могут влиять на свойства и функции нервных клеток, такие как миграция, дифференцировка и морфология клеток.

Известен ряд конструкций ИНК, использующих в качестве наполнителя волокнистый полимерный материал. В качестве наполнителя используются волокна из смеси хитозана и поликапролактона с диаметром 50-2000 нм [9], пористый лист, покрытый пареллельными нановолокнами [10]. Важным преимуществом кондуитов с волокнистым наполнителем является способность имитировать архитектуру природного внеклеточного матрикса (ВКМ), при этом большая удельная площадь волокнистого материала позволяют нанокомпозитным каркасам стимулировать рост нейронов, а параллельная ориентация волокон обеспечивает направленный рост нервных отростков от одного края дефекта к другому. Ближайшим аналогом заявляемой конструкции является кондуит из полилактида, заполненный продольными пучками параллельных волокон из ПЛГК с диаметром 200-600 нм [11]. Продемонстрировано функциональное восстановление поврежденного нерва при имплантации кондуита крысам. Также близким аналогом является кондуит из полиэтиленгликоля, заполненный параллельными волокнами из поликапролактона с диаметром 5 мкм [12]. Однако для изготовления матриксов-миметиков внеклеточного матрикса необходимо учитывать специфические размеры структурных компонентов нейронного ВКМ; например, коллагеновые фибриллы индивидуального эндоневрия имеют средний диаметр 41,31±4,2 нм и 30-60 нм в слое периневрия [13], что существенно меньше диаметра волокон, используемых в вышеуказанных конструкциях ИНК. Таким образом, уменьшение диаметра волокон наполнителя является перспективным вариантом дальнейшего усовершенствования конструкции ИНК. Одним из наиболее подходящих материалов для изготовления нановолокон, сравнимых по размеру с элементами ВКМ, является нейлон. К его преимуществам относятся механическая прочность и гибкость, высокая биосовместимость и низкая скорость биодеградации, позволяющая сохранять внутреннюю структуру кондуита в течение всего срока регенерации нерва. Нейлон также является уникальным среди водонерастворимых полимеров материалом для получения ультратонких волокон. Механические свойства нейлона позволяют использовать метод электроспиннинга для получения волокон с диаметром менее 100 нм. [14]. Поверхность нейлоновых нановолокон, обработанная плазмой, либо ультрафиолетовым облучением, не требует дополнительной модификации соединениями, способствующими клеточной адгезии, такими как поли-D-лизин, полиэтиленимин, коллаген, ламинин и фибриноген, благодаря образованию активных групп на поверхности полимера и усилению адсорбции белков из клеточной среды [15]. Это является дополнительным экономическим и технологическим преимуществом нейлоновых волокон по сравнению другими нановолоконными материалами.

В качестве основы наполнителя предлагаемой конструкции ИНК используется волокнистый материал из ультратонких биосовместимых нановолокон нейлона-4/6 с диаметром ~60 нм и длиной, равной длине кондуита, что обеспечивает сопоставление концов нервных волокон, а также открывает дополнительные возможности по добавлению и удержанию внутри кондуита субстанций и клеточных компонентов, способствующих ускорению регенерации нервной ткани.

Данный материал близок по строению к морфологии внеклеточного матрикса и обеспечивает ускоренный и направленный рост отростков нейронов, а также быструю миграцию и пролиферацию клеток нервной ткани [15]. Волокна с данным диаметром демонстрируют ряд преимуществ по сравнению материалом, состоящим из субмикронных волокон с диаметром 300 нм, а именно ускоренный и направленный рост отростков нейронов, облегчают миграцию клеток за счет формирования фокальных контактов малого размера и способствуют синаптогенезу [15, 16].

Однако из-за малого диаметра и малой прочности данных волокон затруднено формирование из них объемных пучков для заполнения полости кондуита. Поэтому в качестве наполнителя для предлагаемой конструкции ИНК используется смешанный трехслойный материал, состоящий из двух типов параллельных нейлоновых волокон: нановолокна со средним диаметром 60 нм (верхний и нижний внешние слои) и субмикронные волокна со средним диаметром 200 нм (средний слой), которые выполняют армирующую функцию, а также способствуют пролиферации глиальных клеток [15]. Микрофотографии, распределение размеров и анализ направленности применяемых волокон представлены в дополнительных материалах

фиг. 2А-В Ультраструктурная характеристика нановолоконного материала. А - СЭМ-изображение ультратонких, субмикронных и смешанных волокон из нейлона-46, полученных методом электроспиннинга; Б - распределение диаметра нановолокон; В - угловое распределение направления укладки волокон). Элементы ВКМ имеют широкий диапазон размеров структурных компонентов: от 50 нм до 500 нм [17], таким образом, предлагаемый материал наполнителя, состоящий из волокон двух типов с диаметром 60 нм и 200 нм более полно имитирует структуру ВКМ по сравнению с вышеописанными аналогами.

Из собираемого с коллектора трехслойного материала формируются без скручивания продольные пучки с диаметром 1-2 мм, состоящие из параллельных волокон. Перед сборкой кондуита пучки нейлоновых нановолокон обрабатываются ультрафиолетовым облучением в течение 15 минут для стерилизации и улучшения адгезивных свойств поверхности. Параллельные пучки волокон размещаются в полости трубки внешней части кондуита из микропористого ПЛГК. Количество пучков определяется диаметром внешней стенки кондуита. На фиг. 3 схематически представлены элементы конструкции полезной модели. Цифрами обозначены:

1. - Трехслойный волокнистый материал;

2. - Композитные пучки волокон;

3. - Внешняя пористая стенка;

4. - Искусственный нервный кондуит в сборе;

На фиг. 4 представлен внешний вид прототипа ИНК (внешняя стенка для наглядности выполнена из прозрачного материала).

В настоящее время in vivo исследования эффективности ИНК являются "золотым" стандартом для оценки применимости предлагаемых материалов и конструкций, однако, разработка более простого метода тестирования и оптимизации трансплантатов без необходимости проведения длительных и дорогостоящих экспериментов in vivo является перспективной задачей. Известен ряд моделей для исследования восстановления периферических нервов in vitro [18,19]. Однако, таких работ мало и предлагаемые способы предусматривают конструкции кондуита без ВКМ-имитирующего компонента. В этом отношении модели, использующие комбинированные кондуиты [12] выгодно отличаются от моделей с применением полых кондуитов для in vitro исследований, однако в приведенном исследовании описан кондуит с диаметром волокон наполнителя равным 5 мкм, что значительно превышает размеры элементов ВКМ. Наличие ВКМ-миметика в составе кондуита могло бы расширить область применения таких моделей, в том числе для исследования процессов регенерации моторных нейронов с использованием органотипических культур срезов спинного мозга, для которых нанотопология материала имеет важное значение [20]. Таким образом, возможность воссоздать в полости кондуита трехмерную архитектуру, имитирующую ВКМ, которую дает предлагаемая конструкция ИНК, расширяет возможности экспериментальных in vitro исследований процессов восстановления поврежденных нервов. В частности, использование ИНК данного типа в in vitro и ex vivo моделях дает возможность не только более полно воссоздавать условия микроокружения нервной ткани, но и достаточно быстро проводить количественную оценку скорости и направленности роста аксонов, а также сохранения функциональной активности клеток (с использованием доступных in vitro методов: МТТ-тест и анализ возбудимости нейронов) и процесса регенерации нервной ткани (миелинизация аксонов Шванновскими клетками).

Пример 1. Исследование биосовместимости материала внешней стенки ИНК

Биосовместимость материала для изготовления внешней трубки композитного кондуита оценивалась с помощью анализа жизнеспособности модельной клеточной линии фибробластов мыши L929 при культивировании на поверхности полимера. Фибробласты были выбраны в качестве модельного объекта, поскольку они играют важную роль в заживлении ран, и их гибель может усиливать воспалительную реакцию и снижать скорость регенерации [21]. Для проведения испытания фрагмент предварительно отмытой в этаноле и высушенной между двумя слоями парафильма пленки микропористого ПЛГК приклеивался к стеклянной подложке.

Стерилизацию образцов обеспечивали обработкой ультрафиолетовым излучением в течение 15 минут. Клетки высевали в плотности 30000 клеток/образец на поверхность образцов, помещенных в 4-луночные планшеты, предварительно покрытые 1%-ным раствором агарозы для предотвращения адгезии клеток к пластику планшета. Для культивирования использовалась среда DMEM/F12 с 10%-ной эмбриональной бычьей сывороткой и 1%-ный пенициллин/стрептомицина. После 2 дней культивирования при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO₂, клетки окрашивались 2 мкМ кальцеина AM (Sigma, США), 1 мкМ йодида пропидия (Sigma, США) и 1 мкМ Hoechst (ПанЭко, Россия) в течение 15 мин при 37°С. Жизнеспособность клеток оценивали, анализируя микрофотографии, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа Axiovert 200 (Zeiss, Германия).

Результаты исследования биосовместимости тестируемых материалов представлены на фиг. 5 (Репрезентативные флуоресцентные изображения фибробластов мыши L929, культивированных в течение 48 ч на образцах материала и окрашенных кальцеином (зеленый, живые клетки) и пропидий йодидом (красный, мертвые клетки). Шкала - 200 мкм).

Анализ флуоресцентных изображений показал высокую жизнеспособность (более 90%) клеток при культивировании на подложках, полученных из пористого ПЛГК. Как показал анализ ультраструктуры поверхности, данные подложки имеют шероховатую и высокопористую поверхность, необходимую для эффективной клеточной адгезии (фиг. 1А). Процент мертвых клеток на исследуемых поверхностях не превышал 7%, что подтверждает биосовместимость и возможность эффективного использования микропористого ПЛГК в качестве материала внешней трубки искусственного нервного кондуита.

Пример 2. Исследование биосовместимости и морфологии клеток при культивировании на волокнистом наполнителе

2.1. Исследование биосовместимости и роста Шванновских клеток (ШК) и дорсальных корешковых ганглий (ДКГ) при культивировании на смешанных волокнах

2.1.1. Анализ биосовместимости и рост ШК на смешанных волокнах

Для исследования биосовместимости материала нановолоконного наполнителя ИНК образцы материалов; из нейлоновых волокон переносили на стеклянные подложки и приклеивали по краям с помощью раствора полистирола в толуоле. Основным типом глиальных клеток в периферической нервной системе (ПНС) являются клетки Шванна (ШК). ШК выполняют несколько функций: миелинизируют нервы, увеличивая скорость проведения сигнала и обеспечивают передачу сигналов кальция для модуляции синаптической нейротрансмиссии. При повреждении ПНС ШК играют ключевую роль в регенерации аксонов. Приобретая фенотип характерный для репарации ШК мигрируют в область повреждения, удлиняются и организуются в полосы «Бюнгнера, которые поддерживают и направляют регенерацию аксонов [22]. Очевидно, что структура нервного кондуита должна способствовать ШК в создании вектора направления регенерации нервных волокон. В связи с этим было исследовано взаимодействие ШК с разработанными подложками. Для сравнения использовались образцы материалов из ориентированных волокон из нейлона-46 с диаметром 60 нм (ультратонкие, УТ), 200 нм (субмикронные, СМ) и комбинация обоих типов (смешанные, МИКС).

Был исследован рост ШК, выделенных из седалищного нерва взрослой крысы согласно методике [23]. ШК высеивали по 50000 клеток на образец и культивировали в культуральной среде DMEM с добавлением 10% ЭТС, 2 мкМ форсколина (Sigma, США) и 10 нМ нейрорегулина (Biolegend, США) в течение указанного времени. Для оценки жизнеспособности и пролиферативной активности образцы окрашивали кальцеином, пропидий йодидом и Hoechst (как описано в примере 1). Для исследования влияния ультраструктуры на морфологию клетки культивировались в условиях, аналогичных описанным в примере 1 в течение 7 дней, затем были зафиксированы в 4%-ном растворе параформальдегида в течение 10 мин. Для пермеабилизации использовался раствор 0,1%-ный Тритона Х-100 в течение 10 мин, с последующим окрашиванием антителами против S100b белка (Abclonal, Китай) и фаллоидином, меченым Alexa Fluor-488 (Abcam, Великобритания), в течение ночи при 4°С. Как показано на фиг. 5 (Жизнеспособность, пролиферация и рост ШК на различных волоконных подложках), ШК демонстрируют высокую жизнеспособность (Фиг. 6А-В. Исследование биосовместимости волоконных материалов при культивировании ШК. А - Репрезентативные флуоресцентные изображения ШК, культивированных в течение 5 дней на различных субстратах и окрашенных кальцеином (зеленый, живые клетки), пропидий йодидом (ПИ, красный, мертвые клетки) и Hoescht (розовый, ядра и волокна). УТ - ультратонкие, СМ - субмикронные, МИКС - смешанные волокна. Б - Жизнеспособность клеток. В - количество ШК на площадь образца) и скорость пролиферации на всех исследуемых типах волокнистых материалов. Диаметр волокон не влияет на жизнеспособность клеток, которая остается на высоком уровне >97%). При этом плотность клеток в 3 раза увеличивается на волокнистых подложках по сравнению с контролем (стекло, покрытое поли-D-лизином и ламинином): ~1500 клеток/мм² для волокон по сравнению с ~500 клеток/мм² для контроля. Анализируя направленность актиновых стрессовых волокон можно заключить, что волокнистые материалы и в частности смешанные волокна способны реорганизовать цитоскелет ШК и инициировать поляризацию клетки (фиг. 6Г-Д. Морфология ШК при культивировании на волоконных материалах разного типа. Г - Репрезентативные флуоресцентные изображения морфологии ШК, культивированных в течение 7 дней на различных субстратах и окрашенных антителами к S100 белку (зеленый, маркер ШК), фаллоидином (красный, актин) и Hoescht (циан, ядра и волокна). Шкала - 50 мкм. Д - Угловое распределение актиновых стрессовых волокон ШК и волокон в различных подложках). Полученные данные демонстрируют, что структура комбинированного наполнителя ИНК способствует направленному росту и активной пролиферации ШК.

2.1.2. Исследование биосовместимости и роста ДКГ на смешанных волокнах

Следующим этапом исследования биосовместимости комбинированного наполнителя ИНК стала оценка роста органотипических эксплантатов дорзальных корешковых ганглий (ДКГ). Аксоны сенсорных нейронов ДКГ входят в состав седалищного нерва, ответственный за иннервацию задней конечности. Поэтому исследование роста аксонов ДКГ является полезной моделью для изучения регенерации нейронов после аксотомии периферических нервов [24]. ДКГ выделяли из новорожденных крыс с использованием модификации методики, описанной J. Wen [25]. Выделенные ДКГ раскладывали в кольца, размещенные на волокнистом материале, закрепленном на стеклянной подложке. ДКГ культивировали в Нейробазальной среде (ПанЭко, Россия) с добавлением В-27 саплимент (Gibco, США). Через 48 ч культивирования ДКГ прикреплялись к волокнам и кольца удаляли. Общее время культивирования составило 7 дней. Препараты фиксировали 4%-ным раствором параформальдегида и окрашивали антителами против нейрофиламента Н и белка S100b (Abclonal, China), для визуализации ядер использовали краситель Hoechst.

Стоит отметить, что ДКГ культивировали без добавки фактора роста нервов (ФРН) в среду и в отсутствие дополнительной обработки поверхности волокон соединениями, усиливающими адгезию клеток (полилизин, ламинин, матригель и т.д.). Из микрофотографий, приведенных на фиг. 7 (Репрезентативные флуоресцентные микрофотографии, демонстрирующие направленный рост аксонов ДКГ, культивируемых на ориентированных смешанных волокнах. Стрелкой показано направление укладки волокон. Шкала - 200 мкм) следует, что аксоны нейронов ДКГ росли параллельно направлению укладки волокон. Среднее удлинение 5 наиболее длинных аксонов составило 891,3±275,6 мкм. Данные значения элонгации аксонов ДКГ, культивированных на комбинированном волокнистом материале, особенно в условиях отсутствия биохимической стимуляции в виде ФРН свидетельствует о существенном вкладе нанотопологии материала в индукцию роста поврежденных аксонов.

Таким образом, комбинированный материал из двух типов волокон с диаметром 60 нм и 200 нм аналогично материалу, состоящему только из 60 нм волокон усиливает пролиферацию и поляризацию ШК, инициируя элонгацию отростков клеток вдоль волокон с формированием структур сходных с полосами Бангнера. Кроме того, подобная наноархитектура инициирует направленный рост аксонов нейронов ДКГ даже в условиях отсутствия необходимой биохимически-стимулирующей среды (фактора роста нервов).

2.2. Исследование роста ДКГ на трехмерном нановолоконном материале (комбинированные пучки волокон)

Далее была проведена оценка роста аксонов ДКГ на пучках из комбинированных волокон, используемых в качестве наполнителя ИНК. Выделенные ДКГ раскладывали в стеклянные кольца, размещенные на пучках волокон, закрепленных на стеклянной подложке. ДКГ культивировали в аналогично способу, описанному в примере 2.1.2. Препараты фиксировали и окрашивали красителем специфичным для клеточной мембраны Dil (в концентрации 5 мкМ, Thermo Fisher Scientific, США) и красителем Hoechst для визуализации ядер.

На микрофотографиях, представленных на фиг. 8 (Репрезентативные флуоресцентные изображения ДКГ после культивирования на жгутике в течение 7 дней и окрашенных Dil (красный, мембрана) и hoechst (циан, ядра и волокна). Шкала 200 мкм.), видно, что наноструктурированный волокнистый материал индуцирует рост аксонов нейронов ДКГ, преимущественно ориентированных вдоль направления укладки нейлоновых волокон. Средняя длина 10 наиболее длинных отростков составила 1271,8±73,6 мкм. Таким образом, наполнитель искусственного кондуита в виде пучков волокон, также как и 2D-материал в виде закрепленных на стеклянной подложке комбинированных волокон благоприятен для адгезии и направленного роста поврежденных аксонов ДКГ.

Пример 3. Исследование биосовместимости и эффективности комбинированных ИНК

3.1. Исследование пролиферации клеток нейробластомы в полости комбинированного кондуита

Для демонстрации эффективности использования пучков нановолокон в качестве наполнителя ИНК использовались клетки нейробластомы SH-SY5Y, которые имеют «нейроноподобный» фенотип и после индуцированной дифференцировки в зрелое состояние являются популярной моделью для изучения нейрональных функций [26].

Экспериментальные образцы кондуитов размещались вертикально в культуральных планшетах и суспензия клеток загружалась в предварительно смоченную культуральной средой (не более 5 мкл) и заполненную пучками нановолокон полость кондуита. В вертикальном положении кондуиты с клетками инкубировали в течение 20 мин и затем переносили в культуральный планшет в горизонтальном положении. Для оценки сохранения жизнеспособности клетки культивировали в течение 2 дней в среде DMEM/F12 (ПанЭко, Россия), содержащей 10%-ной термо-инактивированной эмбриональной бычьей сыворотки (Biosera, Франция) и 1%-ный пенициллин/стрептомицина (ПанЭко, Россия). Далее образцы окрашивали кальцеином и пропидий йодидом (как описано в примере 1). Полученные результаты представлены в дополнительных материалах (Фиг. 9. Исследование жизнеспособности и пролиферация клеток нейробластомы SH-SY5Y при культивировании в композитных кондуитах разных типов). Как видно на фиг. 9А (Репрезентативные флуоресцентные изображения клеток SH-SY5Y после культивирования в полости кондуита в течение 2 дней и окрашенных кальцеином (живые, зеленый) и пропидий йодидом (мертвые, красный)) клетки сохраняют жизнеспособность при культивировании в полости композитного кондуита (>90% живых кальцеин-положительных клеток). Кроме того, была исследована морфология клеток при визуализации актина - основной структуры цитоскелета. Клетки культивировались в условиях, описанных выше, затем фиксировались 4%-ным раствором параформальдегида в течение 10 мин. Для пермеабилизации использовался раствор 0,1%-ный Тритона Х-100 в течение 10 мин, с последующей инкубацией образцов в растворе фаллоидина, меченного Alexa Fluor-488 (Abeam, Великобритания), в течение ночи при 4°С. Как видно на фиг. 8Б (репрезентативные флуоресцентные изображения клеток SH-SY5Y после культивирования в полости кондуита в течение 2 дней и окрашенных фаллоидином, меченым Alexa Fluor-488 (актин, зеленый) и Hoechst (ядра и волокна, синий). Шкала - 200 мкм) клетки SH-SY5Y экспрессируют актин при культивировании в полости кондуита. Высокая экспрессия цитосклетных белков свидетельствует о распластывании клеток и благоприятных условиях для адгезии. Также заметно, что отростки клеток ориентируются вдоль направления укладки нановолокон (фиг. 9Б - вставка).

Комбинированный материал из нейлоновых волокон, собранный в пучок, при флуоресцентной микроскопии дает сильный фон во всем видимом диапазоне длин волн, что в большинстве случаев затрудняет точную количественную оценку жизнеспособности методом конфокальной микроскопии. В связи с этим был использован для оценки жизнеспособности субстрат-зависимых клеток был использован МТТ-тест. Клетки загружали в полость предварительно смоченного культуральной средой кондуита и культивировали в течение 2 дней. Перед окрашиванием пучки извлекали из кондуита, помещали в лунки 96-луночного планшета и инкубировали согласно стандартному протоколу в среде с добавлением 5 мг/мл бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия (МТТ) в течение 3 ч. Далее из планшетов удаляли среду и в каждую лунку добавляли по 100 мкл ДМСО для растворения образовавшихся кристаллов формазана. С помощью планшетного анализатора (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, США) определяли оптическую плотность при 540 нм. Использование окрашивания для определения метаболической активности клеток (МТТ-тест) показало, что клетки SH-SY5Y при культивировании в полости композитного кондуита распределяются по всей длине кондуита, о чем свидетельствует образование кристаллов формазана и характерное окрашивание нановолоконного наполнителя как видно на фиг. 9В (Фотографии нановолоконного наполнителя при окрашивании тетразолиевым красителем).

3.2. Исследование роста отростков клеток нейробластомы в полости кондуита

Для изучения направленности роста отростков нервных клеток в полости ИНК клетки нейробластомы культивировали в течение 2 дней. Далее образцы окрашивали мембранным зондом Dil и Hoechst (ПанЭко, Россия) для визуализации ядер. На микрофотографии, приведенной на фиг. 10 (Флуоресцентное изображение клеток SH-SY5Y, окрашенных Dil (клеточная мембрана, красный) и hoechst (ядра, синий) при культивировании на пучках нановолокон) видно, что пучки нановолокон позволяют клеткам SH-SY5Y прикрепляться и пролиферировать аналогично 2D-нановолоконному субстрату. Клетки заметно поляризуются, и наблюдается направленный рост отростков.

3.3. Исследование роста аксонов ДКГ в полости комбинированного кондуита и сохранение функциональной активности нейронов ДКГ

Далее был исследован рост аксонов ДКГ в полости комбинированного нервного кондуита. Опытный образец кондуита фиксировали в вертикальном положении в культуральном планшете, смачивали культуральной средой и помещали ДКГ в верхнюю часть полости кондуита в контакте с пучками наполнителя. Спустя 2 ч кондуиты с ДКГ заливали Нейробазальной средой (ПанЭко, Россия) с добавлением В-27 саплимента (Gibco, США) без добавки ФРН и культивировали в течении 7 дней. Кондуит с эксплантатом фиксировали, вынимали наполнитель и окрашивали для визуализации клеточной мембраны (Dil) и ядер (Hoechst).

На микрофотографиях, приведенных на фиг. 11 (Репрезентативные флуоресцентные изображения ДКГ на нановолоконном наполнители, культивированные внутри кондуита с пористой внешней трубкой в течение 7 дней. Белые стрелки - аксоны, желтые стрелки - мигрирующие из ДКГ Шванновские клетки, голубая стрелка - средняя длина аксонов, растущих внутрь кондуита (рассчитанная от центра сомы ДКГ), зеленая стрелка - направление укладки нановолоконного материала внутри кондуита. Шкала - 300 мкм) виден направленный рост аксонов ДКГ по направлению укладки волокон вдоль продольной оси кондуита. Максимальное удлинение аксонов за 7 суток достигало 1500 мкм.

Для подтверждения функциональной активности нейронов ДКГ в полости ИНК использовалось свойство возбудимых клеток высвобождать ионы Са²⁺ из внутриклеточного депо и повышать концентрацию Са²⁺ в цитоплазме при стимуляции растворами с высоких содержанием ионов К⁺. Возбудимость нейронов ДКГ оценивали наблюдением за изменением внутриклеточных сигналов кальция в клетках сомы при внесении 100 мМ KCl. Оценку изменения внутриклеточной концентрации Са проводили путем окрашивания ДКГ, извлеченных после культивирования в течение 7 дней в полости кондуита. Образцы инкубировали в культуральной среде содержащей 1 мкМ Fluo-8 (Люмипроб, Россия) и для увеличения проницаемости зонда сквозь мембрану клеток добавляли Pluronic F127 (Invitrogen, США) в конечной концентрации 0,4%. Визуализацию проводили, распределяя жгутики в тонком слое внеклеточного раствора между покровными стеклами для лучшей фокусировки на клетках сомы ДКГ. Получали серию изображений до и после добавления 100 мМ KCl. Сравнение проводилось по разным полям, полученным при наблюдении за отдельным образцом ДКГ, усреднение проводилось по 20 областям интереса (ROI). Интенсивность флуоресценции Fluo-8 регистрировали при возбуждении светом с длиной волны 488 нм и эмиссией в диапазоне 505-555 нм. Полученные до и во время стимуляции изображения анализировали с использованием программного обеспечения ImageJ (v. 1.5, National Institutes of Health [NIH]). Флуоресцентные изображения внутриклеточных кальциевых волн и количественный анализ изменения интенсивности флуоресценции с течением времени показаны на фиг. 12А (Фиг. 11. Исследование возбудимости нейронов ДКГ. Репрезентативные флуоресцентные изображения динамики изменения внутриклеточного Са²⁺ в ответ на высокую концентрацию KCl в интактных нейронах ДКГ, нагруженных Fluo-8: 0 с - до, 30 с - после стимуляции). Для количественной оценки наблюдаемой кальциевой активности проанализирована интенсивность флуоресценции зонда до и после внесения KCl. Результаты анализа представлены на фиг. 12Б-В (Б - Интенсивность флуоресценции Fluo-8 внутри выбранных областей (отмечены кружками на фиг. 12А); В - Изменение флуоресцентного ответа (F/F₀), индуцируемого KCl. Шкала - 100 мкм). Средний пик изменения интенсивности флуоресценции Са составил порядка 170%, что указывает на сохранение высокой функциональной активности клеток сомы ДКГ после культивирования в течение 7 дней в полости ИНК.

Полученные в результате испытаний данные подтверждают, что предлагаемая конструкция искусственного нервного кондуита способна эффективно обеспечивать регенерацию нервной ткани за счет стимуляции регенеративного потенциала Шванновских клеток и обеспечения направленного и ускоренного роста отростков нервных клеток. Предлагаемый комбинированный кондуит может быть использован при реконструкции нервного ткани после повреждения периферических нервов, а также для создания ex vivo моделей, позволяющих реализовать высокопроизводительный скрининг перспективных ткане-инженерных материалов и нейропротекторных препаратов.

Список литературы:

1. Тутуров А.О., Пятин В.Ф., Сергеев С.М. (2019) Перспективы развития технологий восстановления протяженных дефектов нервов с помощью с помощью кондуитов. Политравма/Polytrauma. №2. С. 95-101.

2. Мирошникова П.К., Люндуп А.В., Бацаленко Н.П., Крашенинников М.Е., Занг Ю., Фельдман Н.Б., Береговых В.В. (2018) Перспективные нервные кондуиты для стимуляции регенерации поврежденных периферических нервов. Вестник РАМН. Т. 73, 6, с. 388-400.

3. Vijayavenkataraman S. Nerve Guide Conduits for Peripheral Nerve Injury Repair: A review on Design, Materials and Fabrication Methods. Acta Biomaterialia, 2020, 106, p. 54-69. doi: 10.1016/j.actbio.2020.02.003.

4. Раменский B.B., Григорьев A.B., Белозерцев Ф.Ю. Кондуит для регенерации поврежденного периферического нерва. Россия. 2019. RU 193833 U1.

5. Спектор М., Шлессер Л., Гайстлих П. Коллагеновые трубки для регенерации нерва. Россия. 2001. RU 2302262 C2.

6. Jiang H., Qian Y., Fan C, Ouyang Y. Polymeric Guide Conduits for Peripheral Nerve Tissue Engineering. Front Bioeng Biotechnol. 2020, 25, 8, p:582646. doi:10.3389/fbioe.2020.582646.

7. Tao J., Hu Y., Wang S., Zhang J., Liu X., Gou Z., Cheng H., Liu Q., Zhang Q., You S., Gou M. A 3D-engineered porous conduit for peripheral nerve repair. Sci Rep.2017, 12, 7, p:46038. doi: 10.1038/srep46038.

8. Ezra M., Bushman J., Shreiber D., Schachner M., Kohn J. Porous and Nonporous Nerve Conduits: The Effects of a Hydrogel Luminal Filler With and Without a Neurite-Promoting Moiety. Tissue Eng Part A. 2016, 22(9-10), p. 818-26. doi: 10.1089/ten.TEA.2015.0354.

9. Zhang M., Bhattarai N. Nanoflbrous conduits for nerve regeneration. US. 2009. US 20100234863 A1.

10. Yu X., Shah M., Chang W. Implantable nerve guidance conduits having polymer fiber guidance channel. US. 2019. US 20190328393 A1.

11. Koh H.S, Yong Т., Teo W.E., Chan C.K., Puhaindran M.E., Tan T.C., Lim A, Lim B.H., Ramakrishna S. In vivo study of novel nanoflbrous intra-luminal guidance channels to promote nerve regeneration. J Neural Eng. 2010, 7(4):046003. doi: 10.1088/1741-2560/7/4/046003.

12. Behbehani M., Glen A., Taylor C.S., Schuhmacher A., Claeyssens F., Haycock J.W. Pre-clinical evaluation of advanced nerve guide conduits using a novel 3D in vitro testing model. Int J Bioprint. 2017, 20, 4(1):123. doi: 10.18063/IJB.v4i1.123.

13. Jain D., Mattiassi S., Goh E.L., Yim. E.K.F. Extracellular matrix and biomimetic engineering microenvironment for neuronal differentiation. Neural Regen. Res. 2020, 15 (4), P. 573-585. doi: 10.4103/1673-5374.266907.

14. Mikheev A.Y., Shlyapnikov Y.M., Kanev I.L., Avseenko A.V., Morozov V.N. Filtering and optical properties of free standing electrospun nanomats from nylon-4,6. European Polymer Journal, 2016, 75, P. 317-328. doi:_10.1016/J.EURPOLYMJ.2016.01.001.

15. Antonova, O.Y.; Kochetkova, O.Y.; Shlyapnikov, Y.M. ECM-Mimetic Nylon Nanofiber Scaffolds for Neurite Growth Guidance. Nanomaterials. 2021, 11, 516. https://doi.org/10.3390/nano11020516.

16. Antonova O.Y., Kochetkova O.Y., Kanev I.L., Shlyapnikova E.A., and Shlyapnikov Y.M. Rapid Generation of Neurospheres from Hippocampal Neurons Using Extracellular-Matrix-Mimetic Scaffolds. ACS Chemical Neuroscience. 2021, 12(15), 2838-2850. doi: 10.1021/acschemneuro. 1c00201.

17. Johnson C.D.L., Zuidema J.M., Kearns K.R., Maguire A.B., Desmond G.P., Thompson D.M., Gilbert R.J. The Effect of Electrospun Fiber Diameter on Astrocyte-Mediated Neurite Guidance and Protection. ACS Appl Bio Mater. 2019, 22, 2(1), p:104-117. doi: 10.1021/acsabm.8b00432.

18. Owens C., Marga F., Forgacs G., Essentials of 3D Biofabrication and Translation. Cambridge.: Academic Press, 2015, P. 440. doi: 10.1016/B978-0-12-800972-7.00023-2.

19. Vyas A., Li Z., Aspalter M., Feiner J., Hoke A., Zhou C., O'Daly A., Abdullah M., Rohde C., Brushart T.M. An in vitro model of adult mammalian nerve repair. Exp Neurol. 2010, 223, 1, p:112-8. doi: 10.1016/j.expneurol.2009.05.022.

20. Gerardo-Nava J., Hodde D., Katona I., Bozkurt A., Grehl Т., Steinbusch H.W., Weis J., Brook G.A. Spinal cord organotypic slice cultures for the study of regenerating motor axon interactions with 3D scaffolds. Biomaterials. 2014, 35, 14, p:4288-96. doi: 10.1016/j.biomaterials.2014.02.007.

21. Eming SA, Martin P, Tomic-Canic M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Sci Transl Med. 2014, 3, 6, 265, p:265sr6. doi: 10.1126/scitranslmed.3009337.

22. Puhl D.L., Funnell J.L., Nelson D.W., Gottipati M.K., Gilbert R.J. Electrospun Fiber Scaffolds for Engineering Glial Cell Behavior to Promote Neural Regeneration. Bioengineering (Basel). 2020, 29, 8, 1, p:4. doi: 10.3390/bioengineering8010004.

23. Andersen N., Srinivas S., Piñero G. et al. A rapid and versatile method for the isolation, purification and cryogenic storage of Schwann cells from adult rodent nerves. Sci Rep.2016, 6, 31781. doi: 10.1038/srep31781.

24. Dubový P., Klusáková I., Hradilová-Sviženská I., Brázda V., Kohoutková M., Joukal M. A Conditioning Sciatic Nerve Lesion Triggers a Pro-regenerative State in Primary Sensory Neurons Also of Dorsal Root Ganglia Non-associated With the Damaged Nerve. Front Cell Neurosci. 2019, 4, 13:11. doi: 10.3389/fhcel.2019.00011.

25. Wen J., Tan D., Li L., Guo J. Isolation and Purification of Schwann Cells from Spinal Nerves of Neonatal Rat. Bio Protoc. 2017, 20, 7, 20, p:e2588. doi: 10.21769/BioProtoc.2588.

26. Feles S, Overath C, Reichardt S, Diegeler S, Schmitz C, Kronenberg J, Baumstark-Khan C, Hemmersbach R, Hellweg CE, Liemersdorf C. Streamlining Culture Conditions for the Neuroblastoma Cell Line SH-SY5Y: A Prerequisite for Functional Studies. Methods Protoc. 2022, 5, 58. doi.org/10.3390/mps5040058.

Claims

Искусственный нервный кондуит, представляющий собой полую биорезорбируемую трубку, отличающийся тем, что полая биорезорбируемая трубка изготовлена из микропористого полилактид-ко-гликолида и заполнена продольными жгутами из нетканого материала, состоящего из трех слоев параллельных нейлоновых нановолокон, при этом верхний и нижний слои состоят из нейлоновых нановолокон диаметром 60 нм, а средний слой состоит из нейлоновых нановолокон диаметром 200 нм.