RU2257581C2

RU2257581C2 - Method for obtaining erythrocytic diagnostic kit for reverse passive hemagglutination (rpg) at salmonellosis in animals

Info

Publication number: RU2257581C2
Application number: RU2003126073/15A
Authority: RU
Inventors: М.Х. Халиков (RU); М.Х. Халиков; С.Г. Хаиров (RU); С.Г. Хаиров; О.Ю. Юсупов (RU); О.Ю. Юсупов; А.Д. Алиев (RU); А.Д. Алиев
Original assignee: Прикаспийский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт
Priority date: 2003-08-25
Filing date: 2003-08-25
Publication date: 2005-07-27
Also published as: RU2003126073A

Abstract

FIELD: veterinary science.

SUBSTANCE: the method deals with growing bacterial mass of Salmonella followed by its deposition, treating with 12%-sodium chloride solution, autoclaving at 121 C for 20 min, supplementing detergent, sedimentation due to centrifuging at 8-9 thousand rot./min for 30-35 min followed by applying supernatant (lipopolysaccharide-protein complex) to sensitize ram's formalinized erythrocytes. The method is considered to be economical, available and enables to obtain active and specific erythrocytic diagnostic kit.

EFFECT: higher efficiency.

Description

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к приготовлению диагностических препаратов, и может бить использовано для серологической диагностики сальмонеллезов животных.The invention relates to the field of veterinary medicine, in particular to the preparation of diagnostic preparations, and can be used for serological diagnosis of animal salmonella.

Известен способ изготовления эритроцитарных диагностикумов для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). (См. ″Способ получения эритроцитарных диагностикумов″, а.с. №648228, авт. И.Я.Мошиашвили, С.И.Елкина и Н.Е.Конделаки).A known method of manufacturing red blood cell diagnostics for the reaction of indirect hemagglutination (RNGA). (See ″ Method for the production of erythrocyte diagnosticums ″, AS No. 648228, auth. I.Ya. Moshiashvili, S.I. Yelkin and N.E. Kondelaki).

Недостатками указанного способа являются сложность технологии приготовления диагностикума, заключающаяся в использовании для сенсибилизации эритроцитов специфического белкового сенситина, и его танизация, проведение дополнительной сенсибилизации эритроцитов неспецифическим белком при температуре 4-8°С в течение 18-20 ч и консервации 4%-ным формалином в фосфатно-буферном растворе.The disadvantages of this method are the complexity of the diagnosticum preparation technology, which consists in using specific protein sensitin for sensitization of red blood cells, and its additional sensitization by red blood cells with a non-specific protein at a temperature of 4-8 ° C for 18-20 hours and preservation with 4% formalin in phosphate buffered saline.

Целью данного изобретения является упрощение технологии приготовления диагностикума путем разработки чувствительного, доступного для серийного производства, стабильного, с длительным сроком хранения, препарата для ускоренной диагностики сальмонеллезов, позволяющего своевременно и наиболее полно выявить больных животных и пригодного для проведения массовых серологических исследований.The aim of this invention is to simplify the preparation of a diagnosticum by developing a sensitive, affordable, for serial production, stable, with a long shelf life, preparation for the accelerated diagnosis of salmonella, allowing timely and most complete identification of sick animals and suitable for mass serological studies.

Технический результат, который может быть получен при реализации заявленного изобретения, заключается в упрощении технологии приготовления диагностикума.The technical result that can be obtained by implementing the claimed invention is to simplify the technology for preparing a diagnosticum.

Предлагаемый нами способ приготовления эритроцитарного диагностикума заключается в следующем: суточную бульонную культуру сальмонелл осаждают путем центрифугирования, доводят ее концентрацию до 25 млрд микробных клеток в 1 мл путем внесения 12%-ного раствора натрия хлорида и подвергают автоклавированию при давлении 1 атм. (121°С) в течение 20 минут.Our proposed method for preparing an erythrocyte diagnosticum is as follows: daily broth culture of salmonella is precipitated by centrifugation, its concentration is brought to 25 billion microbial cells in 1 ml by adding 12% sodium chloride solution and autoclaved at a pressure of 1 atm. (121 ° C) for 20 minutes.

После автоклавирования бакмассу охлаждают до температуры 40-45°С и добавляют 2% детергента (ПАВ - поверхностно-активное вещество). Полученную взвесь сальмонелл выдерживают в водяной бане при температуре 45-50°С в течение 40-45 минут, периодически встряхивая. Затем ее осаждают центрифугированием при 8-9 тыс. об/мин в течение 30-35 минут. Надосадочную жидкость (липополисахаридопротеиновый комплекс) используют в качестве сенситина для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана. Сенсибилизацию эритроцитов проводят в водяной бане при температуре 45°С в течение 1 часа, периодически встряхивая. После этого антиген (липополисахаридопротеиновый комплекс) трижды отмывают физиологическим раствором центрифугированием в течение 15-20 мин при 1500 об/мин (с целью удаления избытка сенситина). Затем взвесь сенсибилизированных эритроцитов доводят до 5%-ной концентрации физиологическим раствором и консервируют добавлением формалина с таким расчетом, чтобы концентрация формальдегида составила 0,3%.After autoclaving, the Bakmass is cooled to a temperature of 40-45 ° C and 2% detergent is added (surfactant is a surfactant). The resulting suspension of Salmonella is kept in a water bath at a temperature of 45-50 ° C for 40-45 minutes, periodically shaking. Then it is precipitated by centrifugation at 8-9 thousand rpm for 30-35 minutes. The supernatant (lipopolysaccharidoprotein complex) is used as sensitin for sensitization of sheep formalin erythrocytes. Erythrocyte sensitization is carried out in a water bath at a temperature of 45 ° C for 1 hour, periodically shaking. After that, the antigen (lipopolysaccharidoprotein complex) is washed three times with physiological saline by centrifugation for 15-20 minutes at 1500 rpm (in order to remove excess sensitin). Then, a suspension of sensitized erythrocytes is adjusted to a 5% concentration with physiological saline and preserved by the addition of formalin so that the formaldehyde concentration is 0.3%.

Готовый диагностикум проверяют на активность и специфичность с использованием сывороток крови от заведомо здоровых животных, от больных сальмонеллезами телят и абортировавших на почве сальмонеллезов овцематок. В качестве контроля используют гипериммунную сальмонеллезную сыворотку.A ready-made diagnosticum is checked for activity and specificity using blood serums from obviously healthy animals, from calves with salmonellosis, and ewes who aborted salmonella from the ewes. As a control, hyperimmune salmonella serum is used.

Для постановки РНГА используют 2,5%-ные формалинизированные и сенсибилизированные эритроциты.For the production of RNGA, 2.5% formalinized and sensitized red blood cells are used.

С целью проверки активности и специфичности приготовленного диагностикума нами проведены производственные испытания на 1018 пробах сывороток крови от абортировавших на почве сальмонеллезов и 1019 пробах клинически здоровых овцематок, а также на 45 пробах больных сальмонеллезами и 75 - здоровых телят.In order to check the activity and specificity of the prepared diagnosticum, we conducted production tests on 1018 samples of blood serum from salmonella aborted on the soil and 1019 samples of clinically healthy ewes, as well as 45 samples of patients with salmonellosis and 75 healthy calves.

В результате испытания разработанного диагностикума получены положительные реакции на сальмонеллезы в титрах 1:400-1:6400 и выше с оценкой в 3-4 креста, а сыворотки крови от здоровых животных дали отрицательный результат. Исследования сывороток в РНГА сопровождались положительным и отрицательным контролем.As a result of testing the developed diagnosticum, positive reactions to salmonellosis were obtained in titers of 1: 400-1: 6400 and higher with an estimate of 3-4 crosses, and blood serum from healthy animals gave a negative result. Studies of serum in RNGA were accompanied by positive and negative controls.

Во всех хозяйствах, где испытывали диагностикум в РНГА, диагноз на сальмонеллезы подтвержден бактериологически.In all farms where a diagnosticum was tested in RNGA, the diagnosis of salmonellosis was confirmed bacteriologically.

Таким образом, проведенные исследования показали активность и специфичность эритроцитарного диагностикума для РНГА, изготовленного по вышеописанному способу. Кроме того, последний является экономичным и доступным в производстве диагностическим препаратом как в лабораторных, так и биофабричных условиях.Thus, the studies showed the activity and specificity of the erythrocyte diagnosticum for RNGA, manufactured by the above method. In addition, the latter is an economical and affordable diagnostic product both in laboratory and biofactory conditions.

Claims

A method of obtaining an erythrocyte diagnosticum for an indirect hemagglutination reaction in animal salmonellosis, including growing the bacterial mass of salmonella, precipitating it, treating it with 12% sodium chloride solution, autoclaving at 121 ° C for 20 minutes, adding detergent, centrifuging precipitation at 8-9 thousand rpm for 30-35 min and the use of a supernatant (lipopolysaccharide-protein complex) for sensitization of formalized sheep erythrocytes.