RU2252225C2 - Method for production of semisynthetic human insulin - Google Patents
Method for production of semisynthetic human insulin Download PDFInfo
- Publication number
- RU2252225C2 RU2252225C2 RU2002135039/13A RU2002135039A RU2252225C2 RU 2252225 C2 RU2252225 C2 RU 2252225C2 RU 2002135039/13 A RU2002135039/13 A RU 2002135039/13A RU 2002135039 A RU2002135039 A RU 2002135039A RU 2252225 C2 RU2252225 C2 RU 2252225C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- insulin
- human insulin
- ester
- trypsin
- reaction
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биохимии и фармации и может быть использовано в биохимических, иммунологических и биологических исследованиях, а также при производстве препаратов инсулинов для терапевтических целей.The invention relates to the field of biochemistry and pharmacy and can be used in biochemical, immunological and biological studies, as well as in the manufacture of insulin preparations for therapeutic purposes.
Известны способы получения полусинтетической субстанции инсулина человека из свиного инсулина и из свиного инсулина с сопутствующими родственньми примесями путем обработки исходного сырья избытком эфира треонина в присутствии трипсина в водной среде при рН ниже изоэлектрической точки (патент №4 601 852, США, 1986 год) или из того же исходного сырья с использованием комбинации двух типов ферментов: карбоксипептидазы А и с последующим присоединением ди-трет-бутилового эфира треонина, который катализируется трипсином в свободном или иммобилизованном состоянии (Норре Seylers, Z. Physiol, Chem. 356, 1631).Known methods for producing a semisynthetic substance of human insulin from porcine insulin and from porcine insulin with related relatives by processing the feedstock with an excess of threonine ester in the presence of trypsin in an aqueous medium at a pH below the isoelectric point (Patent No. 4 601 852, USA, 1986) or the same feedstock using a combination of two types of enzymes: carboxypeptidase A and followed by addition of threonine di-tert-butyl ester, which is catalyzed by trypsin in free or immobilized gated state (Norre Seylers, Z. Physiol, Chem. 356, 1631).
Недостатками этих способов является образование промежуточного продукта типа Des-(Asp.sup.A21)-инсулин, который имеет низкую биологическую активность и довольно низкий выход конечного продукта за счет расщепления связи Arg.sup.B22-Gly.syp.B23 трипсином в водной среде.The disadvantages of these methods is the formation of an intermediate product of the type Des- (Asp.sup.A21) -insulin, which has a low biological activity and a rather low yield of the final product due to cleavage of the Arg.sup.B22-Gly.syp.B23 bond with trypsin in an aqueous medium .
Наиболее близким к данному изобретению по технической сущности и результату, который достигается, является способ получения полусинтетической субстанции инсулина человека, который включает получение эфира инсулина человека транспептидацией свиного инсулина с сопутствующими родственными примесями избытком трет-бутилового эфира треонина в водно-органической среде в присутствии трипсина и органической кислоты. Эта реакция транспептидации проводится при молярном избытке трет-бутилового эфира треонина по отношению к свиному инсулину более 5 и при весовом соотношении трипсина и свиного инсулина от 1 до 1-200. Ингибирование реакции осуществляется созданием кислой среды с рН 3, очистка полученного эфира инсулина человека производится анионной и/или катионной хроматографией, снятие защитных групп осуществляется известным способом трифторуксусной кислотой, после чего производится кристаллизация сырого инсулина человека. Условия проведения реакции: количество воды в реакционной смеси - более 10% и менее 50% объемных, температура реакции - менее 50°С (патент №4 343 898, США, С 12 Р 021/04).Closest to the present invention, the technical essence and the result that is achieved is a method for producing a semi-synthetic substance of human insulin, which involves the production of human insulin ester by transpeptidation of porcine insulin with concomitant related impurities in excess of threonine tert-butyl ether in an aqueous organic medium in the presence of trypsin and organic acid. This transpeptidation reaction is carried out with a molar excess of threonine tert-butyl ester with respect to porcine insulin of more than 5 and with a weight ratio of trypsin and porcine insulin from 1 to 1-200. Inhibition of the reaction is carried out by creating an acidic medium with pH 3, purification of the obtained human insulin ester is carried out by anionic and / or cationic chromatography, deprotection is carried out in a known manner by trifluoroacetic acid, after which crystallization of crude human insulin is carried out. Reaction conditions: the amount of water in the reaction mixture is more than 10% and less than 50% volume, the reaction temperature is less than 50 ° C (patent No. 4 343 898, USA, C 12 P 021/04).
Данный способ позволяет получить выход эфира инсулина человека, который определяет выход конечного продукта, более 60%-90%, но и ему присущ тот же недостаток - при использовании фермент-субстратного отношения, равного 1:1-200, в условиях проведения реакции транспептидации образуются примеси (до 7%), которые невозможно удалить на последующих стадиях получения инсулина человека известными способами, в результате чего получается конечный продукт, загрязненный этими примесями. Кроме того, данный способ является трудоемким и многостадийным.This method allows to obtain the yield of human insulin ether, which determines the yield of the final product, more than 60% -90%, but it also has the same drawback - when using an enzyme-substrate ratio of 1: 1-200, under the conditions of the transpeptidation reaction, impurities (up to 7%) that cannot be removed in the subsequent stages of obtaining human insulin by known methods, resulting in a final product contaminated with these impurities. In addition, this method is time-consuming and multi-stage.
Задачей изобретения является создание способа получения полусинтетического инсулина человека, который гарантирует повышение выхода эфира инсулина человека в результате реакции транспептидации, уменьшение количества трудноудалимых примесей в конечном продукте, обеспечение, таким образом, получения применимого для терапевтических целей биохимически активного, иммунологически безопасного инсулина человека и упрощение уже существующего способа за счет сокращения количества операций.The objective of the invention is to provide a method for producing semisynthetic human insulin, which guarantees an increase in the yield of human insulin ester as a result of the transpeptidation reaction, a decrease in the amount of difficult to remove impurities in the final product, thus providing a biochemically active, immunologically safe human insulin applicable for therapeutic purposes and simplification is already existing method by reducing the number of operations.
Поставленная задача решается тем, что в способе получения полусинтетического инсулина человека, включающем получение эфира инсулина человека транспептидацей свиного инсулина с сопутствующими родственными примесями, которую проводят в присутствии трипсина при молярном избытке ди-трет-бутилового эфира треонина по отношению к свиному инсулину в водно-органической среде, ингибирование реакции снижением рН, очистку эфира инсулина человека, снятие защитных групп и кристаллизацию инсулина человека, согласно изобретению транспептидацию проводят при весовом соотношении трипсина и свиного инсулина, равном 1:300-1000, осуществляют дополнительное ингибирование реакции разбавлением реакционной смеси водой в 2-3 раза, а очистку эфира инсулина человека осуществляют путем проведения ВЭЖХ с последующим получением кристаллов сырого инсулина человека и повторным проведением ВЭЖХ.The problem is solved in that in a method for producing semisynthetic human insulin, which includes producing human insulin ester with transpeptidium of porcine insulin with accompanying related impurities, which is carried out in the presence of trypsin with a molar excess of threonine di-tert-butyl ether in relation to porcine insulin in aqueous organic medium, inhibition of the reaction by lowering the pH, purification of the human insulin ester, deprotection and crystallization of human insulin, according to the invention, the transpeptidation of they are carried out at a weight ratio of trypsin and porcine insulin equal to 1: 300-1000, additional reaction inhibition is carried out by diluting the reaction mixture with water by a factor of 2-3, and human insulin ester is purified by HPLC followed by obtaining crystals of crude human insulin and repeated HPLC .
В качестве исходного сырья в заявляемом способе используют свиной инсулин с сопутствующими родственными примесями, такими как свиной проинсулин (до 2%) и продукты модификации и деградации свиного инсулина. Такой инсулин еще называют сырым инсулином.As the feedstock in the inventive method, pig insulin with concomitant related impurities, such as porcine proinsulin (up to 2%) and products of modification and degradation of porcine insulin, is used. Such insulin is also called crude insulin.
Водно-органическая среда, которая представляет собой воду со смесью апротонных (например, диметилацетамид, диметилсульфоксид) и протонных (наример, 1,2 этандиол, 1,4 бутандиол, 1,5 пентадиол) растворителей.An aqueous-organic medium, which is water with a mixture of aprotic (e.g. dimethylacetamide, dimethyl sulfoxide) and protic (e.g. 1,2 ethanediol, 1,4 butanediol, 1,5 pentadiol) solvents.
Трипсин в представленном техническом решении может быть свиным или бычьим с активностью 40-60 U/мг.Trypsin in the presented technical solution can be pork or bovine with an activity of 40-60 U / mg.
В реакции транспептидации может использоваться ди-трет-бутиловый эфир треонина или его соль.The threonine di-tert-butyl ester or its salt may be used in the transpeptidation reaction.
Дополнительное ингибирование реакции транспептидации разбавлением реакционной смеси водой в 2-3 раза позволяет непосредственно наносить разбавленную смесь на колонку системы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), что устраняет необходимость выполнения ряда технологических операций, которые описаны в прототипе: то есть осаждения реакционной смеси, отделения осадка центрифугированием, растворения осадка. Необходимость выполнения этих операций после снятия защитных групп также устраняется благодаря прямой кристаллизации.Additional inhibition of the transpeptidation reaction by diluting the reaction mixture with water by a factor of 2–3 allows directly applying the diluted mixture to a column of a high performance liquid chromatography (HPLC) system, which eliminates the need for a number of technological operations described in the prototype: that is, precipitation of the reaction mixture, separation of the precipitate by centrifugation dissolving the precipitate. The need to perform these operations after removal of the protective groups is also eliminated due to direct crystallization.
Кроме того, использование системы ВЭЖХ позволяет эффективно очистить эфир инсулина человека от свиного инсулина, который не прореагировал, и от примесей-спутников реакции транспептидации.In addition, the use of the HPLC system makes it possible to efficiently purify human insulin ester from porcine insulin that has not reacted, and from impurities that accompany the transpeptidation reaction.
Заключительная очистка уже конечного продукта - инсулина человека, который получается после снятия защитных групп известным способом трифторуксусной кислотой и прямой кристаллизации сырого инсулина человека, также производится на колонке системы высокоэффективной жидкостной хроматографии и позволяет достичь еще лучших результатов.The final purification of the already final product - human insulin, which is obtained after removal of the protective groups in a known manner with trifluoroacetic acid and direct crystallization of crude human insulin, is also carried out on a column of high performance liquid chromatography and can achieve even better results.
Условия реакции транспептидации, в частности заявляемое фермент-субстратное соотношение, которое отличает заявляемое решение, позволяют увеличить степень конверсии свиного инсулина или выход эфира инсулина человека до 98% и уменьшить количество трудноудаляемых примесей до 1,5%. На повышение степени устранения примесей направлена и дополнительная очистка конечного продукта системой ВЭЖХ - до 0,9%.The conditions of the transpeptidation reaction, in particular the claimed enzyme-substrate ratio, which distinguishes the claimed solution, can increase the degree of conversion of porcine insulin or the yield of human insulin ester up to 98% and reduce the number of difficult to remove impurities to 1.5%. An additional purification of the final product by the HPLC system is also aimed at increasing the degree of elimination of impurities - up to 0.9%.
Для постадийного контроля способа получения полусинтетического инсулина человека, оценки конечного продукта и его идентификации были использованы различные методики ВЭЖХ, пептидного картирования и иммуноферментного анализа.Various methods of HPLC, peptide mapping and enzyme-linked immunosorbent assay were used for step-by-step control of the method for producing semisynthetic human insulin, evaluation of the final product and its identification.
Решение поставленных задач иллюстрируется примерами конкретного выполнения.The solution of the tasks is illustrated by examples of specific performance.
Пример 1Example 1
100 мг сырого свиного инсулина суспендировали в 0,4 мл воды, добавили 0,05 мл уксусной кислоты, 3 мл 0,63 М ди-трет-бутилового эфира треонина в смеси диметилацетамида и 1,4 бутандиола, 0,25 мг трипсина с активностью 50 U/мг в 0,2 мл 0,05 М кальция ацетата, реакционную смесь перемешивали в течение 16 часов при температуре 23°С. Реакцию ингибировали разбавлением водой в два раза по отношению к объему реакционной смеси, и рН смеси довели до 2,5 10% НСl. Анализ реакционной смеси показал, что выход эфирной производной инсулина составил 98%. Разбавленную реакционную смесь профильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм для нанесения на колонку системы ВЭЖХ. В качестве неподвижной фазы использовали сорбент DAISOGEL ODS-AP (С-18) с размером частиц 15 мкм и размером пор 120 Å. Для подвижной фазы использовали 0,06 М глицин-НСl буфер, который содержал 0,015 М аммония сульфат и пропанол-2 с концентрацией от 20 до 35% при рН 2,5. Фракцию эфирной производной осадили в присутствии ионов цинка при рН от 6,8 до 7,0, отцентрифугировали, полученный осадок промыли водой и высушили в вакуумном сушильном шкафу. 82 мг полученного эфира инсулина человека растворили в 1,0 мл трифторуксусной кислоты, выдержали смесь в течение 40 минут при температуре 25°С, трифторуксусную кислоту отогнали на роторном испарителе при температуре не выше 30°С, полученный сырой инсулин человека растворили в воде и провели прямую цитратную кристаллизацию при рН 5,8.100 mg of crude porcine insulin was suspended in 0.4 ml of water, 0.05 ml of acetic acid, 3 ml of 0.63 M threonine di-tert-butyl ether in a mixture of dimethylacetamide and 1.4 butanediol were added, 0.25 mg of trypsin with activity 50 U / mg in 0.2 ml of 0.05 M calcium acetate, the reaction mixture was stirred for 16 hours at a temperature of 23 ° C. The reaction was inhibited by diluting with water twice in relation to the volume of the reaction mixture, and the pH of the mixture was adjusted to 2.5 with 10% Hcl. Analysis of the reaction mixture showed that the yield of the insulin ester derivative was 98%. The diluted reaction mixture was filtered through a 0.2 μm filter for application to an HPLC column. The DAISOGEL ODS-AP (C-18) sorbent with a particle size of 15 μm and a pore size of 120 Å was used as the stationary phase. For the mobile phase, 0.06 M glycine-Hcl buffer was used, which contained 0.015 M ammonium sulfate and propanol-2 with a concentration of 20 to 35% at a pH of 2.5. The ether derivative fraction was precipitated in the presence of zinc ions at a pH of 6.8 to 7.0, centrifuged, the resulting precipitate was washed with water and dried in a vacuum oven. 82 mg of the obtained human insulin ester was dissolved in 1.0 ml of trifluoroacetic acid, the mixture was kept for 40 minutes at a temperature of 25 ° C, trifluoroacetic acid was distilled off on a rotary evaporator at a temperature not exceeding 30 ° C, the obtained crude human insulin was dissolved in water and spent direct citrate crystallization at pH 5.8.
Кристаллическую суспензию отфильтровали, кристаллы промыли водой, растворили в 0,25 М уксусной кислоте и нанесли на колонку системы ВЭЖХ. В качестве подвижной фазы использовали 0,05 М ацетатный буфер, который содержал пропанола-2 от 10 до 20% при рН 2,5. Фракцию инсулина человека кристаллизовали при рН 5,8, суспензию кристаллов отфильтровали, промыли водой и лиофильно высушили. Выход инсулина человека составил 75 мг. Методом пептидного картирования было доказано, что этот продукт действительно является инсулином человека. Затем методом иммуноферментного анализа было установлено, что остаток свиного проинсулина в конечном продукте составлял менее 1 мкг/г, что отвечает фармакопейным требованиям, согласно которым содержание свиного проинсулина в инсулине человека не должно превышать 10 мкг/г. Что касается других сопутствующих примесей, то с помощью аналитической системы ВЭЖХ было установлено их содержание - не более 0,85%.The crystalline suspension was filtered, the crystals were washed with water, dissolved in 0.25 M acetic acid and applied to a column of an HPLC system. As the mobile phase, 0.05 M acetate buffer was used, which contained propanol-2 from 10 to 20% at pH 2.5. The human insulin fraction was crystallized at pH 5.8, the crystal suspension was filtered off, washed with water and freeze-dried. The output of human insulin was 75 mg. Using peptide mapping, it has been proven that this product is indeed human insulin. Then, by enzyme-linked immunosorbent assay, it was found that the remainder of the porcine proinsulin in the final product was less than 1 μg / g, which meets the pharmacopoeial requirements according to which the content of porcine proinsulin in human insulin should not exceed 10 μg / g. As for other related impurities, their content was established using an analytical system of HPLC - not more than 0.85%.
Пример 2Example 2
50 мг сырого свиного инсулина суспендировали в 0,2 мл воды, добавили 0,025 мл уксусной кислоты, 1,5 мл 0,858 М ди-трет-бутилового эфира треонина в смеси диметилацетамида и 1,5 пентадиола, 0,165 мг трипсина с активностью 40 U/мг в 0,1 мл 0,05 М кальция ацетата. Реакционную смесь перемешивали в течение 23 часов при температуре 18°С. Дальше поступали, как в примере 1, но реакционную смесь разбавляли водой в три раза по отношению к объему реакционной смеси. Выход эфира инсулина человека составил 40,5 мг, содержание сопутствующих примесей 0,8%.50 mg of crude porcine insulin was suspended in 0.2 ml of water, 0.025 ml of acetic acid, 1.5 ml of 0.858 M threonine di-tert-butyl ether in a mixture of dimethylacetamide and 1.5 pentadiol, 0.165 mg of trypsin with an activity of 40 U / mg were added. in 0.1 ml of 0.05 M calcium acetate. The reaction mixture was stirred for 23 hours at a temperature of 18 ° C. Then, as in example 1, they did, but the reaction mixture was diluted with water three times in relation to the volume of the reaction mixture. The yield of human insulin ester was 40.5 mg, the content of related impurities was 0.8%.
Пример 3Example 3
75 мг сырого свиного инсулина суспендировалии в 0,3 мл воды, добавили 0,04 мл уксусной кислоты, 2,25 мл 1,14 М ди-трет-бутилового эфира треонина в смеси диметилсульфоксида и 1,2 этандиола, 0,08 мг трипсина с активностью 60 U/мг в 0,15 мл 0,05 М кальция ацетата. Дальше поступали, как в примере 1. Выход эфира инсулина человека по данным аналитической ВЭЖХ составил 97%. Анализ конечного продукта показал, что содержание в нем сопутствующих родственных примесей составляет 0,84%.75 mg of crude porcine insulin was suspended in 0.3 ml of water, 0.04 ml of acetic acid, 2.25 ml of 1.14 M threonine di-tert-butyl ether in a mixture of dimethyl sulfoxide and 1.2 ethanediol, 0.08 mg of trypsin were added with an activity of 60 U / mg in 0.15 ml of 0.05 M calcium acetate. Then, as in example 1. The output of human insulin ester according to analytical HPLC was 97%. Analysis of the final product showed that the content of related related impurities in it is 0.84%.
Пример 4Example 4
Реакционная смесь и условия реакции, как в примере 2, за исключением количества трипсина - трипсина добавили 0,25 мг в 0,1 мл 0,05 М кальция ацетата. Реакцию проводили в течение 10 часов при температуре 23°С. По данным ВЭЖХ выход эфира инсулина человека составил 75%, количество трудно устранимых примесей составляло 5%.The reaction mixture and reaction conditions as in Example 2, except for the amount of trypsin-trypsin, was added 0.25 mg in 0.1 ml of 0.05 M calcium acetate. The reaction was carried out for 10 hours at a temperature of 23 ° C. According to HPLC, the yield of human insulin ester was 75%, the amount of difficult to remove impurities was 5%.
Пример 5Example 5
Реакционная смесь, как в примере 4, за исключением количества трипсина. Для реакции использовали 0,04 мг трипсина в 0,1 мл 0,05 М кальция ацетата. Реакционную смесь перемешивали в течение 20 часов при температуре 20°С. Выход эфира инсулина человека составил 70%, а количество свиного инсулина, который не прореагировал, равнялось 10%.The reaction mixture, as in example 4, except for the amount of trypsin. For the reaction, 0.04 mg of trypsin in 0.1 ml of 0.05 M calcium acetate was used. The reaction mixture was stirred for 20 hours at a temperature of 20 ° C. The yield of human insulin ester was 70%, and the amount of porcine insulin that did not react was 10%.
Пример 6Example 6
50 мг свиного проинсулина суспендировали в 0,25 мл воды, добавили 0,022 мл уксусной кислоты, 1,5 мл 0,7 М ди-трет-бутилового эфира треонина в смеси диметилацетамида и 1,4 бутандиола, 0,17 мг трипсина в 0,1 мл 0,05 М кальция ацетата. Условия проведения реакции были, как в примере 4. Реакционную смесь осадили 10 объемами ацетона и высушили. Анализ осадка по данным ВЭЖХ показал 85% выход эфирной производной инсулина человека.50 mg of porcine proinsulin was suspended in 0.25 ml of water, 0.022 ml of acetic acid, 1.5 ml of 0.7 M threonine di-tert-butyl ether in a mixture of dimethylacetamide and 1.4 butanediol, 0.17 mg of trypsin at 0 were added. 1 ml of 0.05 M calcium acetate. The reaction conditions were, as in example 4. The reaction mixture was precipitated with 10 volumes of acetone and dried. Analysis of the precipitate by HPLC showed an 85% yield of the human derivative of insulin ether.
Таким образом, как показывают примеры конкретного выполнения, использование заявляемого способа обеспечивает увеличение выхода эфира инсулина человека до 98% и уменьшение содержания сопутствующих родственных примесей в конечном продукте до 0,9% (примеры 1-3). В то же время, как показывают примеры 4 и 5, в которых ферментсубстратное соотношение трипсина и свиного инсулина находятся за заявляемыми пределами, поставленные задачи в отношении качества и количества выходного продукта решить не удается. Пример 6 доказывает, что при оптимальных условиях проведения реакции транспептидации свиной проинсулин, который является примесью в исходном сырье, на 85% конвертируется в эфир инсулина человека, что, как понятно, также способствует увеличению выхода конечного продукта.Thus, as examples of specific performance show, the use of the proposed method provides an increase in the yield of human insulin ester up to 98% and a decrease in the content of related related impurities in the final product to 0.9% (examples 1-3). At the same time, as shown by examples 4 and 5, in which the enzyme-substrate ratio of trypsin and porcine insulin are outside the claimed limits, the tasks in relation to the quality and quantity of the output product cannot be solved. Example 6 proves that under optimal conditions for the transpeptidation reaction, porcine proinsulin, which is an impurity in the feedstock, is 85% converted to human insulin ether, which, as is clear, also contributes to an increase in the yield of the final product.
Claims (1)
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
UA2001129230A UA46667C2 (en) | 2001-12-29 | 2001-12-29 | Method for preparing semisynthetic human insulin |
UA2001129230 | 2001-12-29 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2002135039A RU2002135039A (en) | 2004-11-27 |
RU2252225C2 true RU2252225C2 (en) | 2005-05-20 |
Family
ID=35820832
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2002135039/13A RU2252225C2 (en) | 2001-12-29 | 2002-12-26 | Method for production of semisynthetic human insulin |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2252225C2 (en) |
UA (1) | UA46667C2 (en) |
-
2001
- 2001-12-29 UA UA2001129230A patent/UA46667C2/en unknown
-
2002
- 2002-12-26 RU RU2002135039/13A patent/RU2252225C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ROSE K.et aL. Rapid preparation of human insulin and insulin analogues in high yield by enzyme-assisted semi-synthesis. Biochem. J. 1983, v.211, n.3, p.671-76. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
UA46667C2 (en) | 2006-01-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2156257C2 (en) | Method of stable crystalline zinc-insulin analog preparing | |
CA1315229C (en) | Chromatographic purification process | |
US9090705B2 (en) | Process for preparation of insulin compounds | |
AU660213B2 (en) | Large, latent complexes of TGF-beta2 and TGF-beta3 | |
JPS60243091A (en) | Chemical manufacture of antibiotic l17392 and salts | |
EP1734042B1 (en) | Acid cefotetan totally solvent free and method for obtaining same | |
EP0528117B1 (en) | Vancomycin precipitation process | |
RU2252225C2 (en) | Method for production of semisynthetic human insulin | |
JPH0796559B2 (en) | Improved purification method for proinsulin-like substances | |
JP2960257B2 (en) | Biotin introduction reagent and method for purifying synthetic peptide using the same | |
CN111793075A (en) | Preparation method of high-purity 3-deacetylcephalosporin C sodium salt | |
CA2326374C (en) | Process for the recovery and purification of a recombinant protein from a cell | |
NL8501105A (en) | PROCESS FOR THE PURIFICATION OF INSULIN. | |
AU613640B2 (en) | Chromatographic purification process | |
RU2252782C2 (en) | Method for production of insulin drug of durable action | |
GB2441328A (en) | A method for obtaining mupirocin calcium | |
IL99263A (en) | Preparation of crystalline 7-amino-3(5-carboxymethyl-4-methyl-1,3-thiazol-2-ylthiomethyl)-ceph-3-em-4-carboxylic acid | |
US20040152780A1 (en) | Process for the preparation of amorphous cilastatin sodium | |
EP0207727A2 (en) | A process for recovering glucagon from pancreas glands | |
RU2644674C1 (en) | Method for obtaining 3,3',3'',3'''-(3,8,13,17-tetramethylporphyrin-2,7,12,18-tetrayl) tetrapropionic acid (coproporphyrin) | |
WO2022097216A1 (en) | Method for producing recombinant insulin-like growth factor i | |
RU2261107C2 (en) | Method for preparing ready medicinal formulation of insulin with short effect | |
JP4196423B2 (en) | Alkylglyoxal adduct and method for producing the same | |
CN116987153A (en) | High-purity echinocandin drug impurity as well as preparation method and application thereof | |
CN114773427A (en) | Method for purifying polypeptide containing cysteine |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20081227 |