RU2247777C2 - Plasminogen urokinase type modified activator, dna sequence, recombinant plasmid, strain-producer, method for preparing plasminogen urokinase type modified activator and pharmaceutical composition eliciting thrombolytic effect - Google Patents
Plasminogen urokinase type modified activator, dna sequence, recombinant plasmid, strain-producer, method for preparing plasminogen urokinase type modified activator and pharmaceutical composition eliciting thrombolytic effect Download PDFInfo
- Publication number
- RU2247777C2 RU2247777C2 RU2001120927/13A RU2001120927A RU2247777C2 RU 2247777 C2 RU2247777 C2 RU 2247777C2 RU 2001120927/13 A RU2001120927/13 A RU 2001120927/13A RU 2001120927 A RU2001120927 A RU 2001120927A RU 2247777 C2 RU2247777 C2 RU 2247777C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- activator
- maput
- modified
- plasminogen activator
- sequence
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, генетической и белковой инженерии, т.е. к технологии получения белков с видоизмененными природными или новыми свойствами.The invention relates to the field of biotechnology, genetic and protein engineering, i.e. to technology for producing proteins with modified natural or new properties.
Более конкретно, настоящее изобретение относится к новому модифицированному активатору плазминогена урокиназного типа (мАПУТ), который обладает улучшенными тромболитическими свойствами.More specifically, the present invention relates to a new modified plasminogen activator urokinase type (MAPUT), which has improved thrombolytic properties.
Изобретение относится также к последовательности ДНК, которая кодирует новый мАПУТ, рекомбинантной плазмиде, содержащей кодирующую мАПУТ последовательность ДНК, штамму Escherichia coli - продуценту нового мАПУТ, способу получения нового мАПУТ и к фармацевтической композиции с тромболитическим действием, содержащей новый мАПУТ.The invention also relates to a DNA sequence that encodes a new MAPUT, a recombinant plasmid containing the MAPUT coding DNA sequence, an Escherichia coli strain producing a new MAPUT, a method for producing a new MAPUT, and a pharmaceutical composition with thrombolytic effect containing a new MAPUT.
Природные и модифицированные активаторы плазминогена (АП) применяются в качестве тромболитических средств для лечения заболеваний, обусловленных закупоркой сосудов фибрином, таких как инфаркт миокарда, легочная тромбоэмболия, тромбозы вен, тромболитические поражения глаз, в частности гемофтальм, гифема и др. Активаторы плазминогена катализируют превращение плазминогена в плазмин, который, в свою очередь, лизирует фибрин. Одним из активаторов плазминогена является урокиназа.Natural and modified plasminogen activators (APs) are used as thrombolytic agents for the treatment of diseases caused by vascular blockage with fibrin, such as myocardial infarction, pulmonary thromboembolism, venous thrombosis, thrombolytic lesions of the eyes, in particular hemophthalmus, hyphema and other plasminogen activators catalyze the conversion of plasminogen in plasmin, which in turn lyses fibrin. One of the plasminogen activators is urokinase.
Известно, что урокиназа, выделяемая из мочи, представлена тремя формами: низкомолекулярной (33 кДа), высокомолекулярной (50-55 кДа) двухцепочной и высокомолекулярной одноцепочной (проурокиназа), со значительным преобладанием низкомолекулярной формы. Наибольшую ценность для медицины представляют тромболитические препараты на основе высокомолекулярного предшественника (зимогена) урокиназы - проурокиназы, вследствие ее низкой активности до момента ее активации на тромбе. Проурокиназа синтезируется в клетке рибосомами, ассоциированными с эндоплазматическим ретикулом. Первоначально происходит синтез полипептида-предшественника (так называемой препроурокиназы), от которого в процессе ко-трансляционной секреции отщепляется сигнальный пептид. Секретируемая из клетки форма с отщепленным сигнальным пептидом и представляет собой проурокиназу. Проурокиназа ферментативно практически не активна и активируется, как и большинство сериновых протеаз, путем ферментативного гиролиза. Активаторами проурокиназы в организме обычно являются плазмин, калликреин и катепсин В.It is known that urokinase excreted from urine is presented in three forms: low molecular weight (33 kDa), high molecular weight (50-55 kDa) double-stranded and high molecular weight single-chain (prourokinase), with a significant predominance of low molecular weight form. Thrombolytic drugs based on the high molecular weight precursor (zymogen) of urokinase - prourokinase are of the greatest value for medicine, due to its low activity until it is activated on the thrombus. Prourokinase is synthesized in the cell by ribosomes associated with the endoplasmic reticulum. Initially, the synthesis of the precursor polypeptide (the so-called preprourokinase) takes place, from which the signal peptide is cleaved during co-translational secretion. The form secreted from the cell with cleaved signal peptide is a prourokinase. Prourokinase is enzymatically practically inactive and is activated, like most serine proteases, by enzymatic gyrolysis. The activators of prourokinase in the body are usually plasmin, kallikrein and cathepsin B.
Проурокиназа преимущественно активирует фибрин-связанный плазминоген, имеющий другую конформацию по сравнению с циркулирующим плазминогеном. Использование проурокиназы в качестве тромболитического препарата особенно эффективно по причине ее крайне низкой активности до момента активации непосредственно вблизи тромба.Prourokinase predominantly activates fibrin-bound plasminogen having a different conformation compared to circulating plasminogen. The use of prourokinase as a thrombolytic drug is especially effective because of its extremely low activity until activation immediately in the vicinity of the thrombus.
Проурокиназу принято также называть активатором плазминогена урокиназного типа (АПУТ).Prourokinase is also called the urokinase-type plasminogen activator (APUT).
Каталитическая активность проурокиназы и время ее жизни в организме контролируются взаимодействием проурокиназы с ингибитором активатора плазминогена I типа PAI-1.The catalytic activity of prourokinase and its lifetime in the body are controlled by the interaction of prourokinase with an inhibitor of plasminogen activator type I PAI-1.
В организме, кроме участия в процессах тромболизиса, АПУТ выполняет ряд других функций: участвует в воспалительных процессах и активирует пролиферацию клеток, стимулируя тем самым процессы заживления поврежденных тканей и метастазирования опухолей. Участие в этих процессах опосредовано взаимодействием с рядом других белков. Так, процессы пролиферации контролируются взаимодействием N-концевого домена АПУТ с клеточным рецептором.In addition to participating in the processes of thrombolysis, APUT performs a number of other functions in the body: it participates in inflammatory processes and activates cell proliferation, thereby stimulating the healing processes of damaged tissues and tumor metastasis. Participation in these processes is mediated by interaction with a number of other proteins. Thus, proliferation processes are controlled by the interaction of the N-terminal domain of APUT with the cell receptor.
Для использования АПУТ в качестве тромболитического препарата желательно при сохранении уровня биологической активности снизить ингибирование PAI-1, что может быть достигнуто внесением изменений в один из участков связывания ингибитора, и снизить побочные эффекты, связанные с взаимодействием АПУТ с рецептором, что достигается видоизменением амино-терминального участка АПУТ.To use APUT as a thrombolytic drug, it is desirable, while maintaining the level of biological activity, to reduce PAI-1 inhibition, which can be achieved by making changes to one of the inhibitor binding sites, and to reduce the side effects associated with the interaction of APUT with the receptor, which is achieved by modification of the amino-terminal APUT site.
Известны полная аминокислотная и нуклеотидная последовательности препроурокиназы (Holmes W.E. et al., Biotechnology 0: 923-929, 1985; SWISS-PROT: Р00749).The complete amino acid and nucleotide sequences of preprourokinase are known (Holmes W.E. et al., Biotechnology 0: 923-929, 1985; SWISS-PROT: P00749).
В настоящее время взаимодействие PAI с активатором плазминогена урокиназного типа считается хорошо изученным процессом. Известны трехмерные структуры этих белков: АПУТ (Spraggont G.S et al., Structure 3: 681-688, 1995) и PAI-1 (Mottonen J. et al., Nature 355: 270-273, 1992). Сформулированы модели взаимодействия АПУТ с ингибитором PAI-1 (Xue Y. et al., Structure 6:627-636, 1998).Currently, the interaction of PAI with an urokinase-type plasminogen activator is considered a well-studied process. Three-dimensional structures of these proteins are known: APUT (Spraggont G. S. et al., Structure 3: 681-688, 1995) and PAI-1 (Mottonen J. et al., Nature 355: 270-273, 1992). Formulated models of the interaction of APUT with a PAI-1 inhibitor (Xue Y. et al., Structure 6: 627-636, 1998).
Из приведенных выше работ следует, что взаимодействие между АПУТ и PAI осуществляется по крайней мере в двух участках: активном центре АПУТ и так называемой ингибиторной петле, представляющей из себя последовательность с 198 по 204 аминокислоту природного АПУТ: ArgArgHisArgGlyGlySer и выступающей из глобулы АПУТ близко к активному центру. По данным Spraggont G.S et al. (Structure 3: 681-688, 1995) эта петля может образовывать лишь 2 водородные связи с окружающими поверхностными аминокислотами, что говорит о малой связи ингибиторной петли с остальной частью АПУТ.From the above works it follows that the interaction between APUT and PAI is carried out in at least two areas: the APUT active center and the so-called inhibitor loop, which is a sequence from 198 to 204 amino acids of natural APUT: ArgArgHisArgGlyGlySer and protruding from the APUT globule is close to active to the center. According to Spraggont G.S et al. (Structure 3: 681-688, 1995) this loop can form only 2 hydrogen bonds with the surrounding surface amino acids, which indicates a small connection of the inhibitory loop with the rest of the APUT.
Ввиду изложенного выше представлялось естественным, что делеция ингибиторной петли приведет к снижению чувствительности к PAI, не затронув укладки и ферментативной активности АПУТ. Однако попытка получения модифицированного АПУТ с делетированной петлей (Adams D.S., J Biol Chem 266:13 8476-8482,1991) привела к резкому снижению выхода активного АПУТ.In view of the foregoing, it seemed natural that deletion of the inhibitory loop would lead to a decrease in sensitivity to PAI without affecting the folding and enzymatic activity of APUT. However, an attempt to obtain a modified APUT with a deleted loop (Adams D.S., J Biol Chem 266: 13 8476-8482.1991) led to a sharp decrease in the yield of active APUT.
В патенте США №5728654 по аналогии с данными, полученными на другой сериновой протеазе - тканевом активаторе плазминогена (tPA), теоретически предсказаны модификации в, по крайней мере, одном из положений ингибиторной петли АПУТ, которые по мнению авторов патента способны привести к снижению чувствительности и даже резистентности к PAI-1 за счет уменьшения положительного заряда в области ингибиторной петли протеазы. Однако конкретные модифицированные АПУТ в патенте не получены и не описаны. Прямой перенос результатов, полученных для tPA, на проурокиназу весьма сомнителен, поскольку не учитывает влияние мутационных изменений на всю пространственную структуру фермента. tPA имеет совершенно уникальное строение активного центра, что выделяет его из всех сериновых протеаз. А имеющиеся литературные данные позволяют утверждать, что главным местом связывания PAI-1 является не ингибиторная петля, а активный центр ферментов. Как следствие, tPA по-другому взаимодействует с ингибиторами ферментативной активности.In US patent No. 5728654, by analogy with data obtained on another serine protease - tissue plasminogen activator (tPA), modifications are theoretically predicted in at least one of the positions of the APUT inhibitory loop, which, according to the authors of the patent, can lead to a decrease in sensitivity and even resistance to PAI-1 by reducing the positive charge in the region of the protease inhibitor loop. However, specific modified APUT in the patent are not obtained and not described. The direct transfer of the results obtained for tPA to prourokinase is very doubtful, since it does not take into account the effect of mutational changes on the entire spatial structure of the enzyme. tPA has a completely unique structure of the active center, which distinguishes it from all serine proteases. And the available literature data suggest that the main binding site of PAI-1 is not the inhibitory loop, but the active center of the enzymes. As a result, tPA interacts differently with enzyme inhibitors.
Таким образом, существенные различия в строении активных центров tPA и АПУТ и, как следствие, различия в степени связи и характере взаимодействия ингибиторной петли с активным центром фермента (т.е. различия во влиянии области ингибиторной петли на поддержание конформации активного центра) не позволяют теоретически предсказать влияние мутационных изменений в ингибиторной петле АПУТ на его связь с PAI-1 и ферментативную (фибринолитическую и амидолитическую) активность.Thus, significant differences in the structure of the active centers of tPA and APUT and, as a result, differences in the degree of connection and the nature of the interaction of the inhibitor loop with the active center of the enzyme (i.e., differences in the effect of the region of the inhibitor loop on maintaining the conformation of the active center) do not allow to predict the effect of mutational changes in the APUT inhibitory loop on its association with PAI-1 and enzymatic (fibrinolytic and amidolytic) activity.
Нельзя не отметить еще одно важное обстоятельство: предлагаемая авторами патента США №5728564 резкая смена зарядов в ингибиторной петле (а эта петля действительно заметно выступает из глобулы АПУТ) может привести к появлению на поверхности белка нового антигенного детерминанта и, как следствие, - к развитию иммунных реакций, особенно в случае повторного применения. Кроме того, снижать чувствительность к PAI-1 следует очень осторожно, чтобы введение препарата не вызывало геморрагических осложнений.One important circumstance should be noted: the abrupt charge change in the inhibitor loop (and this loop really protrudes from the APUT globule) proposed by the authors of US patent No. 5728564 can lead to the appearance of a new antigenic determinant on the surface of the protein and, as a result, to the development of immune reactions, especially in case of repeated use. In addition, it is necessary to reduce sensitivity to PAI-1 very carefully so that the administration of the drug does not cause hemorrhagic complications.
Итак, при получении фармакологически приемлемых модификаций природного АПУТ необходимо соблюдение тонкого баланса между снижением чувствительности к ингибитору PAI-1 и его способностью вызывать геморрагические и иммунологические осложнения и сохранением функциональной активности фермента, что может быть достигнуто преимущественно экспериментальным путем с последующей коррекцией представлений о структуре и функции такой сложной белковой молекулы, какой является АПУТ.So, when obtaining pharmacologically acceptable modifications of natural APUT, it is necessary to maintain a delicate balance between a decrease in sensitivity to the PAI-1 inhibitor and its ability to cause hemorrhagic and immunological complications and the preservation of the functional activity of the enzyme, which can be achieved mainly experimentally with subsequent correction of ideas about the structure and function such a complex protein molecule as APUT.
Ранее авторами данного изобретения была получена рекомбинантная плазмидная ДНК pUABC22, кодирующая модифицированный активатор плазминогена урокиназного типа (мАПУТ), и штамм Escherichia coil - продуцент мАПУТ (Патент РФ №2140453). В патенте не приводятся аминокислотная последовательность мАПУТ и нуклеотидная последовательность ДНК, его кодирующей. Известно, что мАПУТ, кодируемый данной плазмидой pUABC22, представляет собой рекомбинантную проурокиназу, которая отличается от природной проурокиназы заменой первых 24 аминокислот N-концевого домена, гомологичного эпидермальному ростовому фактору, на 15 чужеродных аминокислот. Однако мАПУТ (далее мАПУТ22), кодируемый плазмидой pUABC22, не содержит видоизменений в участке связывания с ингибитором PAI-1.Previously, the inventors of the present invention obtained recombinant plasmid DNA pUABC22 encoding a modified urokinase-type plasminogen activator (MAPUT), and the Escherichia coil strain producing MAPUT (RF Patent No. 2140453). The patent does not provide the amino acid sequence of MAPUT and the nucleotide sequence of the DNA encoding it. MAPUT, encoded by this plasmid pUABC22, is known to be a recombinant prourokinase that differs from natural prourokinase by replacing the first 24 amino acids of the N-terminal domain homologous to epidermal growth factor by 15 foreign amino acids. However, MAPUT (hereinafter MAPUT22), encoded by the plasmid pUABC22, does not contain modifications at the binding site to the PAI-1 inhibitor.
Основная задача настоящего изобретения состояла в получении такого модифицированного АПУТ, который обладал бы пониженной чувствительностью к PAI-1, не имел побочных эффектов и при этом полностью сохранял биологическую активность, присущую природному АПУТ, т.е. в целом характеризовался лучшими, чем природный АПУТ, тромболитическими свойствами.The main objective of the present invention was to obtain such a modified APUT that would have a reduced sensitivity to PAI-1, had no side effects and at the same time completely retained the biological activity inherent in natural APUT, i.e. generally characterized by better than natural APUT, thrombolytic properties.
Новый модифицированный активатор плазминогена урокиназного типа, заявляемый в соответствии с настоящим изобретением, обладает улучшенными тромболитическими свойствамии и имеет выведенную аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1. В последовательности выделены замененные по сравнению с природным АПУТ аминокислоты: 2 аминокислоты ингибиторной петли и 16 чужеродных аминокислот N-концевого домена. При этом данный белок обладает фибринолитической и амидолитической активностями, присущими природному АПУТ.The new modified urokinase-type plasminogen activator, claimed in accordance with the present invention, has improved thrombolytic properties and has the deduced amino acid sequence of
Новый модифицированный АПУТ имеет молекулярную массу 43 кДа, определенную методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.The new modified APUT has a molecular weight of 43 kDa, determined by polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate.
Снижение чувствительности мАПУТ к ингибитору PAI-1 достигается за счет произведенных аминокислотных замен в участке связывания ингибитора активатора плазминогена I типа PAI-1 с АПУТ.The decrease in the sensitivity of MAPUT to the PAI-1 inhibitor is achieved by amino acid substitutions at the site of binding of the plasminogen activator inhibitor type I PAI-1 to the APUT.
Более конкретно, видоизменение, приводящее к уменьшению чувствительности к PAI, состоит в замене естественной последовательности аминокислот ингибиторной петли RRHRGGS (ArgArgHisArgGlyGlySer) на последовательность RHHAGGS (ArgHisHisAlaGlyGlySer).More specifically, a modification leading to a decrease in sensitivity to PAI consists in replacing the natural amino acid sequence of the RRHRGGS inhibitor loop (ArgArgHisArgGlyGlySer) with the RHHAGGS sequence (ArgHisHisAlaGlyGlySer).
Данная последовательность аминокислот соответствует аминокислотам №178-184 в нумерации аминокислот природной человеческой проурокиназы, №198-204 в случае ее предшественника - препроурокиназы (Holmes W.E. et al., Biotechnology 0: 923-929, 1985; SWISS-PROT: P00749) и №170-176 в случае заявляемой последовательности (SEQ ID NO 1). Такая замена позволяет избежать нарушений укладки белка при одновременном уменьшении чувствительности к PAI-1.This amino acid sequence corresponds to amino acids No. 178-184 in the numbering of amino acids of natural human prourokinase, No. 198-204 in the case of its predecessor, preprourokinase (Holmes WE et al., Biotechnology 0: 923-929, 1985; SWISS-PROT: P00749) and No. 170-176 in the case of the claimed sequence (SEQ ID NO 1). This replacement avoids protein folding disorders while reducing sensitivity to PAI-1.
За счет указанных видоизменений достигается большая ферментативная активность в присутствии PAI-1, чем в случае природного АПУТ. Это позволяет достичь аналогичного тромболитического эффекта при меньших дозах препарата. Кроме того, новый модифицированный АПУТ может оказаться особенно эффективным для пациентов с повышенным содержанием PAI-1 в крови.Due to these modifications, a greater enzymatic activity is achieved in the presence of PAI-1 than in the case of natural APUT. This allows you to achieve a similar thrombolytic effect with lower doses of the drug. In addition, a new modified APUT may be especially effective for patients with high levels of PAI-1 in the blood.
Новый модифицированный АПУТ содержит дополнительно видоизмененную по сравнению с природным АПУТ последовательность амино-терминального домена, гомологичного эпидермальному ростовому фактору, а именно: 24 аминокислоты N-концевого домена, вызывающие пролиферацию клеток, заменены на 15 чужеродных аминокислот.The new modified APUT contains an amino-terminal domain homologous to the epidermal growth factor, which is further modified as compared to natural APUT, namely, 24 amino acids of the N-terminal domain that cause cell proliferation are replaced by 15 foreign amino acids.
Следующим объектом заявляемой группы изобретений является последовательность ДНК, которая кодирует новый модифицированный АПУТ и имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 2.The next object of the claimed group of inventions is a DNA sequence that encodes a new modified APUT and has the nucleotide sequence of
В приведенной последовательности SEQ ID NO 2 выделены нуклеотиды, кодирующие замененные аминокислоты. Выделенные кодоны могут быть заменены любыми другими аналогичными кодонами, определяемыми соответствующими замененными аминокислотами.In the above sequence of
Последовательность ДНК, кодирующую новый модифицированный АПУТ, получают с использованием метода сайт-направленного мутагенеза.A DNA sequence encoding a new modified APUT is obtained using the site directed mutagenesis method.
Еще одним объектом изобретения является рекомбинантная плазмидная ДНК pUABC34 для экспрессии нового модифицированного АПУТ, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1. Плазмида pUABC34 имеет размер 4539 п.н. и содержит следующие последовательно соединенные конструктивные элементы:Another object of the invention is the recombinant plasmid DNA pUABC34 for expression of a new modified APUT having the amino acid sequence of
- фрагмент ДНК, кодирующий мАПУТ и имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 2, содержащую 2 участка узнавания рестриктазой NcoI, участок узнавания рестриктазой NdeI и участок узнавания рестриктазой BelI;- a DNA fragment encoding a MAPUT and having the nucleotide sequence of
- искусственную межгенную последовательность МГП14 и ген тРНК Arg;- the artificial intergenic sequence of MHP14 and the Arg tRNA gene;
- ген устойчивости к ампициллину;- gene for resistance to ampicillin;
- участок начала репликации;- the site of the beginning of replication;
- lac-промотор.- lac promoter.
Карта плазмиды представлена на фиг.1. Карта не дает исчерпывающей информации о деталях последовательности, например о сайтах рестрикции, присутствующих в данной ДНК, однако указанные на этой фигуре сайты являются достаточными для однозначного распознавания функциональных элементов плазмиды.A map of the plasmid is presented in figure 1. The map does not provide comprehensive information about the details of the sequence, for example, about the restriction sites present in this DNA, however, the sites indicated in this figure are sufficient for unambiguous recognition of the functional elements of the plasmid.
В основе получения плазмиды pUABC34 лежит технология рекомбинантных ДНК, все методы которой хорошо известны специалистам в данной области. Для этого BalI - BspEI - фрагмент плазмиды pUABC22 размером 4 т.п.н., содержащий ген устойчивости к антибиотику, участок начала репликации, ген аргининовой тРНК, искусственную межгенную последовательность МГП 14, а также N- и С-концевые фрагменты кодирующей области мАПУТ, и BspEI - BslI - фрагмент плазмиды pUABC22 размером 0.33 т.п.н, представляющий собой фрагмент кодирующей области мАПУТ, не содержащий видоизменений последовательности, лигируют с синтетическим фрагментом "А", который представляет собой последовательность, кодирующую измененный участок связывания с PAI-1 (см. фиг.3). В свою очередь, для получения синтетического фрагмента "А" синтезируют 8 попарно комплементарных олигонуклеотидов (см. фиг.2), фосфорилируют их при помощи полинуклеотидкиназы фага Т4, попарно отжигают и лигируют с образованием синтетического фрагмента рамером 150 п.н.The basis of obtaining plasmids pUABC34 is the technology of recombinant DNA, all methods of which are well known to specialists in this field. For this, BalI - BspEI is a 4 kbp plasmid fragment pUABC22 containing the antibiotic resistance gene, the site of replication origin, the arginine tRNA gene, the artificial intergenic sequence of
Следующим объектом заявляемой группы изобретений является штамм Escherichia coli - продуцент мАПУТ. Штамм получают путем трансформации клеток E.coli K-12 JM109 рекомбинантной плазмидной ДНК pUABC34.The next object of the claimed group of inventions is a strain of Escherichia coli - producer of MAPUT. The strain is obtained by transformation of E. coli K-12 JM109 cells with recombinant plasmid DNA pUABC34.
Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов и имеет коллекционный номер ВКПМ В-8145.The strain is deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms and has a collection number VKPM B-8145.
Еще одним объектом заявляемой группы изобретений является способ получения нового модифицированного АПУТ. Способ заключается в том, что культивируют клетки штамма-продуцента Escherichia coli ВКПМ В-8145 в условиях, обеспечивающих экспрессию мАПУТ, и выделяют из них целевой продукт.Another object of the claimed group of inventions is a method for producing a new modified APUT. The method consists in the fact that the cells of the producer strain of Escherichia coli VKPM B-8145 are cultured under conditions ensuring the expression of MAPUT, and the target product is isolated from them.
Для этого клетки штамма E.coli ВКПМ В-8145, содержащие плазмиду pUABC34, выращивают до плотности OD600=2.5 в LB-среде с ампициллином при 37°С и интенсивной аэрации, собирают с помощью центрифугирования, обрабатывают лизоцимом и разрушают с помощью ультразвука. Осадочную фракцию клеточного лизата растворяют в денатурирующих условиях, а затем проводят реконституцию ферментативной активности мАПУТ.For this, cells of the E. coli strain VKPM B-8145 containing the plasmid pUABC34 are grown to a density of OD 600 = 2.5 in an LB medium with ampicillin at 37 ° C and intensive aeration, collected by centrifugation, treated with lysozyme and destroyed by ultrasound. The sedimentary fraction of the cell lysate is dissolved under denaturing conditions, and then the enzymatic activity of MAPUT is reconstituted.
Еще одним объектом заявляемой группы изобретений являются фармацевтические композиции, обладающие тромболитическим действием. Фармацевтические композиции включает в себя новый мАПУТ в качестве действующего вещества и фармацевтически приемлемый носитель.Another object of the claimed group of inventions are pharmaceutical compositions with thrombolytic effect. Pharmaceutical compositions include the new MAPUT as an active substance and a pharmaceutically acceptable carrier.
Фармацевтические композиции могут быть получены известными в данной области техники способами.Pharmaceutical compositions may be prepared by methods known in the art.
Фармацевтические композиции на основе нового мАПУТ могут быть использованы в качестве лекарственного средства в любой лекарственной форме, преимущественно в виде парентеральных препаратов, таких, например, как растворы для инъекций.Pharmaceutical compositions based on the new MAPUT can be used as a medicine in any dosage form, mainly in the form of parenteral preparations, such as, for example, injectable solutions.
При приготовлении фармацевтических композиций в форме раствора для инъекций в качестве носителей могут быть использованы: растворители, такие как вода, этиловый спирт, макрогель (полигликоль), пропиленгликоль, этоксилированный изостеариловый спирт, полиоксилированный изостеариловый спирт, полиоксиэтиленсорбитановый эфир жирной кислоты, полисахара, такие как манетол, декстран и т.п.; регуляторы рН и буферы, такие как цитрат натрия, ацетат натрия или фосфат натрия, стабилизаторы, такие как пиросульфит натрия, глютатион, этилендиаминтетрауксуасная кислота, тиогликолевая кислота или тиомолочная кислота и др. В этом случае лекарственный препарат может содержать хлорид натрия, глюкозу или глицерин в количестве, достаточном для получения изотонического раствора. Указанные носители могут быть добавлены для получения растворов для подкожных, внутримышечных и внутривенных инъекций способом, известным в данной области техники.In the preparation of pharmaceutical compositions in the form of a solution for injection, the following vehicles can be used as carriers: solvents, such as water, ethyl alcohol, macrogel (polyglycol), propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, polysaccharide such as manetol , dextran and the like; pH regulators and buffers such as sodium citrate, sodium acetate or sodium phosphate, stabilizers such as sodium pyrosulphite, glutathione, ethylenediaminetetraacetic acid, thioglycolic acid or thiolactic acid, etc. In this case, the drug may contain sodium chloride, glucose or glycerin an amount sufficient to produce an isotonic solution. These carriers can be added to obtain solutions for subcutaneous, intramuscular and intravenous injection by a method known in the art.
Количество мАПУТ по настоящему изобретению, которое должно содержать вышеописанные фармацевтические композиции, изменяется в соответствии с типом композиции, способом введения, схемой дозирования и поэтому не может быть точно определено, а выбирается в соответствии с потребностью из определенного диапазона. Композиция может предпочтительно содержать примерно 0,1-10 мас.% мАПУТ от массы композиции.The amount of MAPUT of the present invention, which should contain the above pharmaceutical compositions, varies in accordance with the type of composition, route of administration, dosage schedule, and therefore cannot be precisely determined, but is selected according to need from a certain range. The composition may preferably contain about 0.1-10 wt.% MAPUT by weight of the composition.
Для лучшего понимания настоящего изобретения описание сопровождается следующими иллюстрациями:For a better understanding of the present invention, the description is accompanied by the following illustrations:
На фиг.1 представлена карта рекомбинантной плазмидной ДНК pUABC34, содержащая основные функциональные элементы плазмиды и характерные участки узнавания рестриктазами. Промотор lac-оперона обозначен как "Р"; мАПУТ означает кодирующую область мАПУТ; АрR - ген устойчивости к ампициллину, ori- участок начала репликации; ген аргининовой тРНК (Е.соli) обозначен как тРНК, искусственная межгенная последовательность МГП14 обозначена как МГП. Для привязки расположения функциональных элементов к физической карте (последовательности) приведены участки узнавания рестриктазами: NcoI, NdeI, KpnI, SacI и ScaI.Figure 1 presents a map of recombinant plasmid DNA pUABC34 containing the main functional elements of the plasmid and characteristic recognition sites of restriction enzymes. The lac operon promoter is designated as "P"; MAPUT means the coding region of MAPUT; Ap R - ampicillin resistance gene, ori- site of replication onset; the arginine tRNA gene (E. coli) is designated as tRNA, the artificial intergenic sequence of MHP14 is designated as MHP. To bind the location of functional elements to a physical map (sequence), restriction enzyme recognition sites are shown: NcoI, NdeI, KpnI, SacI and ScaI.
На фиг.2 представлены структуры олигонуклеотидов In1-In8, которые имеют нуклеотидные последовательности SEQ ID NO 3-10 и применяются при синтезе искусственного фрагмента "А" кодирущей области мАПУТ. Направление последовательности задается указанием 3'- и 5'-концов; для наглядности олигонуклеотиды расположены таким образом, как они входят в состав искусственного фрагмента кодирущей области мАПУТ; указано, какие из олигонуклеотидов фосфорилированы; при этом иллюстриуется сборка обеих цепей. Непосредственно под последовательностями олигонуклеотидов указаны кодируемые ими последовательности аминокислот. Аминокислоты, отличные от природных, подчеркнуты.Figure 2 presents the structure of the In1-In8 oligonucleotides that have the nucleotide sequence of SEQ ID NO 3-10 and are used in the synthesis of the artificial fragment "A" of the coding region of MAPUT. The direction of the sequence is specified by indicating the 3'- and 5'-ends; for clarity, the oligonucleotides are arranged in such a way as they are part of the artificial fragment of the coding region of MAPUT; which oligonucleotides are phosphorylated; this illustrates the assembly of both circuits. Directly below the sequences of oligonucleotides are the amino acid sequences encoded by them. Amino acids other than natural are underlined.
Фиг.3 иллюстрирует конструирование рекомбинантной плазмиды pUABC34, кодирующей мАПУТ. Буквами А, В и С обозначены фрагменты ДНК, из которых составляется плазмида pUABC34. Фрагмент "А" - искусственный фрагмент кодирующей области мАПУТ размером 0.15 т.п.н. Фрагмент "В" - это BalI - BspEI-фрагмент плазмиды pUABC22 размером 4 тпн. Он содержит ген усточивости к антибиотику, участок начала репликации, ген аргининовой тРНК, искусственную межгенную последовательность МГП14, а также N- и С-концевые фрагменты кодирующей области мАПУТ. Фрагмент С представляет собой BspEI - BelI - фрагмент плазмиды pUABC22 размером 0.33 т.п.н. Он содержит фрагмент кодирующей области мАПУТ, не содержащий видоизменений.Figure 3 illustrates the construction of a recombinant plasmid pUABC34 encoding MAPUT. The letters A, B, and C indicate the DNA fragments from which plasmid pUABC34 is composed. Fragment "A" is an artificial fragment of the coding region of MAPUT 0.15 kbp in size. Fragment "B" is a BalI - BspEI fragment of
Фиг.4 иллюстрирует построение калибровочной кривой фибринолитического теста и определение активности мАПУТ. По горизонтальной оси откладывается активность стандарта урокиназы в МЕ/мл. При построении использовались точки 12.5, 25, 50 и 100 МЕ/мл. По вертикальной оси откладывается диаметр зоны лизиса в мм. Калибровочные точки обозначены квадратными значками. Точки, по которым производилось измерение экспериментальных образцов мАПУТ, обозначены треугольниками.Figure 4 illustrates the construction of the calibration curve of the fibrinolytic test and the determination of the activity of MAPUT. The horizontal axis represents the activity of the urokinase standard in IU / ml. During the construction, points 12.5, 25, 50, and 100 IU / ml were used. The diameter of the lysis zone in mm is plotted along the vertical axis. Calibration points are indicated by square icons. The points by which the experimental samples of MAPUT were measured are indicated by triangles.
Фиг.5 иллюстрирует результаты амидолитического теста. По горизонтальной оси откладывается время реакции в секундах. По вертикальной оси откладывается оптическая плотность реакционной смеси после остановки реакции. Оптическая плотность измеряется при 405 нм. Значению OD=0.1 соответствует 0.28 мМ концентрация гидролизованного хромогенного субстрата S2444.5 illustrates the results of an amidolytic test. The horizontal axis represents the reaction time in seconds. The vertical axis shows the optical density of the reaction mixture after stopping the reaction. The optical density is measured at 405 nm. OD = 0.1 corresponds to 0.28 mM concentration of hydrolyzed chromogenic substrate S2444.
Кинетические кривые 3, 4 и 5 получены для концентраций стандарта 625, 1250 и 2500 МЕ/мл соответственно. Треугольными значками обозначены точки, по которым производилось измерение экспериментальных образцов мАПУТ. Кинетические кривые 1 и 2 получены для концентраций мАПУТ 20 и 10 мкг/мл соответственно. Круглые значки соответствуют значениям фона, создаваемого плазмином (кривая 6).
На фиг.6 отражены результаты амидолитического теста в присутствии ингибитора PAI-1. Кривые иллюстрируют влияние PAI-1 на заявляемый модифицированный АПУТ (мАПУТ34), содержащий модификацию аминокислотной последовательности в участке связывания ингибитора, и известный модифицированный АПУТ (мАПУТ22, Патент РФ №2140453), у которого такая модификация отсутствует. По горизонтальной оси откладывается время реакции в секундах. По вертикальной оси откладываются значения оптической плотности реакционной смеси после остановки реакции при 405 нм. Значению OD=0.1 соответствует 0.28 мМ концентрация гидролизованного хромогенного субстрата S2444.6 shows the results of an amidolytic test in the presence of a PAI-1 inhibitor. The curves illustrate the effect of PAI-1 on the claimed modified APUT (MAPUT34) containing a modification of the amino acid sequence at the inhibitor binding site, and the known modified APUT (MAPUT22, RF Patent No. 2140453), which does not have such a modification. The horizontal axis represents the reaction time in seconds. The vertical axis represents the optical density of the reaction mixture after stopping the reaction at 405 nm. OD = 0.1 corresponds to 0.28 mM concentration of hydrolyzed chromogenic substrate S2444.
Кривая 1 - мАПУТ22 без PAI; кривая 2 - мАПУТ34 без PAI, кривая 3 - молярное соотношение мАПУТ22/РАI=1:1; кривая 4 - молярное соотношение мАПУТ34/РАI=1:1; кривая 5 - молярное соотношение мАПУТ22/РАI=1:2, кривая 6 - молярное соотношение мАПУТ34/РАI=1:2.Curve 1 - MAPUT22 without PAI; curve 2 - MAPUT34 without PAI, curve 3 - molar ratio of MAPUT22 / PAI = 1: 1;
Перечень последовательностей нуклеотидов и аминокислот, характеризующих настоящее изобретение, включает следующие последовательности:The list of nucleotide and amino acid sequences characterizing the present invention includes the following sequences:
SEQ ID NO 1 представляет собой полную выведенную аминокислотную последовательность нового модифицированного АПУТ. В последовательности выделены замененные по сравнению с природным АПУТ аминокислоты.
SEQ ID NO 2 представляет собой фрагмент ДНК, кодирующий новый мАПУТ. Выделенные кодоны могут быть заменены любыми аналогичными, соответствующими замененным аминокислотам.
SEQ ID NO 3 - SEQ ID NO 10 представляют собой последовательности олигонуклеотидов In1-In10 соответственно, используемых при получении синтетического фрагмента "А" кодирующей области мАПУТ.SEQ ID NO 3 - SEQ ID NO 10 are sequences of In1-In10 oligonucleotides, respectively, used in the preparation of synthetic fragment "A" of the coding region of MAPUT.
Ниже приводятся примеры конкретного осуществления настоящего изобретения нижеследующими примерами. Однако следует иметь в виду, что эти примеры иллюстрирует, но не ограничивают настоящее изобретение.The following are examples of specific embodiments of the present invention with the following examples. However, it should be borne in mind that these examples illustrate but do not limit the present invention.
Пример 1. Получение синтетического фрагмента "А".Example 1. Obtaining a synthetic fragment "A".
На фиг.3 представлена сборка искусственного фрагмента кодирующей области из олигонуклеотидов, который обозначен как синтетический фрагмент "А". Он заменяет собой природный BalI-BclI фрагмент. Синтетические олигонуклеотиды In1-In8 синтезируют фосфорамидитным методом. Используют последовательности нуклеотидов, обозначенные как SEQ ID NO 3 - SEQ ID NO 10 в Перечне последовательностей и представленные на фиг.2.Figure 3 presents the assembly of an artificial fragment of the coding region from oligonucleotides, which is designated as a synthetic fragment "A". It replaces the natural BalI-BclI fragment. Synthetic In1-In8 oligonucleotides are synthesized by the phosphoramidite method. Use the nucleotide sequence indicated as SEQ ID NO 3 - SEQ ID NO 10 in the Sequence Listing and shown in FIG. 2.
5×10-10 моль каждого олигонуклеотида растворяют в 200 мкг буферного раствора состава: трис-НСl 25 мМ, рН 7.5; MgCl2 10 мМ; АТР 0.5 мМ; EDTA 0.1 мМ. К олигонуклеотидам In2-In7 добавляют полинуклеотидкиназу фага Т4 в концентрации 0.1 ед./мкл. Фосфорилирование продолжается 1 час при 37°С. Далее полинуклеотидкиназу инактивируют при 90°С в течение 20 сек.5 × 10 -10 mol of each oligonucleotide is dissolved in 200 μg of a buffer solution of the composition: Tris-Hcl 25 mm, pH 7.5;
Фосфорилированные олигонуклеотиды объединяют попарно: In3 с In4, In5 с In6. К фосфорилированному олигонуклеотиду In2 добавляют нефосфорилированный олигонуклеотид In1 (5·10-10 моль), к фосфорилированному олигонуклеотиду In7 добавляют нефосфорилированный олигонуклеотид In8 (5·10-10 моль). Объединенные попарно олигонуклеотиды прогревают при 90°С в течение 10 сек, а затем медленно (2 часа или более) охлаждают до +20°С в металлическом контейнере. Четыре полученных сшитых попарно олигонуклеотида смешивают, добавляют ДНК-лигазу фага Т4 (до 10 м/мл), инкубируют в течение 20 часов при +15°С, а затем инактивируют ДНК-лигазу 60°С за 20 сек.Phosphorylated oligonucleotides are combined in pairs: In3 with In4, In5 with In6. To the phosphorylated oligonucleotide was added In2 unphosphorylated oligonucleotide In1 (5 × 10 -10 mol) was added unphosphorylated oligonucleotide In8 (5 x 10 -10 moles) to phosphorylated oligonucleotide In7. The paired oligonucleotides are heated at 90 ° C for 10 seconds, and then slowly (2 hours or more) are cooled to + 20 ° C in a metal container. The four obtained crosslinked oligonucleotides are mixed, T4 phage DNA ligase is added (up to 10 m / ml), incubated for 20 hours at + 15 ° C, and then 60 ° C DNA ligase is inactivated for 20 sec.
Продукты реакции разделяют в 5% полиакриламидном геле. После окрашивания бромистым этидием из геля вырезают продукт длиной 150 п.н. и экстрагируют его в буферный раствор (трис-НСl 20 мМ, рН 7.5, NaCl 20 мм; EDTA 0.1 мМ) путем пассивной диффузии в течение 60 часов при 50°С. Продукт (синтетический искусственный фрагмент "А", кодирующий измененный участок связывания с PAI-1) концентрируют бутанолом-1 до объема от 100 до 400 мкл, а затем высаживают добавлением 3 объемов этанола. Продукт растворяют в буферном растворе состава: трис-НСl 20 мМ, рН 7.5; EDTA 0.1 мМ и его концентрацию определяют спектрофотометрически.The reaction products are separated on a 5% polyacrylamide gel. After staining with ethidium bromide, a 150 bp product is cut from the gel. and extracted into a buffer solution (Tris-
Пример 2. Получение рекомбинантной плазмидной ДНК pUABC34.Example 2. Obtaining recombinant plasmid DNA pUABC34.
1. 10 мкг плазмиды pUABC22 (Патент РФ №2140453) гидролизуют 20 ед. рестриктаз BalI и BspEI в буфере следующего состава: трис-НСl 25 мМ, рН 7.5; MgCl2 10 мМ; NaCl 50 мМ; EDTA 0.1 мМ. Продукты гидролиза разделяют в 0.8% легкоплавкой агарозе (Clontech Lab. Inc.). После окрашивания бромистым этидием идентифицируют фрагмент размером 4 т.п.н., кусочек геля вырезают, подвергают инкубации при 70°С в течение 15 мин., удаляют агарозу из образца экстракцией водным раствором фенола, а примеси фенола удаляют экстракцией бутанолом-1.1. 10 μg of plasmid pUABC22 (RF Patent No. 2140453) hydrolyze 20 units restriction enzymes BalI and BspEI in a buffer of the following composition: Tris-Hcl 25 mm, pH 7.5;
Полученный продукт высаживают добавлением 3 объемов этанола и растворяют в буферном растворе: трис-НСl 20 мМ, рН 7.5; EDTA 0.1 мМ. На фиг.3 фрагмент размером 4 т.п.н. обозначен как "В".The resulting product is planted by adding 3 volumes of ethanol and dissolved in a buffer solution: Tris-
2. 10 мкг плазмиды pUABC22 гидролизуют 20 ед. рестриктаз BelI и BspEI в буфере следующего состава: трис-НСl 25 мм, рН 7.5; MgCl2 10 мМ; NaCl 50 мМ; EDTA 0.1 мМ. Продукты гидролиза разделяют в 1.2% легкоплавкой агарозе (Clontech Lab. Inc.). После окрашивания бромистым этидием идентифицируют продукт длиной 0.33 т.п.н., кусочек геля вырезают; удаляют агарозу из образца экстракцией водным фенолом, а примеси фенола удаляют экстракцией бутанолом-1. Полученный продукт высаживают добавлением 3 объемов этанола. Полученный фрагмент растворяют в буфере: трис-НСl 20 мМ, рН 7.5; EDTA 0.1 мМ. На фиг.1 фрагмент размером 0.33 т.п.н. обозначен как "С".2. 10 μg of plasmid pUABC22 hydrolyze 20 units restriction enzymes BelI and BspEI in a buffer of the following composition: Tris-Hcl 25 mm, pH 7.5;
3. Оба выделенных фрагмента смешивают друг с другом и синтетическим фрагментом "А", добавляют MgCl2 до концентрации 10 мМ, АТР - до 0.5 мМ и ДНК-лигазу фага Т4 - до 10 ед./мл. После 20-часовой инкубации при +15°С полученную смесь трансформируют в клетки E.coli K-12 JM109. Для этого клетки E.coli K-12 JM109 выращивают при 37°С в среде LB до достижения оптической плотности 0.3 (при 600 нм). Клетки собирают центрифугированием и ресуспендируют в буфер (КСН3СОО 20 мМ, КСl 100 мМ, СаСl2 10 мМ, МnСl2 10 мМ, glycerol 10%, рН 5.5) при 0°С в объеме, составляющем 1/2 объема исходной культуры. Клетки вторично собирают центрифугированием и ресуспендируют при 0°С в том же буфере в объеме, составляющем 1/20 объема исходной культуры.3. Both selected fragments are mixed with each other and with synthetic fragment “A”, MgCl 2 is added to a concentration of 10 mM, ATP to 0.5 mM, and T4 phage DNA ligase up to 10 units / ml. After a 20-hour incubation at + 15 ° C, the resulting mixture was transformed into E. coli K-12 JM109 cells. For this, E. coli K-12 JM109 cells were grown at 37 ° C in LB medium until an optical density of 0.3 (at 600 nm) was reached. Cells are harvested by centrifugation and resuspended in buffer (KCH 3 COO 20 mM,
К 0.2 мл суспензии клеток добавляют лигазную смесь. После инкубации в течение 40 мин при 0°С и последующей инкубации при 42°С в течение 2 мин к клеткам добавляют 1 мл среды LB. Клетки инкубируют при 37°С в течение 40 мин и высевают на чашки с ампициллином (0.1 мг/мл). Из полученных клонов с помощью рестриктного анализа отбирают клоны, содержащие плазмиды с 2 участками узнавания рестриктазой NcoI и 2 участками узнавания рестриктазой NdeI. Нуклеотидную последовательность одного из отобранных клонов подтверждают методом Сэнгера и плазмиду с подтвержденной нуклеотидной последовательностью обозначают как pUABC34.A ligase mixture is added to 0.2 ml of the cell suspension. After incubation for 40 min at 0 ° C and subsequent incubation at 42 ° C for 2 min, 1 ml of LB medium is added to the cells. Cells are incubated at 37 ° C for 40 min and plated on plates with ampicillin (0.1 mg / ml). Clones containing plasmids with 2 NcoI restriction enzyme recognition sites and 2 NdeI restriction enzyme recognition sites were selected from the obtained clones using restriction analysis. The nucleotide sequence of one of the selected clones is confirmed by the Sanger method and a plasmid with a confirmed nucleotide sequence is designated as pUABC34.
Пример 3. Получение штамма-продуцента мАПУТ.Example 3. Obtaining a producer strain of MAPUT.
Клетки штамма Escherichia coli JM109 трансформируют плазмидой pUABC34 по методике примера 2 и получают штамм-продуцент модифицированного активатора плазминогена урокиназного типа. Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов и имеет коллекционный номер ВКПМ В-8145.Cells of the strain Escherichia coli JM109 are transformed with plasmid pUABC34 according to the procedure of example 2 and get the strain producing the modified plasminogen activator urokinase type. The strain is deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms and has a collection number VKPM B-8145.
Пример 4. Получение рекомбинантного модифицированного активатора плазминогена урокиназного типа.Example 4. Obtaining a recombinant modified plasminogen activator urokinase type.
Бактерии штамма E.coli ВКПМ В-8145, содержащие плазмиду pUABC34, выращивают до плотности OD600=2.5 в течение 16 ч в 50 мл LB-среды с ампициллином (100 мкг/мл) при 37°С и интенсивной аэрации. По окончании выращивания клетки собирают центрифугированием в течение 30 мин при 4000 об/мин, суспендируют в 2.5 мл буферного раствора (трис-НСl 20 мМ, рН 6.7, NaCl 30 мМ), добавляют 2.5 мг лизоцима и инкубируют 10 мин при 4°С. К полученной смеси добавляют Трис-HCl, рН 8.3, до 50 мМ и ЭДТА до 20 мМ, инкубируют 30 мин при 4°С, после чего обрабатывают ультразвуком 1 мин. Осадочную фракцию клеточного экстракта отделяют центрифугированием в течение 90 мин при 5000 об/мин, суспендируют в 1 мл 2%-ного Тритона Х-100 и центрифугируют 5 мин при 14000 об/мин. Осадок суспендируют в 100 мкл раствора, содержащего 200 мМ ЭДТА и 500 мМ Трис-HCl, рН 8.0, добавляют 800 мкл денатурирующего раствора (6 М гуанидинхлорид, 100 мМ 2-меркаптоэтанол), инкубируют 20 мин при 65°С, нерастворимый осадок убирают центрифугированием.Bacteria of the E. coli strain VKPM B-8145 containing the plasmid pUABC34 were grown to a density of OD 600 = 2.5 for 16 h in 50 ml of LB medium with ampicillin (100 μg / ml) at 37 ° С and intensive aeration. At the end of the cultivation, cells are collected by centrifugation for 30 min at 4000 rpm, suspended in 2.5 ml of buffer solution (Tris-
Процедуру реконституции ферментативной активности проводят следующим образом. Раствор разбавляют в 20 раз буфером: 100 мМ Трис-HlCl, рН 9.0, 200 мМ аргинин-хлорид, 5 мМ восстановленный глютатион, 1 мМ окисленный глютатион, денатурирующий агент (1 М гуанидинхлорид) и инкубируют в течение 40 ч при 4°С. Полученную смесь подвергают диализу против 1 л раствора, содержащего 100 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl, рН 8.0, в течение 6 ч. Выпавший осадок удаляют центрифугированием и измеряют активность в тесте на фибринолизис.The procedure for reconstitution of enzymatic activity is as follows. The solution was diluted 20 times with buffer: 100 mM Tris-HlCl, pH 9.0, 200 mM arginine chloride, 5 mM reduced glutathione, 1 mM oxidized glutathione, denaturing agent (1 M guanidine chloride) and incubated for 40 hours at 4 ° C. The resulting mixture was dialyzed against 1 L of a solution containing 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, for 6 hours. The precipitate was removed by centrifugation and the activity was measured in a fibrinolysis test.
Ренатурированный рекомбинантный модифицированный активатор плазминогена представлен, главным образом, проферментной формой с молекулярной массой 43 кДа, что подтверждают данные электрофоретического и зимографических анализов. Выход активного мАПУТ составляет порядка 200000 ед. на 1 г биомассы.The renatured recombinant modified plasminogen activator is represented mainly by the proenzyme form with a molecular weight of 43 kDa, which is confirmed by the data of electrophoretic and zymographic analyzes. The output of the active MAPUT is about 200,000 units. per 1 g of biomass.
Была исследована специфическая активность нового модифицированного АПУТ в сравнении с природным АПУТ путем определения фибринолитической активности по лизису фибрина и определения амидолитической активности после активации плазмином. Кроме того, было исследовано влияние ингибитора PAI-1 на мАПУТ в тесте на амидолитическую активность. При исследованиях в качестве стандарта использовалась высокомолекулярная урокиназа фирмы Calbiochem с активностью 100000 МЕ/мг.The specific activity of the new modified APUT was compared with natural APUT by determining the fibrinolytic activity by fibrin lysis and determining the amidolytic activity after activation by plasmin. In addition, the effect of the PAI-1 inhibitor on MAPUT was tested in the amidolytic activity test. In studies, high molecular weight urokinase from Calbiochem with an activity of 100,000 IU / mg was used as a standard.
Пример 5. Определение фибринолитической активности.Example 5. Determination of fibrinolytic activity.
Определение фибринолитической активности осуществляют по методу (Gaffney P.J. et al., Thrombos and Heamostas 45: 34-37, 1981). Агарозу (Clontech Lab. Inc.) разводят водой до получения 1.2% суспензии; суспензию кипятят до полного растворения агарозы и охлаждают до температуры 37°С.The determination of fibrinolytic activity is carried out according to the method (Gaffney P.J. et al., Thrombos and Heamostas 45: 34-37, 1981). Agarose (Clontech Lab. Inc.) is diluted with water to obtain a 1.2% suspension; the suspension is boiled until the agarose is completely dissolved and cooled to a temperature of 37 ° C.
Фибриноген (Sigma F 8630) растворяют в фосфатном буфере (20 мМ фосфата натрия, рН 7.5, 300 мМ NaCl, 0.1% Тритон Х-10, 5% глицерин) до концентрации 10 мг/мл при 37°С. Добавляют какодилат натрия (рН 7.4) до концентрации 5 мМ и тромбин (Sigma, T 3399) - до концентрации 0.08 ед/мл. Растворы фибриногена и агарозы смешивают и разливают в чашки Петри. После полимеризации при комнатной температуре чашки могут использоваться или храниться при +4°С.Fibrinogen (Sigma F 8630) was dissolved in phosphate buffer (20 mM sodium phosphate, pH 7.5, 300 mM NaCl, 0.1% Triton X-10, 5% glycerol) to a concentration of 10 mg / ml at 37 ° C. Sodium cacodylate (pH 7.4) was added to a concentration of 5 mM and thrombin (Sigma, T 3399) to a concentration of 0.08 u / ml. Fibrinogen and agarose solutions are mixed and poured into Petri dishes. After polymerization at room temperature, plates can be used or stored at + 4 ° C.
Приготовляют 0,2% раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) в фосфатном буфере: 10 мМ фосфата натрия, 150 мМ NaCI, pH 7.4. Образец стандарта высокомолекулярной урокиназы разводят в 0,2% растворе БСА таким образом, чтобы получить разведения от 12,5 до 100 МЕ/мл. Затем приготовляют растворы мАПУТ с концентрацией 20 и 40 мкг/мл.Prepare a 0.2% solution of bovine serum albumin (BSA) in phosphate buffer: 10 mm sodium phosphate, 150 mm NaCl, pH 7.4. A high molecular weight urokinase standard sample is diluted in a 0.2% BSA solution so as to obtain dilutions from 12.5 to 100 IU / ml. Then, solutions of MAPUT with a concentration of 20 and 40 μg / ml are prepared.
2 мл каждого разведения стандарта высокомолекулярной урокиназы (12.5, 25, 50 и 100 МЕ/мл) и исследуемых образцов наносят на поверхность фибринового геля. После 10-часовой инкубации при 30°С измеряют диаметр зон лизиза для образцов стандарта и мАПУТ. Стандарт используют для построения калибровочной кривой, по которой затем определяют активность мАПУТ. Квадратные значки на фиг.4 иллюстрируют построение калибровочной кривой. Треугольными значками обозначены точки, по которым производилось измерение экспериментальных образцов мАПУТ.2 ml of each dilution of the high molecular weight urokinase standard (12.5, 25, 50 and 100 IU / ml) and the test samples are applied to the surface of the fibrin gel. After a 10-hour incubation at 30 ° C, the diameter of the lysis zones is measured for standard samples and MAPUT. The standard is used to construct a calibration curve, which then determine the activity of MAPUT. The square icons in FIG. 4 illustrate the construction of a calibration curve. Triangular icons indicate the points at which the experimental samples of MAPUT were measured.
Как следует из результатов фибринолитического теста, активность мАПУТ не отличается от активности природной высокомолекулярной урокиназы и составляет ~105 МЕ/мг.As follows from the results of the fibrinolytic test, the activity of MAPUT does not differ from the activity of natural high-molecular urokinase and amounts to ~ 10 5 IU / mg.
Пример 6. Определение амидолитической активности.Example 6. Determination of amidolytic activity.
Образец стандарта высокомолекулярной урокиназы растворяют в 0,2% растворе БСА в фосфатном буфере (10 мМ фосфат натрия, 150 мМ NaCI, pH 7,4) до концентрации 5000 МЕ/мл. Плазмин (Serva, P-32965) растворяют в фосфатном буфере до концентрации 1 ед/мл. 100 мкл раствора стандарта урокиназы инкубируют с 1 мкл раствора плазмина в течение 1,0-1,5 часов при 37°С.A sample of the high molecular weight urokinase standard is dissolved in a 0.2% BSA solution in phosphate buffer (10 mM sodium phosphate, 150 mM NaCI, pH 7.4) to a concentration of 5000 IU / ml. Plasmin (Serva, P-32965) was dissolved in phosphate buffer to a concentration of 1 unit / ml. 100 μl of the urokinase standard solution are incubated with 1 μl of plasmin solution for 1.0-1.5 hours at 37 ° C.
Готовят образцы мАПУТ в 0,2% растворе БСА в фосфатном буфере с концентрацией 10 и 20 мкг/мл. 100 мкл раствора образцов мАПУТ инкубируют с 1 мкл раствора плазмина в течение 1,0-1,5 часов при 37°С.Samples of MAPUT are prepared in a 0.2% BSA solution in phosphate buffer at a concentration of 10 and 20 μg / ml. 100 μl of the sample solution MAPUT incubated with 1 μl of a solution of plasmin for 1.0-1.5 hours at 37 ° C.
Готовят последовательные разведения стандарта высокомолекулярной урокиназы, активированной плазмином, с помощью 0.2% раствора БСА в фосфатном буфере. Получают растворы с концентрацией стандарта 625, 1250 и 2500 МЕ/мл.Serial dilutions of the standard of high molecular weight urokinase activated by plasmin are prepared using a 0.2% BSA solution in phosphate buffer. Get solutions with a concentration of standard 625, 1250 and 2500 IU / ml
В качестве контроля используют раствор 1 мкл раствора плазмина в 0.2% раствора БСА в фосфатном буфере.As a control, a solution of 1 μl of a solution of plasmin in a 0.2% solution of BSA in phosphate buffer is used.
Амидолитическую активность оценивают по скорости гидролиза хромогенного субстрата S2444 (L-пироглутамил-глицил-L-аргинин-4-нитроанилид гидрохлорид, Serva B-52338) в присутствии добавляемых ферментов. К 100 мкл разведений активированной урокиназы, контрольного раствора и испытуемых образцов мАПУТ добавляют по 10 мкл 10 мМ водного раствора хромогенного субстрата S2444 и инкубируют при 37°С в течение 30 мин. Реакцию останавливают добавлением 500 мкл раствора 10% уксусной кислоты, растворы перемешивают и измеряют оптическую плотность при длине волны 405 нм. Результаты амидолитического теста представлены на фиг.5. Кинетические кривые 3, 4 и 5 получены для концентраций стандарта 625, 1250 и 2500 МЕ/мл соответственно. Треугольными значками обозначены точки, по которым производилось измерение экспериментальных образцов мАПУТ. Кинетические кривые 1 и 2 получены для концентраций мАПУТ 20 и 10 мкг/мл соответственно. Круглые значки соответствуют значениям фона, создаваемого плазмином (кривая 6).Amidolytic activity is assessed by the hydrolysis rate of the chromogenic substrate S2444 (L-pyroglutamyl-glycyl-L-arginine-4-nitroanilide hydrochloride, Serva B-52338) in the presence of added enzymes. To 100 μl of dilutions of activated urokinase, control solution and test samples of MAPUT, 10 μl of 10 mM aqueous solution of chromogenic substrate S2444 are added and incubated at 37 ° C for 30 min. The reaction is stopped by adding 500 μl of a solution of 10% acetic acid, the solutions are mixed and the absorbance is measured at a wavelength of 405 nm. The results of the amidolytic test are presented in figure 5.
По наклону начального (линейного) участка кривых делают вывод о скорости гиролиза хромогенного субстрата. Скорость гидролиза, отнесенная к концентрации фермента, характеризует удельную активность фермента.According to the slope of the initial (linear) portion of the curves, a conclusion is drawn about the rate of gyrolysis of the chromogenic substrate. The hydrolysis rate, referred to the concentration of the enzyme, characterizes the specific activity of the enzyme.
Как следует из результатов амидолитического теста, активность мАПУТ не отличается от активности природной высокомолекулярной урокиназы и составляет ~105 МЕ/мг.As follows from the results of the amidolytic test, the activity of MAPUT does not differ from the activity of natural high-molecular urokinase and amounts to ~ 10 5 IU / mg.
Пример 7. Определение чувствительности мАПУТ к ингибированию PAI-1.Example 7. Determination of the sensitivity of MAPUT to inhibition of PAI-1.
Влияние ингибитора PAI-1 на активность нового мАПУТ (мАПУТ34) определяют в амидолитическом тесте. Для сравнения используют известный мАПУТ22 (Патент РФ №2140453), от которого заявляемый мАПУТ отличается наличием модификации аминокислотной последовательности в участке связывания ингибитора PAI-1.The effect of the PAI-1 inhibitor on the activity of the new MAPUT (MAPUT34) is determined in the amidolytic test. For comparison, the well-known MAPUT22 (RF Patent No. 2140453) is used, from which the claimed MAPUT is distinguished by the presence of a modification of the amino acid sequence in the binding site of the PAI-1 inhibitor.
Готовят образцы мАПУТ22 и мАПУТ34 в 0,2% растворе БСА в фосфатном буфере (10 мМ фосфат натрия, 150 мМ NaCl, pH 7,4) с концентрацией 20 мкг/мл.Samples of MAPUT22 and MAPUT34 are prepared in a 0.2% BSA solution in phosphate buffer (10 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4) with a concentration of 20 μg / ml.
Плазмин (Serva, P-32965) растворяют в фосфатном буфере до концентрации 1 ед./мл. По 100 мкл раствора образцов мАПУТ инкубируют с 1 мкл раствора плазмина в течение 1,0-1,5 часов при 37°С.Plasmin (Serva, P-32965) was dissolved in phosphate buffer to a concentration of 1 unit / ml. 100 μl of sample solution of MAPUT are incubated with 1 μl of plasmin solution for 1.0-1.5 hours at 37 ° C.
В качестве контроля используют раствор 1 мкл раствора плазмина в 0.2% раствора БСА в фосфатном буфере.As a control, a solution of 1 μl of a solution of plasmin in a 0.2% solution of BSA in phosphate buffer is used.
Ингибитор PAI-1 (Calbiochem) растворяют в 0,1% растворе БСА в фосфатном буфере (фосфат Na 10 мМ, NaCl 150 мМ, pH 7.2-7.5) до концентрации 500 мкг/мл.The PAI-1 inhibitor (Calbiochem) is dissolved in a 0.1% BSA solution in phosphate buffer (
К аликвотам по 10 мкл 10 мМ водного раствора хромогенного субстрата S2444 добавляют 0, 4 и 8 мкл раствора PAI-1, что позволяет затем создать соотношения между мАПУТ и PAI, равные 0, 1:1 и 1:2.Aliquots of 10 μl of a 10 mM aqueous solution of the chromogenic substrate S2444 are added with 0, 4 and 8 μl of a PAI-1 solution, which then allows the creation of ratios between MAPUT and PAI equal to 0, 1: 1 and 1: 2.
К полученным разведениям PAI-1 в растворе хромогенного субстрата S2444 добавляют по 100 мкл контрольного раствора или растворов испытуемых образцов мАПУТ22 и мАПУТ34 и инкубируют при 37°С в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10 и 30 мин. Реакцию останавливают добавлением 100 мкл раствора 10% уксусной кислоты, растворы перемешивают и измеряют оптическую плотность при длине волны 405 нм.To the obtained dilutions of PAI-1 in a solution of chromogenic substrate S2444, 100 μl of the control solution or solutions of the tested samples MAPUT22 and MAPUT34 are added and incubated at 37 ° C for 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, and 30 minutes. The reaction is stopped by adding 100 μl of a solution of 10% acetic acid, the solutions are stirred and absorbance is measured at a wavelength of 405 nm.
Сравнительную активность нового и известного мАПУТ в отсутствие и в присутствии PAI-1 оценивают по характеру кинетических кривых, представленных на фиг.6. Кривая 1 получена для мАПУТ22 без PAI; кривая 2 - для мАПУТ34 без PAI. Кривая 3 получена при молярном соотношении мАПУТ22 и PAI, равном 1:1; а кривая 5 - при соотношении 1:2. Кривая 4 получена при молярном соотношении мАПУТ34 и PAI, равном 1:1; а кривая 6 - при соотношении 1:2.The comparative activity of the new and known MAPUT in the absence and in the presence of PAI-1 is evaluated by the nature of the kinetic curves shown in Fig.6.
Поскольку по ходу реакции происходит не только гидролиз хромогенного субстрата, но и постепенная инактивация ферментов за счет их взаимодействия с PAI, то и скорость реакции меняется не только за счет изменения концентрации субстрата, но и за счет постепенной инактивации фермента. Это обстоятельство делает неадекватным описание системы лишь начальной скоростью реакции, а требует описания изменения скорости во времени.Since in the course of the reaction not only the hydrolysis of the chromogenic substrate occurs, but also the gradual inactivation of the enzymes due to their interaction with PAI, the reaction rate also changes not only due to a change in the concentration of the substrate, but also due to the gradual inactivation of the enzyme. This circumstance makes the description of the system inadequate only the initial reaction rate, and requires a description of the change in speed over time.
Как следует из данных фиг.6, в отсутствие PAI интегральный эффект реакции как на начальном участке кривой, так и по выходе реакции на плато идентичны для обоих ферментов мАПУТ22 и мАПУТ34. При проведении реакции в присутствии PAI активность как мАПУТ22, так и мАПУТ34 уменьшается, но в существенно разной степени.As follows from the data of Fig.6, in the absence of PAI, the integral effect of the reaction both at the initial portion of the curve and at the exit of the reaction to the plateau is identical for both the enzymes MAPUT22 and MAPUT34. When carrying out the reaction in the presence of PAI, the activity of both MAPUT22 and MAPUT34 decreases, but to a significantly different extent.
Так при соотношении мАПУТ22/РАI, равном 1:1, активность в течение первых 3-х минут уменьшается в 2.5 раза, а через 30 мин - в 2.6 раза по сравнению с теми же величинами в отсутствие PAI. Уменьшение активности мАПУТ34 в аналогичных условиях происходит соответственно лишь в 1.3 и 1.2 раза.So, when the MAPUT22 / PAI ratio is 1: 1, the activity decreases 2.5 times during the first 3 minutes, and 2.6 times after 30 minutes compared to the same values in the absence of PAI. A decrease in the activity of MAPUT34 under similar conditions occurs only 1.3 and 1.2 times, respectively.
А при соотношении мАПУТ22/РАI, равном 1:2, активность мАПУТ22 в течение первых 3-х минут реакции уменьшается в 3.8 раза, а за 30 мин - в 4.3 раза по сравнению с теми же величинами в отсутствие PAI. Уменьшение активности мАПУТ34 в аналогичных условиях происходит соответственно лишь в 1.8 и 1.6 раза.And when the MAPUT22 / PAI ratio is 1: 2, the activity of MAPUT22 during the first 3 minutes of the reaction decreases by 3.8 times, and by 30 times by 4.3 times compared with the same values in the absence of PAI. A decrease in the activity of MAPUT34 under similar conditions occurs, respectively, only 1.8 and 1.6 times.
Следует отметить, что кривые для мАПУТ22 в присутствии PAI (кривые 3 и 5 фиг.6) выходят на насыщение уже на 6-ой минуте реакции на низком уровне, что говорит о практически полной инактивации мАПУТ22 к этому времени. При этом кривые реакций в отсутствие PAI (кривые 1 и 2) и кривые реакций мАПУТ34 с PAI (кривые 4 и 6) к этому времени еще не насыщаются, что говорит о наличии в реакционной смеси активного фермента.It should be noted that the curves for MAPUT22 in the presence of PAI (curves 3 and 5 of FIG. 6) reach saturation already at the 6th minute of the reaction at a low level, which indicates almost complete inactivation of MAPUT22 by this time. Moreover, the reaction curves in the absence of PAI (curves 1 and 2) and the reaction curves of MAPUT34 with PAI (curves 4 and 6) are not saturated by this time, which indicates the presence of an active enzyme in the reaction mixture.
Пример 8. Лекарственная форма для инъекций.Example 8. Dosage form for injection.
Для приготовления лекарственной формы для инъекций используют следующий состав: модифицированный АПУТ - 23,5 мг натрия хлорид - 180 мг.For the preparation of a dosage form for injection, the following composition is used: modified APUT - 23.5 mg of sodium chloride - 180 mg.
Модифицированный АПУТ растворяют в воде для инъекций, раствор подвергают стерилизации с использованием стерилизационного фильтра "Миллипор" с величиной пор 0,22 мм. Стерильный раствор разливают во флаконы по 5 мл, замораживают при температуре -46°С в течение 4 часов, а затем осуществляют сублимационную сушку при температуре -40°С с постепенным повышением температуры до 20°С в течение 48 часов.The modified APUT is dissolved in water for injection, the solution is sterilized using a Millipor sterilization filter with a pore size of 0.22 mm. The sterile solution is poured into 5 ml vials, frozen at -46 ° C for 4 hours, and then freeze-dried at -40 ° C with a gradual increase in temperature to 20 ° C for 48 hours.
Перечень последовательностей приведен в конце описания.A sequence listing is provided at the end of the description.
Claims (6)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2001120927/13A RU2247777C2 (en) | 2001-07-27 | 2001-07-27 | Plasminogen urokinase type modified activator, dna sequence, recombinant plasmid, strain-producer, method for preparing plasminogen urokinase type modified activator and pharmaceutical composition eliciting thrombolytic effect |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2001120927/13A RU2247777C2 (en) | 2001-07-27 | 2001-07-27 | Plasminogen urokinase type modified activator, dna sequence, recombinant plasmid, strain-producer, method for preparing plasminogen urokinase type modified activator and pharmaceutical composition eliciting thrombolytic effect |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2001120927A RU2001120927A (en) | 2003-07-27 |
| RU2247777C2 true RU2247777C2 (en) | 2005-03-10 |
Family
ID=35364919
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2001120927/13A RU2247777C2 (en) | 2001-07-27 | 2001-07-27 | Plasminogen urokinase type modified activator, dna sequence, recombinant plasmid, strain-producer, method for preparing plasminogen urokinase type modified activator and pharmaceutical composition eliciting thrombolytic effect |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2247777C2 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2458987C1 (en) * | 2011-06-27 | 2012-08-20 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвити | Method for producing recombinant fragment of human plasminogen possessing antiangiogenic action |
| RU2553533C2 (en) * | 2013-10-23 | 2015-06-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Международный биотехнологический центр "Генериум" ("МБЦ "Генериум") | Method of extraction and purification of recombinant human prourokinase m5 |
| RU2765043C1 (en) * | 2020-12-02 | 2022-01-25 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ кардиологии" Минздрава России) | Two-component pharmaceutical composition having fibrinolytic effect |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2528249C2 (en) * | 2012-11-23 | 2014-09-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Method for angiogenesis inhibition with recombinant forms of urokinase |
-
2001
- 2001-07-27 RU RU2001120927/13A patent/RU2247777C2/en active
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2458987C1 (en) * | 2011-06-27 | 2012-08-20 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвити | Method for producing recombinant fragment of human plasminogen possessing antiangiogenic action |
| RU2553533C2 (en) * | 2013-10-23 | 2015-06-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Международный биотехнологический центр "Генериум" ("МБЦ "Генериум") | Method of extraction and purification of recombinant human prourokinase m5 |
| RU2765043C1 (en) * | 2020-12-02 | 2022-01-25 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ кардиологии" Минздрава России) | Two-component pharmaceutical composition having fibrinolytic effect |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Dubey et al. | Isolation, production, purification, assay and characterization of fibrinolytic enzymes (Nattokinase, Streptokinase and Urokinase) from bacterial sources | |
| JP2584192B2 (en) | Recombinant expression vector expressing human urokinase and transformed cell | |
| ES2240972T3 (en) | MUTANTS OF THE THROMBIN. | |
| CN100537770C (en) | Enzyme is cut the proteolytic enzyme of the model Wilbond factor (vWF) | |
| EP0200451B1 (en) | Protease resistant urokinase composition, its production and use | |
| JP2005525798A (en) | Production method of recombinant protein in microorganism | |
| CN107760660B (en) | Tissue type plasminogen activator mutant and application thereof | |
| US20040197858A1 (en) | Process for producing human thrombin by gene modification technique | |
| RU2247777C2 (en) | Plasminogen urokinase type modified activator, dna sequence, recombinant plasmid, strain-producer, method for preparing plasminogen urokinase type modified activator and pharmaceutical composition eliciting thrombolytic effect | |
| RU2283863C2 (en) | Recombinant staphylokinase derivative, method for production and uses thereof | |
| JPH022376A (en) | Vector and compound for developing enzyme precursor type human protein c | |
| US9518255B2 (en) | Mutants of staphylokinase carrying amino and carboxy-terminal extensions for polyethylene glycol conjugation | |
| US4999194A (en) | Two-chain urokinase plasminogen activators for treatment of thrombotic disease | |
| Verstraete | The search for the ideal thrombolytic agent | |
| JPH08231595A (en) | Fibrinolytic chimera protein having thrombin inhibiting property | |
| KR101106507B1 (en) | Fibrinolytic protease derived from Formitella fracinea | |
| JPH02438A (en) | Modified low molecular weight plasminogen activated factor and production thereof | |
| RU2373281C2 (en) | Method of producing recombinant staphylokinase with regulation of oxygen level | |
| KR101884394B1 (en) | Recombinant fibrinolytic protease from Vibrio furnissii and uses thereof | |
| KR100419451B1 (en) | Protein with thrombolytic activities extracted from natural product | |
| JP2000504941A (en) | Plasminogen activator can be activated by thrombin | |
| CN111690634A (en) | Preparation and application of thrombolytic enzyme | |
| AU2014228858A1 (en) | Dual reactivity potent Kunitz inhibitor of fibrinolysis | |
| JP2005278550A (en) | Method for producing double chain tissue plasminogen activator | |
| GB2247022A (en) | Pro-urokinase derivatives |