RU2236008C1 - Method for diagnosing oxidation stress in human organism - Google Patents
Method for diagnosing oxidation stress in human organism Download PDFInfo
- Publication number
- RU2236008C1 RU2236008C1 RU2003123776/15A RU2003123776A RU2236008C1 RU 2236008 C1 RU2236008 C1 RU 2236008C1 RU 2003123776/15 A RU2003123776/15 A RU 2003123776/15A RU 2003123776 A RU2003123776 A RU 2003123776A RU 2236008 C1 RU2236008 C1 RU 2236008C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- biomolecules
- optical units
- hemolysate
- thiol groups
- oxidative
- Prior art date
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Предлагаемое изобретение относится к медицине и может быть использовано при диагностике и лечении различных заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом.The present invention relates to medicine and can be used in the diagnosis and treatment of various diseases accompanied by oxidative stress.
Окислительный стресс является распространенным патобиохимическим состоянием, широко встречающимся при различных экстремальных физиологических и патологических состояниях [Кулинский В.И. //Соросовский образовательный журнал, 1999, №1, с. 2-8]. Развитие окислительного стресса обусловлено дефицитом или несостоятельностью антиоксидантных факторов и/или избытком прооксидантных факторов, что проявляется дисбалансом анти-/прооксидантных систем [Е.Е.Дубинина, С.О.Бурмистров, Д.А.Ходов, И.Г.Поротое //Вопросы медицинской химии, 1995, №1, с. 24-26, Dean R.T., Hunt I.V., Grant A.J. et al. //Free Radical Biol. Med., 1991, v. 11, № 12, p. 161-165]. Окислительный стресс является причиной развития мембранных патологий обратимого или необратимого характера, что зависит от интенсивности повреждающих факторов и длительности окислительной нагрузки на организм [Ю.А.Владимиров. //Соросовский образовательный журнал, 2000, №12, с. 13-19]. Диагностика окислительного стресса и мониторинг эффективности антиоксидантной терапии, направленной на купирование его основных проявлений, требуют четко обоснованных критериев, разграничивающих повышенную напряженность антиоксидантных систем организма и сформировавшийся окислительный стресс.Oxidative stress is a common pathobiochemical state, widely encountered in various extreme physiological and pathological conditions [V. Kulinsky. // Soros Educational Journal, 1999, No. 1, p. 2-8]. The development of oxidative stress is caused by a deficiency or failure of antioxidant factors and / or an excess of prooxidant factors, which is manifested by an imbalance of anti- / prooxidant systems [E.E.Dubinina, S.O. Burmistrov, D.A. Khodov, I.G. Porotoy // Questions of medical chemistry, 1995, No. 1, p. 24-26, Dean R.T., Hunt I.V., Grant A.J. et al. // Free Radical Biol. Med., 1991, v. 11, No. 12, p. 161-165]. Oxidative stress is the cause of the development of membrane pathologies of a reversible or irreversible nature, which depends on the intensity of the damaging factors and the duration of the oxidative load on the body [Yu.A. Vladimir. // Soros Educational Journal, 2000, No. 12, p. 13-19]. Diagnosis of oxidative stress and monitoring the effectiveness of antioxidant therapy aimed at stopping its main manifestations require clearly substantiated criteria that distinguish between increased tension of the antioxidant systems of the body and the resulting oxidative stress.
Известен способ выявления дисбаланса системы анти-/прооксиданты (окислительного стресса) - “Антиоксидантный индекс эритроцитов” [Мальцев Г.Ю., Васильев А.В. //Вопросы питания, 1999, №2, с. 41-43], основанный на определении активности супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы как показателей антиоксидантной системы и уровня диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА) как показателей прооксидантной системы, с последующим вычислением разности между компонентами антиоксидантной системы и прооксидантными показателями с использованием нормирующих коэффициентов при расчете.A known method for detecting an imbalance of the anti- / prooxidant system (oxidative stress) - “Antioxidant index of red blood cells” [Maltsev G.Yu., Vasiliev A.V. // Nutrition issues, 1999, No. 2, p. 41-43], based on the determination of the activity of superoxide dismutase, catalase, glutathione reductase and glutathione peroxidase as indicators of the antioxidant system and the level of diene conjugates (DC) and malondialdehyde (MDA) as indicators of the prooxidant system, followed by calculation of the difference between the components of the antioxidant system and prooxide using normalizing factors in the calculation.
Ход определения: активность СОД эритроцитов определяют на основе метода М. Niashikimi и соавт. в модификации Г.Ю.Мальцева, А.В.Васильева [Niashikimi М., Rao N.A., Jagi К. Biochem Biophys Res Commun, 1972; 46: 849-854., Мальцев Г.Ю., Васильев А.В. Способ определения активности каталазы и супероксиддисмутазы эритроцитов на анализаторе открытого типа. Вопросы медицинской химии, 1994, № 2, с. 56-58.]; активность каталазы - в модификации Г.Ю.Мальцева, А.В.Васильева [Мальцев Г.Ю., Васильев А.В. Способ определения активности каталазы и супероксиддисмутазы эритроцитов на анализаторе открытого типа./Вопросы медицинской химии, 1994, № 2, с. 56-58] методом Oshino и соавт. [Oshino N., Chance В. Arch Niochem 1973; 154: 117-131.]; активность глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы - на основе метода G. Мillе [Мille G. The purification and properties of glutatione peroxidase of erythrocytes. J Biol Chem 1959; 244: 502-506.] и J.Tilbotson и соавт. [Tilbotsen J.A., Sauberlich H.S. J Nutrition 1971; 101: 1459.] соответственно. Все ферментные методы были адаптированы для полуавтоматического анализатора открытого типа ФП-901 фирмы "Лабсистемс" (Финляндия).Definition process: SOD activity of erythrocytes is determined based on the method of M. Niashikimi et al. as modified by G.Yu. Maltsev, A.V. Vasiliev [Niashikimi M., Rao N.A., Jagi K. Biochem Biophys Res Commun, 1972; 46: 849-854., Maltsev G.Yu., Vasiliev A.V. A method for determining the activity of erythrocyte catalase and superoxide dismutase on an open type analyzer. Questions of medical chemistry, 1994, No. 2, p. 56-58.]; catalase activity - in the modification of G.Yu. Maltsev, A.V. Vasiliev [Maltsev G.Yu., Vasiliev A.V. A method for determining the activity of erythrocyte catalase and superoxide dismutase on an open type analyzer. / Questions of medical chemistry, 1994, No. 2, p. 56-58] by the method of Oshino et al. [Oshino N., Chance B. Arch Niochem 1973; 154: 117-131.]; activity of glutathione peroxidase and glutathione reductase - based on the method of G. Mille [Mille G. The purification and properties of glutatione peroxidase of erythrocytes. J Biol Chem 1959; 244: 502-506.] And J. Tilbotson et al. [Tilbotsen J.A., Sauberlich H.S. J Nutrition 1971; 101: 1459.] respectively. All enzyme methods were adapted for the FP-901 open-type semi-automatic analyzer of the Labsystems company (Finland).
Содержание МДА в эритроцитах оценивают на основе метода L.Emster и соавт. [Emster L., Nordenbrandt К. In "Methods in Enzymology" Estabrook R.W., Pullman M.E., eds. 1967; 10: 575.], ДК в эритроцитах - методом Z.Placer [Placer Z. Nahrung 1968; 12: 679.] в модификации Ю.А.Владимирова и соавт. [Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. - М.: Наука, 1972, с. 237-238.].The content of MDA in red blood cells is estimated based on the method of L. Emster et al. [Emster L., Nordenbrandt K. In "Methods in Enzymology" Estabrook R.W., Pullman M.E., eds. 1967; 10: 575.], DC in red blood cells - by the method of Z. Placer [Placer Z. Nahrung 1968; 12: 679.] in the modification of Yu.A. Vladimirim et al. [Vladimirov Yu.A., Archakov A.I. Lipid peroxidation in biological membranes. - M .: Nauka, 1972, p. 237-238.].
Антиоксидантный индекс эритроцитов рассчитывают по формулеThe red blood cell antioxidant index is calculated by the formula
АОИ=k1(COД)+k2(Каталаза)+k3(ГП)+k4(ГР)-k5(MДAэp.)-k6(ДКэр.),AOI = k 1 (COD) + k 2 (Catalase) + k 3 (GP) + k 4 (GR) -k 5 (MDAer.) - k 6 (DCera),
где АОИ - антиоксидантный индекс, в скобках - абсолютные значения параметров; k1...k6 - нормирующие, или взвешивающие, коэффициенты, которые представляют собой обратные величины 1/Х; Х - среднее абсолютное значение параметра в контрольной клинической группе или в группе добровольцев.where AOI is the antioxidant index, in brackets are the absolute values of the parameters; k 1 ... k 6 - normalizing, or weighting, coefficients, which are the reciprocal of 1 / X; X is the average absolute value of the parameter in the control clinical group or in the group of volunteers.
Результаты оценивают следующим образом: среднестатистическая величина АОИ, полученная в контрольной группе, будет равна 2; состояние, при котором значения АОИ меньше 2, рассматривают как окислительный стресс.The results are evaluated as follows: the average value of AOI obtained in the control group will be equal to 2; a condition in which AOI values are less than 2 are considered as oxidative stress.
Недостатки:Disadvantages:
а) использование в способе “Антиоксидантный индекс” результатов исследования активности ферментов приводит к снижению его достоверности и затрудняет трактовку данного коэффициента, что связано с широкой вариабельностью изменения их активности как в сторону повышения, так и в сторону понижения, даже в условиях одной патологии;a) the use of the results of the study of enzyme activity in the “Antioxidant Index” method leads to a decrease in its reliability and complicates the interpretation of this coefficient, which is associated with the wide variability of changes in their activity both upward and downward, even in conditions of the same pathology;
б) значительная трудоемкость в сочетании с недостаточно высокой чувствительностью и специфичностью существующих методов определения активности ферментов, используемых в способе “Антиоксидантный индекс”, а также многообразие подходов, используемых в различных лабораториях, что может затруднять трактовку полученных результатов;b) significant laboriousness in combination with insufficiently high sensitivity and specificity of existing methods for determining the activity of enzymes used in the Antioxidant Index method, as well as the variety of approaches used in various laboratories, which may complicate the interpretation of the results;
в) при расчете антиоксидантного индекса происходит оперирование несравнимыми с точки зрения размерности физических величин [величина активности ферментов (индекс ферментной защиты)] и химической кинетики реакций [количество продуктов других, преимущественно неферментативных реакций (индекс уровня продуктов ПОЛ)], что повышает вероятность получения недостаточно объективных или неверных результатов при использовании данного способа.c) when calculating the antioxidant index, operations are performed that are incomparable in terms of the dimensionality of physical quantities [enzyme activity value (enzyme protection index)] and chemical reaction kinetics [number of products of other, mainly non-enzymatic reactions (LPO product level index)], which increases the likelihood of obtaining insufficient objective or incorrect results when using this method.
За прототип нами принят способ выявления дисбаланса системы анти-/прооксиданты (окислительного стресса) “Антиоксидантный коэффициент (АОК) эритроцитов” [Ф.А.Тугушева, А.И.Куликова, И.М.Зубина //Вопросы медицинской химии, 1993, т. 39, №3, с. 18-21], основанный на определении уровня токоферола, общих и небелковых SH-групп как показателей антиоксидантной системы эритроцита и малонового диальдегида (МДА) как показателя уровня продуктов ПОЛ эритроцита, с последующим делением антиоксидантных показателей на прооксидантные.For the prototype, we adopted a method for detecting an imbalance of the anti- / prooxidant system (oxidative stress) “Antioxidant coefficient (AOK) of red blood cells” [F.A. Tugusheva, A.I. Kulikova, I.M.Zubina // Questions of medical chemistry, 1993, t. 39, No. 3, p. 18-21], based on the determination of the level of tocopherol, total and non-protein SH-groups as indicators of the antioxidant system of the erythrocyte and malondialdehyde (MDA) as an indicator of the level of erythrocyte lipid peroxidation products, followed by the division of the antioxidant parameters into prooxidant ones.
Объектом исследования служила свежевыпущенная кровь (эритроцитарная взвесь) здоровых и больных людей. Об интенсивности ПОЛ судят по уровню МДА, который определяют с помощью стандартной методики [Романова Л.А., Стальная И.Д. //Современные методы в биохимии. - М., 1977, с. 64-66]. Антиоксидантный потенциал оценивают по содержанию токоферолоподобных веществ (ТФ), общих и небелковых сульфгидрильных групп. ТФ определяют спектрофотометрически, взяв за основу стандартную методику [Рудакова-Жилина Н.К., Матюхова Н.П. //Лаб. дело, 1982, №1, с. 19-22] и несколько модифицировав ее применительно к плазме и эритроцитарной взвеси. Содержание сульфгидрильных групп (SH-групп) определяют методом [Sedlak/Lindsay R.Н. //Analyt. Biochem, 1968, v. 25, № 1-3, p. 192-205].The object of the study was freshly released blood (erythrocyte suspension) of healthy and sick people. The intensity of LPO is judged by the level of MDA, which is determined using a standard technique [Romanova L.A., Steel I.D. // Modern methods in biochemistry. - M., 1977, p. 64-66]. Antioxidant potential is estimated by the content of tocopherol-like substances (TF), total and non-protein sulfhydryl groups. TF is determined spectrophotometrically, taking as a basis the standard technique [Rudakova-Zhilina N.K., Matyukhova N.P. // Lab. business, 1982, No. 1, p. 19-22] and slightly modifying it in relation to plasma and erythrocyte suspension. The content of sulfhydryl groups (SH-groups) is determined by the method of [Sedlak / Lindsay R.N. // Analyt. Biochem, 1968, v. 25, No. 1-3, p. 192-205].
Расчет проводят по формулеThe calculation is carried out according to the formula
АОКэр.=(ТФ+общие SH-гр.+небелковые SH-гр.)/МДА.AOKER. = (TF + general SH-gr. + Non-protein SH-gr.) / MDA.
Чем ниже было значение АОКэр. по сравнению с показателями донорской группы, принятой за 100%, тем более выраженным считают дисбаланс (окислительный стресс) в системе анти-/прооксиданты организма.The lower the value of AOKar. Compared to the indicators of the donor group, taken as 100%, the imbalance (oxidative stress) in the body's anti- / prooxidants system is considered the more pronounced.
Недостатки:Disadvantages:
а) из прооксидантных показателей учитывают только узкоспецифичный конечный продукт пероксидации липидов - МДА, что приводит к снижению достоверности данного метода;a) from prooxidant indicators, only the narrowly specific final product of lipid peroxidation, MDA, is taken into account, which leads to a decrease in the reliability of this method;
б) отсутствует учет промежуточных продуктов окислительной модификации биологических молекул как липидной (диеновые конъюгаты и т.п.), так и другой природы (белковой, нуклеотидной, углеводной), что снижает чувствительность данного метода и приводит к неверному отражению уровня имеющегося окислительного стресса, а следовательно, неадекватному назначению терапии, направленной на его устранение;b) there is no accounting for the intermediate products of the oxidative modification of biological molecules of both lipid (diene conjugates, etc.) and other nature (protein, nucleotide, carbohydrate), which reduces the sensitivity of this method and leads to an incorrect reflection of the level of oxidative stress, and therefore, inadequate prescription of therapy aimed at eliminating it;
в) используемые для расчета антиоксидантного коэффициента эритроцитов величины (токоферол и SH-группы) имеют неодинаковую размерность; подвергнуты некорректной обработке (суммирование показателей, значимость которых в составе антиоксидантной системы (АОС) несоизмерима: SH-группы - это обязательный и ключевой компонент АОС, а токоферол является одним из целого ряда липофильных антиоксидантов, регенерация которого, в свою очередь, зависит от SH-групп), что снижает достоверность полученных данных при оценке окислительного стресса у больного;c) the values used to calculate the antioxidant coefficient of erythrocytes (tocopherol and SH-groups) have an unequal dimension; subjected to incorrect processing (the summation of indicators whose significance in the composition of the antioxidant system (AOS) is incommensurable: SH-groups are an essential and key component of AOS, and tocopherol is one of a number of lipophilic antioxidants, the regeneration of which, in turn, depends on SH- groups), which reduces the reliability of the data when assessing oxidative stress in a patient;
г) концентрация токоферола в тканях и биологических жидкостях организма определяется множеством разнообразных факторов, зачастую не связанных с наличием окислительного стресса (алиментарные, конституциональные, половые, возрастные, генетические и т.д.), а следовательно изменения его не всегда отражают дисбаланс в системе анти-/прооксиданты, что может приводит к несвоевременной диагностике окислительного стресса и/или назначению неадекватной антиоксидантной терапии при лечении больного.d) the concentration of tocopherol in the tissues and biological fluids of the body is determined by many different factors, often not related to the presence of oxidative stress (alimentary, constitutional, sexual, age, genetic, etc.), and therefore its changes do not always reflect the imbalance in the anti - / prooxidants, which can lead to untimely diagnosis of oxidative stress and / or the appointment of inadequate antioxidant therapy in the treatment of the patient.
Задача - создание достоверного, однозначно трактуемого способа комплексной оценки окислительного стресса с помощью коэффициента окислительной модификации биомолекул эритроцитов (КОМБэр.), основанного на использовании минимального количества дополнительных специальных лабораторных методов диагностики, позволяющего определять выраженность окислительного стресса, своевременно назначать антиоксидантную терапию в необходимом объеме и контролировать ее эффективность в процессе лечения; с последующей проверкой в практической медицине вышеизложенных предложений при диагностике и лечении окислительного стресса.The task is to create a reliable, unambiguously interpreted method for the comprehensive assessment of oxidative stress using the coefficient of oxidative modification of erythrocyte biomolecules (COMBER.), Based on the use of a minimum number of additional special laboratory diagnostic methods that allow determining the severity of oxidative stress, timely prescribing antioxidant therapy in the required volume and monitoring its effectiveness in the treatment process; with subsequent verification in practical medicine of the above proposals in the diagnosis and treatment of oxidative stress.
Сущностью изобретения является то, что в гемолизате определяют уровень тиоловых групп, по разнице между показателем среднего количества тиоловых групп гемолизата практически здоровых людей, равного 0,174± 0,004 оптических единиц, и количеством тиоловых групп гемолизата обследуемого человека определяют количество дисульфидных групп и при значении этой разницы, равной 0,000± 0,008 оптических единиц, определяют отсутствие окислительного стресса, а при положительном значении этой разницы дополнительно определяют количество промежуточных и минорных продуктов окислительной модификации биомолекул: белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, дополнительно определяют количество продуктов окислительной модификации биомолекул после предварительной химической индукции Fе2+ процессов перекисного окисления по формулеThe essence of the invention is that the level of thiol groups is determined in the hemolysate, by the difference between the average number of thiol groups of the hemolysate of practically healthy people, equal to 0.174 ± 0.004 optical units, and the number of thiol groups of the hemolysate of the examined person, the number of disulfide groups is determined and, with the value of this difference, equal to 0.000 ± 0.008 optical units, determine the absence of oxidative stress, and if this difference is positive, the number of intermediate and minor GOVERNMENTAL products of oxidative modification of biomolecules: proteins, lipids, carbohydrates, nucleic acids that react with thiobarbituric acid, further comprising determining the amount of products of oxidative modification of biomolecules after preliminary chemical induction of Fe 2+ of peroxide oxidation of the formula
КОМБэр.=(ТБЧэр.+ТБЧэр. Ind)· (Ед-sh-гр.-Ei-sh-гр.)· 100,COMB. = (TBCH. + TBCH. Ind) · (E d -sh-gr.-E i -sh-gr.) · 100,
где КОМБэр. - коэффициент окислительной модификации биомолекул эритроцитов в окислительных единицах активности, ОЕА,where is kombare. - coefficient of oxidative modification of erythrocyte biomolecules in oxidative units of activity, OEA,
ТБЧэр. - количество в эритроцитах промежуточных и минорных продуктов окислительной модификации биомолекул: белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, в оптических единицах, ОЕ,TBChar. - the number in the red blood cells of intermediate and minor products of the oxidative modification of biomolecules: proteins, lipids, carbohydrates, nucleic acids that react with thiobarbituric acid, in optical units, OE,
ТБЧэр. Ind - количество в эритроцитах промежуточных и минорных продуктов окислительной модификации биомолекул: белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, индуцированных Fe2+, оптические единицы, ОЕ,TBChar. Ind is the number of intermediate and minor products of oxidative modification of biomolecules in red blood cells: proteins, lipids, carbohydrates, nucleic acids that react with thiobarbituric acid, induced by Fe 2+ , optical units, OE,
Ед-sh-гр. - показатель среднего количества тиоловых групп гемолизата у практически здоровых людей, выраженный в оптических единицах, ОЕ, равный 0,174±0,004 ОЕ,E d -sh-gr. - an indicator of the average number of thiol groups of hemolysate in practically healthy people, expressed in optical units, OE, equal to 0.174 ± 0.004 OE,
Ei-sh-гр. - количество тиоловых групп гемолизата обследуемого человека, выраженное в оптических единицах, ОЕ,E i -sh-gr. - the number of thiol groups of the hemolysate of the examined person, expressed in optical units, OE,
100 - расчетный коэффициент,100 - estimated coefficient,
определяют коэффициент окислительной модификации биомолекул эритроцитов, и чем выше положительное значение КОМБэр., тем выше уровень окислительного стресса организма.determine the coefficient of oxidative modification of erythrocyte biomolecules, and the higher the positive value of COMB., the higher the level of oxidative stress of the body.
Технической сущностью предложения является:The technical essence of the proposal is:
1) комплексная оценка состояния как прооксидантного, так и антиоксидантного звена одновременно, с использованием минимально необходимого количества показателей, что позволит уменьшить количество расходного материала, сократит время, необходимое для проведения анализа,1) a comprehensive assessment of the state of both the prooxidant and antioxidant link at the same time, using the minimum required number of indicators, which will reduce the amount of consumables, reduce the time required for analysis,
2) использование эритроцитов для определения выраженности дисбаланса анти-/прооксидантных систем, как показателя отражающего формирование окислительного стресса на клеточном уровне, что позволяет более достоверно оценивать состояние этих систем для организма человека в целом,2) the use of red blood cells to determine the severity of the imbalance of anti- / prooxidant systems, as an indicator reflecting the formation of oxidative stress at the cellular level, which allows a more reliable assessment of the state of these systems for the human body as a whole,
3) оценка окислительного стресса базируется на количественном определении всех продуктов окислительной модификации различной природы (липидной, белковой, нуклеотидной, углеводной), которые являются составными компонентами мембран и субклеточных структур, что позволит правильно оценить выраженность сформировавшегося окислительного стресса у больного,3) the assessment of oxidative stress is based on a quantitative determination of all products of oxidative modification of various nature (lipid, protein, nucleotide, carbohydrate), which are components of membranes and subcellular structures, which will correctly assess the severity of the formed oxidative stress in a patient,
4) исследуются универсальные показатели окислительного стресса, имеющие однозначную трактовку при его оценке, а также применяется приоритетный подход в дифференцированной оценке вклада каждой из составляющих уравнения в получаемый результат при расчете интегрального коэффициента окислительной модификации биомолекул (ведущее значение имеет значение нарастания количества окисленных тиоловых групп (-S-S-) с учетом повышения ТБЧэр. и ТБЧэр. Ind как продуктов окислительного стресса), что повысит достоверность применяемого метода, уменьшит количество неверных (в том числе ложноотрицательных) результатов,4) the universal indicators of oxidative stress are examined, which are unambiguously interpreted when assessing it, and a priority approach is applied in differentiating the contribution of each of the components of the equation to the result when calculating the integral coefficient of oxidative modification of biomolecules (the leading value is the increase in the number of oxidized thiol groups (- SS-) taking into account the increase in TBCHer. And TBChar. Ind as products of oxidative stress), which will increase the reliability of the method used, reduce the number of incorrect (including false negative) results,
5) исследование процессов пероксидации, основанное на определении как исходного количества окисленно-модифицированных продуктов, так и их прирост при индукции перекисного окисления химическими прооксидантами (Fe2+), позволит оценивать глубину повреждения защитных механизмов от окислительного стресса на клеточном уровне, рассчитать объем необходимой антиоксидантной терапии.5) a study of peroxidation processes, based on the determination of both the initial amount of oxidized modified products and their growth during the induction of peroxidation with chemical prooxidants (Fe 2+ ), will make it possible to assess the depth of damage to protective mechanisms from oxidative stress at the cellular level, and to calculate the amount of antioxidant required therapy.
Способ осуществляют следующим образом.The method is as follows.
Для диагностики окислительного стресса организма человека используют коэффициент окислительной модификации биомолекул эритроцитов (КОМБэр.). Объектом исследования служила кровь обследуемых людей, стабилизированная антикоагулянтами.For the diagnosis of oxidative stress of the human body, the coefficient of oxidative modification of erythrocyte biomolecules (COMBer.) Is used. The object of the study was the blood of the examined people, stabilized by anticoagulants.
Количество SH-групп измеряют по методу [Романчук Л.А., Рубина X.М. Спектрофотометрический метод определения сульфгидрильных групп крови. //Вопр. мед. химии, 1961, вып.6, с. 652]. Определение основано на том, что парахлормеркурийбензоат образует со свободными сульфгидрильными группами меркаптидный комплекс. Полученный меркаптид обладает специфическим поглощением при длине волны 255 нм, что позволяет определять количество SH-групп в белках и пептидах. Реакционную смесь инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре и определяют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 255 нм. После определения уровня тиоловых групп находят разницу между показателем среднего количества тиоловых (-SH) групп гемолизата практически здоровых людей (63 практически здоровых человека, Ед-sh-гр.=0,174± 0,004 ОЕ, получаемые данные обработаны в соответствии с принятыми методами вариационной статистики) и количеством тиоловых (-SH) групп гемолизата обследуемого человека и, таким образом, определяют количество окисленных тиоловых или дисульфидных групп (-S-S-).The number of SH-groups is measured according to the method [Romanchuk L.A., Rubina X.M. Spectrophotometric method for determination of sulfhydryl blood groups. // Q. honey. Chemistry, 1961, issue 6, p. 652]. The definition is based on the fact that parachloromercurium benzoate forms a mercaptide complex with free sulfhydryl groups. The obtained mercaptide has a specific absorption at a wavelength of 255 nm, which allows us to determine the number of SH groups in proteins and peptides. The reaction mixture was incubated for 15 min at room temperature and the optical density of the solution was determined on a spectrophotometer at a wavelength of 255 nm. After determining the level of thiol groups, a difference is found between the average number of thiol (-SH) groups of hemolysate in practically healthy people (63 practically healthy people, E d -sh-gr. = 0.174 ± 0.004 OE, the data obtained are processed in accordance with the accepted methods of variation statistics ) and the number of thiol (-SH) groups of the hemolysate of the examined person and, thus, determine the amount of oxidized thiol or disulfide groups (-SS-).
Прооксидантную активность эритроцитов оценивают с использованием теста с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) по количеству продуктов окислительной модификации биомолекул, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-активных продуктов), использовав основные принципы двух методов [В.Н.Ушкалова, Н.В.Иоанидис, Г.Д.Кадочникова, З.М.Деева /Контроль перекисного окисления липидов. Новосибирск. 1993; Современные методы в биохимии /Под ред. В.Н.Ореховича. М.: Медицина, 1977]. Данный подход позволяет определять не только перекисные продукты липидного происхождения, но и продукты окислительной модификации других биомолекул белкового, нуклеотидного, углеводного происхождения, реагирующие с ТБК, с образованием окрашенных продуктов реакции, которые можно определять спектрофотометрическими методами.The erythrocyte prooxidant activity is evaluated using the thiobarbituric acid (TBA) test by the number of oxidative modification products of biomolecules that react with thiobarbituric acid (TBA-active products), using the basic principles of two methods [V.N. Ushkalova, N.V. Ioanidis, G. .D. Kadochnikova, Z.M. Deeva / Control of lipid peroxidation. Novosibirsk 1993; Modern methods in biochemistry / Ed. V.N.Orekhovich. M .: Medicine, 1977]. This approach allows us to determine not only lipid peroxides, but also products of oxidative modification of other biomolecules of protein, nucleotide, carbohydrate origin, reacting with TBA, with the formation of colored reaction products that can be determined spectrophotometrically.
Количество эритроцитов в цельной крови определяют фотоколориметрически по методу Ресселя [Рессель Л.К., Тодоров И. Клинические лабораторные исследования в педиатрии. - София, 1961, с. 259]. Для этого эритроциты вносят в раствор Гоуэрса, где они приобретают сферическую форму. Оптическую плотность взвеси измеряют при красном светофильтре (λ =610 нм), при этом процент задержанного света пропорционален количеству эритроцитов.The number of red blood cells in whole blood is determined photocolorimetrically by the method of Ressel [Ressel LK, Todorov I. Clinical laboratory studies in pediatrics. - Sofia, 1961, p. 259]. For this, red blood cells are introduced into Gowers solution, where they acquire a spherical shape. The optical density of the suspension is measured with a red filter (λ = 610 nm), while the percentage of delayed light is proportional to the number of red blood cells.
Ход определения.The course of determination.
В пробирку с 10 мл реактива Гоуэрса вносят 0,02 мл крови, тщательно перемешивают и определяют с помощью фотоэлектроколориметрии (ФЭК-56М) или микрофотоколориметра экстинкцию полученной взвеси при красном светофильтре и толщине кюветы 2 мм. Контролем служит раствор Гоуэрса. Количество эритроцитов в мл пробы крови рассчитывают по формуле, используя коэффициент пересчета, найденный по калибровочному графику, построенному с использованием камеры Горяева.0.02 ml of blood is added to a test tube with 10 ml of Gowers's reagent, thoroughly mixed and the extinction of the suspension obtained with a red filter and a cell thickness of 2 mm is determined using photoelectrocolorimetry (FEK-56M) or a microphotocolorimeter. Gowers solution is used as a control. The number of red blood cells in ml of a blood sample is calculated using the formula using the conversion factor found from the calibration graph constructed using the Goryaev’s camera.
Эритроциты/мл=26,00· Е· 109.Red blood cells / ml = 26.00 · E · 10 9 .
Для определения количества продуктов окислительной модификации биомолекул (ОМБ) эритроцитов необходимо использовать стандартное количество эритроцитов (≈ 5 млрд). Для этого отбирают в центрифужную пробирку цельную гепаринизированную кровь объемом, рассчитываемым по формуле: Vэр.=(5· 109× 1)/X, где Vэр. - требуемый объем цельной крови, мл; Х - количество эритроцитов исследуемой крови, млрд; 1 - стандартный коэффициент, мл. После чего кровь центрифугируют при 1500 об/мин в течение 10 мин, затем отбирают плазму. Оставшуюся эритроцитарную массу перемешивают и инкубируют 90 мин в условиях жесткого окисления в термостате (t=37° С, с доступом О2 воздуха). После инкубации к реакционной смеси прибавляют 1 мл 28% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУК), перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Завершив центрифугирование, супернатант переносят количественно в большую пробирку, в которую добавляют 1 мл 1% раствора ТБК. Полученный раствор термостатируют на кипящей водяной бане 15 мин, охлаждают пробирки в холодной воде и определяют оптическую плотность раствора на SF-46, λ =450 и 532 нм (где длина волны 450 нм соответствует максимуму оптической плотности промежуточных продуктов перекисного окисления -диеновые конъюгаты и др., а длина волны 532 нм - максимуму оптической плотности конечных продуктов перекисного окисления - малоновый диальдегид и др.). Тиобарбитуровое число эритроцитов (ТБЧэр.) рассчитывают по формулеTo determine the number of products of oxidative modification of biomolecules (OMB) of red blood cells, it is necessary to use the standard number of red blood cells (≈ 5 billion). To do this, whole heparinized blood is taken into a centrifuge tube with the volume calculated by the formula: VER. = (5 · 10 9 × 1) / X, where Vэр. - the required volume of whole blood, ml; X - the number of red blood cells of the test blood, billion; 1 - standard coefficient, ml. After that, the blood is centrifuged at 1500 rpm for 10 min, then the plasma is taken. The remaining erythrocyte mass is mixed and incubated for 90 min under conditions of severe oxidation in a thermostat (t = 37 ° C, with access of O 2 air). After incubation, 1 ml of a 28% trichloroacetic acid (TCA) solution is added to the reaction mixture, stirred and centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes. Upon completion of centrifugation, the supernatant is transferred quantitatively to a large tube into which 1 ml of a 1% TAC solution is added. The resulting solution is thermostated in a boiling water bath for 15 minutes, the tubes are cooled in cold water and the optical density of the solution is determined at SF-46, λ = 450 and 532 nm (where the wavelength of 450 nm corresponds to the maximum optical density of the intermediate products of peroxidation - diene conjugates, etc. ., and the wavelength of 532 nm - the maximum optical density of the final products of peroxidation - malondialdehyde, etc.). The thiobarbituric number of red blood cells (TBCHer.) Is calculated by the formula
ТБЧэр.=Iэр.-450+Iэр.-532 ОE,TBCHer. = Ier.-450 + Ier.-532 OE,
где Iэр. - оптическая плотность раствора, измеренная при длине волны 450 и 532 нм, оптические единицы.where is Ier. - the optical density of the solution, measured at a wavelength of 450 and 532 nm, optical units.
Для определения количества продуктов 0МБ эритроцитов после предварительной химической индукции Fe2+ необходимо использовать стандартное количество эритроцитов (≈ 5 млрд). Для этого отбирают в центрифужную пробирку цельную гепаринизированную кровь объемом, рассчитываемым по формуле: Vэр.=(5· 109× 1)/X, где Vэр. - требуемый объем цельной крови, мл; Х - количество эритроцитов исследуемой крови, млрд; 1 - стандартный коэффициент, мл. Затем кровь центрифугируют при 1500 об/мин в течение 10 мин, после чего отбирают плазму. К оставшейся эритроцитарной массе добавляют 200 мкл 10% раствора FeSO4 для индукции перекисного окисления, перемешивают и инкубируют 90 мин в условиях жесткого окисления в термостате (t=37° С, с доступом O2 воздуха). После инкубации к реакционной смеси прибавляют 1 мл 28% раствора ТХУК, перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Завершив центрифугирование, супернатант переносят количественно в большую пробирку, в которую добавляют 1 мл 1% раствора ТБК. Полученный раствор термостатируют на кипящей водяной бане 15 мин. После этого охлаждают пробирки в холодной воде и определяют оптическую плотность раствора на SF-46, λ =450 и 532 нм (где длина волны 450 нм соответствует максимуму оптической плотности промежуточных продуктов перекисного окисления - диеновые конъюгаты и др., а длина волны 532 нм - максимуму оптической плотности конечных продуктов перекисного окисления - малоновый диальдегид и др.). Тиобарбитуровое число эритроцитов после индукции перекисного окисления (ТБЧэр. Ind) рассчитывают по формулеTo determine the number of products of 0MB of red blood cells after preliminary chemical induction of Fe 2+, it is necessary to use a standard number of red blood cells (≈ 5 billion). To do this, whole heparinized blood is taken into a centrifuge tube with the volume calculated by the formula: VER. = (5 · 10 9 × 1) / X, where Vэр. - the required volume of whole blood, ml; X - the number of red blood cells of the test blood, billion; 1 - standard coefficient, ml. Then the blood is centrifuged at 1500 rpm for 10 min, after which the plasma is taken. To the remaining erythrocyte mass, add 200 μl of a 10% solution of FeSO 4 to induce peroxidation, mix and incubate for 90 min under conditions of severe oxidation in a thermostat (t = 37 ° C, with access of O 2 air). After incubation, 1 ml of a 28% TCA solution was added to the reaction mixture, stirred and centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes. Upon completion of centrifugation, the supernatant is transferred quantitatively to a large tube into which 1 ml of a 1% TAC solution is added. The resulting solution was thermostated in a boiling water bath for 15 minutes. After that, the tubes are cooled in cold water and the optical density of the solution is determined at SF-46, λ = 450 and 532 nm (where the wavelength of 450 nm corresponds to the maximum optical density of the intermediate products of peroxidation - diene conjugates, etc., and the wavelength of 532 nm - maximum optical density of the final products of peroxidation - malondialdehyde, etc.). The thiobarbituric number of red blood cells after induction of peroxidation (TBHer. Ind) is calculated by the formula
ТБЧэр. Ind=Iэр. Ind-450+Iэр. Ind-532 OE,TBChar. Ind = Ier. Ind-450 + Ier. Ind-532 OE,
где Iэр. Ind - оптическая плотность раствора, в котором проводилась предварительная химическая индукция перекисного окисления Fe2+, измеренная при длине волны 450 и 532 нм, оптические единицы.where is Ier. Ind is the optical density of the solution in which the preliminary chemical induction of peroxidation of Fe 2+ was carried out, measured at a wavelength of 450 and 532 nm, optical units.
Особенность исследования заключается в определении базального количества продуктов ОМБ эритроцитов (отражающих интенсивность течения свободнорадикальных процессов (СРП) у больных на данном этапе заболевания) и их количества после определенным образам проведенной индукции перекисного окисления (показатель возможного прироста этих продуктов при воздействии на организм дополнительных инициаторов СРП эндогенной и экзогенного природы). Антиоксидантный резерв эритроцитов исследуют по количеству накопившихся в них продуктов ОМБ после инициации процессов перекисного окисления добавлением к полученной эритроцитарной массе раствора сульфата железа (II) с последующей инкубацией получаемой смеси в течение 90 мин в условиях жесткого окисления (при температуре 37° С, с доступом кислорода воздуха). Гептанизопропиловая экстракция (согласно классической методике) не проводится, что позволяет оценить не только процессы перекисного окисления липидов, но и интенсивность окислительной модификации других биосубстратов, в частности белков и нуклеиновых кислот, продукты деградации которых образуются и накапливаются в опытном растворе при инкубации с химическими индукторами пероксидации и могут вступать в реакцию с ТБК, образуя окрашенные соединения. Измерения экстинкции растворов, содержащих продукты, реагирующие с ТБК, производят при длинах волн 532 и 450 нм с целью определения как промежуточных продуктов ОМБ (λ =450 нм), так и минорных производных (λ =532 нм), преимущественно продуктов липопероксидации.The peculiarity of the study is to determine the basal amount of erythrocyte OMB products (reflecting the intensity of the course of free radical processes (PSA) in patients at this stage of the disease) and their quantity after certain forms of peroxidation induction (an indicator of the possible increase in these products when additional initiators of endogenous PSA are exposed to the body and exogenous nature). The erythrocyte antioxidant reserve is examined by the number of OMB products accumulated in them after the initiation of peroxidation by adding iron (II) sulfate to the resulting erythrocyte mass, followed by incubation of the resulting mixture for 90 min under conditions of hard oxidation (at a temperature of 37 ° C, with oxygen access air). Heptanisopropyl extraction (according to the classical method) is not carried out, which allows us to evaluate not only lipid peroxidation processes, but also the rate of oxidative modification of other biosubstrates, in particular proteins and nucleic acids, the degradation products of which are formed and accumulate in the experimental solution during incubation with chemical peroxidation inducers and can react with TBA to form colored compounds. The extinction measurements of solutions containing products reacting with TBA are performed at wavelengths of 532 and 450 nm in order to determine both the intermediate products of OMB (λ = 450 nm) and minor derivatives (λ = 532 nm), mainly lipid peroxidation products.
Коэффициент окислительной модификации биомолекул эритроцитов рассчитывают по формулеThe coefficient of oxidative modification of red blood cell biomolecules is calculated by the formula
КОМБэр.=(ТБЧэр.+ИБЧэр. Ind)· (Ед-sh-гр.-Ei-sh-гр.)· 100,COMBAR. = (TBCHar. + IBCher. Ind) · (E d -sh-gr.-E i -sh-gr.) · 100,
где КОМБэр. - коэффициент окислительной модификации биомолекул эритроцитов в окислительных единицах активности, ОЕА,where is kombare. - coefficient of oxidative modification of erythrocyte biomolecules in oxidative units of activity, OEA,
ТБЧэр. - количество в эритроцитах промежуточных и минорных продуктов окислительной модификации биомолекул: белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, оптические единицы, ОЕ,TBChar. - the number in the red blood cells of intermediate and minor products of the oxidative modification of biomolecules: proteins, lipids, carbohydrates, nucleic acids that react with thiobarbituric acid, optical units, OE,
ТБЧэр. Ind - количество в эритроцитах промежуточных и минорных продуктов окислительной модификации биомолекул: белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, индуцированных Fe2+ в оптических единицах, ОЕ,TBChar. Ind is the number of intermediate and minor products of oxidative modification of biomolecules in red blood cells: proteins, lipids, carbohydrates, nucleic acids that react with thiobarbituric acid, induced by Fe 2+ in optical units, OE,
Ед-sh-гр. - показатель среднего количества тиоловых групп гемолизата у практически здоровых людей, выраженный в оптических единицах, ОE, равный 0,174±0,004 ОЕ,E d -sh-gr. - an indicator of the average number of thiol groups of hemolysate in practically healthy people, expressed in optical units, OE equal to 0.174 ± 0.004 OE,
Ei-sh-гр. - количество тиоловых групп гемолизата обследуемого человека, выраженное в оптических единицах, ОЕ,E i -sh-gr. - the number of thiol groups of the hemolysate of the examined person, expressed in optical units, OE,
100 - расчетный коэффициент.100 is the calculated coefficient.
Полученные результаты трактуют следующим образом:The results are interpreted as follows:
1) Рассчитанный интегральный КОМБэр. является отрицательным числом меньше минус единицы (КОМБэр.<-1,0 ОЕА) - вероятно выявлен больной с гомоцистеинемией, теоретически возможно при нерациональном и длительном использовании инфузий с тиосодержащих препаратов (унитиол, липоевая кислота и др.).1) The calculated integral KOMBER. is a negative number less than minus one (KOMBER. <- 1.0 OEA) - a patient with homocysteinemia is likely to be identified, theoretically possible with irrational and prolonged use of infusions from thios containing preparations (unitiol, lipoic acid, etc.).
2) Рассчитанный интегральный КОМБэр. равен нулю или находится в интервале от -1,0 до +1,0 (КОМБэр.=0± 1,0 ОЕА) - данный показатель характерен для практически здоровых людей в условиях баланса в системе анти-/прооксиданты, что определяет отсутствие окислительного стресса.2) The calculated integral KOMBER. equal to zero or in the range from -1.0 to +1.0 (COMBAR. = 0 ± 1.0 OEA) - this indicator is typical for healthy people in conditions of balance in the anti- / prooxidant system, which determines the absence of oxidative stress .
3) Рассчитанный интегральный КОМБэр. является положительным числом больше единицы (КОМБэр.>1,0 ОЕА) - у обследуемого человека имеется сформировавшийся окислительный стресс различной интенсивности.3) The calculated integral KOMBER. is a positive number greater than unity (COMBAR.> 1.0 OEA) - the examined person has formed oxidative stress of varying intensity.
4) Рассчитанный интегральный КОМБэр. имеет пределы нарастания при положительных (КОМБэр.>>0,0 ОЕА) значениях, что связано как с полной истощаемостью субстратов окисления, особенно при отсутствии регенерирующих систем или низкой их активности, так и с необратимостью деструктивных процессов, связанных с явлениями гиперкатаболизма, прежде всего денатурацией белковых структур.4) The calculated integral KOMBER. it has limits of growth at positive (COMBAR. >> 0.0 OEA) values, which is associated both with the complete depletion of oxidation substrates, especially in the absence of regenerating systems or their low activity, and with the irreversibility of destructive processes associated with the phenomena of hypercatabolism, primarily denaturation of protein structures.
Обоснование достигнутых результатов.Justification of the results.
В качестве объекта исследования дисбаланса про-/антиоксидантных систем (окислительного стресса) на клеточном уровне нами были выбраны эритроциты, учитывая их способность гибко изменять свой обмен при меняющихся условиях жизнедеятельности и важную роль в формировании компенсаторно-адаптивных реакций организма. Изложенные факты позволяют рассматривать клетки крови как информативный объект оценки состояния биохимических механизмов адаптации и определения чувствительности организма к проводимой терапии на клеточном уровне.We chose erythrocytes as the object of study of the imbalance of pro / antioxidant systems (oxidative stress) at the cellular level, given their ability to flexibly change their metabolism under changing conditions of life and an important role in the formation of compensatory-adaptive reactions of the body. The stated facts allow us to consider blood cells as an informative object for assessing the state of biochemical adaptation mechanisms and determining the body's sensitivity to therapy at the cellular level.
Эритроцитарное звено первым реагирует на повышение активности свободнорадикального окисления и первым исчерпывает свои компенсаторные возможности [Е.В.Ройтман, И.И.Дементьева, О.А.Азизова и др. //Клиническая лабораторная диагностика, 2001, №3, с. 42-43].The erythrocyte unit is the first to respond to an increase in the activity of free radical oxidation and the first to exhaust its compensatory abilities [E.V. Roitman, I.I. Dementieva, O.A. Azizova, etc. // Clinical Laboratory Diagnostics, 2001, No. 3, p. 42-43].
Проводя анализ литературных данных [В.В.Костюшов //Патологическая физиология и экспериментальная терапия, 2002, №1, с. 20-23] и с учетом собственных результатов исследований на большой группе больных (n>300 человек) с различной патологией (ожоговая болезнь, почечная патология, эндокринная патология, отравления), нами сделан вывод об исключительной роли тиолового звена в диагностике окислительного стресса, так как этот показатель изменяется однонаправлено в сторону понижения количества SH-групп (восстановленных тиоловых, сульфгидрильных) при большинстве тяжелых патологических состояний (за исключением некоторой наследственной патологии, сопровождающейся накоплением в крови тиолсодержащих компонентов), для которых характерно развитие окислительного стресса. Дефицит SH-групп, как правило, сопровождается избыточной продукцией продуктов свободнорадикального окисления, большая часть которых относится к продуктам, реагирующим с тиобарбитуровой кислотой (ТБК). Таким образом, существует тесная взаимосвязь между снижением количества эритроцитарных SH-групп и избыточной продукцией прооксидантных факторов, которая и была положена в основу разработанного нами интегрального показателя окислительного стресса - коэффициента окислительной модификации биомолекул эритроцитов (КОМБэр.).Conducting an analysis of literature data [V.V. Kostyushov // Pathological physiology and experimental therapy, 2002, No. 1, p. 20-23] and taking into account our own results of studies on a large group of patients (n> 300 people) with various pathologies (burn disease, renal pathology, endocrine pathology, poisoning), we concluded that the thiol link plays an exceptional role in the diagnosis of oxidative stress, how this indicator changes unidirectionally towards a decrease in the number of SH-groups (reduced thiol, sulfhydryl) in most severe pathological conditions (with the exception of some hereditary pathology, accompanied by accumulation of thiol-containing components in the blood), which are characterized by the development of oxidative stress. Deficiency of SH-groups, as a rule, is accompanied by excess production of free radical oxidation products, most of which are related to products that react with thiobarbituric acid (TBA). Thus, there is a close correlation between the decrease in the number of erythrocyte SH groups and the excess production of prooxidant factors, which was the basis for the integrated indicator of oxidative stress that we developed, the coefficient of oxidative modification of erythrocyte biomolecules (COMBER).
Проведены исследования состояния про-/антиоксидантных систем у различных категорий больных (n>300 чел.). Так у ожеговых больных с индексом Франка I (меньше 30) количество тиоловых SH-групп гемолизата было понижено в среднем на 23,3%, у больных с индексом Франка II (30-60) - на 39,3%, с индексом Франка III (61-120) - на 63,2%, у больных сахарным диабетом 1 типа - на 27,6%, у больных с сахарным диабетом 2 типа - на 22,3%, у больных сахарным диабетом с кетоацидозом - на 33,4%, у больных хронической почечной недостаточностью (ХПН) I-II (предтерминальная) - на 16,5%, у больных с ХПН III (терминальная, по классификации С.И.Рябова и Б.Б.Бондаренко, 1975 г.) - на 47,0%, у больных с острой почечной недостаточностью (ОПН) - на 46,0% по сравнению с контрольной группой практически здоровых людей (n=63 человека): Ед-sh-гр.=0,174± 0,004(X± m) ОE. Повышение количества дисульфидных групп (-S-S-), превышающее удвоенное значение стандартной ошибки средней арифметической (2m) количества SH-групп у практически здоровых людей (патологическое количество -S-S->2m>2× 0,004 ОE>0,008 ОE), т.е. более 0,008 ОE, трактуется как окислительный стресс.Studies of the state of pro / antioxidant systems in various categories of patients (n> 300 people). So, in burn patients with a Frank I index (less than 30) the number of thiol SH-groups of hemolysate was reduced by an average of 23.3%, in patients with a Frank II index (30-60) - by 39.3%, with a Frank III index (61-120) - by 63.2%, in patients with type 1 diabetes - by 27.6%, in patients with type 2 diabetes - by 22.3%, in patients with diabetes with ketoacidosis - by 33.4 %, in patients with chronic renal failure (CRF) I-II (preterminal) - by 16.5%, in patients with CRF III (terminal, according to the classification of S.I. Ryabov and B. B. Bondarenko, 1975) - 47.0% in patients with acute renal failure NOSTA (ARF) - by 46.0% as compared to the control group of healthy subjects (n = 63 persons). -sh-d E c = 0,174 ± 0,004 (X ± m ) OE. An increase in the number of disulfide groups (-SS-), exceeding twice the standard error of the arithmetic mean (2m) of the number of SH-groups in practically healthy people (pathological amount -SS->2m> 2 × 0.004 OE> 0.008 OE), i.e. more than 0.008 OE, is interpreted as oxidative stress.
При этом средние значения интегрального коэффициента окислительной модификации биомолекул эритроцитов для каждой из обследованных категорий больных составили: у ожоговых больных с индексом Франка I КОМБэр.=5,8 ОEА; у больных с индексом Франка II КОМБэр.=9,8 ОEА; с индексом Франка III КОМБэр.=16,3 ОEА; у больных с сахарным диабетом 1 типа КОМБэр.=6,0 ОEА; у больных с сахарным диабетом 2 типа КОМБэр.=4,8 ОЕА; у больных сахарным диабетом с кетоацидозом КОМБэр.=7,2 ОЕА: у больных ХПН I-II (предтерминальная) КОМБэр.=4,0 ОЕА; у больных с ХПН III (терминальная) КОМБэр.=9,3 ОЕА; у больных с ОПН КОМБэр.=8,5 ОЕА по сравнению с контрольной группой (у практически здоровых людей КОМБэр.=0,0± 1,0 ОЕА).Moreover, the average values of the integral coefficient of the oxidative modification of erythrocyte biomolecules for each of the examined categories of patients were as follows: in burn patients with the Franco I index COMBER. = 5.8 OEA; in patients with a Frank II index of COMB. = 9.8 OEA; with the index of Frank III COMB. = 16.3 OEA; in patients with type 1 diabetes mellitus KOMBER. = 6.0 OEA; in patients with type 2 diabetes mellitus KOMBER. = 4.8 OEA; in patients with diabetes mellitus with ketoacidosis KOMBER. = 7.2 OEA: in patients with chronic renal failure I-II (preterm) KOMBER. = 4.0 OEA; in patients with chronic renal failure III (terminal) KOMBER. = 9.3 OEA; in patients with acute renal failure, COMBER. = 8.5 OEA compared with the control group (in healthy individuals, COMBER. = 0.0 ± 1.0 OEA).
Пример №1. В эндокринологическое отделение Краснодарского муниципального лечебно-диагностического объединения (КМЛДО, 2-ая Городская больница) в феврале 2001 года поступила больная Чегаева Л.П., возраст 53 года. Диагноз: сахарный диабет 2 типа, инсулинпотребный, тяжелая форма. Стаж заболевания составлял 9 лет. Проведено обследование с целью диагностирования возможного наличия окислительного стресса. Количество тиоловых групп (SH-групп) было снижено на 56,3% (по сравнению со средним показателем уровня тиоловых групп контрольной группы: Ед-sh-гр.=0,174±0,004 ОЕ) и составило: Ei-sh-гр.=0,076 ОЕ. Количество базальных и индуцированных добавлением Fe2+ продуктов окислительной модификации биомолекул эритроцитов было повышено на 23,3% (по сравнению со средним показателем базальных и индуцированных добавлением Fe2+ продуктов окислительной модификации биомолекул эритроцитов контрольной группы) и составило: ТБЧэр.=0,489 ОЕ, ТБЧэр. Ind=0,623 ОЕ.Example No. 1. In February 2001, the patient Chegaeva L.P., 53 years old, was admitted to the endocrinology department of the Krasnodar Municipal Diagnostic and Treatment Association (KMLDO, 2nd City Hospital). Diagnosis: type 2 diabetes mellitus, insulin-consuming, severe. The experience of the disease was 9 years. A survey was conducted to diagnose the possible presence of oxidative stress. The number of thiol groups (SH-groups) was reduced by 56.3% (compared with the average level of the thiol groups of the control group: E d -sh-gr. = 0.174 ± 0.004 OE) and amounted to: E i -sh-gr. = 0.076 OE. The number of basal and products of oxidative modification of erythrocyte biomolecules induced by the addition of Fe 2+ was increased by 23.3% (compared to the average value of basal and products of oxidative modification of erythrocyte biomolecules induced by the addition of Fe 2+ ) of the control group) and amounted to: TBecher. = 0.489 OE, TBChar. Ind = 0.623 OE.
КОМБэр.=(0,489 ОЕ+0,623 ОЕ)· (0,174 ОЕ-0,076 ОЕ)· 100=10,9 ОЕА, что определяли как резко выраженный окислительный стресс.COMBER. = (0.489 OE + 0.623 OE) · (0.174 OE-0.076 OE) · 100 = 10.9 OEA, which was determined as a pronounced oxidative stress.
Было проведено лечение в течение двух недель, в том числе с применением антиоксидантных препаратов (прежде всего липоевой кислоты в стандартной дозировке). Количество тиоловых групп (SH-групп) увеличилось по сравнению с показателями при поступлении (до лечения), но все равно отличалось от показателей контрольной группы и было снижено на 39,7% (по сравнению со средним показателем уровня тиоловых групп контрольной группы) и составило: Ei-sh-гр.=0,105 ОЕ. Количество базальных и индуцированных добавлением Fe2+ продуктов окислительной модификации биомолекул эритроцитов после проведенного лечения не было повышено (по сравнению со средним показателем базальных и индуцированных добавлением Fe2+ продуктов окислительной модификации биомолекул эритроцитов контрольной группы) и составило: ТБЧэр.=0,288 ОЕ, ТБЧэр. Ind=0,453 ОE.Treatment was carried out for two weeks, including with the use of antioxidant drugs (primarily lipoic acid in a standard dosage). The number of thiol groups (SH-groups) increased compared with the parameters at admission (before treatment), but still differed from the indicators of the control group and was reduced by 39.7% (compared with the average level of the thiol groups of the control group) and amounted to : E i -sh-gr. = 0.105 OE. The amount of basal and products of oxidative modification of erythrocyte biomolecules induced by the addition of Fe 2+ was not increased after treatment (compared with the average value of basal and products of oxidative modification of erythrocyte biomolecules induced by the addition of Fe 2+ ) and amounted to: TBHer. = 0.288 OE, TBChar . Ind = 0.453 OE.
КОМБэр.=(0,288 ОЕ+0,453 ОЕ)· (0,174 ОЕ-0,105 ОЕ)· 100=5,1 ОЕА, что определяли как значительное снижение (в 2,1 раза) явлений окислительного стресса на фоне проводимого лечения по сравнению с показателями при поступлении (до назначения антиоксидантной терапии).KOMBER. = (0.288 OE + 0.453 OE) · (0.174 OE-0.105 OE) · 100 = 5.1 OEA, which was defined as a significant decrease (2.1 times) in the phenomena of oxidative stress during treatment compared with the values for admission (before prescribing antioxidant therapy).
Пример №2. В эндокринологическое отделение Краснодарского муниципального лечебно-диагностического объединения (КМЛДО, 2-ая Городская больница) в марте 2001 года поступил больной Гельварг П.В., возраст 61 год. Диагноз: сахарный диабет 2 типа, тяжелая форма. Стаж болезни 8 лет. Проведено обследование с целью диагностирования возможного наличия окислительного стресса. Количество тиоловых групп (SH-групп) было снижено на 65,5% (по сравнению со средним показателем уровня тиоловых групп контрольной группы: Ед-sh-гр.=0,174±0,004 ОЕ) и составило: Ei-sh-гр.=0,060 ОЕ. Количество базальных и индуцированных добавлением Fe2+ продуктов окислительной модификации биомолекул эритроцитов при поступлении не было повышено (по сравнению со средним показателем базальных и индуцированных добавлением Fe2+ продуктов окислительной модификации биомолекул эритроцитов контрольной группы) и составило: ТБЧэр.=0,290 ОЕ, ТБЧэр. Ind=0,572 ОЕ.Example No. 2. In March 2001, patient Gelvarg P.V., age 61, was admitted to the endocrinology department of the Krasnodar Municipal Diagnostic and Treatment Association (KMLDO, 2nd City Hospital). Diagnosis: type 2 diabetes, severe. Disease experience of 8 years. A survey was conducted to diagnose the possible presence of oxidative stress. The number of thiol groups (SH-groups) was reduced by 65.5% (compared with the average level of the thiol groups of the control group: E d -sh-gr. = 0.174 ± 0.004 OE) and amounted to: E i -sh-gr. = 0.060 OE. The amount of basal and products of oxidative modification of erythrocyte biomolecules induced by the addition of Fe 2+ was not increased upon admission (compared with the average value of basal and products of oxidative modification of erythrocyte biomolecules induced by the addition of Fe 2+ ) and amounted to: TBHer. = 0.290 OE, TBChar. Ind = 0.572 OE.
КОМБэр.=(0,290 ОЕ+0,572 ОЕ)· (0,174 ОЕ-0,060 ОЕ)· 100=9,8 ОЕА, что определяли как выраженный окислительный стресс.KOMBER. = (0.290 OE + 0.572 OE) · (0.174 OE-0.060 OE) · 100 = 9.8 OEA, which was defined as severe oxidative stress.
Было проведено лечение в течение двух недель, в том числе с применением антиоксидантных препаратов (прежде всего липоевой кислоты в стандартной дозировке). Количество тиоловых групп (SH-групп) после проведения лечения антиоксидантными препаратами вернулось к норме по сравнению со средними показателями уровня тиоловых групп контрольной группы: Ei-sh-гр.=0,181 ОЕ. Количество базальных и индуцированных добавлением Fe2+ продуктов окислительной модификации биомолекул эритроцитов после проведенного лечения не отличалось от средних показателей базальных и индуцированных добавлением Fe2+ продуктов окислительной модификации биомолекул эритроцитов контрольной группы: ТБЧэр.=0,328 ОЕ, ТБЧэр. Ind=0,542 ОЕ.Treatment was carried out for two weeks, including with the use of antioxidant drugs (primarily lipoic acid in a standard dosage). The number of thiol groups (SH-groups) after treatment with antioxidant drugs returned to normal compared with the average level of thiol groups in the control group: E i -sh-gr. = 0.181 OE. The number of basal products and those induced by the addition of Fe 2+ oxidative modification of erythrocyte biomolecules after the treatment did not differ from the average values of the basal products and those induced by the addition of Fe 2+ oxidative modification of erythrocyte biomolecules in the control group: TBChar. = 0.328 OE, TBChar. Ind = 0.542 OE.
КОМБэр.=(0,328 ОЕ+0,542 ОЕ)· (0,174 ОЕ-0,181 ОЕ)· 100=-0,61 ОЕА, что определяли как полное купирование окислительного стресса у данного больного на фоне проводимой терапии (в том числе препаратами с антиоксидантной активностью).KOMBER. = (0.328 OE + 0.542 OE) · (0.174 OE-0.181 OE) · 100 = -0.61 OEA, which was defined as the complete relief of oxidative stress in this patient during therapy (including drugs with antioxidant activity) .
Данное изобретение позволяет:This invention allows:
1. Оценить баланс прооксидантно-антиоксидантных систем эритроцитов как косвенного показателя, отражающего наличие окислительного стресса на клеточном уровне человеческого организма, и выявить наличие окислительного стресса в организме человека, что позволит своевременно провести адекватные мероприятия по его устранению, назначив необходимые препараты с антиоксидантными свойствами в соответствующих дозировках.1. To assess the balance of prooxidant-antioxidant systems of red blood cells as an indirect indicator that reflects the presence of oxidative stress at the cellular level of the human body, and to identify the presence of oxidative stress in the human body, which will allow timely adequate measures to eliminate it, prescribing the necessary drugs with antioxidant properties in the appropriate dosages.
2. Провести оценку резерва антиоксидантных систем эритроцитов в условиях моделируемого окислительного стресса in vitro при индуцировании перекисного окисления, что при наличии достаточно низкого показателя коэффициента окислительной модификации биомолекул позволит сократить дозировки используемых препаратов с антиоксидантной активностью, уменьшая тем самым количество возможных побочных эффектов, с разной частотой встречающихся при применение различных препаратов, особенно в избыточных дозировках и при отсутствии необходимых показаний, а также снизить расходы на лечение окислительного стресса.2. To evaluate the reserve of antioxidant erythrocyte systems under conditions of simulated oxidative stress in vitro when inducing peroxidation, which, if there is a sufficiently low coefficient of oxidative modification of biomolecules, will reduce the dosage of the drugs used with antioxidant activity, thereby reducing the number of possible side effects with different frequencies encountered with the use of various drugs, especially in excess dosages and in the absence of the necessary display ny, as well as reduce the cost of treating oxidative stress.
3. Позволяет разработать индивидуальные критерии к назначению антиоксидантной терапии у различных категорий больных, а также оценивать ее эффективность в процессе лечения с целью проведения коррекции в случае необходимости.3. Allows you to develop individual criteria for the appointment of antioxidant therapy in various categories of patients, as well as evaluate its effectiveness in the treatment process with the aim of correcting if necessary.
Практическим результатом предложения является своевременное выявление окислительного стресса у обследуемых больных, его стадии и интенсивности, что позволяет назначать эффективную антиоксидантную терапию, сократить время пребывания больных в стационарах, ограничить количество медикаментов, необходимых для лечения каждого больного, за счет коррекции патологического процесса на клеточном и субклеточном уровнях.The practical result of the proposal is the timely detection of oxidative stress in the examined patients, its stage and intensity, which allows us to prescribe effective antioxidant therapy, reduce the time spent by patients in hospitals, and limit the amount of medications needed to treat each patient by correcting the pathological process on the cellular and subcellular levels.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003123776/15A RU2236008C1 (en) | 2003-07-28 | 2003-07-28 | Method for diagnosing oxidation stress in human organism |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003123776/15A RU2236008C1 (en) | 2003-07-28 | 2003-07-28 | Method for diagnosing oxidation stress in human organism |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2236008C1 true RU2236008C1 (en) | 2004-09-10 |
| RU2003123776A RU2003123776A (en) | 2005-01-27 |
Family
ID=33434093
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003123776/15A RU2236008C1 (en) | 2003-07-28 | 2003-07-28 | Method for diagnosing oxidation stress in human organism |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2236008C1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2546526C1 (en) * | 2014-02-11 | 2015-04-10 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" (ФБУН "ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения") | Diagnostic technique for oxidative stress in children exposed to nickel from external environment |
| RU2652336C1 (en) * | 2017-05-29 | 2018-04-25 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Сибирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России) | Method for evaluating the degree of oxidative stress according to the content of carboxylated thioredoxin in the cells |
| RU2798309C1 (en) * | 2022-12-29 | 2023-06-21 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Приволжский исследовательский медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of assessing the level of oxidative stress in patients with burns |
-
2003
- 2003-07-28 RU RU2003123776/15A patent/RU2236008C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ТУГУШЕВА Ф.А. и др. Антиоксидантный коэффициент эритроцитов // Вопросы медицинской химии. - 1993. - Т.39. - №3. с. 18-21. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2546526C1 (en) * | 2014-02-11 | 2015-04-10 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" (ФБУН "ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения") | Diagnostic technique for oxidative stress in children exposed to nickel from external environment |
| RU2652336C1 (en) * | 2017-05-29 | 2018-04-25 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Сибирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России) | Method for evaluating the degree of oxidative stress according to the content of carboxylated thioredoxin in the cells |
| RU2798309C1 (en) * | 2022-12-29 | 2023-06-21 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Приволжский исследовательский медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of assessing the level of oxidative stress in patients with burns |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2003123776A (en) | 2005-01-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Skutnik-Radziszewska et al. | Salivary antioxidants and oxidative stress in psoriatic patients: can salivary total oxidant status and oxidative status index be a plaque psoriasis biomarker? | |
| Reddy et al. | Reduced plasma antioxidants in first-episode patients with schizophrenia | |
| Percy et al. | Red cell superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase in Down syndrome patients with and without manifestations of Alzheimer disease | |
| MacKinnon et al. | Measures of total free radical activity in critically ill patients | |
| Repetto et al. | Peripheral markers of oxidative stress in probable Alzheimer patients | |
| Gorni et al. | Oxidative stress in elderly population: A prevention screening study | |
| Pereira et al. | DNA damage and cytotoxicity in adult subjects with prediabetes | |
| Ates et al. | Thiol/disulphide homeostasis, ischemia modified albumin, and ferroxidase as oxidative stress markers in women with obesity with insulin resistance | |
| Shukla et al. | Nitric oxide, lipid peroxidation products, and antioxidants in primary fibromyalgia and correlation with disease severity | |
| Famulari et al. | The antioxidant enzymatic blood profile in Alzheimer's and vascular diseases. Their association and a possible assay to differentiate demented subjects and controls | |
| Elmas et al. | Thiol/disulfide homeostasis as a novel indicator of oxidative stress in children with simple febrile seizures | |
| JP2008531987A (en) | Oxidative stress measurement device and related method | |
| JPH06507235A (en) | diagnostic test | |
| Monciotti et al. | Elevated sodium-lithium countertransport activity in erythrocytes is predictive of the development of microalbuminuria in IDDM | |
| RU2236008C1 (en) | Method for diagnosing oxidation stress in human organism | |
| Glauser et al. | Racial differences in free radical scavenging enzyme activity in children | |
| Schorah | The level of vitamin C reserves required in man: Towards a solution to the controversy | |
| Özsürekci et al. | Thiol–disulfide homeostasis and ischemia‐modified albumin as a marker of oxidative stress in patients with sarcopenia | |
| Winangun et al. | Relationship of albumin serum levels and Neutrophil-Lymphocyte Ratios (NLR) on activities of daily living elderly patients with delirium at Sanglah General Hospital, Bali, Indonesia | |
| US20090123956A1 (en) | Measurement of the oxidants-antioxidants balance in liquids | |
| Jozanov-Stankov et al. | Determination of total antioxidant status (TAS) as a biochemical parameter in control of workers' health | |
| Pektaş et al. | Dynamic thiol/disulfide homeostasis in serum of patients with generalized vitiligo | |
| Cojic et al. | Data‐Driven Cluster Analysis of Oxidative Stress Indexes in relation to Vitamin D Level, Age, and Metabolic Control in Patients with Type 2 Diabetes on Metformin Therapy | |
| RU2798309C1 (en) | Method of assessing the level of oxidative stress in patients with burns | |
| Woo et al. | Influence of obesity on plasma fructosamine concentration |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20050729 |