RU2235786C2

RU2235786C2 - Method for inhibition of dna modulation, set

Info

Publication number: RU2235786C2
Application number: RU2000121564/13A
Authority: RU
Inventors: Вольфганг В. ДЕППЕРТ (DE); Вольфганг В. ДЕППЕРТ
Original assignee: Вольфганг В. ДЕППЕРТ
Priority date: 1998-01-26
Filing date: 1999-01-22
Publication date: 2004-09-10
Also published as: EP1049810A2; NO20003762L; WO1999037803A9; NO20003762D0; DE19802792A1; JP2002507389A; KR20010040407A; BR9907725A; PL342399A1; WO1999037803A3; WO1999037803A2; AU2920099A; SK11052000A3; DE19980080D2; CN1289373A; KR100413929B1; AU755775B2; CA2318313A1

Abstract

FIELD: biotechnology, molecular biology.

SUBSTANCE: invention can be used for inhibition of mut p53-induced modulation of DNA. Modulation of DNA is blocked by inhibition of binding mut p53 comprising the core domain and/or mutant C-terminal domain with the sequence AATATATTT or its variants wherein the content of AT residues are not changed. Inhibition is carried out using substances blocking mut p53, in particular, PAB 240 and PAV 241. Invention relates also to a set used for identification of substances that can be used for suppression of DNA modulation and this set involves mut p53 and DNA comprising the nucleotide sequence AATATATTT or its variants. Invention provides the identification of substances that can be used for inhibition of NA modulations induced by mut p53.

EFFECT: improved method for inhibition.

10 cl, 5 dwg

Description

Настоящее изобретение относится к способу ингибирования модуляции ДНК, вызванной мутантным р53. Кроме того, изобретение относится к системе идентификации веществ, пригодных для такого ингибирования.The present invention relates to a method for inhibiting DNA modulation induced by mutant p53. In addition, the invention relates to a system for identifying substances suitable for such inhibition.

В клетках присутствует протеин, обозначенный как р53. Он является супрессором опухоли и активируется при повреждениях ДНК. В этом случае он связывается с промоторами генов-мишеней и активирует их транскрипцию. В результате происходит остановка роста клеток с последующей репарацией повреждений ДНК, соответственно наступает гибель клеток.In the cells there is a protein designated as p53. It is a tumor suppressor and is activated by DNA damage. In this case, it binds to the promoters of the target genes and activates their transcription. As a result, cell growth is stopped, followed by repair of DNA damage, and cell death occurs accordingly.

Было установлено, что р53 во многих типах опухолей содержит мутации. В этой форме он не обладает активностью в отношении супрессии опухоли. Более того, он часто превращается в протеин, обладающий онкогенными свойствами. Предпринимались различные попытки ингибировать онкогенные свойства мутантного р53 (в дальнейшем обозначаемого как mut p53). Однако эти попытки не привели к достижению удовлетворительных результатов.It has been found that p53 contains mutations in many types of tumors. In this form, it does not have activity against tumor suppression. Moreover, it often turns into a protein with oncogenic properties. Various attempts have been made to inhibit the oncogenic properties of mutant p53 (hereinafter referred to as mut p53). However, these attempts did not lead to satisfactory results.

Таким образом, задачей настоящего изобретения является разработка средства, с помощью которого можно исследовать mut p53 и при необходимости ингибировать его онкогенные свойства.Thus, it is an object of the present invention to provide a means by which mut p53 can be investigated and, if necessary, inhibit its oncogenic properties.

Указанная задача решается с помощью объектов, представленных в формуле изобретения.This problem is solved using the objects presented in the claims.

Таким образом, объектом настоящего изобретения является способ ингибирования вызванной мутантным p53 модуляции ДНК, предусматривающий ингибирование связывания mut p53 с ДНК, в которой возможно размыкание цепи.Thus, an object of the present invention is a method of inhibiting mutated p53 modulation of DNA, comprising inhibiting the binding of mut p53 to DNA, in which chain breaking is possible.

Настоящее изобретение базируется на сделанном авторами открытии того факта, что mut p53 в отличие от p53 дикого типа может вызывать модуляцию ДНК, в которой возможно размыкание цепи. Было обнаружено, что такой тип ДНК является распространенным и часто присутствует в MAR-ДНК. Понятием MAR-ДНК ("Matrix Attachment Region", "область присоединения матрикса") обозначают регуляторные элементы высшего порядка структурной организации хроматина, с помощью которых хроматин разделяется на топологически независимые "петли", что позволяет осуществлять независимую пространственную и временную регуляцию экспрессии гена и репликации ДНК. Кроме того, было установлено, что ДНК, в которой возможно размыкание цепи, часто включает последовательность ААТАТАТТТ или ее вариант. Наряду с указанной последовательностью ДНК часто имеет и другие области с высоким содержанием остатков AT. Далее, было обнаружено, что модуляция ДНК может быть различной, например она может представлять собой прочный комплекс, состоящий из mut p53 и ДНК, или ее разомкнутую цепь. Было установлено, что модуляция часто представляет собой разомкнутую цепь, если рассматриваемая последовательность и при необходимости пограничные последовательности в целом имеют высокое содержание остатков AT. С другой стороны, модуляция часто представляет собой прочный комплекс, когда последовательности не имеют или имеют лишь небольшое содержание AT. На основе этого было сделано заключение о том, что обусловленную mut p53 модуляцию ДНК можно ингибировать путем подавления связывания mut p53 с ДНК, в которой возможно размыкание цепи.The present invention is based on the discovery made by the authors of the fact that mut p53, in contrast to wild-type p53, can cause modulation of DNA, in which chain breaking is possible. This type of DNA has been found to be common and often present in MAR-DNA. The term MAR-DNA ("Matrix Attachment Region") refers to the regulatory elements of higher order structural organization of chromatin, by which chromatin is divided into topologically independent "loops", which allows independent spatial and temporal regulation of gene expression and replication DNA In addition, it has been found that DNA in which chain breaking is possible often includes an AATATATTT sequence or variant thereof. Along with the indicated DNA sequence, it often has other regions with a high content of AT residues. Further, it was found that the modulation of DNA can be different, for example, it can be a solid complex consisting of mut p53 and DNA, or its open chain. It was found that modulation is often an open circuit if the sequence in question and, if necessary, the boundary sequences as a whole have a high content of AT residues. On the other hand, modulation is often a robust complex when the sequences do not or only have a small AT content. Based on this, it was concluded that mut p53-mediated DNA modulation can be inhibited by suppressing the binding of mut p53 to DNA, in which chain breaking is possible.

Согласно изобретению открытие этого факта используется в способе ингибирования вызванной mut p53 модуляции ДНК. Такой способ предусматривает ингибирование связывания mut p53 с ДНК, в которой возможно размыкание цепи.According to the invention, the discovery of this fact is used in a method of inhibiting mut p53-induced DNA modulation. Such a method involves inhibiting the binding of mut p53 to DNA, in which chain opening is possible.

Понятие "mut p53" обозначает любой p53 или его фрагмент, который может связываться с ДНК, в которой возможно размыкание цепи. p53 главным образом представляет собой протеин, который имеет мутантный коровый домен и/или мутантный С-конец. Примерами таких мутантных p53 являются Рrо273 p53 и MethA p53. mut p53 также может представлять собой протеин, который присутствует наряду с другим протеином в слитом протеине.The term “mut p53” refers to any p53 or fragment thereof that can bind to DNA in which chain breaking is possible. p53 is mainly a protein that has a mutant core domain and / or a mutant C-terminus. Examples of such mutant p53 are Pro273 p53 and MethA p53. mut p53 may also be a protein that is present along with another protein in a fusion protein.

Понятие "ДНК, в которой возможно размыкание цепи" означает любую ДНК, которая может быть модулирована с помощью mut p53. Модуляция ДНК может иметь различный характер, например она может представлять собой прочный комплекс, состоящий из mut p53 и ДНК, в которой возможно размыкание цепи, или ее разомкнутую цепь. ДНК, в которой возможно размыкание цепи, главным образом представляет собой ДНК, которая имеет одну или несколько копий последовательности ААТАТАТТТ или ее варианта. Кроме того, ДНК может иметь и другие области с высоким содержанием остатков AT. ДНК, в которой возможно размыкание цепи, предпочтительно находится в MAR-ДНК.The term "DNA in which a chain opening is possible" means any DNA that can be modulated with mut p53. Modulation of DNA can be of a different nature, for example, it can be a solid complex consisting of mut p53 and DNA, in which the chain can be opened, or its open chain. The DNA in which the chain can be opened is mainly DNA that has one or more copies of the AATATATTT sequence or variant thereof. In addition, DNA may have other regions with a high content of AT residues. DNA in which chain breaking is possible is preferably located in MAR-DNA.

Понятие "связывание" означает связывание любого типа и характера, в результате которого mut p53 может связываться с ДНК, в которой возможно размыкание цепи. Главным образом связывание представляет собой непосредственное связывание mut p53 с ДНК. Связывание также может осуществляться косвенным образом, т.е. в этом случае p53 связывается с ДНК посредством других факторов, таких как протеины.The term "binding" means the binding of any type and nature, as a result of which mut p53 can bind to DNA, which may open the chain. Mostly binding is the direct binding of mut p53 to DNA. Linking can also be carried out indirectly, i.e. in this case, p53 binds to DNA through other factors, such as proteins.

Понятие "ингибирование" означает ингибирование любого типа и характера, в результате которого может подавляться связывание mut p53 с ДНК, в которой возможно размыкание цепи. Тип ингибирования зависит от того, осуществляется ли связывание mut p53 с ДНК непосредственно или происходит косвенным образом. В случае косвенного связывания, например посредством других факторов, таких как протеины, ингибирование может осуществляться с помощью веществ, которые ингибируют эти другие факторы. Могут также использоваться вещества, которые ингибируют mut p53. В случае непосредственного связывания mut p53 с ДНК целесообразно использовать вещества, которые ингибируют mut p53. Такие вещества могут представлять собой, например, любые вещества, ингибирующие мутантный коровый домен p53 и/или мутантный С-конец p53. Примерами таких веществ являются поликлональные антитела (ПАт) ПАт 240 и ПАт 421.The term "inhibition" means the inhibition of any type and character, as a result of which mut p53 binding to DNA can be suppressed, in which chain breaking is possible. The type of inhibition depends on whether mut p53 binds directly to DNA or indirectly. In the case of indirect binding, for example by other factors, such as proteins, inhibition can be carried out using substances that inhibit these other factors. Substances that inhibit mut p53 may also be used. In the case of direct binding of mut p53 to DNA, it is advisable to use substances that inhibit mut p53. Such substances can be, for example, any substances that inhibit the mutant core domain p53 and / or the mutant C-terminus p53. Examples of such substances are polyclonal antibodies (PAt) PAt 240 and PAt 421.

Объектом изобретения является также система, предназначенная для идентификации веществ, которые пригодны для ингибирования вызванных mut p53 модуляций ДНК. Такая система включает mut p53 и ДНК, в которой возможно размыкание цепи, а также при необходимости вещество, ингибирующее действие которого в отношении связывания mut p53 с ДНК, в которой возможно размыкание цепи, требуется исследовать. В отношении отдельных компонентов системы соответственно применимы приведенные выше определения. Кроме того, следует отметить, что модуляция ДНК, соответственно ее ингибирование могут быть определены общепринятыми методами. Так, например, размыкание цепи ДНК, соответственно образование комплекса, и их ингибирование могут быть определены с помощью метода EMSA ("Electrophoretic Mobility Shift Assay", "анализ сдвига электрофоретической подвижности"). Для этой цели предлагается инкубировать mut p53 вместе с меченой двухцепочечной ДНК, в которой возможно размыкание цепи, и производить электрофоретическое разделение смеси, в результате чего можно обнаружить образование одноцепочечной ДНК, соответственно комплекса, и их ингибирование.The invention also provides a system for identifying substances that are suitable for inhibiting mut p53-induced DNA modulations. Such a system includes mut p53 and DNA in which chain breaking is possible, as well as, if necessary, a substance whose inhibitory effect on binding mut p53 to DNA in which chain breaking is possible, needs to be investigated. For the individual components of the system, the above definitions apply accordingly. In addition, it should be noted that DNA modulation, respectively, its inhibition can be determined by generally accepted methods. For example, DNA chain opening, complex formation, and their inhibition, respectively, can be determined using the EMSA method (Electrophoretic Mobility Shift Assay, Electrophoretic Mobility Shift Analysis). For this purpose, it is proposed to incubate mut p53 together with labeled double-stranded DNA, in which the chain can be opened, and to perform electrophoretic separation of the mixture, as a result of which it is possible to detect the formation of single-stranded DNA, respectively, of the complex, and their inhibition.

С помощью настоящего изобретения оказывается возможным ингибировать вызываемую mut p53 модуляцию ДНК. Такая модуляция может представлять собой прочный комплекс, состоящий из mut p53 и ДНК, в которой возможно размыкание цепи, или представлять собой вызванное этим протеином размыкание цепи ДНК. Модуляция ДНК играет большую роль во многих процессах, происходящих в клетке. Так, например, размыкание цепи ДНК представляет собой важный этап при экспрессии генов и репликации ДНК. Размыкание цепи ДНК находится под строгим контролем. С помощью mut p53 этот контроль может быть существенно ослаблен. В результате открывается путь, который может привести к перерождению клетки, т.е. к образованию опухоли.Using the present invention, it is possible to inhibit mut p53-induced DNA modulation. Such a modulation may be a robust complex consisting of mut p53 and DNA in which a chain break is possible, or may be a DNA chain break caused by this protein. DNA modulation plays a large role in many processes occurring in the cell. For example, opening the DNA strand is an important step in gene expression and DNA replication. The opening of the DNA chain is under strict control. With mut p53, this control can be significantly weakened. As a result, a path opens that can lead to cell degeneration, i.e. to the formation of a tumor.

Настоящее изобретение дает возможность осуществлять терапевтическое воздействие при заболеваниях, при которых mut p53 вызывает модуляцию ДНК. Такие заболевания прежде всего представляют собой опухолевые заболевания. Кроме того, настоящее изобретение отличается тем, что предоставляет возможность идентифицировать вещества, пригодные для ингибирования модуляций ДНК, вызванных mut p53, прежде всего в случае опухолей. Такие вещества также являются объектом настоящего изобретения.The present invention enables therapeutic effects in diseases in which mut p53 causes DNA modulation. Such diseases are primarily tumor diseases. In addition, the present invention is characterized in that it enables the identification of substances suitable for inhibiting mutations of DNA caused by mut p53, especially in the case of tumors. Such substances are also an object of the present invention.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

На прилагаемых к описанию чертежах показано:The accompanying description of the drawings shows:

на фиг.1 - вызванное mut p53 размыкание цепи ДНК в MARI-ДНК,figure 1 - caused by mut p53 opening of the DNA strand in MARI DNA,

на фиг.2 - вызванное mut p53 размыкание цепи ДНК в MARII-ДНК,figure 2 - caused by mut p53 opening of the DNA chain in MARII DNA,

на фиг.3 - вызванное mut p53 образование комплекса в MAR6- и MAR7-ДНК,figure 3 - caused by mut p53 complex formation in MAR6 and MAR7 DNA,

на фиг.4 - вызванное mut p53 образование комплекса в MAR1- и MAR5-ДНК иfigure 4 - caused by mut p53 complex formation in MAR1 and MAR5 DNA and

на фиг.5 - ингибирование вызванного mut p53 размыкания цепи ДНК в MARI-ДНК.figure 5 - inhibition caused by mut p53 opening of the DNA strand in MARI-DNA.

Ниже изобретение поясняется на примере.The invention is illustrated below by way of example.

Пример: Модуляция ДНК с помощью mut p53 и ее ингибирование.Example: DNA modulation with mut p53 and its inhibition.

В этом примере проиллюстрирована модуляция ДНК в форме размыкания цепи ДНК, соответственно в форме образования комплекса.This example illustrates the modulation of DNA in the form of opening the DNA strand, respectively, in the form of complex formation.

(а) Индуцирование размыкания цепи ДНК, соответственно образования комплекса с помощью mut p53.(a) Inducing the opening of the DNA strand, respectively, the formation of the complex using mut p53.

Из XbaI-фрагмента MAR иммуноглобулина IgE длиной 997 пар оснований, расположенного в области энхансера гена тяжелой цепи иммуноглобулина, конструировали две MAR-области в форме олигонуклеотидов. Они представляли собой MARI, т.е. 3'-фланкирующую область энхансера, и MARII, т.е. 5'-фланкирующую область энхансера. Олигонуклеотиды имели следующие последовательности:From the XbaI fragment of the IgE immunoglobulin MAR 997 bp long, located in the enhancer region of the immunoglobulin heavy chain gene, two MAR regions in the form of oligonucleotides were constructed. They were MARI, i.e. 3'-flanking region of the enhancer, and MARII, i.e. 5'-flanking region of the enhancer. Oligonucleotides had the following sequences:

MARI, 3'-фланкирующая область энхансера IgH:MARI, 3'-flanking region of the IgH enhancer:

MARII, 5'-фланкирующая область энхансера IgH:MARII, 5'-flanking region of the IgH enhancer:

5'-TTTTAACAATAATAAATTAAGTTTAAAATATTTGCG-3'.5'-TTTTAACAATAATAAATTAAGTTTAAAATATTTGCG-3 '.

MARI имела указанную выше последовательность ААТАТАТТТ. MARII имела вариант этой последовательности, при этом общее содержание остатков AT оставалось неизменным.MARI had the above AATATATTT sequence. MARII had a variant of this sequence, while the total content of AT residues remained unchanged.

Затем конструировали олигонуклеотиды, имеющие варианты MARI, заключающиеся в том, что общее содержание остатков AT было уменьшено. Эти олигонуклеотиды имели следующие последовательности:Then, oligonucleotides having MARI variants were constructed, consisting in the fact that the total content of AT residues was reduced. These oligonucleotides had the following sequences:

MAR6: ACTATGCTT;MAR6: ACTATGCTT;

MAR7:GCTCTCTTT.MAR7: GCTCTCTTT.

После этого конструировали олигонуклеотиды, которые имели последовательность MARI наряду с пограничными "GC-сцеплениями". Эти "GC-сцепления" уменьшали общее содержание АТ-остатков.Thereafter, oligonucleotides that had a MARI sequence along with borderline "GC linkages" were constructed. These "GC linkages" reduced the total content of AT residues.

Олигонуклеотиды синтезировали, их концы метили с помощью ³²P и подвергали реакции отжига, в результате чего они становились двухцепочечными. Их инкубировали с р53 дикого типа, соответственно с mut p53, например с MethA p53, соответственно с Pro 273 p53, и подвергали тестированию с помощью EMSA. При этом работали по следующей методике.Oligonucleotides were synthesized, their ends were labeled with ³² P and subjected to an annealing reaction, as a result of which they became double-stranded. They were incubated with wild-type p53, respectively, mut p53, for example, MethA p53, respectively, Pro 273 p53, and tested using EMSA. At the same time, they worked according to the following procedure.

Смеси, содержащие p53 дикого типа и MethA p53, соответственно Pro 273 p53, подвергали предварительной инкубации в течение 20 мин с 2 мкг Poly dl:dC (неспецифический конкурент) в среде, содержащей 10 мМ Hepes (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота) с рН 7,8, 50 мМ КСl, 1 мМ ЭДТК, 5 мМ MgCl₂, 10% глицерина.Mixtures containing wild-type p53 and MethA p53, respectively Pro 273 p53, were preincubated for 20 min with 2 μg Poly dl: dC (non-specific competitor) in a medium containing 10 mM Hepes (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'- 2-ethanesulfonic acid) with a pH of 7.8, 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl ₂ , 10% glycerol.

После предварительной инкубации добавляли меченые олигонуклеотиды и смеси инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем смеси подвергали в течение 3 ч гель-электрофорезу в 4%-ном нативном полиакриламидном геле, после чего гели сушили и подвергали авторадиографии (фиг.1-4).After preliminary incubation, labeled oligonucleotides were added and the mixtures were incubated for 30 min at room temperature. Then, the mixtures were subjected to gel electrophoresis for 3 h in a 4% native polyacrylamide gel, after which the gels were dried and subjected to autoradiography (Figs. 1-4).

Было установлено, что mut p53, например MethA p53, соответственно Pro 273 p53, могут вызывать модуляцию ДНК, например размыкание цепи, соответственно образование комплекса с ДНК, в которой возможно размыкание цепи.It was found that mut p53, for example MethA p53, respectively Pro 273 p53, can cause DNA modulation, for example, opening of the chain, respectively, the formation of a complex with DNA, in which the opening of the chain is possible.

(б) Ингибирование вызванного mut p53 размыкания цепи ДНК(b) Inhibition of mutation of p53 DNA chain opening

Осуществляли последовательность операций, описанную в разделе (а), за исключением того, что смеси с MethA p53 также содержали антитела ПАт 421, соответственно ПАт 240. В качестве олигонуклеотидов использовали олигонуклеотиды, содержащие MARI-ДНК (фиг.5).The sequence of operations described in section (a) was carried out, except that the mixtures with MethA p53 also contained antibodies PAt 421, respectively PAt 240. Oligonucleotides containing MARI DNA were used as oligonucleotides (Fig. 5).

Очевидно, что связывание mut p53 с веществом, которое ингибирует ДНК, в которой возможно размыкание цепи, таким как ПАт 421, соответственно ПАт 240, может приводить к ингибированию индуцированного mut p53 размыкания цепи ДНК.Obviously, the binding of mut p53 to a substance that inhibits DNA in which a chain opening is possible, such as PA 421 or PA 240, can lead to inhibition of mut p53 induced DNA chain opening.

Claims

1. A method of suppressing DNA modulation, comprising inhibiting the binding of mut p53, containing a mutant core domain and / or mutant C-terminal domain, to DNA in which chain breaking is possible, and the inhibition refers to the binding of mut p53 to the AATATATTT sequence or variants thereof, whose content of AT residues has not changed.

2. The method according to claim 1, where the modulation is a strong complex of mut p53 and DNA, which may open the circuit.

3. The method according to claim 1, where the modulation is the opening of the DNA strand, in which the possible breaking of the chain.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, where the variant includes the sequence AATATATTT.

5. The method according to any one of claims 1 to 4, where the DNA, which may open the chain, is located in MAR-DNA.

6. The method according to any one of claims 1 to 5, where the inhibition is carried out using substances that inhibit the mutant core domain and / or the mutant C-terminal domain of p53.

7. The method according to claim 6, where the substances are antibodies RAV 240 and RAV 421.

8. A kit designed to identify substances suitable for inhibiting DNA modulation, and comprising the following components: (a) mut p53 with a mutant core domain and / or mutant C-terminal domain, (b) DNA in which a chain can be opened which includes the sequence AATATATTT or its variants in which the content of AT residues has not changed.

9. The kit of claim 8, which further includes a substance whose inhibitory effect on the binding of mut p53 to DNA, in which the chain can be opened, needs to be investigated.

10. The kit of claim 8 or 9, in which the variant includes the sequence AAAATATTT.