RU2233142C1 - Method for detecting spermatic viability after cryoconservation in fish - Google Patents
Method for detecting spermatic viability after cryoconservation in fish Download PDFInfo
- Publication number
- RU2233142C1 RU2233142C1 RU2003101419/13A RU2003101419A RU2233142C1 RU 2233142 C1 RU2233142 C1 RU 2233142C1 RU 2003101419/13 A RU2003101419/13 A RU 2003101419/13A RU 2003101419 A RU2003101419 A RU 2003101419A RU 2233142 C1 RU2233142 C1 RU 2233142C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sperm
- samples
- free radicals
- cryopreservation
- viability
- Prior art date
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
- Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к рыбной промышленности и может быть использовано в искусственном разведении рыб и других животных при создании банка генов ценных и исчезающих видов животных с целью сохранения биоразнообразия.The invention relates to the fishing industry and can be used in the artificial breeding of fish and other animals to create a gene bank of valuable and endangered species of animals in order to preserve biodiversity.
Практическое использование методов криоконсервации спермы животных сдерживается их несовершенством и неизученностью механизмов криоповреждений и способов их корректировки. Режимы замораживания - оттаивания, увеличение концентрации внутри- и внеклеточных солей, чрезмерное обезвоживание клетки, токсичность криозащитных сред могут вызвать как генетические повреждения, так и повреждения цитоплазматических мембран, от целостности которых зависит нормальное функционирование клеток.The practical use of methods for the cryopreservation of animal sperm is constrained by their imperfection and unstudied mechanisms of cryo-damage and methods for their correction. Freezing and thawing regimes, an increase in the concentration of intracellular and extracellular salts, excessive dehydration of the cell, toxicity of cryoprotective media can cause both genetic damage and damage to the cytoplasmic membranes, the integrity of which depends on the normal functioning of cells.
Для обеспечения высокой эффективности методов криоконсервации спермы животных очень важно с высокой степенью точности прогнозировать ее выживаемость после криоконсервации. Это необходимо для оценки действия криозащитных сред и корректировки их состава, отбора проб наиболее жизнеспособных сперматозоидов для закладки на долгосрочное хранение и прогнозирования жизнеспособности эмбрионов.To ensure the high efficiency of animal sperm cryopreservation methods, it is very important to predict its survival after cryopreservation with a high degree of accuracy. This is necessary for assessing the action of cryoprotective media and adjusting their composition, sampling the most viable spermatozoa for laying for long-term storage and predicting the viability of embryos.
В настоящее время не существует достаточно объективных методов определения жизнеспособности спермы животных по степени их повреждения после криоконсервации.Currently, there are no sufficiently objective methods for determining the viability of animal sperm by the degree of damage after cryopreservation.
Наиболее распространенным способом определения жизнеспособности спермы после криоконсервации является оценка качества спермы рыб по ее активности. Активность определяют под микроскопом по соотношению числа подвижных сперматозоидов с прямолинейным поступательным движением к общему количеству клеток в поле зрения и выражают в процентах. (См. Сборник научно-технической и методической документации по аквакультуре. М.: ВНИРО, 2001, с.152-158).The most common way to determine the viability of sperm after cryopreservation is to assess the quality of the sperm of fish by its activity. Activity is determined under a microscope by the ratio of the number of motile spermatozoa with rectilinear translational motion to the total number of cells in the field of view and is expressed as a percentage. (See. Collection of scientific, technical and methodological documentation on aquaculture. M .: VNIRO, 2001, p.152-158).
Способ является недостаточно достоверным и воспроизводимым из-за сложности получения капли спермы для визуального анализа под микроскопом строго одинакового объема. Методика нанесения капли спермы вызывает гибель части спермиев, что вносит дополнительную погрешность. Обеспечение стабильных и воспроизводимых условий нахождения спермиев при реализации способа (температура, рН и др.) также затруднительно. Кроме того, подвижность сперматозоидов не характеризует степень их повреждения в процессе криоконсервации и не всегда коррелирует с их жизнеспособностью и оплодотворяющей способностью, которая является основным показателем качества спермы.The method is not reliable and reproducible due to the difficulty of obtaining a drop of sperm for visual analysis under a microscope of exactly the same volume. The method of applying a drop of sperm causes the death of some sperm, which introduces an additional error. Ensuring stable and reproducible conditions for the presence of sperm during the implementation of the method (temperature, pH, etc.) is also difficult. In addition, sperm motility does not characterize the extent of their damage during cryopreservation and does not always correlate with their viability and fertilization ability, which is the main indicator of sperm quality.
Известен способ оценки качества спермы, заключающийся в измерении количества тепла, выделяемого спермиями при постоянной температуре инкубации. (См. Патент ГДР №85875, кл. 45 h 29/00, 1971).A known method for evaluating the quality of sperm, which consists in measuring the amount of heat released by sperm at a constant incubation temperature. (See GDR Patent No. 85875, CL 45 h 29/00, 1971).
Однако данный способ является недостаточно корректным, т.к. количество тепла, выделяемого спермиями, зависит от многих трудноконтролируемых факторов, например степени возбуждения, зрелости спермиев и т.д.However, this method is not correct enough, because the amount of heat released by sperm depends on many difficult to control factors, for example, the degree of arousal, sperm maturity, etc.
Известны способы определения качества спермы, основанные на принципе измерения времени изменения окраски спермы под воздействием различных индикаторов. (См. авт. свид. СССР №375067, кл. А 61 D 7/02, 1973, №622466, А 61 D 7/02, 1978).Known methods for determining the quality of sperm, based on the principle of measuring the time of color change of sperm under the influence of various indicators. (See ed. Certificate of the USSR No. 375067, class A 61 D 7/02, 1973, No. 622466, A 61 D 7/02, 1978).
Однако данные способы непригодны для оценки жизнеспособности спермы рыб после криоконсервации, т.к. солевой состав криозащитных сред может изменять результаты окрашивания.However, these methods are unsuitable for assessing the viability of fish sperm after cryopreservation, because the salt composition of cryoprotective media can change the staining results.
Известен способ определения качества спермиев, предусматривающий оценку уровня повреждения мембран, который заключается в смешивании спермы с питательной средой, содержащей флуорохром, и последующий анализ окрашенных спермиев под микроскопом. (См. авт. свид. №1329780, кл. A 61 D 7/02, А 61 В 10/00, 1987). В качестве флуорохрома используют смесь двух красителей - тиазинового красного и этидиум бромида. При повреждениях мембраны акросомы тиазиновый красный проникает в акросому и вызывает ее свечение, а этидиум бромид, проникая через поврежденную цитоплазматическую мембрану спермия, вызывает свечение его головки. Качество спермиев оценивают по интенсивности их свечения под люминесцентным микроскопом по балльной шкале.A known method for determining the quality of sperm, which involves assessing the level of damage to the membranes, which consists in mixing sperm with a nutrient medium containing fluorochrome, and subsequent analysis of stained sperm under a microscope. (See ed. Certificate No. 1329780, class A 61 D 7/02, A 61 B 10/00, 1987). As a fluorochrome, a mixture of two dyes is used - thiazine red and ethidium bromide. When the acrosome membrane is damaged, thiazine red penetrates the acrosome and causes its luminescence, and ethidium bromide, penetrating the damaged sperm cytoplasmic membrane, causes its head to glow. The quality of sperm is evaluated by the intensity of their luminescence under a luminescent microscope on a point scale.
Однако данный способ трудоемок и дает лишь общее представление о поврежденной структуре мембраны спермия по балльной шкале, не позволяя получить количественную характеристику уровня повреждений.However, this method is time-consuming and gives only a general idea of the damaged structure of the sperm membrane on a point scale, not allowing to obtain a quantitative description of the level of damage.
Наиболее близким способом того же назначения к заявленному изобретению по совокупности признаков является способ определения жизнеспособности спермы, предусматривающий оценку степени повреждения мембран по изменению дыхания клеток в различных средах. (См. авт. свид. СССР №938990, кл. А 61 D 7/02, 1982). Способ заключается в полярографической оценке энергетической системы сперматозоидов в среде инкубации, которую проводят по реакции дыхания на 2,4 - динитрофенол и дополнительно определяют целостность внешней клеточной мембраны сперматозоидов по реакции дыхания на янтарат калия. Поскольку в неповрежденные сперматозоиды янтарно-кислый калий не проникает, усиление дыхания имеет место только в случае увеличения проницаемости мембран.The closest method of the same purpose to the claimed invention according to the totality of features is a method for determining sperm viability, which involves assessing the degree of damage to membranes by changing the respiration of cells in various environments. (See ed. Certificate of the USSR No. 938990, class A 61 D 7/02, 1982). The method consists in a polarographic assessment of the energy system of sperm in the incubation medium, which is carried out by the reaction of respiration on 2,4-dinitrophenol and additionally determine the integrity of the outer cell membrane of sperm by the reaction of respiration on potassium amber. Since succinic acid does not penetrate intact spermatozoa, increased respiration occurs only in the case of increased membrane permeability.
Таким образом, указанный способ позволяет графически зарегистрировать результат измерения и определить по отношению скорости дыхания до введения янтарата калия и после его введения степень повреждения мембран.Thus, this method allows you to graphically register the measurement result and determine the ratio of the rate of respiration before the introduction of potassium succinic acid and after its introduction the degree of damage to the membranes.
К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата, относится то, что способ недоступен к применению в полевых условиях, сложен в выполнении, требует дорогостоящего оборудования. Кроме того, способ является косвенным и недостаточно чувствительным, т.к. результат определения в большой степени зависит от тщательности и воспроизводимости подготовки анализируемой пробы.The reasons that impede the achievement of the technical result indicated below include the fact that the method is not available for use in the field, difficult to perform, requires expensive equipment. In addition, the method is indirect and not sensitive enough, because the result of the determination to a large extent depends on the thoroughness and reproducibility of the preparation of the analyzed sample.
Настоящее изобретение направлено на универсализацию и упрощение способа, снижение трудоемкости и повышение чувствительности определения.The present invention is directed to the universalization and simplification of the method, reducing the complexity and increasing the sensitivity of the determination.
Технический результат достигается тем, что в способе определения жизнеспособности спермы рыб после криоконсервации, предусматривающем оценку степени повреждения мембран и определение ее жизнеспособности по результатам этой оценки, особенность заключается в том, что образцы спермы до и после криоконсервации подвергают воздействию радиоактивного индикатора свободнорадикальных реакций с последующим измерением радиоактивности образцов методом жидкостной сцинтилляции, оценку степени повреждения мембран проводят по изменению уровня содержания в них меченых свободных радикалов по уравнениюThe technical result is achieved by the fact that in the method for determining the viability of fish sperm after cryopreservation, which involves assessing the degree of damage to the membranes and determining its viability according to the results of this assessment, the peculiarity is that sperm samples before and after cryopreservation are exposed to a radioactive indicator of free radical reactions with subsequent measurement the radioactivity of samples by liquid scintillation, the degree of damage to the membranes is assessed by changing the level the content of labeled free radicals in them according to the equation
Δ=(DPMoп-DPMК)·100/DPMK,Δ = (DPM OP -DPM K) · 100 / DPM K,
где Δ - показатель изменения уровня меченых свободных радикалов, %,where Δ is an indicator of changes in the level of labeled free radicals,%,
DPMK - содержание меченых свободных радикалов в образцах спермы до криоконсервации, расп/мин,DPM K - the content of labeled free radicals in semen samples before cryopreservation, rasp / min,
DPMоп - содержание меченых свободных радикалов в образцах спермы после криоконсервации, расп/мин,DPM op - the content of labeled free radicals in semen samples after cryopreservation, rasp / min,
а жизнеспособными считают образцы, имеющие показатель изменения уровня свободных радикалов (Δ) не более 30-50%.and considered viable samples having an indicator of changes in the level of free radicals (Δ) of not more than 30-50%.
Кроме того, радиоактивный индикатор целесообразно добавлять к образцам спермы в соотношении 10:1,5. При этом предпочтительно сперму подвергать воздействию радиоактивного индикатора в течение 1-2 ч.In addition, it is advisable to add a radioactive indicator to the sperm samples in a ratio of 10: 1.5. In this case, it is preferable to expose the sperm to a radioactive indicator for 1-2 hours.
В заявленном способе для оценки степени криоповреждения спермы использован метод радикальной сополимеризации. Метод ориентирован на метаболический критерий - интенсивность свободнорадикальных реакций. Этот метод позволяет измерять стрессовую реакцию клеток сперматозоидов, подверженных криоконсервации, путем сравнения уровня свободнорадикальных реакций в них с контрольным (характеризующимся стационарным метаболическим состоянием клеток, не подвергаемых вредному воздействию). Изменение интенсивности окислительно-восстановительных метаболических реакций в клетках отражается на содержании свободных радикалов (СР) - короткоживущих промежуточных продуктов этих реакций. Радикалы могут считаться движущими факторами биохимических реакций. Основные группы свободных радикалов, определяемых в клетках животных различными методами, характеризуют две разные категории окислительных реакций: образование перекисных радикалов в липидах мембран и образование интермедиатов окислительно-восстановительных ферментативных реакций. При повреждениях клеток, вызванных различными причинами, развивается неспецифический "окислительный стресс", включающий развитие цепных реакций перекисного окисления липидов, образование супероксид-радикалов, повреждающих мембранные структуры клетки, а также генетический материал, а на более позднем этапе - изменение (как правило, снижение) активности мембрано-связанных ферментов, а также ферментов антиокислительной защитной системы клетки (каталазы, СОД и др.). Таким образом, при различных патологических процессах индуцируются реакции радикального характера, которые нарушают стационарное течение клеточных процессов.In the inventive method for assessing the degree of cryogenic damage to sperm, the method of radical copolymerization is used. The method focuses on the metabolic criterion - the intensity of free radical reactions. This method allows you to measure the stress response of sperm cells susceptible to cryopreservation by comparing the level of free radical reactions in them with a control (characterized by a stationary metabolic state of cells that are not exposed to harmful effects). A change in the intensity of redox metabolic reactions in cells is reflected in the content of free radicals (SR) - short-lived intermediate products of these reactions. Radicals can be considered the driving factors of biochemical reactions. The main groups of free radicals, which are determined in animal cells by various methods, characterize two different categories of oxidative reactions: the formation of peroxide radicals in membrane lipids and the formation of intermediates of redox enzymatic reactions. For cell damage caused by various causes, nonspecific “oxidative stress” develops, including the development of chain reactions of lipid peroxidation, the formation of superoxide radicals that damage the membrane structure of the cell, as well as genetic material, and at a later stage, a change (usually a decrease ) activity of membrane-bound enzymes, as well as enzymes of the antioxidant defense system of the cell (catalase, SOD, etc.). Thus, with various pathological processes, radical reactions are induced that disrupt the stationary course of cellular processes.
Принцип метода состоит в применении растворимого в воде радиоактивного индикатора - мономера, который, будучи введен в живые клетки при инкубации, включается в СР-реакции in vivo и полимеризуется в местах образования СР. Становясь нерастворимым, полимер не выводится из клетки. После фиксации в мембране сперматозоида относительное содержание СР детектируется соответственно уровню радиоактивности в образцах спермы.The principle of the method is the use of a water-soluble radioactive indicator - a monomer, which, introduced into living cells during incubation, is included in the CP reaction in vivo and polymerizes at the sites of formation of CP. By becoming insoluble, the polymer is not removed from the cell. After fixation in the sperm membrane, the relative content of SR is detected according to the level of radioactivity in semen samples.
Методом электронного парамагнитного резонанса установлено, что СР в образце связываются веществом-маркером. Повреждения выявляются по СР-реакциям в первые 1-2 часа воздействия и затем подтверждаются в долгосрочных опытах по определению жизнеспособности спермиев другими методами и их оплодотворяющей способности. Предпочтительное соотношение количества радиоактивного индикатора к образцам спермы 10:1,5 подобрано опытным путем.Using electron paramagnetic resonance, it was found that the superlattices in the sample are bound by a marker substance. Damage is detected by CP reactions in the first 1-2 hours of exposure and then confirmed in long-term experiments to determine the viability of sperm by other methods and their fertilizing ability. The preferred ratio of the amount of radioactive indicator to sperm samples 10: 1.5 is selected empirically.
Многочисленными опытами установлено, что уровень изменения содержания СР в образцах спермы рыб, характеризующий степень повреждения клеток, в норме не превышает 30-35%; сдвиг уровня СР-реакций более чем на 50% соответствует началу патологических процессов, а более значительные изменения приводят к их гибели.Numerous experiments have established that the level of change in the SR content in fish sperm samples, characterizing the degree of cell damage, normally does not exceed 30-35%; a shift in the level of CP reactions by more than 50% corresponds to the onset of pathological processes, and more significant changes lead to their death.
Проведенный анализ уровня техники позволил установить, что не обнаружен источник, характеризующийся признаками, тождественными всем существенным признакам заявленного изобретения. Следовательно, заявленное изобретение соответствует уровню "новизна".The analysis of the prior art made it possible to establish that the source was not detected, characterized by signs identical to all the essential features of the claimed invention. Therefore, the claimed invention meets the level of "novelty."
Дополнительный поиск известных решений показал, что заявленное изобретение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники.An additional search for known solutions showed that the claimed invention does not follow explicitly from the prior art for a specialist.
Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию "изобретательский уровень".Therefore, the claimed invention meets the condition of "inventive step".
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.The proposed method is as follows.
Образцы спермы до и после криоконсервации подвергают воздействию радиоактивного индикатора свободнорадикальных реакций. Образцы спермы после криоконсервации предварительно размораживают в теплой воде. К сперме добавляют радиоактивный индикатор, например 14С - акриламид активностью 0,1 мкКюри/мл в соотношении 1,5:100, и выдерживают в течение 1-2 ч при комнатной температуре. Далее образцы отмывают пятикратно раствором Рингера на миллипоровых фильтрах под давлением. Затем фильтры с пробами помещают во флаконы для сцинтилляционного счета и высушивают на воздухе в течение суток. Пробы подготавливают для измерения радиоактивности методом жидкостной сцинтилляции и определяют радиоактивность. Аналогичные операции проводят для образцов нативной (не замороженной) спермы или нативной спермы, разведенной испытуемой средой. Значение радиоактивности проб соответствует содержанию в них свободных радикаловSperm samples before and after cryopreservation are exposed to a radioactive indicator of free radical reactions. Sperm samples after cryopreservation are previously thawed in warm water. A radioactive indicator is added to semen, for example, 14 C - acrylamide with an activity of 0.1 μCi / ml in a ratio of 1.5: 100, and incubated for 1-2 hours at room temperature. Next, the samples are washed five times with Ringer's solution on millipore filters under pressure. Then the filters with samples are placed in bottles for scintillation counting and dried in air for a day. Samples are prepared for measuring radioactivity by liquid scintillation and radioactivity is determined. Similar operations are carried out for samples of native (not frozen) sperm or native sperm diluted with the test medium. The value of the radioactivity of the samples corresponds to the content of free radicals in them
Оценку степени повреждения мембран в образцах проводят по изменению уровня содержания в них меченых свободных радикалов по уравнению:Assessment of the degree of damage to the membranes in the samples is carried out by changing the level of the content of labeled free radicals in them according to the equation:
Δ=(DPMоп-ОРМк)·100/DPMК,Δ = (DPM op -ORM to ) 100 / DPM K ,
где Δ - показатель изменения уровня меченых свободных радикалов, %;where Δ is an indicator of a change in the level of labeled free radicals,%;
DPМk - содержание меченых свободных радикалов в образцах спермы до криоконсервации, расп/мин;DPM k — content of labeled free radicals in semen samples before cryopreservation, rasp / min;
DPMоп - содержание меченых свободных радикалов в образцах спермы после криоконсервации, расп/мин.DPM op - the content of labeled free radicals in semen samples after cryopreservation, rasp / min.
Жизнеспособными считают образцы, имеющие показатель изменения уровня свободных радикалов (Δ) не более 30-50%.Samples that have an indicator of changes in the level of free radicals (Δ) of not more than 30-50% are considered viable.
Изобретение иллюстрируется следующим примером.The invention is illustrated by the following example.
Опыты по определению жизнеспособности спермы рыб после криоконсервации производили со спермой осетровых рыб, замороженной в различных криозащитных средах. Образцы спермы до и после криоконсервации подвергали воздействию радиоактивного индикатора свободнорадикальных реакций. Образцы спермы после криоконсервации, находящиеся в пробирках "Эппендорф", предварительно размораживали, помещая в водяную баню с температурой воды 38-40°С на 1 минуту. В пробирки, содержащие 1,5 мл спермы, добавляли по 10 мкл радиоактивного индикатора (14С - акриламид активностью 0,1 мкКюри/мл) и выдерживали в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Далее образцы отмывали пятикратно раствором Рингера на миллипоровых фильтрах под давлением, применяя водоструйный насос. Для этого отбирали и помещали на фильтр по 200 мкл каждой пробы. Затем фильтры с пробами помещали во флаконы для сцинтилляционного счета и высушивали на воздухе в течение суток. Перед измерением радиоактивности методом жидкостной сцинтилляции пробы подготавливали следующим образом: для проведения кислотного гидролиза в каждый флакон добавляли по 0,4 мл конц. HClO4 и по 0,4 мл конц. Н2О2; помещали в термостат (50°С) на 6 час; далее добавляли по 2,5 мл 1,5 М трисаминометана для нейтрализации кислоты и по 15 мл сцинтилляционной смеси на основе диоксана (раствор Брея). Определение радиоактивности проб проводили на жидкостном сцинтилляционном спектрометре "Rackbeta" фирмы LKB.Experiments to determine the viability of fish sperm after cryopreservation were carried out with sturgeon sperm frozen in various cryoprotective media. Sperm samples before and after cryopreservation were exposed to a radioactive indicator of free radical reactions. Sperm samples after cryopreservation in Eppendorf tubes were previously thawed, placed in a water bath with a water temperature of 38–40 ° C for 1 minute. To the tubes containing 1.5 ml of sperm, 10 μl of a radioactive indicator ( 14 C - acrylamide with an activity of 0.1 μCi / ml) was added and kept for 1.5 h at room temperature. Next, the samples were washed five times with Ringer's solution on millipore filters under pressure using a water-jet pump. For this, 200 μl of each sample was taken and placed on the filter. Then, filters with samples were placed in scintillation counting bottles and dried in air for 24 hours. Before measuring the radioactivity by liquid scintillation, samples were prepared as follows: to conduct acid hydrolysis, 0.4 ml conc. Was added to each vial. HClO 4 and 0.4 ml conc. H 2 O 2 ; placed in a thermostat (50 ° C) for 6 hours; then 2.5 ml of 1.5 M trisaminomethane were added to neutralize the acid and 15 ml of dioxane-based scintillation mixture (Bray solution). The radioactivity of the samples was determined using a LKB Rackbeta liquid scintillation spectrometer.
Оценку степени повреждения мембран в образцах проводили по изменению уровня содержания в них меченых свободных радикалов по показателю Δ, а также по проценту оплодотворения икры дефростированной спермой и дальнейшего развития (до вылупления). Контролем служила нативная сперма (без замораживания). Каждый вариант опыта включал 3 повторности.The degree of damage to the membranes in the samples was assessed by changing the level of labeled free radicals in them in terms of Δ, as well as by the percentage of fertilized eggs with defrosted sperm and their further development (before hatching). The control was native sperm (without freezing). Each experiment included 3 replicates.
Результаты приведены в таблице.The results are shown in the table.
Как видно из таблицы, значения изменения уровня содержания меченых свободных радикалов в образцах спермы более 30-50% соответствует резкому снижению оплодотворяющей способности спермы.As can be seen from the table, the values of changes in the level of labeled free radicals in semen samples of more than 30-50% correspond to a sharp decrease in the fertilizing ability of sperm.
На основании приведенных данных можно сделать вывод, что среда №64 обладает наибольшими криозащитными свойствами, судя как по показателю Δ, предложенному в данном способе, так и по оплодотворяющей способности дефростированной спермы. Криозащитные качества среды №63 приемлемы, а сред №№56 и 52 недостаточны.Based on the data presented, it can be concluded that medium No. 64 has the highest cryoprotective properties, judging by both the Δ indicator proposed in this method and the fertilizing ability of defrosted sperm. Cryoprotective qualities of environment No. 63 are acceptable, and environments No. 56 and 52 are insufficient.
Таким образом, заявляемый способ позволяет определить криоповреждения в сперматозоидах перед закладкой проб на долгосрочное хранение в криобанк, что способствует сокращению расходов на обслуживание биохранилищ. Как правило, криоповреждения могут присутствовать в 90% образцов. В среднем в год закладывается в криобанк около 11000 спермодоз. Обеспечение сохранности одной спермодозы (включая стоимость жидкого азота) составляет 38 рублей. Экономия от предварительного (предзакладочного) контроля криоповреждений заявленным методом составляет около 30000 рублей.Thus, the inventive method allows you to determine cryogenic damage in spermatozoa before laying samples for long-term storage in the cryobank, which helps to reduce the cost of maintaining biorepositories. Typically, cryo damage can be present in 90% of the samples. On average, about 11,000 sperm doses are put into the cryobank per year. Ensuring the safety of one sperm dose (including the cost of liquid nitrogen) is 38 rubles. The savings from preliminary (pre-mortgage) control of cryo-damage by the claimed method is about 30,000 rubles.
Заявляемый способ универсален, нетрудоемок, прост в выполнении, обладает достаточной чувствительностью определения и может быть использован при разработке условий замораживания и оттаивания спермы, криопротекторов и сред для ее замораживания, а также при разработке других способов ее сохранения.The inventive method is universal, easy, simple to perform, has sufficient detection sensitivity and can be used to develop conditions for freezing and thawing sperm, cryoprotectants and media for freezing it, as well as developing other ways to preserve it.
Изложенные выше сведения свидетельствуют о выполнении при использовании заявленного изобретения следующей совокупности условий:The above information indicates that when using the claimed invention, the following combination of conditions:
- способ определения жизнеспособности спермы рыб после криоконсервации по заявленному изобретению относится к рыбной промышленности и может быть использован в искусственном разведении рыб и других животных;- a method for determining the viability of fish sperm after cryopreservation according to the claimed invention relates to the fishing industry and can be used in artificial breeding of fish and other animals;
- для заявленного способа в том виде, как он охарактеризован в независимом пункте изложенной формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке средств и методов.- for the claimed method in the form described in the independent clause of the claims, the possibility of its implementation using the means and methods described in the application is confirmed.
Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию "промышленная применимость".Therefore, the claimed invention meets the condition of "industrial applicability".
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003101419/13A RU2233142C1 (en) | 2003-01-21 | 2003-01-21 | Method for detecting spermatic viability after cryoconservation in fish |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003101419/13A RU2233142C1 (en) | 2003-01-21 | 2003-01-21 | Method for detecting spermatic viability after cryoconservation in fish |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2003101419A RU2003101419A (en) | 2004-07-27 |
| RU2233142C1 true RU2233142C1 (en) | 2004-07-27 |
Family
ID=33413802
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003101419/13A RU2233142C1 (en) | 2003-01-21 | 2003-01-21 | Method for detecting spermatic viability after cryoconservation in fish |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2233142C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2657495C1 (en) * | 2017-09-25 | 2018-06-14 | Общество с ограниченной ответственностью "Экостар-Наутех" | Method for obtaining a granular sorbent for lithium recovery from lithium-containing brines under conditions of production of commercial lithium products |
| CN114208730A (en) * | 2021-12-10 | 2022-03-22 | 宁德师范学院 | Cryopreservation and recovery method for maintaining sperm insemination performance of large yellow croaker and application |
-
2003
- 2003-01-21 RU RU2003101419/13A patent/RU2233142C1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2657495C1 (en) * | 2017-09-25 | 2018-06-14 | Общество с ограниченной ответственностью "Экостар-Наутех" | Method for obtaining a granular sorbent for lithium recovery from lithium-containing brines under conditions of production of commercial lithium products |
| CN114208730A (en) * | 2021-12-10 | 2022-03-22 | 宁德师范学院 | Cryopreservation and recovery method for maintaining sperm insemination performance of large yellow croaker and application |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bantle | FETAX—A developmental toxicity assay using frog embryos | |
| Celeghini et al. | Practical techniques for bovine sperm simultaneous fluorimetric assessment of plasma, acrosomal and mitochondrial membranes | |
| Shields et al. | Blastomere morphology as a predictive measure of fish egg viability | |
| McDaniel et al. | Use of a sperm analyzer for evaluating broiler breeder males. 1. Effects of altering sperm quality and quantity on the sperm motility index | |
| Partyka et al. | Methods of assessment of cryopreserved semen | |
| Ratnawati et al. | Character motility of liquid semen on Ongole crossbreed (PO), Bali and Madura bulls with different diluents at cold storage | |
| Duncan et al. | Measurements of viability suitable for plant tissue cultures | |
| Karger et al. | Prognostic value of a pre-freeze hypo-osmotic swelling test on the post-thaw quality of dog semen | |
| Burgdorf-Moisuk et al. | Validation of lactate measurement in American flamingo (Phoenicopterus ruber) plasma and correlation with duration and difficulty of capture | |
| Llavanera et al. | Assessment of sperm mitochondrial activity by flow cytometry and fluorescent microscopy: A comparative study of mitochondrial fluorescent probes in bovine spermatozoa | |
| Dolník et al. | Flow cytometry in assessment of sperm integrity and functionality–a review | |
| Aless et al. | Assessment of viability, chromatin structure stability, mitochondrial function and motility of stallion fresh sperm by using objective methodologies | |
| RU2233142C1 (en) | Method for detecting spermatic viability after cryoconservation in fish | |
| JP2021019604A (en) | Process control for increased robustness of genetic assay | |
| RU2568845C1 (en) | Method of assessment of genetic full-value of sperm | |
| RU2541456C1 (en) | Method for biological assessment of toxicity level of marine environment | |
| Jorde et al. | Detecting genetic structure in migrating bowhead whales off the coast of Barrow, Alaska | |
| Shaliutina et al. | Using fish spermatozoa in in vitro toxicity tests: A potential toxicology tool | |
| Bank et al. | Parameters for evaluation of viability assays: accuracy, precision, specificity, sensitivity, and standardization | |
| Chagnot et al. | Hyperspectral deep ultraviolet autofluorescence of muscle fibers is affected by postmortem changes | |
| Parker | Criteria of life: Some methods of measuring viability | |
| Kemp et al. | Otolith chemistry is more accurate than otolith shape in identifying cod species (genus Pseudophycis) in the diet of Australian fur seals (Arctocephalus pusillus doriferus) | |
| CN101636658A (en) | Fluorescence-based assay for detecting compounds for modulating the sodium-calcium exchanger (NCX) in 'forward mode' | |
| Muid et al. | Zinc phosphide induced DNA damage in the blood cells of Gallus sp. using comet DNA assay | |
| RU2679312C1 (en) | Method for evaluating the genetic usefulness of spermatozoa |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20090122 |