RU2568845C1

RU2568845C1 - Method of assessment of genetic full-value of sperm

Info

Publication number: RU2568845C1
Application number: RU2014122210/15A
Authority: RU
Inventors: Владимир Александрович Трофимов; Сергей Юрьевич Пузанов; Александр Владимирович Трофимов; Антон Павлович Стеблов
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "Генетико-селекционный исследовательский центр "Генология-МГУ"
Priority date: 2014-05-30
Filing date: 2014-05-30
Publication date: 2015-11-20

Abstract

FIELD: veterinary medicine.

SUBSTANCE: method comprises adding to the ejaculate samples in vitro in a medium for dilution of hydrogen peroxide at a concentration of 0.5-1.0 mM, followed by the identification and determining in the sperm of primary morphological signs of apoptosis, nicking and DNA fragmentation, the intensity of lipid peroxidation. And in detection of the low percentage of apoptotic dying sperm up to 10-15% of bright enough and expressed halo glow, increasing the content of TBA-reactive products of not more than 30-40% relative to control, the sperm are assessed as genetically full.

EFFECT: use of the invention enables to improve the diagnostics of pathological disorders in sperm in the chromatin level.

Description

Способ оценки генетической полноценности сперматозоидовA method for assessing the genetic usefulness of sperm

Изобретение относится к области ветеринарии и животноводства и может быть использовано при искусственном осеменении для выявления генетически неполноценных сперматозоидов, их выбраковке и недопустимости использования для искусственного осеменения.The invention relates to the field of veterinary medicine and animal husbandry and can be used for artificial insemination to identify genetically defective spermatozoa, their culling and inadmissibility of use for artificial insemination.

Известны различные способы оценки активности и прогнозирования оплодотворяющей способности спермы. В практике искусственного осеменения наибольшее применение получила оценка качества спермы по органолептическим признакам, концентрации, подвижности и переживаемости сперматозоидов [ABS Global, Inc. Руководство по искусственному осеменению. Пятое издание, 2002]. Также известны способы оценки качества спермы путем определения процента сперматозоидов с аномальной морфологией, осмотической резистентности, устойчивости (толерантности) к холодовому и другим видам стресса, содержания высокоэнергетических молекул, активности различных дегидрогеназ и гидролаз (гиалуронидазы, акрозина и другие) [Руководство ВОЗ для лабораторного исследования и обработки человеческой спермы, 2010]. Для выявления фертильности и аномальных сперматозоидов предложено определение статуса метилирования ДНК. Данный подход направлен на выявление эпигенетических нарушений в сперматозоидах, зависимых от многих факторов (в том числе, возраста), и требует применения сложной дорогостоящей аппаратуры и не может быть воспроизведен в зоотехнических и ветеринарных лабораториях [US Patent No. WO 2009059327, G01N 33/48, 30 December, 2009].There are various methods for assessing activity and predicting the fertilizing ability of sperm. In the practice of artificial insemination, the assessment of sperm quality by organoleptic characteristics, concentration, motility, and sperm survival rate has been most widely used [ABS Global, Inc. Guide to artificial insemination. Fifth Edition, 2002]. There are also known methods for assessing sperm quality by determining the percentage of spermatozoa with abnormal morphology, osmotic resistance, resistance (tolerance) to cold and other types of stress, high-energy molecules, the activity of various dehydrogenases and hydrolases (hyaluronidases, acrosin and others) [WHO Manual for Laboratory Research and human sperm processing, 2010]. To identify fertility and abnormal sperm, the determination of DNA methylation status has been proposed. This approach is aimed at identifying epigenetic disorders in spermatozoa that are dependent on many factors (including age), and requires the use of complex, expensive equipment and cannot be reproduced in zootechnical and veterinary laboratories [US Patent No. WO 2009059327, G01N 33/48, 30 December, 2009].

Одним из важнейших подходов к анализу генетической полноценности сперматозоидов является определение фрагментации (целостности) окрашенного хроматина/ДНК сперматозоидов путем измерения размера гало [Ferna′ndez J.L., Muriel L., Rivero M.T., Goyanes V., Va′zquez R. et al. // The sperm chromatin dispersion test: a simple method for the determination of sperm DNA fragmentation // J. Androl., 2003; 24: 59-66].One of the most important approaches to the analysis of sperm genetic usefulness is the determination of the fragmentation (integrity) of stained chromatin / sperm DNA by measuring the size of the halo [Ferna’ndez J.L., Muriel L., Rivero M.T., Goyanes V., Vazquez R. et al. // The sperm chromatin dispersion test: a simple method for the determination of sperm DNA fragmentation // J. Androl., 2003; 24: 59-66].

Известен способ определения суммарной антиокислительной активности спермоплазмы для оценки оплодотворяющей способности сперматозоидов путем регистрации железо-индуцируемой хемилюминисценции модельной системы до и после добавления спермоплазмы [RU 2278382, МПК G01N 33/487, опубл. 20.06.2006 г.].A known method for determining the total antioxidant activity of sperm plasma to assess the fertilizing ability of spermatozoa by recording the iron-induced chemiluminescence of the model system before and after adding sperm plasma [RU 2278382, IPC G01N 33/487, publ. June 20, 2006].

Недостатком известных способов является отсутствие комплексного подхода, позволяющего учесть широкий спектр нарушений в генетическом аппарате сперматозоидов, неоднозначность оценки генетического аппарата и целесообразности применения для искусственного осеменения.A disadvantage of the known methods is the lack of an integrated approach that allows you to take into account a wide range of violations in the sperm genetic apparatus, the ambiguity of the assessment of the genetic apparatus and the appropriateness of use for artificial insemination.

Необходимость применения комплексного подхода к оценке генетической полноценности сперматозоидов обусловлена многообразием факторов, влияющих на структурно-функциональное состояние хроматина и, как следствие, на оплодотворяющую способность сперматозоидов, жизнеспособность и полноценность потомства. К их числу в первую очередь следует отнести: окислительные модификации ДНК, образование сшивок, одноцепочечные и двухцепочечные разрывы (фрагментация хроматина), обусловленные высоким уровнем свободнорадикальных процессов, включая перекисное окисление липидов и образование активных форм кислорода; стимуляцию и запуск процессов апоптоза в сперматозоидах.The need for an integrated approach to assessing the genetic usefulness of spermatozoa is due to a variety of factors affecting the structural and functional state of chromatin and, as a consequence, the fertilizing ability of sperm, the viability and usefulness of the offspring. These include, first of all: oxidative DNA modifications, crosslinking, single-stranded and double-stranded breaks (chromatin fragmentation) due to a high level of free radical processes, including lipid peroxidation and the formation of reactive oxygen species; stimulation and triggering of apoptosis in sperm.

При этом современные методы оценки патологических нарушений в сперматозоидах основаны на выявлении уже имеющихся клеточных и молекулярных дефектов, не позволяя выявлять «скрытые» нарушения, связанные с недостаточностью антиоксидантной и репарационной систем, что ограничивает возможности диагностики на генетическом уровне.At the same time, modern methods for assessing pathological abnormalities in spermatozoa are based on the identification of existing cellular and molecular defects, not allowing the detection of “hidden” disorders associated with deficiency of antioxidant and repair systems, which limits the diagnostic capabilities at the genetic level.

Технический результат заключается в повышении диагностики патологических нарушений в сперматозоидах на хроматиновом уровне посредством оценки генетической полноценности сперматозоидов и целесообразности дальнейшего их использования для оплодотворения.The technical result consists in increasing the diagnosis of pathological disorders in spermatozoa at the chromatin level by evaluating the genetic usefulness of sperm and the feasibility of their further use for fertilization.

Сущность изобретения заключается в том, что в пробы эякулята in vitro в среде для разбавления добавляют перекись водорода в концентрации 0,5-1,0 мМоль с последующим выявлением в сперматозоидах первичных морфологических признаков апоптоза, одноцепочечных разрывов и фрагментации ДНК, интенсивности процессов перекисного окисления липидов. При выявлении низкого процента апоптотически гибнущих сперматозоидов до 10-15%, достаточно яркого и выраженного свечения Гало, возрастания содержания ТБК-реактивных продуктов не более чем на 30-40% по отношению к контролю, оценивают сперматозоиды как генетически полноценные.The essence of the invention lies in the fact that in an in vitro sample of ejaculate in a dilution medium, hydrogen peroxide is added in a concentration of 0.5-1.0 mmol, followed by the identification of primary morphological signs of apoptosis, single-strand breaks and DNA fragmentation in the spermatozoa, and the intensity of lipid peroxidation processes . When a low percentage of apoptotically dying spermatozoa up to 10-15%, a sufficiently bright and pronounced luminescence of Halo, an increase in the content of TBA-reactive products by no more than 30-40% relative to the control is detected, spermatozoa are evaluated as genetically complete.

Для оценки генетической полноценности сперматозоидов использован прием воздействия на сперматозоиды генотоксикантом, в качестве которого применяется перекись водорода, приводящая к окислительной модификации биомолекул (включая белки, липиды и ДНК). В высоких концентрациях и при продолжительном воздействии перекись водорода приводит к развитию окислительного стресса, сопровождающегося повреждением ДНК (образование сшивок, разрыв цепей), которые проявляются при наличии нарушений в репарационной системе клетки и недостаточности антиоксидантной системы.To assess the genetic usefulness of spermatozoa, we used a method of exposing spermatozoa to a genotoxicant, which uses hydrogen peroxide, which leads to the oxidative modification of biomolecules (including proteins, lipids, and DNA). In high concentrations and with prolonged exposure, hydrogen peroxide leads to the development of oxidative stress, accompanied by DNA damage (crosslinking, chain breaking), which are manifested in the presence of disorders in the cell's repair system and deficiency of the antioxidant system.

Реакция сперматозоидов на действие перекиси водорода оценивается с помощью комплекса методик и сравнивается с аналогичными показателями сперматозоидов контрольной группы.The reaction of sperm to the action of hydrogen peroxide is evaluated using a set of methods and compared with similar indicators of sperm in the control group.

Первоначальный отбор генетически полноценных сперматозоидов может осуществляться путем обследования нативных, не подвергающихся влиянию перекиси водорода сперматозоидов контрольной группы. Изначально высокий процент гибнущих клеток и высокий апоптотический индекс (ниже 80%), фрагментация хроматина, высокое содержание ТБК-реактивных продуктов в сперматозоидах контрольной группы уже указывают на то, что в их геномах могут быть генетические нарушения, обусловленные недостаточной активностью антиоксидантной и репарационной систем дефектных сперматозоидов, то есть их можно отнести к генетически неполноценным.The initial selection of genetically complete spermatozoa can be carried out by examining native sperm cells that are not affected by hydrogen peroxide in the control group. Initially, a high percentage of dying cells and a high apoptotic index (below 80%), chromatin fragmentation, and a high content of TBA-reactive products in the spermatozoa of the control group already indicate that their genomes may have genetic abnormalities due to insufficient activity of defective and antioxidant and repair systems sperm, that is, they can be attributed to genetically inferior.

При воздействии на сперматозоиды перекисью водорода величины показателей, определяемых с помощью комплекса методик и характеризующих проапоптическую активность, фрагментацию хроматина, интенсивность процессов перекисного окисления липидов может возрастать в пределах не более 10-20% от исходных величин. В этом случае сперматозоиды характеризуются как генетически полноценные, обладающие нормальной функциональной активностью.When exposed to hydrogen peroxide in sperm, the values of indicators determined using a complex of methods and characterizing proapoptotic activity, chromatin fragmentation, and the intensity of lipid peroxidation can increase within no more than 10-20% of the initial values. In this case, the sperm are characterized as genetically complete, with normal functional activity.

Другой вариант реакции сперматозоидов на действие перекиси водорода заключается в том, что ответ клеток на воздействие генотоксиканта связан с резким повышением процента гибнущих клеток, усилением процессов фрагментации хроматина и активизацией перекисного окисления липидов, свидетельствующих о наличии генетических дефектов, обуславливающих генетическую неполноценность сперматозоидов.Another variant of the reaction of spermatozoa to the action of hydrogen peroxide is that the response of the cells to the effect of the genotoxicant is associated with a sharp increase in the percentage of dying cells, an increase in chromatin fragmentation processes and activation of lipid peroxidation, indicating the presence of genetic defects that cause genetic inferiority of spermatozoa.

Если концентрация перекиси водорода будет меньше 0,5 мМоль, то прооксидантное действие будет недостаточным для выявления генетической неполноценности сперматозоидов. Если концентрация перекиси водорода будет выше 1 мМоль, то вследствие повышения прооксидантной активности отмечается повышенная гибель сперматозоидов.If the concentration of hydrogen peroxide is less than 0.5 mmol, the prooxidant effect will be insufficient to detect sperm genetic inferiority. If the concentration of hydrogen peroxide is higher than 1 mmol, then due to an increase in prooxidant activity, an increased death of spermatozoa is noted.

Способ осуществляется следующим образом. Для определения качества спермы исследования проводят при температуре 38-40°C. Полученный препарат спермы разбавляют в среде для разбавления и делят на две равные части. Одну пробу оставляют в нативном состоянии (контроль), а ко второй добавляют перекись водорода в концентрации 0,5-1,0 мМоль с последующим выявлением и определением в сперматозоидах, полученных образцов, с помощью комплекса методик структурно-функциональных изменений ядра и хроматина, одноцепочечных разрывов ДНК, уровня процессов перекисного окисления липидов. При оценке генетической полноценности сперматозоидов используются методики морфологической оценки структурного состояния ядра и хроматина с помощью флуоресцентного ядерного красителя Hoechst 33258, определяется фрагментация ДНК методом Гало, анализируется интенсивность перекисного окисления липидов с помощью ТБК-теста [Mikhailenko V.M., Philchenkov A.A. Analysis of 1Н NMR-detectable mobile lipid domains for assessment of apoptosis induced by inhibitors of DNA synthesis and replication // Cell Biology International, 2005, 29, 33-39; Fernandez J. L. The Sperm Chromatin Dispersion Test: A Simple Method for the Determination of Sperm DNA Fragmentation // Journal of Andrology. Volume 24, Issue 1, January-February, 2003, pages 59-66; Janero D.R. Malondialdehyde and thiobarbituric acid-reactivity as diagnostic indices of lipid peroxidation and peroxidative tissue injury // Free Radical Biology and Medicine. Volume 9, Issue 6, 1990, Pages 515-540].The method is as follows. To determine the quality of sperm, studies are carried out at a temperature of 38-40 ° C. The resulting sperm preparation is diluted in dilution medium and divided into two equal parts. One sample is left in the native state (control), and hydrogen peroxide is added to the second at a concentration of 0.5-1.0 mmol, followed by detection and determination of the obtained samples in spermatozoa using a complex of methods of structural and functional changes in the nucleus and chromatin, single-chain DNA breaks, the level of lipid peroxidation processes. When assessing the genetic usefulness of spermatozoa, methods of morphological assessment of the structural state of the nucleus and chromatin using the Hoechst 33258 fluorescent nuclear dye are used, DNA fragmentation is determined by the Halo method, and the lipid peroxidation rate is analyzed using the TBA test [Mikhailenko V.M., Philchenkov A.A. Analysis of 1H NMR-detectable mobile lipid domains for assessment of apoptosis induced by inhibitors of DNA synthesis and replication // Cell Biology International, 2005, 29, 33-39; Fernandez J. L. The Sperm Chromatin Dispersion Test: A Simple Method for the Determination of Sperm DNA Fragmentation // Journal of Andrology. Volume 24, Issue 1, January-February, 2003, pages 59-66; Janero D.R. Malondialdehyde and thiobarbituric acid-reactivity as diagnostic indices of lipid peroxidation and peroxidative tissue injury // Free Radical Biology and Medicine. Volume 9, Issue 6, 1990, Pages 515-540].

Генетически полноценные сперматозоиды не имеют патологических аномалий и дефектов, характеризуются отсутствием или слабой степенью агглютинации, слабой склонностью к апоптозу (не более 10-15%), отсутствием разрывов в ДНК, ярким и выраженным свечением Гало, низким уровнем содержания ТБК-реактивных продуктов (0,24±0,05 мкМоль/л).Genetically complete spermatozoa do not have pathological abnormalities and defects, are characterized by the absence or weak degree of agglutination, weak tendency to apoptosis (no more than 10-15%), lack of DNA breaks, bright and pronounced halo glow, low level of TBA-reactive products (0 , 24 ± 0.05 μmol / L).

При действии перекиси водорода генетически полноценные сперматозоиды характеризуются высокой жизнеспособностью (количество гибнущих сперматозоидов возрастает в среднем на 20%), имеют достаточно яркое и выраженное свечение Гало, при этом содержание ТБК-реактивных продуктов возрастает не более чем на 30-40% по отношению к контролю.Under the action of hydrogen peroxide, genetically complete spermatozoa are characterized by high viability (the number of dying spermatozoa increases by an average of 20%), have a fairly bright and pronounced halo glow, while the content of TBA-reactive products increases by no more than 30-40% relative to the control .

Генетически неполноценные сперматозоиды могут иметь патологические аномалии и дефекты, склонны к индуцированному или спонтанному апоптозу, имеют высокую частоту встречаемости одноцепочечных разрывов в ДНК и менее яркое и выраженное свечение Гало, а также высокий уровень ТБК-реактивных продуктов, чем генетически полноценные сперматозоиды.Genetically defective spermatozoa can have pathological abnormalities and defects, are prone to induced or spontaneous apoptosis, have a high frequency of occurrence of single-stranded breaks in DNA and a less bright and pronounced halo glow, as well as a high level of TBA-reactive products than genetically complete spermatozoa.

При действии перекиси водорода у генетически неполноценных сперматозоидов возрастает склонность к индуцированному апоптозу (процент гибнущих сперматозоидов возрастает на 50% и более), подавляется свечение Гало, отмечается резкое повышение содержания ТБК-реактивных продуктов на 50-80% и выше по отношению к контролю.Under the action of hydrogen peroxide, genetically inferior spermatozoa increase their tendency to induced apoptosis (the percentage of dying spermatozoa increases by 50% or more), the halo glow is suppressed, and a sharp increase in the content of TBA-reactive products by 50-80% and higher relative to the control is noted.

По сравнению с известными решениями предлагаемое позволяет повысить диагностику патологических нарушений в сперматозоидах на хроматиновом уровне посредством оценки генетической полноценности сперматозоидов и целесообразности дальнейшего их использования для оплодотворения.Compared with the known solutions, the proposed one allows to increase the diagnosis of pathological disorders in spermatozoa at the chromatin level by evaluating the genetic usefulness of sperm and the feasibility of their further use for fertilization.

Claims

A method for assessing the genetic usefulness of spermatozoa, which consists in the addition of hydrogen peroxide in a concentration of 0.5-1.0 mmol in an in vitro ejaculate sample in a dilution medium, followed by the identification and determination of primary morphological signs of apoptosis, single-strand breaks and DNA fragmentation in spermatozoa , the intensity of lipid peroxidation processes, while revealing a low percentage of apoptotically dying spermatozoa up to 10-15% of a sufficiently bright and pronounced halo glow, increasing containing no more than 30–40% of TBA-reactive products in relation to the control, sperm are estimated as genetically complete.