RU2223775C1

RU2223775C1 - Method for obtaining dry preparation based upon alive lactobacilli for treating and preventing dysbacteriosis of different etiology in patients and animals

Info

Publication number: RU2223775C1
Application number: RU2002113809/15A
Authority: RU
Inventors: Д.А. Мохов; С.А. Швецов; А.В. Ежов; рков Ю.А. По; Ю.А. Поярков
Original assignee: Научно-исследовательский институт микробиологии МО РФ
Priority date: 2002-05-28
Filing date: 2002-05-28
Publication date: 2004-02-20
Also published as: RU2002113809A

Abstract

FIELD: medicine, veterinary science, microbiology. SUBSTANCE: the suggested method to obtain bacterial preparation based upon lactobacilli deals with obtaining cell biomass due to deep cultivation in liquid nutritive medium, its freezing and freeze drying dehydration. Moreover, before freezing lactobacilli biomass is supplemented with polygluki up to final concentration of 1.5% (weight/volume), pouring microbial suspension into vials is carried out at constant work of mixing device (at rotation velocity being (0.3-0.5)rot(rot/min^-1), freezing is performed at the rate of 2 C•min^-1. As a result, bacterial preparation is obtained in tableted form at minimum deviation in concentration of alive microbes in vials of the same series, decreased microbial lethality at drying and increased storage terms of preparation has been achieved. EFFECT: higher efficiency. 2 ex, 2 tbl

Description

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам получения бактерийных препаратов, на основе лактобактерий, и может быть использовано при приготовлении лечебно-профилактических бактерийных препаратов, предназначенных для использования в медицинской практике и ветеринарии. The invention relates to the microbiological industry, and in particular to methods for producing bacterial preparations based on lactobacilli, and can be used in the preparation of therapeutic and prophylactic bacterial preparations intended for use in medical practice and veterinary medicine.

Известен способ получения препарата "Лактобактерин сухой" (ФС 42252ВС-89). Способ заключается в следующем. Посевной материал лактобацилл вносят в пробирки с 10,0 см³ среды МРС-1 и подращивают в течение 48 ч при температуре (37. . .39)^oС. Полученные таким образом бульонные культуры засевают в бутыли вместимостью 5,0 дм³ со стерильной жидкой питательной средой МРС-1 из расчета (0,3. ..0,5) млрд. живых клеток в 1 см³ среды и культивируют в течение 48 ч при температуре (37...39)^oС. Приготовленные культуры смешивают с сахарозо-желатиновой средой высушивания в соотношении 1:1, замораживают со скоростью 0,005^oС•мин^-1, а затем сублимируют в течение 110 ч при температуре 37^oС. В 1 см³ регидратированного препарата содержится 0,86 млрд. молочнокислых бактерий. При хранении в течение 1 года сохраняется до 75% жизнеспособных микробов.A known method of obtaining the drug "Lactobacterin dry" (FS 42252BC-89). The method is as follows. The seed material of lactobacilli is introduced into test tubes with 10.0 cm ³ of MPC-1 medium and grown for 48 hours at a temperature of (37. .39) ^o C. The broth cultures thus obtained are inoculated in 5.0 dm ³ bottles with sterile liquid nutrient medium MPC-1 at the rate of (0.3. .. 0.5) billion living cells in 1 cm ^{3 of} medium and cultured for 48 hours at a temperature of (37 ... 39) ^o C. The prepared cultures are mixed with a sucrose-gelatin drying medium in a ratio of 1: 1, frozen at a rate of 0.005 ^o C • min ^-1 , and then sublimated for 110 hours at a temperature of 37 ^o C. 1 cm ^{3 of the} rehydrated preparation contains 0.86 billion lactic acid bacteria. When stored for 1 year, up to 75% of viable microbes are retained.

К недостаткам этого способа следует отнести невозможность получения данным способом высокой концентрации лактобацилл в биопрепарате, а также гибель не менее 25% микроорганизмов при хранении биопрепарата в течение 1 года. Указанные недостатки объясняются тем, что, во-первых, на этапе культивирования не удается достичь высокого выхода биомассы, во-вторых, при замораживании с очень низкой скоростью (0,005^oС•мин^-1) внутриклеточная вода не замерзает, увеличивается концентрация солевых растворов, что приводит к повреждению клеточных структур, и, в-третьих, длительное время высушивания (110 ч) замедляет процессы перехода бактерий в анабиотическое состояние, увеличивая тем самым долю мертвых клеток в готовом продукте.The disadvantages of this method include the impossibility of obtaining this method a high concentration of lactobacilli in a biological product, as well as the death of at least 25% of microorganisms during storage of the biological product for 1 year. These disadvantages are explained by the fact that, firstly, at the cultivation stage, it is not possible to achieve a high yield of biomass, and secondly, when freezing at a very low speed (0.005 ^o C • min ^-1 ), intracellular water does not freeze, the concentration of saline solutions increases, which leads to damage to cell structures, and, thirdly, a long drying time (110 h) slows down the transition of bacteria into an anabiotic state, thereby increasing the proportion of dead cells in the finished product.

Наиболее близким к заявляемому является способ получения сухого препарата на основе живых лактобацилл для лечения и профилактики воспалительных заболеваний у крупного рогатого скота - (патент RU 2072655 V, от 27.01.1997). Способ заключается в следующем: музейные культуры лактобацилл, хранящиеся в лиофилизированном состоянии, засевают в пробирки с жидкой питательной средой МРС-1 и выращивают в течение 48 ч при температуре (37... 39)^oС. Лактобациллы из пробирок пересевают в матрацы со скошенной агаризованной питательной среды МРС-4. Через 48 ч полученный микробный газон смывают средой МРС-1 и используют для засева бутылей вместимостью 5,0 дм³. Лактобациллы вносят в бутыли из расчета (0,7...1,0) млрд. живых клеток в 1 см³ среды и культивируют при температуре (37...39)^oС. К выращенным культурам стерильно добавляют пептон до конечной концентрации 5%(вес/объем) и разливают в пенициллиновые флаконы по 2,0 см³. Флаконы помещают в сублимационную камеру. Замораживание ведут со скоростью 1^oС•мин^-1 до минус (40...42)^oС и выдерживают при этой температуре (75...85) мин. Затем создают разрежение 0,7...1,3 мм рт.ст. Подводят тепло и подогревают культуру со скоростью (2... 4)^oС•мин^-1 до (24...25)^oС. Досушивание ведут в течение (7...10) ч. По окончании процесса флаконы закрывают резиновыми пробками и герметизируют алюминиевыми колпачками. В 1 см³ целевого продукта после регидратации содержится не менее 5,0 млрд. живых клеток.Closest to the claimed is a method of obtaining a dry preparation based on live lactobacilli for the treatment and prevention of inflammatory diseases in cattle - (patent RU 2072655 V, from 01.27.1997). The method consists in the following: museum cultures of lactobacilli, stored in a lyophilized state, seeded in test tubes with liquid nutrient medium MPC-1 and grown for 48 hours at a temperature of (37 ... 39) ^o C. Lactobacilli are transferred from tubes to mattresses with beveled agarized nutrient medium MPC-4. After 48 hours, the resulting microbial lawn is washed off with MPC-1 medium and used for inoculation with 5.0 dm ³ bottles. Lactobacilli are introduced into bottles at the rate of (0.7 ... 1.0) billion living cells in 1 cm ^{3 of} medium and cultured at a temperature of (37 ... 39) ^o С. Peptone is added sterilely to the grown cultures to a final concentration of 5 % (weight / volume) and poured into penicillin vials of 2.0 cm ³ . Vials are placed in a sublimation chamber. Freezing is carried out at a speed of 1 ^o C • min ^-1 to minus (40 ... 42) ^o C and maintained at this temperature (75 ... 85) min. Then create a vacuum of 0.7 ... 1.3 mm Hg Heat is brought in and the culture is heated at a rate of (2 ... 4) ^o С • min ^-1 to (24 ... 25) ^o С. Drainage is carried out for (7 ... 10) hours. At the end of the process, the vials are closed with rubber corks and sealed with aluminum caps. In 1 cm ^{3 of the} target product after rehydration contains at least 5.0 billion living cells.

К недостаткам способа-прототипа следует отнести: 1) вариабельность концентрации живых микробов во флаконах одной серии препарата (50...60)%; 2) высокую гибель микробов при высушивании биопрепарата и при хранении в течение (1. ..2) лет. Указанные недостатки объясняются тем, что: 1) розлив во флаконы осуществляется ручным встряхиванием бутыли с полуфабрикатом, при этом его гомогенизации не происходит, что приводит к большому расхождению значений содержания живых микробов во флаконах одной серии, а также к нестандартности внешнего вида готового препарата; 2) применяемая защитная среда содержит большое количество гетерогенного белка - пептона (5% вес/объем), обладающего высокой гидрофильностью, и не имеет в своем составе веществ, снижающих ее, что приводит к повреждению клеточных структур при замораживании, увеличивая долю мертвых клеток в готовом препарате, а также к вспениванию во время сублимации. The disadvantages of the prototype method include: 1) the concentration variability of living microbes in bottles of one series of the drug (50 ... 60)%; 2) the high death of microbes during drying of the biological product and during storage for (1. ..2) years. These shortcomings are explained by the fact that: 1) filling into bottles is carried out by manually shaking the bottle with the semi-finished product, while its homogenization does not occur, which leads to a large discrepancy in the content of live microbes in the bottles of one series, as well as to the non-standard appearance of the finished product; 2) the applied protective medium contains a large amount of a heterogeneous protein - peptone (5% weight / volume), which has high hydrophilicity, and does not contain substances that reduce it, which leads to damage to cell structures during freezing, increasing the proportion of dead cells in the finished the drug, as well as foaming during sublimation.

Задачей изобретения является получение бактерийного препарата в форме таблетки с минимальным расхождением в концентрации живых микробов во флаконах одной серии, снижение гибели микробов при высушивании и увеличение срока хранения препарата. The objective of the invention is to obtain a bacterial preparation in the form of tablets with a minimum discrepancy in the concentration of living microbes in vials of the same series, reducing the death of microbes upon drying and increasing the shelf life of the drug.

Поставленная задача решается благодаря тому, что в заявляемый способ получения бактерийного препарата на основе лактобацилл, предусматривающий получение биомассы клеток глубинным культивированием в жидкой питательной среде, ее замораживание и сублимационное обезвоживание, внесены следующие отличия:
1. Перед замораживанием к биомассе лактобацилл добавляют полиглюкин до конечной концентрации 1,5% (вес/объем).The problem is solved due to the fact that in the inventive method for producing a bacterial preparation based on lactobacilli, which involves obtaining cell biomass by deep cultivation in a liquid nutrient medium, its freezing and freeze-drying, the following differences are made:
1. Before freezing, polyglucin is added to the lactobacilli biomass to a final concentration of 1.5% (weight / volume).

2. Розлив микробной суспензии во флаконы осуществляют при постоянной работе перемешивающего устройства аппарата (скорость вращения мешалки - (0,3...0,5) об•(об•мин^-1).2. Bottling of the microbial suspension in vials is carried out with continuous operation of the mixing device of the apparatus (stirrer rotation speed - (0.3 ... 0.5) r • (r • min ^-1 ).

3. Замораживание осуществляют со скоростью 2^oС•мин^-1.3. Freezing is carried out at a rate of 2 ^o C • min ^-1 .

Сущность предложенного способа заключается в следующем. Музейные культуры штаммов лактобацилл, хранящиеся в лиофилизированном состоянии, засевают в пробирки с жидкой питательной средой МРС-1 и раздельно выращивают в течение 48 ч при температуре (37. ..39)^oС. Лактобациллы из пробирок пересевают в матрацы со скошенной агаризованной МРС-4. Через 48 ч полученный микробный газон смывают средой МРС-1 и используют для засева бутылей вместимостью 5,0 дм³. Лактобациллы вносят в бутыли из расчета (0,7...1,0) млрд. живых клеток в 1 см³ среды и культивируют при температуре (37...39)^oС. Раздельно выращенные культуры двух штаммов лактобацилл объединяют в емкости с перемешивающим устройством, стерильно добавляют полиглюкин до конечной концентрации 1,5%(вес/объем) и разливают по 2,0 см³ в пенициллиновые флаконы при постоянной работе мешалки со скоростью (0,3...0,5) об•(об•мин^-1). Флаконы помещают в сублимационную камеру. Замораживание ведут со скоростью 2^oС•мин^-1 до температуры минус (30...35)^oС и выдерживают при этой температуре (75...85) мин. Затем при помощи вакуумного насоса создают разрежение в камере (0,7...1,3) мм рт.ст. Подводят тепло и подогревают культуру со скоростью (2...4)^oС•мин^-1 до 28^oС. Досушивание ведут в течение (7...10) ч. По окончании процесса флаконы закрывают резиновыми пробками и герметизируют алюминиевыми колпачками. В 1 см³ целевого продукта после регидратации содержится не менее 5 млрд. живых лактобацилл.The essence of the proposed method is as follows. Museum cultures of lactobacilli strains stored in a lyophilized state are inoculated into test tubes with MPC-1 liquid nutrient medium and separately grown for 48 h at a temperature of (37. ..39) ^o C. Lactobacilli are transferred from test tubes to mattresses with beveled agarized MPC- 4. After 48 hours, the resulting microbial lawn is washed off with MPC-1 medium and used for inoculation with 5.0 dm ³ bottles. Lactobacilli are introduced into bottles at the rate of (0.7 ... 1.0) billion living cells in 1 cm ^{3 of} medium and cultured at a temperature of (37 ... 39) ^o С. Separately grown cultures of two strains of lactobacilli are combined in containers with with a stirring device, polyglucin is sterile added to a final concentration of 1.5% (weight / volume) and poured into 2.0 cm ³ into penicillin vials with continuous operation of the stirrer at a speed of (0.3 ... 0.5) rev • (rev • min ^-1 ). Vials are placed in a sublimation chamber. Freezing is carried out at a speed of 2 ^o C • min ^-1 to a temperature of minus (30 ... 35) ^o C and maintained at this temperature (75 ... 85) min. Then, using a vacuum pump, a vacuum is created in the chamber (0.7 ... 1.3) mm Hg. Heat is brought in and the culture is heated at a rate of (2 ... 4) ^o C • min ^-1 to 28 ^o C. Draining is carried out for (7 ... 10) hours. At the end of the process, the bottles are closed with rubber stoppers and sealed with aluminum caps. 1 cm ^{3 of the} target product after rehydration contains at least 5 billion live lactobacilli.

Наличие причинно-следственной связи между совокупностью признаков заявляемого объекта и достигаемым техническим результатом показано в таблице 1. The presence of a causal relationship between the totality of the features of the claimed object and the achieved technical result is shown in table 1.

Изобретение позволяет получать бактерийный препарат с концентрацией не менее 5,0 млрд. жизнеспособных лактобацилл в 1 см³. Обеспечивает сохранение структуры микробных клеток, тем самым повышая долю живых микробов при хранении препарата в течение 1 года или увеличивая срок хранения препарата до 2 лет.The invention allows to obtain a bacterial preparation with a concentration of not less than 5.0 billion viable lactobacilli in 1 cm ³ . Provides preservation of the structure of microbial cells, thereby increasing the proportion of living microbes during storage of the drug for 1 year or increasing the shelf life of the drug up to 2 years.

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами. The possibility of carrying out the claimed invention is shown by the following examples.

Пример 1. Доказательство эффективности среды высушивания и режима замораживания
Для проведения исследования использовали нативные культуры штаммов лактобацилл, выращенные в бутылях емкостью 5,0 дм³. Сублимационное обезвоживание проводили по условиям прототипа и объекта. В высушенных препаратах после регидратации определяли количество живых клеток, для этого по одной и той же методике отбирали одинаковые по массе пробы, после регидратации которых проводили определение количества живых клеток методом последовательных разведении. Выживаемость рассчитывали из отношения концентраций жизнеспособных клеток до и после сублимационного обезвоживания. Выживаемость лактобацилл в препарате при хранении рассчитывали из отношения концентрации жизнеспособных клеток сразу после высушивания и через 1, 2 года хранения при температуре минус (18...22)^oС. Полученные результаты, представленные в таблице 2, показывают, что выживаемость лактобацилл при высушивании с использованием защитной среды и режимов сублимации по заявляемому способу достоверно превышают показатели прототипа в 1,3 раза, а выживаемость лактобацилл в препарате при хранении в течение 1 года и 2 лет - в 1,25 и в 1,5 раза соответственно.Example 1. Proof of the effectiveness of the drying environment and the freezing mode
For the study used native cultures of strains of lactobacilli grown in large bottles with a capacity of 5.0 DM ³ . Sublimation dehydration was performed according to the conditions of the prototype and the object. In rehydrated preparations, after rehydration, the number of living cells was determined; for this, the same mass samples were taken by the same method, after rehydration of which the number of living cells was determined by successive dilution. Survival was calculated from the ratio of the concentration of viable cells before and after sublimation dehydration. The survival of lactobacilli in the preparation during storage was calculated from the ratio of the concentration of viable cells immediately after drying and after 1, 2 years of storage at a temperature of minus (18 ... 22) ^o С. The results obtained, presented in table 2, show that the survival of lactobacilli upon drying using a protective environment and sublimation modes according to the claimed method significantly exceed the prototype indicators by 1.3 times, and the survival rate of lactobacilli in the preparation during storage for 1 year and 2 years - 1.25 and 1.5 times, respectively.

Пример 2. Доказательство эффективности условий розлива полуфабриката. Example 2. Proof of the effectiveness of the bottling conditions of the semi-finished product.

Для проведения исследования использовали нативные культуры штаммов лактобацилл, выращенные в бутылях емкостью 5,0 дм³. Розлив полуфабриката во флаконы осуществляли по условиям прототипа и объекта. Препарат высушивали. У высушенных препаратов оценивали внешний вид и после регидратации определяли в них количество живых клеток, для этого по одной и той же методике отбирали одинаковые по объему пробы, после регидратации которых проводили определение количества живых клеток методом последовательных разведении. Полученные результаты, представленные в таблице 3, показывают, что при соблюдении условий розлива по заявляемому способу препарат во флаконах стабильно имеет вид таблетки серовато-белого цвета с желтоватым оттенком, с расхождением в концентрации живых клеток не более 10,0%, при аналогичных характеристиках препарата по прототипу: внешний вид - неоформленная масса темно-коричневого цвета, расхождение в концентрации живых клеток - (50...60)%.For the study used native cultures of strains of lactobacilli grown in large bottles with a capacity of 5.0 DM ³ . The bottling of the semi-finished product in bottles was carried out according to the conditions of the prototype and the object. The drug was dried. The appearance of the dried preparations was evaluated and, after rehydration, the number of living cells was determined in them; for this, the same samples were taken using the same method, after rehydration, the number of living cells was determined by successive dilution. The results obtained, presented in table 3, show that, subject to the filling conditions of the present method, the preparation in the bottles stably looks like a tablet of a grayish-white color with a yellowish tint, with a difference in the concentration of living cells of not more than 10.0%, with similar characteristics of the drug according to the prototype: appearance - an unformed mass of dark brown color, the difference in the concentration of living cells - (50 ... 60)%.

Claims

A method of obtaining a dry preparation based on live lactobacilli for the treatment and prevention of dysbacterioses of various etiologies in humans and animals, comprising separately growing two strains of lactobacilli in dense and liquid nutrient media, mixing the cultures in a ratio of 1: 1 and drying them, characterized in that Polyglucin is used as a cryoprotectant in a final concentration of 1.5%, the microbial suspension is poured into bottles from the apparatus with the continuous operation of its mixing device, freezing is carried out is set at a rate of 2 ° C · min ^-1 .