RU2223106C2

RU2223106C2 - Method for obtaining biologically active product by applying raw material of antlers-type reindeer breeding

Info

Publication number: RU2223106C2
Application number: RU2002111064/15A
Authority: RU
Inventors: В.Г. Луницын
Original assignee: Всероссийский научно-исследовательский институт пантового оленеводства
Priority date: 2002-04-24
Filing date: 2002-04-24
Publication date: 2004-02-10

Abstract

FIELD: antlers-type reindeer breeding. SUBSTANCE: the present innovation deals with processing reindeer production, in particular, with the method for obtaining biologically active extract out of conserved tails of antlers-type reindeers. The method includes reducing raw material, its extraction with ethanol and acidification of an extract with acetic acid, moreover, as raw material one should apply conserved tails, and reduction should be carried out up to particles of 150-400 mc, extraction is performed at room temperature with ethanol, at first, for 72 h at ratio of alcohol : raw material to be 6 : 1, then with 60%-alcohol for 48 h at ratio of alcohol : raw material to be 4 : 1, and then with 50%-alcohol for 24 h at the ratio of alcohol : raw material to be 2 : 1 followed by combining extracts, acidification with acetic acid up to pH being 4.7, freezing at -15-20 C and filtering target product. The method provides rational application of by-product of antlers-type reindeer breeding and intensifies the process. EFFECT: higher efficiency. 5 tbl

Description

Изобретение относится к переработке оленеводческой продукции, в частности к способу получения биологически активного экстракта из консервированных хвостов пантовых оленей. The invention relates to the processing of reindeer herding products, in particular to a method for producing a biologically active extract from canned antler tails.

Известен способ получения биологически активного вещества (велкорнина) путем многократного экстрагирования измельченных пантов подкисленным этиловым спиртом при температуре его кипения (см. патент РФ 2008906, МКИ А 61 К 35/32). A known method of producing a biologically active substance (velcornin) by repeatedly extracting crushed antlers with acidified ethyl alcohol at its boiling point (see RF patent 2008906, MKI A 61 K 35/32).

Однако высокая концентрация этилового спирта и температура (70-75^oС) способствуют денатурированию большой части белков, а в том числе и белковой части гормонов и ферментов, снижая биологическую активность экстракта.However, a high concentration of ethyl alcohol and a temperature (70-75 ^o C) contribute to the denaturation of most of the proteins, including the protein part of hormones and enzymes, reducing the biological activity of the extract.

Известен способ получения биологически активного препарата (рантарина), включающий экстракцию пантов северного оленя 40%-ным раствором этилового спирта. Недостатком данного способа является то, что низкое содержание этилового спирта не обеспечивает полной экстракции липидной фракции (а.с. 355830; А 61 К 17/00). A known method of obtaining a biologically active drug (Rantarin), including the extraction of antlers of the reindeer with a 40% solution of ethyl alcohol. The disadvantage of this method is that the low content of ethyl alcohol does not provide complete extraction of the lipid fraction (as.with. 355830; A 61 K 17/00).

Известен способ получения биологически активного вещества (пантокрина) путем измельчения (до величины частиц 0,5-2 мм) и экстракции пантов (марала, изюбра, оленя пятнистого) после удаления кожного покрова 50%-ной уксусной кислотой в течение 6 суток (см. В.Н.Иванов, М.П.Сошнянина, Панты и пантокрин, Чита, 1991 - прототип). A known method of producing a biologically active substance (pantocrine) by grinding (to a particle size of 0.5-2 mm) and extraction of antlers (deer, red deer, sika deer) after removing the skin with 50% acetic acid for 6 days (see V.N.Ivanov, M.P.Soshnyanina, Panta and pantocrine, Chita, 1991 - prototype).

Однако, как следует из многочисленных исследований (см. кн. Пантовое оленеводство, В. Н. Егерь, Н.Г.Деев, М.: Колос, 1994, с.34, кн. Пантокрин, Сборник научных трудов, Горно-Алтайск, 1969, с.27), из панта при его экстракции подкисленным спиртом в раствор переходит лишь 3% его массы. Таким образом, известные методы экстрагирования пантов не обеспечивают полного выделения ценных веществ. However, as follows from numerous studies (see Prince Antler reindeer husbandry, V.N. Huntsman, N.G. Deev, Moscow: Kolos, 1994, p. 34, Prince Pantokrin, Collection of scientific works, Gorno-Altaysk, 1969, p.27), from the antler when it is extracted with acidified alcohol, only 3% of its mass passes into the solution. Thus, the known methods for the extraction of antlers do not provide a complete selection of valuable substances.

Хвосты пантовых оленей как ценный продукт пантового оленеводства характеризуется наличием в хвостовой железе биологически активных веществ. Antler deer tails as a valuable product of antler deer breeding is characterized by the presence of biologically active substances in the tail gland.

Необходима разработка способа получения биологически активного вещества, позволяющего рационально использовать побочный продукт пантового оленеводства (хвосты) и интенсифицировать процесс. It is necessary to develop a method for producing a biologically active substance, which makes it possible to rationally use a by-product of antler reindeer husbandry (tails) and to intensify the process.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения биологически активного вещества из сырья пантового оленеводства, включающем измельчение сырья, его экстракцию этиловым спиртом и подкисление экстракта уксусной кислотой в качестве сырья используют консервированные хвосты, а измельчение проводят до частиц 150-400 мкм, при этом хвосты экстрагируют вначале 70%-ным этиловым спиртом в течение 72 часов при соотношении спирт: сырье 6:1, далее экстракт сливают, а оставшуюся массу заливают 60%-ным спиртом на 48 часов при соотношении спирт:сырье 4:1, на третьем этапе оставшуюся после удаления экстракта массу заливают 50% этиловым спиртом в соотношении спирт: сырье 2:1 и экстрагируют 24 часа. После чего экстракты со всех трех этапов объединяют и подкисляют уксусной кислотой до рН 4,7, вымораживают при температуре минус 15-20^oС и фильтруют.The specified technical result is achieved by the fact that in the method of producing a biologically active substance from antler reindeer husbandry raw materials, including grinding the raw material, extracting it with ethyl alcohol and acidifying the extract with acetic acid, canned tails are used as the raw material, and grinding is carried out to particles of 150-400 microns, while the tails are first extracted with 70% ethyl alcohol for 72 hours at a ratio of alcohol: raw materials of 6: 1, then the extract is drained, and the remaining mass is poured with 60% alcohol for 48 hours at a ratio alcohol: Raw 4: 1, in the third stage the extract remaining after removal of the mass is poured 50% ethyl alcohol in a ratio of alcohol: raw material 2: 1 and extracted 24 hours. Then the extracts from all three stages are combined and acidified with acetic acid to a pH of 4.7, frozen at a temperature of minus 15-20 ^o C and filtered.

Сущность способа заключается в том, что хвостовые железы по своей структуре представляют зернистую, нежную массу, поэтому воздействие этиловым спиртом высокой концентрации, а тем более при высоких температурах, отрицательно сказывается на эффективности конечного продукта. В то же время низкая концентрация этилового спирта при экстрагировании также не обеспечивает высокого качества даже при длительном воздействии. The essence of the method lies in the fact that the tail glands in their structure represent a granular, delicate mass, therefore exposure to high concentration of ethanol, and even more so at high temperatures, negatively affects the efficiency of the final product. At the same time, the low concentration of ethyl alcohol during extraction also does not provide high quality even with prolonged exposure.

Было исследовано влияние факторов концентрации этилового спирта, время экстракции и соотношение компонентов. Так, при экстракции 90%-ным, 80%-ным, 70%-ным, 60%-ным спиртом сначала в течение 24 (все четыре концентрации), далее 48, 72, 96 часов (также все четыре концентрации этилового спирта на каждую длительность) наиболее оптимальным по показателю отсутствия денатурированных белков и эффективности конечного продукта оказался режим экстракции 70%-ным этиловым спиртом в течение 72 часов. Опыт проводился при соотношении спирт: сырье 3:1. Исследования по выявлению оптимального соотношения при экстракции 70%-ным спиртом в течение 72 часов показало, что оптимальным соотношением компонентов пои данном режиме является 6:1. Опираясь на то, что сырье (жом) после первого этапа экстракции стало наиболее подготовленным, а точнее более уязвимым, в последующем эксперименте были испытаны по той же схеме более низкие концентрации этилового спирта, а именно 70, 60, 50%-ные при 24, 43, 72 часах длительности (при каждой концентрации). Опыты проводились при соотношении спирт:сырье 4:1. Оптимальным оказался режим экстракции 60%-ным спиртом в течении 48 часов. При выявлении оптимального соотношения компонентов спирт: сырье в режиме экстракции 60%-ным спиртом в течение 48 часов исследовались 2: 1, 3:1, 4:1, 5:1. Оптимальным оказалось соотношение спирт:сырье 4:1. Третий этап экстракции, обоснованный по той же схеме - снижение концентрации спирта при снижении времени экстракции и соотношения спирт: сырье, характеризовался следующим режимом: экстракция 50%-ным спиртом в течение 24 часов при соотношении спирт:сырье 2:1. Подкисление объединенного со всех трех этапов экстракта до рН 4,7 обеспечило в дальнейшем выпадение длинноциклических белковых молекул в осадок при вымораживании. Граничные значения температур, при которых проводилось вымораживание (-15 - -20^oС), обусловлены тем, что при температурах выше -15^oС процесс выпадения белков более длительный, а ниже -20^oС происходит кристаллизация связанной воды, что в дальнейшем снижает активность препарата. Измельчение хвостов до частиц свыше 400 мкм резко снижало качество готового экстракта, которое стабилизировалось при экстрагировании сырья с величиной частиц 150-170 мкм. Поэтому за оптимальный принят размол сырья до частиц 150-400 мкм.The effects of ethanol concentration factors, extraction times and component ratios were investigated. So, during extraction with 90%, 80%, 70%, 60% alcohol, first within 24 (all four concentrations), then 48, 72, 96 hours (also all four concentrations of ethyl alcohol for each duration) the most optimal in terms of the absence of denatured proteins and the effectiveness of the final product was the extraction mode with 70% ethyl alcohol for 72 hours. The experiment was carried out with a ratio of alcohol: raw materials of 3: 1. Studies to identify the optimal ratio during extraction with 70% alcohol for 72 hours showed that the optimal ratio of components in this mode is 6: 1. Based on the fact that the raw material (pulp) after the first extraction stage became the most prepared, or rather more vulnerable, in a subsequent experiment, lower concentrations of ethyl alcohol were tested in the same way, namely 70, 60, 50% at 24, 43, 72 hours of duration (at each concentration). The experiments were carried out with a ratio of alcohol: raw materials of 4: 1. The optimal regime was extraction with 60% alcohol for 48 hours. When identifying the optimal ratio of the components of alcohol: raw materials in the extraction mode of 60% alcohol for 48 hours, 2: 1, 3: 1, 4: 1, 5: 1 were investigated. The optimal ratio was alcohol: raw materials 4: 1. The third stage of extraction, justified by the same scheme - reducing the alcohol concentration while reducing the extraction time and the alcohol: feed ratio, was characterized by the following regime: extraction with 50% alcohol for 24 hours at a 2: 1 ratio of alcohol: feed. The acidification of the extract combined from all three stages to a pH of 4.7 ensured the further precipitation of long-cyclic protein molecules into a precipitate upon freezing. The boundary values of temperatures at which freezing was carried out (-15 - -20 ^o С) are due to the fact that at temperatures above -15 ^o С the process of protein precipitation is longer, and below -20 ^o С crystallization of bound water occurs, which further reduces drug activity. Grinding the tails to particles above 400 microns sharply reduced the quality of the finished extract, which stabilized during extraction of raw materials with a particle size of 150-170 microns. Therefore, the optimal adopted grinding of raw materials to particles of 150-400 microns.

Пример. Хвосты после консервирования измельчают первоначально в костедробилке, затем в криогенной шаровой мельнице конструкции ИТК "ФТИНТ", с использованием которой в процессе размола не происходит нагревание продукта, что также способствует сохранению биологически активных веществ. Хвосты размалывали в порошок до частиц 150-400 мкм (150 мкм - 60%, 400 мкм - 12%, от 150 до 400 мкм - остальное). Величина таких частиц способствовала созданию большей поверхности взаимодействия продукта с экстрагирующим веществом (водным раствором этилового спирта), а следовательно, полному и более быстрому их извлечению. Экстрагирование проводили по следующей схеме: на первом этапе измельченное сырье заливали 70%-ным водным раствором этилового спирта в соотношении спирт: сырье 6:1 и настаивали в течение 72 часов. На втором этапе экстракт сливали, а оставшуюся массу (жом) повторно заливали 60%-ным водным раствором этилового спирта в соотношении спирт:сырье 4:1 и настаивали в течение 48 часов. На третьем этапе после слива экстракта оставшуюся массу заливали третий раз 50%-ным водным раствором этилового спирта при соотношении спирт:сырье 2:1 и настаивали в течение 24 часов. Все три экстракта объединяли и подкисляли уксусной кислотой до рН 4,7. Все три этапа экстрагирования проводили при 22^oС, а вымораживание - при -18^oС в течение 3 суток. Биологический состав порошка из хвостовых желез и из пантов марала представлен в таблицах 1, 2.Example. After preservation, the tails are crushed initially in a crusher, then in a cryogenic ball mill of the FTKINT design, using which the product is not heated during the grinding process, which also helps preserve biologically active substances. The tails were ground into powder to particles of 150-400 microns (150 microns - 60%, 400 microns - 12%, from 150 to 400 microns - the rest). The magnitude of these particles contributed to the creation of a larger surface for the interaction of the product with the extracting substance (an aqueous solution of ethyl alcohol), and therefore, their complete and faster extraction. The extraction was carried out according to the following scheme: at the first stage, the crushed raw materials were poured with a 70% aqueous solution of ethyl alcohol in the ratio of alcohol: raw materials 6: 1 and insisted for 72 hours. At the second stage, the extract was poured, and the remaining mass (pulp) was re-filled with a 60% aqueous solution of ethyl alcohol in the ratio of alcohol: raw materials 4: 1 and insisted for 48 hours. In the third stage, after draining the extract, the remaining mass was poured a third time with a 50% aqueous solution of ethyl alcohol at a ratio of alcohol: raw materials of 2: 1 and insisted for 24 hours. All three extracts were combined and acidified with acetic acid to pH 4.7. All three stages of extraction were carried out at 22 ^o C, and freezing at -18 ^o C for 3 days. The biological composition of the powder from the tail glands and deer antlers is presented in tables 1, 2.

Биохимический состав порошка из хвостов и пантов маралов показывает, что значительных отличий практически нет. В хвостовых железах больше жира, меньше фосфолипидов. Содержание общего азота в хвостовой железе 5,6 на 100 г, в пантах 7,9 г. Аминокислотный состав экстракта, приготовленный из хвостовых желез заявленным способом и по прототипу, в сравнении с экстрактом из пантов представлен в таблице 3. The biochemical composition of the powder from the tails and antlers of deer shows that there are practically no significant differences. In the tail glands there is more fat, less phospholipids. The total nitrogen content in the tail gland is 5.6 per 100 g, in antlers 7.9 g. The amino acid composition of the extract prepared from the tail glands by the claimed method and according to the prototype, in comparison with the extract from antlers, is presented in table 3.

В опыте было изучено влияние экстракта по заявленному способу из хвостов пантовых оленей и пантокрина на иммобилизационный стресс. С этой целью было взято четыре группы белых мышей по 10 в каждой с массой тела 19-20 г. Первой группе мышей вводили экстракт из хвостов пантовых оленей в дозе 1,5 мл/кг, второй - соответственно в аналогичной дозе пантокрин, третью и четвертую группы подвергали интактному и стрессированному контролю. Препараты вводили в течение 6 дней. Иммобилизационный стресс вызывали подвешиванием животных за шейную складку на 18 часов. После этого подопытных лабораторных животных снимали и через 15 минут у них изучали ориентировочно-исследовательское поведение в открытом поле. При эмоциональной реакции по Броди (1953) оценивалась реакция со стороны лабораторных животных на 4 вида воздействия - захват в клетке, в которой постоянно живет мышь, захват в руки после помещения животного на плоскую поверхность, реакция на приближение пинцета, реакция на толчок пинцетом. Дополнительно при этих манипуляциях регистрировали дефекацию с мочеиспусканием, писк и мышечное напряжение. Каждая реакция оценивалась по 4-балльной системе, затем их суммировали, давая общую оценку эмоциональной реакции. Подсчитывали количество лейкоцитов в периферической крови. После этого животных подвергли убою, определяли вес надпочечников, селезенки, тимуса с последующим расчетом весовых коэффициентов органов на 20 г массы тела по методу Добрякова (1976), подсчитывали в банках проявления стресса у лабораторных животных. In the experiment, the effect of the extract according to the claimed method from the tails of antler deer and pantocrine on immobilization stress was studied. For this purpose, four groups of white mice were taken, 10 each with a body weight of 19-20 g. The first group of mice was injected with an extract of antler deer tails at a dose of 1.5 ml / kg, the second, respectively, in the same dose of pantocrine, the third and fourth groups were subjected to intact and stressful control. The drugs were administered for 6 days. Immobilization stress was caused by suspension of animals by the cervical fold for 18 hours. After that, the experimental laboratory animals were removed and after 15 minutes they studied the tentative research behavior in the open field. An emotional reaction according to Brody (1953) evaluated the reaction from laboratory animals to 4 types of exposure - capture in the cage in which the mouse constantly lives, capture in the hands after placing the animal on a flat surface, reaction to the approach of the forceps, reaction to the forceps push. Additionally, during these manipulations defecation with urination, squeak and muscle tension were recorded. Each reaction was evaluated using a 4-point system, then they were summarized, giving a general assessment of the emotional reaction. The number of leukocytes in peripheral blood was counted. After this, the animals were slaughtered, the weight of the adrenal glands, spleen, and thymus was determined, followed by the calculation of organ weights per 20 g of body weight according to the Dobryakov method (1976), stress manifestations in laboratory animals were calculated in banks.

Экспериментальная установка "открытое поле" представляла собой камеру размером 60•60•30 см из оргстекла. Камера разделена на 24 квадрата, в каждом из которых имелось отверстие диаметром 3 см. На высоте 1 м располагали лампочку освещения мощностью 100 Вт. Каждую мышь помещали в один из углов камеры, а ориентировочно-поведенческие реакции оценивали в течение 2 минут по следующим показателям: количество пересеченных квадратов, количество заглядываний в отверстия, количество вставаний на задние лапки, количество умываний (груминг), количество дефекаций. Рассчитывали коэффициент г/о, представляющий соотношение горизонтальной активности и заглядывания в отверстия. Результаты исследований приведены в таблицах 4 и 5. Из приведенных данных можно заключить, что экстракт из хвостов пантовых оленей не уступает, а по отдельным показателям даже превосходит препарат пантокрин по антистрессорному действию, нормализуя активно поведенческие и соматические показатели стрессированных лабораторных животных. В другом опыте оценку антистрессовых, адаптогенных свойств препарата из хвостовых желез в сравнении с пантокрином определяли по времени интенсивной мышечной работы по методике плавания путем регистрации спонтанного времени плавания испытуемых животных до полного утопления (до момента гибели). В опыт было взято три группы мышей по 15 животных в каждой весом 18-20 г. Первой группе лабораторных животных вводили экстракт из хвостов пантовых оленей в дозе 1,5 мм/кг, второй - соответственно пантокрин в течение 5 дней до испытания. Группе контрольных животных вводили дисстилированную воду. Полученные результаты показали, что среднее время от начала эксперимента до полной утопляемости в опытных группах было в 4 раза выше, чем в контрольной. Оба лекарственных средства повышают адаптогенные свойства животных, причем экстракт из хвостов пантовых оленей не уступал пантокрину. The experimental setup "open field" was a camera measuring 60 • 60 • 30 cm from plexiglass. The camera is divided into 24 squares, each of which had an opening with a diameter of 3 cm. At a height of 1 m, a 100 W lighting bulb was placed. Each mouse was placed in one of the corners of the chamber, and orientational-behavioral reactions were evaluated for 2 minutes using the following indicators: the number of squares crossed, the number of peeps in the holes, the number of stands on the hind legs, the number of washes (grooming), and the number of bowel movements. The g / v coefficient was calculated, representing the ratio of horizontal activity and peeping into holes. The research results are shown in tables 4 and 5. From the above data, it can be concluded that the extract from the antler tails is not inferior, and in some respects even superior to the pantocrine preparation in antistress effect, normalizing actively behavioral and somatic indicators of stressed laboratory animals. In another experiment, the assessment of the antistress, adaptogenic properties of the preparation from the caudal glands in comparison with pantocrine was determined by the time of intensive muscular work by the swimming technique by recording the spontaneous swimming time of the test animals until they were completely drowned (until death). Three groups of mice were taken in the experiment, 15 animals each weighing 18-20 g. The first group of laboratory animals was injected with antler deer tail extract at a dose of 1.5 mm / kg, the second, respectively, pantocrine for 5 days before the test. The group of control animals was administered distilled water. The results showed that the average time from the start of the experiment to complete drowning in the experimental groups was 4 times higher than in the control. Both drugs increase the adaptogenic properties of animals, and the extract from the tails of antler deer was not inferior to pantocrine.

Для изучения стимулирующего действия препаратов использовали тест, основанный на изменении уровня артериального давления у кроликов в остром опыте (ТУФ 204755). Препарат (экстракт) из хвостовых желез вызывает снижение кровяного давления у всех трех использованных животных на следующие величины 23,8; 28,5; 26,1%. Следовательно, препарат обладает гипотензивным действием. To study the stimulating effect of the drugs, a test was used based on a change in the level of blood pressure in rabbits in an acute experiment (TUV 204755). The preparation (extract) from the caudal glands causes a decrease in blood pressure in all three animals used by the following values of 23.8; 28.5; 26.1%. Therefore, the drug has a hypotensive effect.

Таким образом, использование заявленного способа получения биологически активного вещества из хвостов позволило получить лекарственное средство, близкое по стимулирующему действию с пантокрином, что позволяет расширить арсенал средств, обладающих биологической активностью, и более полно и рационально использовать продукцию пантового оленеводства. Thus, the use of the claimed method for producing a biologically active substance from tails made it possible to obtain a drug similar in stimulating effect to pantocrine, which allows to expand the arsenal of products with biological activity and to more fully and efficiently use antler reindeer husbandry products.

Claims

A method of obtaining a biologically active product from antler reindeer husbandry raw materials, including grinding the raw material, extracting it with ethyl alcohol and acidifying the extract with acetic acid, characterized in that canned tails are used as the raw material, and grinding is carried out to particles of 150-400 μm, the extraction being carried out at room temperature at first with 70% ethyl alcohol for 72 hours with an alcohol: raw material ratio of 6: 1, then with 60% alcohol for 48 hours with an alcohol: raw material ratio of 4: 1, and then with 50% alcohol for 24 h At a ratio of alcohol: raw materials of 2: 1, followed by combining the extracts, acidification to pH 4.7, freezing at a temperature of minus 15-20 ° С and filtering the target product.