RU2213775C1

RU2213775C1 - Cellular culture for substitution therapy

Info

Publication number: RU2213775C1
Application number: RU2002116080A
Authority: RU
Inventors: Н.П. Глинских; А.А. Бахарев; Н.А. Шмелева; И.В. Устьянцев; А.К. Штукатуров; Г.З. Саидгалин
Original assignee: Глинских Нина Поликарповна; Косяков Константин Сергеевич; Малиновский Вячеслав Борисович; Пленкин Владимир Юрьевич; Устьянцев Павел Васильевич; Устьянцев Игорь Васильевич
Priority date: 2002-06-18
Filing date: 2002-06-18
Publication date: 2003-10-10
Also published as: RU2002116080A

Abstract

FIELD: biology, medicine. SUBSTANCE: invention relates to the known strain ЛЭЧ-4(81) of human lung embryo diploid cells that is used for substitution therapy carrying out. Cellular culture is used as suspension or cells on synthetic baking for treatment of burn patients, patients with trauma of locomotor system, in recovery and correction of functions of damaged tissues and organs. The use of the strain ЛЭЧ-4(81) in medicine provides creature of bioprostheses that are good integrated by recipient body. Invention can be used in substitution, recovery, correcting of function of damaged tissues by implantation or transplantation of health tissues or organs cultured in vitro that are able to retain physiological functions under corresponding conditions of culturing. EFFECT: valuable medicinal properties of culture, reduced cost.

Description

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано при замещении, восстановлении, корректировке функций поврежденных тканей путем имплантации или трансплантации выращенных in vitro клеток из здоровых тканей или органов. Такие клетки способны сохранять при соответствующих условиях культивирования свои физиологические функции. Умение культивировать клетки in vitro в достаточном количестве дает возможность использовать их в клинической практике. The invention relates to biology and medicine and can be used in the replacement, restoration, adjustment of the functions of damaged tissues by implantation or transplantation of cells grown in vitro from healthy tissues or organs. Such cells are able to maintain their physiological functions under appropriate culturing conditions. The ability to cultivate cells in vitro in sufficient quantities makes it possible to use them in clinical practice.

Известно, что только несколько типов клеток нормальных тканей успешно размножаются in vitro; в основном это клетки, происходящие из соединительных тканей. К их числу относятся фибробласты, миобласты, клетки эндотелия, выстилающие камеры сердца, лимфатические и кровеносные сосуды, а также мезотелиальные клетки, выстилающие брюшную и плевральную полости. It is known that only a few types of normal tissue cells multiply successfully in vitro; these are mainly cells originating from connective tissues. These include fibroblasts, myoblasts, endothelial cells lining the chambers of the heart, lymphatic and blood vessels, as well as mesothelial cells lining the abdominal and pleural cavities.

Известно, что культивированные трансплантаты используются в различных случаях:
для лечения обширных ожогов III степени;
для регенерации эпидермиса;
для регенерации ротового эпителия;
для коррекции врожденных дефектов пениса;
для создания эпителиальной выстилки полости яичек сосцевидного отростка;
для лечения хронических кожных язв;
для репарации мочевого тракта;
для лечения диабета;
для восстановления функций печени;
для лечения мышечных заболеваний и др. (ж. "Инновации", 2000, 1-2, с. 94-96).It is known that cultured grafts are used in various cases:
for the treatment of extensive burns of the III degree;
for the regeneration of the epidermis;
for the regeneration of the oral epithelium;
for the correction of congenital defects of the penis;
to create the epithelial lining of the cavity of the testicular mastoid cavity;
for the treatment of chronic skin ulcers;
for urinary tract repair;
for the treatment of diabetes;
to restore liver function;
for the treatment of muscle diseases, etc. (J. "Innovation", 2000, 1-2, pp. 94-96).

Известны биосовместимые синтетические внеклеточные матрицы для тканевой инженерии (РЖ Медицина, реф. 5913, МПК F 23 G 5/00, 1999, 10). Тканевая инженерия может заменить пересадку органов и тканей, которых нет в достаточном для всех нуждающихся количестве. Трансплантация клеток с использованием биодеградируемых синтетических внеклеточных матриксов создает возможность формирования полностью натуральных новых тканей и таким образом замещает потерю или недостаток функций органов и тканей. Синтетические внеклеточные матриксы служат в качестве "лесов" для организации новой ткани. Biocompatible synthetic extracellular matrices for tissue engineering are known (RZh Medicine, ref. 5913, IPC F 23 G 5/00, 1999, 10). Tissue engineering can replace organ and tissue transplants, which are not enough for everyone in need. Cell transplantation using biodegradable synthetic extracellular matrices creates the possibility of the formation of completely natural new tissues and thus replaces the loss or lack of functions of organs and tissues. Synthetic extracellular matrices serve as scaffolds for organizing new tissue.

Известен способ регенерации тканей зубов и ротовой полости (пат. США 5585829, С 12 N 5/00; С 12 N 5/02) путем культивирования ex vivo живых клеток на матриксе для использования в медицине для тестирования in vitro токсичности и биосовместимости материалов. A known method of regenerating tooth tissue and the oral cavity (US Pat. US 5585829, C 12 N 5/00; C 12 N 5/02) by culturing ex vivo living cells on a matrix for use in medicine for testing in vitro toxicity and biocompatibility of materials.

Известен способ культивирования клеток для тканевой терапии, необходимых для восстановления функций поврежденного органа или ткани, клетки для культивирования выделяются из организма пациента или донора. После культивирования имплантату придается необходимая форма, и он пересаживается больному. Для улучшения реваскуляции имплантата используются различные стимуляторы роста пролонгированного действия (РЖ "Биотехнология", реф. 00.01-ОЧР1.353, 2000, 1) - (ПРОТОТИП). A known method of culturing cells for tissue therapy, necessary to restore the functions of a damaged organ or tissue, the cells for cultivation are isolated from the patient or donor. After cultivation, the implant is given the necessary shape, and it is transplanted to the patient. To improve the implant revascularization, various sustained-growth growth stimulants are used (RJ Biotechnology, ref. 00.01-OCHR1.353, 2000, 1) - (PROTOTYPE).

Недостатками известных технических решений являются:
недостаточная интеграция живых клеток в организме реципиента;
большие сроки культивирования;
использование дорогостоящих материалов: среды роста, стимуляторов и т.п.The disadvantages of the known technical solutions are:
insufficient integration of living cells in the recipient's body;
long cultivation periods;
the use of expensive materials: growth media, stimulants, etc.

Целью изобретения является создание биопротезов, содержащих живые клеточные элементы, которые хорошо интегрируются в организме реципиента; сокращение сроков культивирования, расширение номенклатуры исходных материалов для создания биопротезов для терапевтического лечения при помощи трансплантатов дефектов кожи, хряща, кровеносных сосудов, ткани головного мозга, кишечника, кости, мочевого пузыря, мочеточника, мочеиспускательного канала, печени, сердца и др. The aim of the invention is the creation of bioprostheses containing living cellular elements that integrate well in the recipient's body; shortening the cultivation time, expanding the range of starting materials for the creation of bioprostheses for therapeutic treatment with transplants of defects in the skin, cartilage, blood vessels, brain tissue, intestines, bone, bladder, ureter, urethra, liver, heart, etc.

Для решения поставленной задачи предлагается клеточная культура для заместительной терапии, отличающаяся тем, что в качестве культуры клеток она содержит штамм диплоидных клеток легкого эмбриона человека, например штамм ЛЭЧ-4(81). To solve this problem, a cell culture for replacement therapy is proposed, characterized in that it contains a strain of diploid cells of a human lung embryo as a cell culture, for example, LEC-4 strain (81).

Культура представляет собой морфологически однородную популяцию клеток с ограниченным сроком жизни, определенного тканевого происхождения, сохраняющую стабильный кариотип (2n не менее 75% клеток), свободную от посторонних агентов, онкогенно безопасную, культивируемую на искусственных питательных средах в стандартных бутылках для кровезаменителей. The culture is a morphologically homogeneous population of cells with a limited lifespan, of a certain tissue origin, preserving a stable karyotype (2n of at least 75% of cells), free of foreign agents, oncogenically safe, cultivated on artificial nutrient media in standard blood substitute bottles.

Препарат выпускается в виде монослойной культуры в виде взвеси для немедленного использования и в виде клеток на синтетической подложке типа "Фолидерм", "Биоколл", "Полипор" и т.п. The drug is available as a monolayer culture in the form of a suspension for immediate use and in the form of cells on a synthetic substrate such as Folderm, Biokoll, Polypor, etc.

Монослойная культура имеет вид морфологически однородного слоя клеток, прикрепленных к стеклу и покрытых прозрачной питательной средой красно-оранжевого цвета. A monolayer culture has the appearance of a morphologically homogeneous layer of cells attached to glass and coated with a transparent nutrient medium of red-orange color.

Культуральная взвесь представляет собой мутную жидкость красновато-оранжевого цвета, содержащую 500-600 тыс. клеток в 1 мл. The culture suspension is a reddish-orange turbid liquid containing 500-600 thousand cells in 1 ml.

Препарат в виде клеток на синтетической подложке представляет собой пленочное синтетическое покрытие для ран общей площадью 60-80 см², на поверхности которого выращены клетки с плотностью 80-100 тыс. на 1 см², размещенное в стандартном флаконе для кровезаменителей объемом 250 мл. Покрытие и клетки находятся в прозрачной культуральной среде.The preparation in the form of cells on a synthetic substrate is a film synthetic coating for wounds with a total area of 60-80 cm ² , on the surface of which cells with a density of 80-100 thousand per 1 cm ² are grown, placed in a standard 250 ml blood substitute bottle. The coating and cells are in a transparent culture medium.

Работу с препаратом проводят в стерильных условиях. До вскрытия бутылок с клетками обращают внимание на их целостность и концентрацию ионов в среде (рН). В случае имеющихся трещин или изменения рН среды ниже 7,0 культуру в работу не берут. Work with the drug is carried out under sterile conditions. Before opening the bottles with cells pay attention to their integrity and the concentration of ions in the medium (pH). In the case of cracks or changes in the pH of the medium below 7.0, the culture is not taken into work.

Культура клеток в виде монослоя используется для получения взвеси клеток. Перед работой горло бутылки обжигают спиртовым факелом, вскрывают стерильно у огня и сливают содержащую среду. В бутылку вносят по 10-15 мл 0,02%-ного раствора Версена и 0,25%-ного раствора трипсина (в соотношении 1: 1) и оставляют для контакта с клетками на 2-3 мин. Растворы сливают, а клетки заливают стерильными буферными растворами Эрла, Хенкса или стерильным изотоническим физиологическим раствором в количестве 50 мл, затем встряхивают до образования гомогенной взвеси. A cell culture in the form of a monolayer is used to obtain a suspension of cells. Before work, the throat of the bottle is burned with an alcohol torch, it is opened sterile at a fire and the containing medium is drained. 10-15 ml of a 0.02% Versen solution and 0.25% trypsin solution (1: 1 ratio) are added to the bottle and left to contact with the cells for 2-3 minutes. The solutions are drained, and the cells are poured with sterile Earl, Hanks buffer solutions or sterile isotonic saline in an amount of 50 ml, then shaken until a homogeneous suspension is formed.

Взвесь центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин, супернатант сливают, а осадок разводят указанными буферными растворами до концентрации 40±10 тыс. клеток, после чего наносят на специально подготовленную рану. The suspension is centrifuged for 10 min at 1500 rpm, the supernatant is drained, and the sediment is diluted with the indicated buffer solutions to a concentration of 40 ± 10 thousand cells, after which it is applied to a specially prepared wound.

Из флакона с пленочным покрытием сливают культуральную жидкость, заливают стерильным раствором Эрла или Хенкса (или стерильным изотоническим физиологическим раствором) на 5-10 мин. После обработки пленочное покрытие наносят на подготовленную рану поверхностью с клетками к ране. The culture fluid is drained from the film-coated vial, poured with sterile Earl or Hanks solution (or sterile isotonic saline) for 5-10 minutes. After treatment, a film coating is applied to the prepared wound with a surface with cells to the wound.

Штамм диплоидных клеток легкого эмбриона человека ЛЭЧ-4(81) разработан Екатеринбургским научно-исследовательским институтом вирусных инфекций (А.С. СССР 1147748), он зарегистрирован в качестве оригинального и сохраняется в низкотемпературном банке-музее заявителя. The LEC-4 human lung embryo diploid cell strain (81) was developed by the Yekaterinburg Research Institute of Viral Infections (A.S. USSR 1147748), it is registered as the original and is stored in the applicant’s low-temperature museum bank.

Аллофибробласты выращены в лаборатории клеточных культур ЕНИИВИ. Allofibroblasts were grown in the laboratory of cell cultures of JINIVI.

Использование культивированных фибробластов в заместительной терапии не требует дорогостоящих питательных сред, стимуляторов роста, что снижает их себестоимость более чем в 20 раз; фибробласты легко поддаются пассированию, при котором они частично утрачивают поверхностные антигены гистосовместимости; применение культуры фибробластов открывает возможность использования для изготовления трансплантатов аллоклеток и создания клеточных банков; сокращаются сроки получения трансплантатов, готовых к использованию в клинике, с 3 недель до 2-3 суток. The use of cultured fibroblasts in replacement therapy does not require expensive nutrient media, growth stimulants, which reduces their cost by more than 20 times; fibroblasts can be easily passivated, in which they partially lose surface histocompatibility antigens; the use of a fibroblast culture opens up the possibility of using allocells and the creation of cell banks for the manufacture of transplants the time for receiving transplants ready for use in the clinic is reduced from 3 weeks to 2-3 days.

Клеточные культуры могут использоваться в системе лечения ожоговых больных, а также больных с травмами опорно-двигательного аппарата, при восстановлении и коррекции функций поврежденных тканей и органов. Cell cultures can be used in the treatment system for burn patients, as well as patients with injuries of the musculoskeletal system, in the restoration and correction of the functions of damaged tissues and organs.

Claims

The use of a strain of diploid cells of a light human embryo LEC-4 (81) as a cell culture for replacement therapy.