RU2204140C2

RU2204140C2 - Method for diagnosing brucellosis infection in human patients under laboratory conditions

Info

Publication number: RU2204140C2
Application number: RU2001121392/14A
Authority: RU
Inventors: И.А. Соколова; мкин Г.И. Л; Г.И. Лямкин; пустина Л.В. Л; Л.В. Ляпустина; О.В. Малецка; О.В. Малецкая; М.Н. Касторна; М.Н. Касторная; А.В. Тамбовцев
Original assignee: Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт
Priority date: 2001-07-30
Filing date: 2001-07-30
Publication date: 2003-05-10

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: method involves selectively condensing on magnoimmunosorbents, washing samples with their following boiling in water, genetically testing by applying polymerase chain reaction method. Blood serum is taken from patient and formed elements are destroyed by adding distilled water in 1:45- 1:50 proportion and stirring it. Selective condensation on magnoimmunosorbents is carried out after adding 10% brucellosis magnoimmunosorbents in the amount of 0.02 mg/l and incubating during 25-30 min. EFFECT: high reliability and sensitivity of method.

Description

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в лабораторной диагностике бруцеллезной инфекции. The invention relates to microbiology and can be used in laboratory diagnosis of brucellosis infection.

Известны исследования по индикации бруцелл полимеразной цепной реакцией (ПЦР) [Ю. К. Кулаков, В.Н. Горелов, В.Л. Мотин и др. Молекулярная генетика, микробиология, вирусология. 7-8, 1992, с. 23-27]. Клетки бактерий B.melitensis 565 дважды отмывали в дистиллированной воде и кипятили 15 мин, затем осаждали 5 мин при 14 тыс. об/мин. В реакции амплификации использовали надосадочную жидкость. Чувствительность индикации составила 10⁴-10³ мкм/мл.Known studies on the indication of brucella by polymerase chain reaction (PCR) [Yu. K. Kulakov, V.N. Gorelov, V.L. Motin et al. Molecular genetics, microbiology, virology. 7-8, 1992, p. 23-27]. Bacterial cells of B. melitensis 565 were washed twice in distilled water and boiled for 15 minutes, then they were besieged for 5 minutes at 14 thousand rpm. The supernatant was used in the amplification reaction. The sensitivity of the indication was 10 ⁴ -10 ³ μm / ml.

При исследовании клинического материала, например крови, на наличие бруцелл возникают трудности, связанные с малым содержанием бруцелл в крови, прочностью их клеточной стенки, внутриклеточным расположением паразита, наличием ингибиторов полимеразной цепной реакции. Известны клинические исследования по выявлению возбудителей инфекционных заболеваний в патологическом материале путем сочетанного использования магнитной сорбции и ПЦР [J. Clin. Мicrоbiol. Immunol. , 1995, Nov, 11, pp. 2908-2912]. Согласно этому способу на магнитные носители наносятся специфические иммуноглобулиновые фракции или моноклональные антитела и инкубируются в бактериальной суспензии. Из бактериальных клеток, связавшихся с носителями, выделяют ДНК, которую амплифицируют с последующей идентификацией специфических фрагментов. Отмечается значительное повышение чувствительности и специфичности обнаружения бактерий. Однако при выявлении бруцелл в крови человека этот метод не обеспечивает достаточной надежности и чувствительности, т.к. не выявляются внутриклеточно расположенные бруцеллы. In the study of clinical material, such as blood, for the presence of brucella, difficulties arise associated with the low content of brucella in the blood, the strength of their cell wall, the intracellular location of the parasite, and the presence of polymerase chain reaction inhibitors. Known clinical studies to identify pathogens of infectious diseases in pathological material by the combined use of magnetic sorption and PCR [J. Clin. Microbiol. Immunol. , 1995, Nov, 11, pp. 2908-2912]. According to this method, specific immunoglobulin fractions or monoclonal antibodies are applied to magnetic carriers and incubated in a bacterial suspension. DNA is isolated from the bacterial cells bound to the carriers, which is amplified with the subsequent identification of specific fragments. A significant increase in the sensitivity and specificity of detection of bacteria is noted. However, when detecting brucella in human blood, this method does not provide sufficient reliability and sensitivity, because intracellular brucellas are not detected.

Известен способ ПЦР-диагностики бруцеллезной инфекции у людей в клиническом материале, в частности крови [Шестопалов М.Ю., Калиновский А.К., Балахонов С. В. и др. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1999. 3. - С. 12-17]. Способ включает подготовку пробы, лизис клеток бруцелл для выделения ДНК и генотестирование. Исследуемую пробу добавляют в щелочной лизирующе-осаждающий раствор, центрифугируют, осадок промывают этаналом, растворяют в ТЕ-буфере и генотестируют. Недостатком способа является недостаточная чувствительность, т.к. при лизисе из пробы не удаляются ингибиторы полимеразной цепной реакции. A known method for PCR diagnosis of brucellosis infection in humans in clinical material, in particular blood [Shestopalov M.Yu., Kalinovsky AK, Balakhonov S.V. et al. // Molecular Genetics, Microbiology and Virology. - 1999. 3. - S. 12-17]. The method includes sample preparation, lysis of Brucella cells for DNA isolation and gene testing. The test sample is added to an alkaline lysing-precipitating solution, centrifuged, the precipitate is washed with ethanal, dissolved in TE buffer and genotested. The disadvantage of this method is the lack of sensitivity, because upon lysis, polymerase chain reaction inhibitors are not removed from the sample.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ индикации микроорганизмов, описанный в патенте РФ 2165081, кл G 01 N 33/53, опубл. 20.03.2001, БИ 8. Согласно этому способу определяют наличие возбудителя бруцеллеза в объектах внешней среды с использованием селективного концентрирования бруцелл, содержащихся в пробах исследуемого материала, на бруцеллезных магноиммуносорбентах, отмывания образовавшихся комплексов от ингибиторов ПЦР, кипячения в дистиллированной воде для выхода ДНК в раствор и ганотестирования в ПЦР. Недостатком данного способа является недостаточная чувствительность при определении возбудителя бруцеллеза в крови больных, поскольку данным способом не определяются бруцеллы, находящиеся внутри форменных элементов крови. Closest to the claimed method is a method of indicating microorganisms described in the patent of the Russian Federation 2165081, CL G 01 N 33/53, publ. 03/20/2001, BI 8. According to this method, the presence of the pathogen of brucellosis in environmental objects is determined using selective concentration of brucella contained in the samples of the test material on brucellosis magneto-immunosorbents, washing the resulting complexes from PCR inhibitors, boiling in distilled water to leave DNA in solution and ganotests in PCR. The disadvantage of this method is the lack of sensitivity in determining the causative agent of brucellosis in the blood of patients, since this method does not determine the brucella inside the blood cells.

Технической задачей изобретения является повышение чувствительности и достоверности способа диагностики. An object of the invention is to increase the sensitivity and reliability of the diagnostic method.

Решение технической задачи заключается в том, что при подготовке пробы осуществляют разрушение форменных элементов крови путем добавления к цитратной крови дистиллированной воды в соотношении 1:45-1:50. Затем образец смешивают с 10% взвесью бруцеллезных магноиммуносорбентов в количестве 0,02 г/мл и инкубируют в течение 25-30 мин. Отмывают осадок физиологическим раствором трижды. Лизис клеток бруцелл, сорбированных на магноиммуносорбентах, осуществляют кипячением осадка в дистиллированной воде в течение 30 мин. Супернатант, в качестве подготовленной пробы, используют для проведения реакции амплификации для определения ДНК бруцелл. The solution to the technical problem is that during the preparation of the sample, blood cells are destroyed by adding distilled water to citrate blood in a ratio of 1: 45-1: 50. Then the sample is mixed with a 10% suspension of brucellosis magnetic immunosorbents in an amount of 0.02 g / ml and incubated for 25-30 minutes. Wash the precipitate with saline three times. Lysis of brucella cells sorbed on magnetic immunosorbents is carried out by boiling the precipitate in distilled water for 30 minutes. The supernatant, as a prepared sample, is used to conduct an amplification reaction to determine the Brucella DNA.

Существенными отличительными признаками заявляемого способа является следующая совокупность действий, обеспечивающая технический результат изобретения;
- предварительное смешивание цитратной крови с дистиллированной водой, что способствует разрушению форменных элементов крови, внутри которых находятся бруцеллы;
- добавление взвеси бруцеллезных магноиммуносорбентов к образцу и инкубация, при этом происходит специфическая адсорбция и концентрирование высвободившихся клеток бруцелл на поверхности магноиммуносорбентов.Salient features of the proposed method is the following set of actions, providing a technical result of the invention;
- preliminary mixing of citrated blood with distilled water, which contributes to the destruction of blood cells, inside which are brucella;
- adding a suspension of brucellosis magnetic immunosorbents to the sample and incubation, while there is a specific adsorption and concentration of the released brucella cells on the surface of the magnetic immunosorbents.

Использование в анализе бруцеллезных магноиммуносорбентов приводит к увеличению специфичности и чувствительности определения. The use of brucellosis magnetic immunosorbents in the analysis leads to an increase in the specificity and sensitivity of the determination.

Пример 1. Example 1

У пациента из вены берут 7,5 мл крови, смешивают с 1,5 мл 3,8% цитрата натрия. Добавляют 40 мл дистиллированной воды, встряхивают 15 сек, затем добавляют 0,2 мл 10% взвеси бруцеллезных магноиммуносорбентов, инкубируют в течение 30 мин при температуре 37^oС, периодически встряхивая. Супернатант удаляют, осадок заливают физиологическим раствором рН 7,2, перемешивают. Супернатант вновь удаляют и повторяют промывание осадка физиологическим раствором дважды. К осушенному осадку добавляют 0,5 мл дистиллированной воды, встряхивают и кипятят в течение 30 мин. Супернатант используют в качестве пробы для проведения ПЦР-анализа. Полимеразную цепную реакцию проводят с использованием праймеров, комплементарных участку ДНК бруцелл. Положительный результат (наличие бруцелл в пробе крови) учитывают по наличию амплификата в пробе, находящегося на уровне амплификата положительного контроля.7.5 ml of blood are taken from a patient from a vein, mixed with 1.5 ml of 3.8% sodium citrate. Add 40 ml of distilled water, shake for 15 seconds, then add 0.2 ml of 10% suspension of brucellosis magnetic immunosorbents, incubate for 30 minutes at a temperature of 37 ^o C, periodically shaking. The supernatant is removed, the precipitate is poured with physiological solution of pH 7.2, stirred. The supernatant is again removed and the pellet washed with saline twice. 0.5 ml of distilled water is added to the dried precipitate, shaken and boiled for 30 minutes. The supernatant is used as a sample for PCR analysis. The polymerase chain reaction is carried out using primers complementary to the brucella DNA region. A positive result (the presence of brucella in the blood sample) is taken into account by the presence of the amplification in the sample, which is at the level of the amplification of the positive control.

Claims

A method for laboratory diagnosis of brucellosis infection in humans, including selective concentration on magnetic immunosorbents, washing samples followed by boiling in water, polymerase chain reaction gene testing, characterized in that a patient takes a blood sample, destroys the formed elements in it by adding distilled water in the ratio of 1 : 45-1: 50, mix, and selective concentration on the magnetic immunosorbents of the released intracellularly located brucella is carried out after adding 10% suspension rutselleznyh magnoimmunosorbentov in an amount of 0.02 g / ml and incubating for 25-30 min.