RU2203945C1

RU2203945C1 - Strain of bacterium pseudomonas aureofaciens for preparing preparation against wheat disease caused by fungal phytopathogens

Info

Publication number: RU2203945C1
Application number: RU2001123209/13A
Authority: RU
Inventors: О.Н. Логинов; Е.В. Свешникова; Н.Н. Силищев; А.И. Мелентьев; нова Н.Ф. Галимз; Н.Ф. Галимзянова; Т.Ф. Бойко
Original assignee: Институт биологии Уфимского научного центра РАН
Priority date: 2001-08-17
Filing date: 2001-08-17
Publication date: 2003-05-10

Abstract

FIELD: agriculture microbiology, agriculture. SUBSTANCE: invention relates to the strain Pseudomonas aureofaciens 51 that is isolated from top soil sample of Meleuzovskiy district of Bashkorstan Republic. The strain Pseudomonas aureofaciens is deposited in cultures collection of Biology Institute of Ufa Science Center RAS at = IB 51. Suspension prepared in culturing this strain is used as preparation against wheat disease for treatment of wheat seeds. Preparation obtained on the basis of this strain inhibits development of wheat diseases caused by kernel smut and root rots. EFFECT: valuable properties of preparation. 3 tbl, 4 ex

Description

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и касается штамма, который оказывает антагонистическое действие на возбудителей заболеваний пшеницы твердой головней и корневыми гнилями и поэтому может быть использован для защиты от них сельскохозяйственных растений. The invention relates to agricultural microbiology and relates to a strain that exerts an antagonistic effect on pathogens of wheat diseases with hard smut and root rot and therefore can be used to protect agricultural plants from them.

Известен штамм Pseudomonas sp. ЦМПМ В-348, используемый для получения препарата при защите злаковых от возбудителя обыкновенной корневой гнили Helminthosporium sativum (1). Однако этот штамм неэффективен для подавления корневой гнили злаков, вызываемой комплексом грибов Fusarium spp. и Н. sativum. A known strain of Pseudomonas sp. CMPM B-348, used to obtain the drug for the protection of cereals from the pathogen of ordinary root rot Helminthosporium sativum (1). However, this strain is ineffective for suppressing the root rot of cereals caused by a complex of fungi Fusarium spp. and H. sativum.

Известны штаммы Pseudomonas putida, подавляющий рост фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum (2) и Pseudomonas putida BKM В-1743Д, подавляющий рост грибов рода Fusarium (3). Недостатками известных штаммов является узкий спектр антагонистического действия. Known strains of Pseudomonas putida, inhibiting the growth of the phytopathogenic fungus Fusarium oxysporum (2) and Pseudomonas putida BKM B-1743D, inhibiting the growth of fungi of the genus Fusarium (3). The disadvantages of the known strains is a narrow spectrum of antagonistic action.

В качестве прототипа выбран штамм бактерий Pseudomonas species, проявляющий антагонистическую активность к фитопатогенным грибам Alternaria spp., Bipolaris sorokiniana, Fusarium oxysporum, F. gibbosum, F. sumbucinum (4). Однако отсутствуют сведения о действии этого штамма на такие широко распространенные возбудители болезней растений, как Fusarium culmorum, F. graminearum, F. nivale, F. semitectum, F. solani. The bacterial strain Pseudomonas species, which exhibits antagonistic activity against phytopathogenic fungi Alternaria spp., Bipolaris sorokiniana, Fusarium oxysporum, F. gibbosum, F. sumbucinum, was selected as a prototype (4). However, there is no information on the effect of this strain on such widespread pathogens of plant diseases as Fusarium culmorum, F. graminearum, F. nivale, F. semitectum, F. solani.

Кроме того, во всех перечисленных аналогах и прототипе нет сведений об активности выделенных штаммов микроорганизмов по отношению к возбудителю наиболее вредоносной болезни пшеницы - твердой головне (Tilletia caries), потери от которой приводят к недобору 10-15% урожая. In addition, in all of the listed analogues and prototype there is no information about the activity of the isolated microorganism strains with respect to the causative agent of the most harmful wheat disease - smut (Tilletia caries), losses from which lead to a shortfall of 10-15% of the crop.

Технической задачей изобретения является выделение нового природного штамма с широким спектром действия на возбудителей грибных заболеваний растений, в том числе и твердой головни. An object of the invention is the selection of a new natural strain with a wide spectrum of action on pathogens of fungal diseases of plants, including smut.

Поставленная задача достигается выявлением и использованием штамма Pseudomonas aureofaciens 51, выделенного из образца пахотных земель, отобранного в Мелеузовском районе Республики Башкортостан. Штамм депонирован в коллекции культур Института биологии Уфимского научного центра РАН под ИБ 51. Он характеризуется следующими признаками. The task is achieved by the identification and use of the strain Pseudomonas aureofaciens 51 isolated from arable land sample taken in the Meleuzovsky district of the Republic of Bashkortostan. The strain is deposited in the culture collection of the Institute of Biology of the Ufa Scientific Center of the Russian Academy of Sciences under IB 51. It is characterized by the following features.

Морфологические признаки. Короткие, подвижные палочки, грам-отрицательные, спор не образуют. Морфологию колоний на питательных средах определяли после 4-5 сут роста при 28^oС. На мясопептонном агаре (МПА) - круглые с ровными краями, гладкие, слабовыпуклые, непрозрачные, ярко-оранжевые в центре с более светлой окантовкой, слизистой консистенции колонии, диаметр 5-6 мм, пигмент ярко-оранжевый, диффундирующий в среду. На МПА с 2% глицерина - колонии крупнее, интенсивнее окрашены, более интенсивная диффузия в среду пигмента.Morphological signs. Short, mobile sticks, gram-negative, do not form a dispute. The colony morphology on nutrient media was determined after 4-5 days of growth at 28 ^° C. On meat and peptone agar (MPA), round with smooth edges, smooth, slightly convex, opaque, bright orange in the center with a lighter edging, colony mucous consistency, diameter 5-6 mm, the pigment is bright orange, diffusing into the medium. On MPA with 2% glycerol, the colonies are larger, more intensively colored, more intense diffusion into the pigment medium.

Пигментация на диагностических средах Кинга для флюоресцирущих псевдомонад: Кинг А - пигмент отсутствует; Кинг Б - образуется желто-зеленый флюоресцирующий пигмент. В жидких питательных средах (МПБ) образуется тонкая, сплошная, складчатая пленка. На МПА-косяках штрих обильный, сплошной с ровным краем. Pigmentation on King diagnostic media for fluorescent pseudomonads: King A - no pigment; King B - a yellow-green fluorescent pigment is formed. In liquid culture media (BCH), a thin, continuous, folded film is formed. On MPA-jambs, the stroke is plentiful, continuous with a smooth edge.

Физиолого-биохимические признаки. По отношению к кислороду - аэроб, окислительный тип метаболизма. Не нуждается в факторах роста. Разжижает желатин. Пептонизирует и свертывает молоко. Образует леван из сахарозы, не гидролизует крахмал. Продуцирует каталазу, образует аргининдигидролазу. Гидролизует лецитин, Твин-80. Растет при 4^oС, растет на МПБ с 3% NaCl. Усваивает с образованием кислоты глюкозу, ксилозу, сахарозу, арабинозу, рафинозу, фруктозу. В качестве источника углерода использует мальтозу, бутанол, гексанол, маннит, глицерин, бензойную кислоту, пропионовую кислоту, антраниловую кислоту, янтарную кислоту, α-кетоглутаровую кислоту, пируват, лактат, цитрат, фенилаланин, серин, лейцин, аргинин, аланин, валин, триптофан, орнитин, пролин, лизин, тирозин. Не усваивает лактозу, этанол, пропанол, сорбит, ацетамид, малеиновую кислоту, адипиновую кислоту, оксалат, изомасляную кислоту, треонин, метионин, цистеин, гексан, декан, октадекан, формальдегид, фенол.Physiological and biochemical characteristics. In relation to oxygen - aerob, an oxidative type of metabolism. Does not need growth factors. Thins gelatin. Peptones and coagulates milk. Forms Levan from sucrose, does not hydrolyze starch. It produces catalase, forms arginine dihydrolase. Hydrolyzes lecithin, Tween-80. Grows at 4 ^o C, grows on BCH with 3% NaCl. Absorbs glucose, xylose, sucrose, arabinose, raffinose, fructose with the formation of acid. It uses maltose, butanol, hexanol, mannitol, glycerin, benzoic acid, propionic acid, anthranilic acid, succinic acid, α-ketoglutaric acid, pyruvate, lactate, citrate, phenylalanine, serine, leucine, arginine, alanine, valine, as a carbon source. tryptophan, ornithine, proline, lysine, tyrosine. It does not absorb lactose, ethanol, propanol, sorbitol, acetamide, maleic acid, adipic acid, oxalate, isobutyric acid, threonine, methionine, cysteine, hexane, decane, octadecane, formaldehyde, phenol.

Штамм устойчив к ампициллину (5000 мкг/мл), стрептомицину (500 мкг/мл), эритромицину (100 мкг/мл), чувствителен к гентамицину (100 мкг/мл). The strain is resistant to ampicillin (5000 μg / ml), streptomycin (500 μg / ml), erythromycin (100 μg / ml), sensitive to gentamicin (100 μg / ml).

Штамм не обладает фитопатогенной активностью, о чем свидетельствует отсутствие мацерации на ломтиках картофеля при нанесении на них уколом живых клеток штамма. The strain does not have phytopathogenic activity, as evidenced by the absence of maceration on the potato slices when applied to them with an injection of living cells of the strain.

Штамм хранится на косяках МПА в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 2-4 мес, а также в лиофильно-высушенном состоянии. The strain is stored on the jambs of the MPA in the refrigerator with reseeding on fresh jambs after 2-4 months, as well as in the freeze-dried state.

Штамм идентифицирован по определителю Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. The strain was identified by Bergey's Manual of Determinative Bacteriology.

Пример 1. Получение биомассы
Штамм выращивают в течение 48 ч при 28-30^oC с аэрацией до титра 10⁹ КОЕ/мл на среде LB следующего состава, г/л: пептон - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; натрий хлористый - 10,0; вода водопроводная до 1 л. При необходимости суспензию клеток разводят водой до необходимого титра.Example 1. Obtaining biomass
The strain is grown for 48 hours at 28-30 ^o C with aeration to a titer of 10 ⁹ CFU / ml on LB medium of the following composition, g / l: peptone - 10.0; yeast extract - 5.0; sodium chloride - 10.0; tap water up to 1 liter. If necessary, the cell suspension is diluted with water to the desired titer.

Определяющим отличием предлагаемого штамма от прототипа является более широкий спектр действия на возбудителей грибных заболеваний растений. The defining difference of the proposed strain from the prototype is a wider spectrum of action on pathogens of fungal diseases of plants.

Пример 2. Изучение антагонистической активности нового штамма Pseudomonas aureofaciens ИБ 51
На пластинки глюкозо-пептонного агара (глюкоза - 5 г; пептон - 5 г; калий фосфорнокислый двузамещенный - 4 г; калий фосфорнокислый однозамещенный - 2 г; вода дистиллированная - 1 л) высевают сплошным газоном суспензию спор грибного фитопатогена. Затем на эти же пластинки уколом сажают бактерии штамма Pseudomonas aureofaciens ИБ 51. Чашки инкубируют при 28^oС в течение 3 сут.Example 2. The study of the antagonistic activity of a new strain of Pseudomonas aureofaciens IB 51
On plates of glucose-peptone agar (glucose - 5 g; peptone - 5 g; potassium phosphate disubstituted - 4 g; potassium phosphate monosubstituted - 2 g; distilled water - 1 l), a suspension of fungal phytopathogen is sown with a continuous lawn. Then, bacteria of the Pseudomonas aureofaciens strain IB 51 are injected onto the same plates with an injection. The plates are incubated at 28 ^{° C.} for 3 days.

Учет проводят по зонам отсутствия или подавления роста гриба вокруг колонии штамма. Результаты приведены в табл.1 и свидетельствуют о широком спектре антагонистического действия нового штамма. Accounting is carried out in areas of absence or inhibition of fungal growth around the colony strain. The results are shown in table 1 and indicate a wide spectrum of antagonistic action of the new strain.

Пример 3. Антагонистическое действие нового штамма против комплекса возбудителей корневых гнилей пшеницы испытывают в лабораторных условиях на пшенице сорта "Жница" с естественным уровнем заражения посевного материала, полученного в условиях опытного поля Башкирского Государственного Аграрного Университета. Семена пшеницы обрабатывают суспензией штамма (с титром 10⁹ КОЕ/мл) из расчета 1 мл суспензии на 50 г семян. Семена переносят на увлажненную до полной влагоемкости полоску фильтровальной бумаги, прикрывают такой же полоской увлажненной фильтровальной бумаги, поверх которой накладывают полоску полиэтилена, сворачивают в рулон, помещают вертикально в лабораторный стакан и оставляют при комнатной температуре. В контрольных опытах обработку семян осуществляют водопроводной водой. В качестве эталонов используют химический препарат дивидент и биопрепараты - фитоспорин и планриз. Эксперимент выполняют в четырехкратной повторности. Обработку результатов проводят через 7 дней. Эффективность штамма определяют при сопоставлении степени проявления корневых гнилей проростков пшеницы в опыте и контроле. Результаты приведены в табл.2.Example 3. The antagonistic effect of the new strain against a complex of pathogens of root rot of wheat is tested in laboratory conditions on wheat of the variety "Reaper" with a natural level of infection of seed obtained in the experimental field of the Bashkir State Agrarian University. Wheat seeds are treated with a suspension of strain (with a titer of 10 ⁹ CFU / ml) at the rate of 1 ml of suspension per 50 g of seeds. The seeds are transferred onto a strip of filter paper moistened to full moisture capacity, covered with the same strip of moistened filter paper, on top of which a strip of polyethylene is applied, rolled up, placed vertically in a beaker and left at room temperature. In control experiments, seed treatment is carried out with tap water. As standards, use the chemical drug divident and biological products - phytosporin and planriz. The experiment is performed in quadruplicate. Processing the results is carried out after 7 days. The effectiveness of the strain is determined by comparing the degree of manifestation of root rot of wheat seedlings in the experiment and control. The results are shown in table.2.

В этой же таблице приведены и результаты лабораторных экспериментов, выполненных по аналогичной методике, но с дополнительным инфицированием посевного материала спорами фитопатогенных грибов Fusarium oxysporum и Bipolaris sorokiniana (титр споровой суспензии обоих патогенов составил 5•10⁴ КОЕ/мл).The same table also shows the results of laboratory experiments performed by a similar method, but with additional infection of the seed with spores of phytopathogenic fungi Fusarium oxysporum and Bipolaris sorokiniana (the spore suspension titer of both pathogens was 5 • 10 ⁴ CFU / ml).

Из табл. 2 видно, что новый штамм в условиях естественного инфекционного фона заражения не уступает биологическим препаратам фитоспорин и планриз в эффективности воздействия на фитопатогены. Наряду с этим следует отметить, что предлагаемый штамм обладает способностью стимулировать рост пшеницы, что проявляется не только в увеличении средней длины проростков на 13-19%, но и в снижении в 4,5-6 раз числа проростков, обладающих дефектами, отстающих в росте корешков и ростков. From the table. Figure 2 shows that the new strain under the conditions of a natural infectious background of infection is not inferior to biological preparations phytosporin and planriz in the effectiveness of its effect on phytopathogens. Along with this, it should be noted that the proposed strain has the ability to stimulate the growth of wheat, which is manifested not only in an increase in the average length of seedlings by 13-19%, but also in a decrease of 4.5-6 times the number of seedlings with defects lagging behind in growth roots and sprouts.

Что касается дополнительного заражения посевного материала фитопатогенами: увеличение инфекционной нагрузки за счет Fusarium oxysporum показало, что новый штамм успешно справляется с присутствием на зернах данного патогена. As for the additional infection of the seed with phytopathogens: an increase in the infectious load due to Fusarium oxysporum showed that the new strain successfully copes with the presence of this pathogen on the grains.

Пример 4. Антагонистическое действие штамма против возбудителя твердой головни пшеницы испытывали на пшенице сорта "Жница", искусственно зараженной Tilletia caries, в условиях закрытого грунта в теплице. Заспорение спорами твердой головни осуществляли из расчета 1-2 г спор на 1 кг зерна. Семена пшеницы обрабатывали суспензией штамма (с титром 10⁹ КОЕ/мл) из расчета 1 мл суспензии на 50 г семян и высаживали в вегетационные сосуды по 60 штук с учетом всхожести данного сорта пшеницы. В контрольных экспериментах обработку семян осуществляли водопроводной водой. В качестве эталонов использовали химический препарат дивидент и биологические препараты фитоспорин и планриз. Эксперименты выполняли в трехкратной повторности.Example 4. The antagonistic effect of the strain against the causative agent of smut of wheat was tested on wheat cultivar "Reaper", artificially infected with Tilletia caries, in closed ground in a greenhouse. Disputes with solid smut spores were carried out at the rate of 1-2 g spores per 1 kg of grain. Wheat seeds were treated with a suspension of strain (with a titer of 10 ⁹ CFU / ml) at the rate of 1 ml of suspension per 50 g of seeds and were planted in vegetation vessels of 60 pieces, taking into account the germination of this variety of wheat. In control experiments, seed treatment was carried out with tap water. The divident chemical preparation and biological preparations phytosporin and planriz were used as standards. The experiments were performed in triplicate.

Эффективность штамма определяли при сопоставлении степени проявления заболевания растений твердой головней в опыте и контроле в период молочно-восковой спелости зерна. Результаты приведены в табл.3. The effectiveness of the strain was determined by comparing the degree of manifestation of plant diseases of hard smut in the experiment and control during the period of milk-wax ripeness of grain. The results are shown in table.3.

Как свидетельствуют результаты эксперимента, биологическая эффективность подавления твердой головни на пшенице у штамма Pseudomonas aureofaciens 51 составляет 52,7%, при 41,8% у выбранного аналога. According to the results of the experiment, the biological effectiveness of suppressing smut on wheat in the strain Pseudomonas aureofaciens 51 is 52.7%, with 41.8% in the selected analogue.

Таким образом, штамм Pseudomonas aureofaciens 51 обладает антагонистической активностью в отношении широкого круга фитопатогенных грибов, в том числе против возбудителя твердой головни Tilletia caries, a также характеризуется способностью стимулировать рост пшеницы, что в целом позволяет увеличить урожай в 1,7 раза. Thus, the strain Pseudomonas aureofaciens 51 has antagonistic activity against a wide range of phytopathogenic fungi, including the pathogen Tigletia caries, and is also characterized by the ability to stimulate wheat growth, which in general allows to increase the yield by 1.7 times.

Список литературы
1. Авторское свидетельство СССР 1464468, кл. А 01 N 63/00, 1988.List of references
1. Copyright certificate of the USSR 1464468, cl. A 01 N 63/00, 1988.

2. Патент США 4714614, кл. 424-93, 1987. 2. US patent 4714614, CL. 424-93, 1987.

3. Патент RU 1805849, кл. А 01 N 63/00, 1993. 3. Patent RU 1805849, cl. A 01 N 63/00, 1993.

4. Патент RU 2130261, кл. А 01 N 63/00, С 12 N 1/20, 1999. 4. Patent RU 2130261, cl. A 01 N 63/00, C 12 N 1/20, 1999.

Claims

The bacterial strain Pseudomonas aureofaciens, deposited in the collection of microorganisms of the Institute of Biology of the Ufa Scientific Center of the Russian Academy of Sciences under the number IB 51, to obtain a drug against wheat diseases caused by fungal plant pathogens.