RU2203072C1

RU2203072C1 - Method for preparing suspension of fetal cells for transplantation in case of chronic hepatic diseases

Info

Publication number: RU2203072C1
Application number: RU2001136019/14A
Authority: RU
Inventors: Г.Р. Курбатова; Р.У. Гиниатуллин; А.И. Козель; Е.Н. Игнатьева
Original assignee: Челябинский государственный институт лазерной хирургии
Priority date: 2001-12-29
Filing date: 2001-12-29
Publication date: 2003-04-27

Abstract

FIELD: medicine, transplantology. SUBSTANCE: method deals with sampling fetal cells, putting them into medium for dilution, homogenization by keeping cellular integrity, dilution of homogenate and its, at least, two-fold laser irradiation. Moreover, the method deals with sampling fetal tissues of liver and/or spleen and/or thymus and, additionally, before sampling fetal tissues one should introduce hepatotropic poison into donor's body at the quantity not having any toxic action. EFFECT: increased functional activity of transplanted fetal cells. 2 cl, 3 ex, 1 tbl

Description

Изобретение относится к медицине, в частности к трансплантологии, и может найти широкое применение при лечении хронических заболеваний печени. The invention relates to medicine, in particular to transplantology, and can be widely used in the treatment of chronic liver diseases.

Известен способ приготовления суспензии фетальных клеток в частности гепатоцитов, предназначенных для трансплантации при хронических заболеваниях печени, предусматривающий забор фетальных тканей печени, механическое воздействие для освобождения гепатоцитов, фильтрацию и отмывку гепатоцитов центрифугированием и последующее их разведение до требуемой концентрации фетальных гепатоцитов (см. кн. "Лечение печеночной недостаточности методами трансплантации и экстракорпорального подключения печени и других тканей (биологические и клинические аспекты). Под редакцией академика РАМН В.И. Шумакова, Москва, 1994 г., стр. 43, 63). A known method of preparing a suspension of fetal cells, in particular hepatocytes, intended for transplantation in chronic liver diseases, involving the collection of fetal liver tissue, mechanical action to release hepatocytes, filtering and washing the hepatocytes by centrifugation and their subsequent dilution to the desired concentration of fetal hepatocytes (see book. " Treatment of liver failure with transplantation and extracorporeal connection of the liver and other tissues (biological and aspects of sul). Edited by academician VI Shumakov, Moscow, 1994, pp. 43, 63).

Использование полученной суспензии для трансплантации внутрибрюшинно улучшает функционирование печени больного. The use of the suspension for transplantation intraperitoneally improves the functioning of the patient's liver.

Известен способ приготовления суспензии фетальных клеток, предназначенных для трансплантации при хронических заболеваниях печени, выбранный в качестве ближайшего аналога, предусматривающий забор фетальных тканей, помещение их в среду для разведения, гомогенизацию с сохранением целостности клеток и последующее до требуемого разведение гомогената (см. патент 2153344, М.кл. А 61 К 35/407, А 61 Р 43/00, опубл. 27.07.2000 г.). A known method of preparing a suspension of fetal cells intended for transplantation in chronic liver diseases, selected as the closest analogue, involving the collection of fetal tissues, placing them in a dilution medium, homogenization while maintaining the integrity of the cells and subsequent to the required dilution of the homogenate (see patent 2153344, M.cl. A 61 K 35/407, A 61 P 43/00, publ. 07.27.2000).

Данный способ предусматривает забор тканей печени у эмбриона, отмывание ее в питательной среде 199, получение гомогената, центрифугирование, выделение верхнего, среднего и нижнего слоя, отсасывание среднего слоя и верхней части нижнего слоя, разведение в питательной среде 199. This method involves the collection of liver tissue from the embryo, washing it in a nutrient medium 199, obtaining a homogenate, centrifuging, isolating the upper, middle and lower layers, aspirating the middle layer and the upper part of the lower layer, diluting in a nutrient medium 199.

Данный способ достаточно трудоемок поскольку предусматривает дополнительные операции, например центрифугирование, разделение гомогената на три слоя, выделение каждого слоя в отдельную колбу и отсасывание части слоев. This method is quite laborious since it involves additional operations, for example, centrifugation, separation of the homogenate into three layers, the separation of each layer in a separate flask and the suction of part of the layers.

Кроме того, несмотря на увеличение регенерирующей способности печеночной ткани и уменьшение реакции ее отторжения, положительные результаты после трансплантации суспензии гепатоцитов, полученных данным способом, наблюдаются только через 10-20 дней после проведения эксперимента. In addition, despite an increase in the regenerative ability of the liver tissue and a decrease in the reaction of its rejection, positive results after transplantation of a suspension of hepatocytes obtained by this method are observed only 10-20 days after the experiment.

Таким образам задачей, на решение которой направлено данное изобретение, является повышение функциональной активности трансплантируемых фетальных клеток. Thus, the task to which this invention is directed is to increase the functional activity of transplanted fetal cells.

Указанная задача достигается тем, что в известном способе приготовления суспензии фетальных клеток, предназначенных для трансплантации при хронических заболеваниях печени, предусматривающем забор фетальных тканей, помещение их в среду для разведения, гомогенизацию с сохранением целостности клеток и последующее до требуемого разведение гомогената, согласно изобретения разведенный гомогенат дополнительно подвергают по меньшей мере двукратному лазерному облучению. This task is achieved by the fact that in the known method of preparing a suspension of fetal cells intended for transplantation in chronic liver diseases, involving the collection of fetal tissues, placing them in a dilution medium, homogenization while maintaining the integrity of the cells and subsequent dilution of the homogenate according to the invention, the diluted homogenate additionally subjected to at least two laser irradiation.

При этом предусматривается забор фетальных тканей печени, и/или селезенки, и/или тимуса. At the same time, the fetal tissues of the liver and / or spleen and / or thymus are provided for.

И кроме того дополнительно предусматривается перед забором фетальных тканей из организма донора, введение в организм донора гепатотропного яда, в количестве, не оказывающем на этот организм токсического действия. And in addition, it is additionally provided before the intake of fetal tissues from the body of the donor, the introduction of hepatotropic poison into the body of the donor, in an amount that does not have a toxic effect on this body.

Экспериментально установлено, что дополнительное по меньшей мере двукратное лазерное облучение разведенного гомогената способствует значительному, по сравнению с ближайшим аналогом, повышению функциональной активности трансплантируемых фетальных клеток, их более высокой по сравнению со всеми известными регенерирующей способностью и, как следствие, значительному ускорению процесса регенерации поврежденной печени. It was experimentally established that an additional at least two-fold laser irradiation of the diluted homogenate contributes to a significant, in comparison with the closest analogue, increase in the functional activity of transplanted fetal cells, their higher compared with all the known regenerative ability and, as a result, a significant acceleration of the process of regeneration of the damaged liver .

По мнению заявителя, именно воздействие лазерным излучением усиливает иммуностимуляторные свойства фетальных клеток, что и позволяет ускорить процесс регенерации пораженной печени, что в свою очередь повышает эффективность использования данных клеток для лечения хронических заболеваний печени. According to the applicant, it is the exposure to laser radiation that enhances the immunostimulatory properties of fetal cells, which allows accelerating the regeneration of the affected liver, which in turn increases the efficiency of using these cells for the treatment of chronic liver diseases.

Именно лазерное облучение активизирует продуцирование фетальными клетками находящихся в них биологически активных веществ. It is laser irradiation that activates the production of biologically active substances in them by fetal cells.

Экспериментально установлено, что данный результат достигается именно при использовании фетальных тканей печени, и/или селезенки, и/или тимуса. It was experimentally established that this result is achieved precisely with the use of fetal tissues of the liver, and / or spleen, and / or thymus.

Кроме того экспериментально установлено, еще в большей степени происходит повышение функциональной активности фетальных клеток, если дополнительно перед забором фетальных тканей из организма донора, в него ввести однократно гепатотропный яд в количестве, не оказывающем на этот организм токсического действия. In addition, it has been experimentally established that an increase in the functional activity of fetal cells occurs even more if, before additionally taking fetal tissues from the donor organism, hepatotropic poison is introduced into it in an amount that does not exert a toxic effect on this organism.

По мнению заявителя, это обеспечивается благодаря тому, что воздействие на фетальные органы, оказываемое гепатотропным ядом резко активизирует выработку в фетальных органах биологически активных веществ, предназначенных для их защиты. According to the applicant, this is due to the fact that the effect on the fetal organs exerted by the hepatotropic poison dramatically activates the production of biologically active substances in the fetal organs intended for their protection.

Совокупность существенных признаков заявляемого объекта "способ" имеет отличия от ближайшего аналога и не следует явным образом из изученного уровня техники, что свидетельствует о его соответствии критериям "новизна" и "изобретательский уровень". The set of essential features of the claimed object "method" has differences from the closest analogue and does not follow explicitly from the studied prior art, which indicates its compliance with the criteria of "novelty" and "inventive step".

Данное изобретение может найти широкое применение в здравоохранении, что свидетельсвует о его соответствии критерию "промышленная применимость". This invention can find wide application in healthcare, which indicates its compliance with the criterion of "industrial applicability".

Способ в эксперименте осуществляется следующим образом. The method in the experiment is as follows.

Фетальные ткани печени, и/или селезенки, и/или тимуса берутся у плодов крыс-самок линии Вистар с 20-дневным сроком беременности и помещаются в физиологический раствор. Fetal tissues of the liver, and / or spleen, and / or thymus are taken from the fetuses of female Wistar rats with a 20-day gestation period and placed in physiological saline.

Смесь фетальных клеток готовится с помощью гомогенизатора с люфтом, сохраняющим целостность клеток. A mixture of fetal cells is prepared using a homogenizer with a backlash that preserves the integrity of the cells.

При этом кусочки печени, и/или селезенки, и/или тимуса гомогенизируются на физиологическом растворе. In this case, pieces of the liver and / or spleen and / or thymus are homogenized in physiological saline.

На основе полученных гомогенатов органов готовится суспензия с разведением 3•10⁵. Клеточность суспензии подсчитывается с помощью камеры Горяева. Жизнеспособность клеток оценивается с помощью окраски их взвеси трипановым синим.On the basis of the obtained organ homogenates, a suspension is prepared with a dilution of 3 • 10 ⁵ . The cellularity of the suspension is calculated using a Goryaev’s camera. Cell viability is assessed by staining their suspension with trypan blue.

Затем суспензия помещается в стерильные стеклянные пробирки. В пробирки вставляется световод, диаметр которого выбран таковым, чтобы он плотно входил в пробирку. The suspension is then placed in sterile glass tubes. An optical fiber is inserted into the tubes, the diameter of which is chosen so that it fits tightly into the tube.

Световод устанавливается на некотором расстоянии от поверхности суспензии, не соприкасаясь с ней, и по меньшей мере дважды облучается лазерным излучением, например гелий-неоновым лазером модели "Улей". Время облучения за один раз составляет от 0,5 до 2 минут. Время перерыва между облучениями от 1 до 5 минут. Плотность мощности лазерного облучения 75 мВ/см².The optical fiber is installed at a certain distance from the surface of the suspension, not in contact with it, and is at least twice irradiated with laser radiation, for example, a helium-neon laser of the Ulei model. The exposure time at a time is from 0.5 to 2 minutes. The time interval between exposures is from 1 to 5 minutes. The laser power density is 75 mV / cm ² .

После облучения световод извлекается из пробирки. Суспензия фетальных клеток готова к трансплантации. After irradiation, the optical fiber is removed from the tube. A suspension of fetal cells is ready for transplantation.

При экспериментах, проводимыx на биологических объектах (крысах), дополнительно за 16 часов до извлечения фетальных тканей из организма крысы-донора, ей вводился 50%-ный масляный раствор четыреххлористого углерода в количестве из расчета 0,4 мл на 100 грамм веса крысы-донора. In experiments conducted on biological objects (rats), an additional 16 hours before extraction of fetal tissues from the body of the donor rat, she was injected with a 50% oil solution of carbon tetrachloride in an amount of 0.4 ml per 100 grams of the weight of the donor rat .

Данное количество гепатотропного яда не оказывает на организм крысы-донора токсического действия. This amount of hepatotropic poison does not have a toxic effect on the body of the donor rat.

В таблице приведены примеры конкретного выполнения данного способа. The table shows examples of specific performance of this method.

Примечание. В примере 1 за 16 часов до извлечения фетальных органов из организма крысы-донора весом 200 грамм, ей вводили 0,8 мл 50%-ного масляного раствора четыреххлористого углерода. Note. In example 1, 16 hours before the removal of fetal organs from the body of a donor rat weighing 200 grams, she was injected with 0.8 ml of a 50% oil solution of carbon tetrachloride.

Claims

1. A method of preparing a suspension of fetal cells intended for transplantation in chronic liver diseases, comprising collecting fetal tissues, placing them in a dilution medium, homogenization while maintaining the integrity of the cells and subsequent to the required dilution of the homogenate, characterized in that the diluted homogenate is additionally subjected to at least at least twice laser exposure.

2. The method according to claim 1, characterized in that it provides for the collection of fetal tissues of the liver, and / or spleen, and / or thymus.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that, in addition to the intake of fetal tissues, the hepatotropic poison is introduced into the body of the donor in quantities that do not have a toxic effect on this organism.