RU2200327C2 - Method for diagnostics of syphilis (variants) - Google Patents
Method for diagnostics of syphilis (variants) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2200327C2 RU2200327C2 RU99124840/14A RU99124840A RU2200327C2 RU 2200327 C2 RU2200327 C2 RU 2200327C2 RU 99124840/14 A RU99124840/14 A RU 99124840/14A RU 99124840 A RU99124840 A RU 99124840A RU 2200327 C2 RU2200327 C2 RU 2200327C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- solid
- syphilis
- phase carrier
- diagnosis
- vials
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к микробиологическим методам исследования и может быть использовано при диагностике сифилиса методами иммуноферментного анализа (ИФА) и количественного иммуноферментного анализа (КИФА). The invention relates to microbiological research methods and can be used in the diagnosis of syphilis by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and quantitative enzyme-linked immunosorbent assay (KIFA).
Сложность диагностики сифилиса обусловлена свойствами возбудителя заболевания - спирохеты Treponema pallidum, которая плохо культивируется на питательных средах in vitro и не окрашивается при микроскопии. В настоящее время разработан ряд методов для идентификации инфекционного процесса на разных стадиях. Существующие лабораторные тесты можно разделить на несколько групп: прямая визуализация бледных трепонем при наличии очагов поражения; нетрепонемные тесты, используемые для отбора; трепонемные подтверждающие тесты. The complexity of the diagnosis of syphilis is due to the properties of the pathogen - spirochete Treponema pallidum, which is poorly cultured on nutrient media in vitro and not stained by microscopy. Currently, a number of methods have been developed for identifying the infection process at different stages. Existing laboratory tests can be divided into several groups: direct visualization of pale treponemas in the presence of lesions; nontreponemal tests used for screening; treponemal confirmatory tests.
При прямой визуализации микроорганизмов и реакции связывания комплемента (РСК) с использованием в качестве антигена кардиолипина, зачастую наблюдаются ложноотрицатильные и ложноположительные результаты, особенно при наличии побочных инфекционных заболеваний. With direct visualization of microorganisms and complement binding reactions (CSCs) using cardiolipin as antigen, false-negative and false-positive results are often observed, especially in the presence of adverse infectious diseases.
В последнее время активно внедрен н диагностику сифилиса метод ИФА с использованием в качестве антигенов как патогенных, так и непатогенных трепонем. Известны коммерческие ИФА тест-системы зарубежного и отечественного производства с набором материалов и реагентов, необходимых для постановки реакции, учет которой проводится в двух вариантах автоматически и визуально. Результаты испытаний этих тест-систем на различных стадиях и формах заболевания показали значительные возможности повышения чyвcтвитeльнocти и специфичности диагностики сифилиса (Г.А.Дмигрисв, Е.Е.Брагина, Современные методы лабораторной диагностики сифилиса. Вестник дерматологии и венерологии, 2, 1996, с. 29-30, там же, 3, 1996, с. 33-34). Recently, the ELISA method with the use of both pathogenic and non-pathogenic treponemas as antigens has been actively introduced into the diagnosis of syphilis. Known commercial ELISA test systems of foreign and domestic production with a set of materials and reagents necessary for the formulation of the reaction, which is carried out in two versions automatically and visually. The test results of these test systems at various stages and forms of the disease showed significant opportunities for increasing the sensitivity and specificity of the diagnosis of syphilis (G.A.Dmigrisv, E.E. Bragin, Modern methods of laboratory diagnosis of syphilis. Herald of dermatology and venereology, 2, 1996, p. 29-30, ibid., 3, 1996, pp. 33-34).
Однако при различных формах заболевания чувствительность и специфичность методов неоднозначны, проблематична дифференциация антител при ряде аутоиммунных заболеваний. However, with various forms of the disease, the sensitivity and specificity of the methods are ambiguous, the differentiation of antibodies with a number of autoimmune diseases is problematic.
Чувствительность и специфичность ИФА обусловлены не только степенью чистоты используемых ингредиентов, но и свойствами твердой фазы, которая должна сохранять иммунологические свойства и стабильность иммобилизованных лигандов, обладать минимальной способностью неспецифически связывать компоненты анализируемой системы и быть удобной при разделении фаз. The sensitivity and specificity of ELISA are determined not only by the degree of purity of the ingredients used, but also by the properties of the solid phase, which should preserve the immunological properties and stability of immobilized ligands, have minimal ability to bind non-specifically the components of the analyzed system, and be convenient for phase separation.
При использовании в качестве иммуносорбента наиболее широко распространенных полистироловых микропланшет возникают проблемы с их недостаточной сорбционной способностью или наличием эллюирующих несвязанных антител (антигенов), приводящие к снижению специфичности и чувствительности метода. When using the most widespread polystyrene microplates as an immunosorbent, problems arise with their insufficient sorption ability or the presence of eluting unbound antibodies (antigens), leading to a decrease in the specificity and sensitivity of the method.
Чувствительность иммуноанализа также определяется чистотой и активностью используемых антигенов (АГ) и антител (AT). (Иммуноферментный анализ: современное состояние и тенденции развития. Обзорная информация. Серия "Медицинская генетика и иммунология" В.И.Покровский и др., вып. 3, М., 1986, с. 4-5). The sensitivity of immunoassay is also determined by the purity and activity of the antigens (AH) and antibodies (AT) used. (Enzyme-linked immunosorbent assay: current status and development trends. Overview. The series "Medical genetics and immunology" V.I. Pokrovsky et al., Issue 3, M., 1986, S. 4-5).
Известен способ диагностики сифилиса иммунофлюоресцентным методом, согласно которому с целью повышения чувствительности метода в случаях врожденного заболевания, при серорезистентных формах в качестве сорбента на предметное стекло наносят ультраозвученный трепонемный антиген, а из исследуемой сыворотки выделяют иммуноглобулин М. (Mullеr F., Immun. Infeet., 1977, р. 109-113). There is a known method for the diagnosis of syphilis by the immunofluorescence method, according to which, in order to increase the sensitivity of the method in cases of congenital disease, in case of seroresistant forms, an ultrasonically treponemal antigen is applied as a sorbent on a glass slide, and immunoglobulin M. is isolated from the test serum (Muller F., Immun. Infeet. 1977, p. 109-113).
Способ недостаточно надежен при низком содержании в сыворотке крови противотрепонемных антител, а также недостаточно экспрессен. The method is not reliable enough with a low content of antitreponemal antibodies in the blood serum, as well as insufficiently expressed.
В результате установления того факта, что сенсибилизация нейтрофилов периферической крови к трепонемному антигену вызывает выраженные изменения клеточной поверхности и внутриклеточных структур, предложены тестированные признаки повреждения нейтрофилов при воздействии на них ультраозвученной бледной трепонемой для дифференциальной диагностики заболеваний в ранней стадии (а.с. СССР 833206, A 61 B 10/00, G 01 N 38/16, от 30.05.81, Бюл. 20). As a result of the establishment of the fact that sensitization of peripheral blood neutrophils to treponemal antigen causes pronounced changes in the cell surface and intracellular structures, tested signs of neutrophil damage when exposed to ultra-voiced pale treponema for differential diagnosis of diseases at an early stage are proposed (A.S. 833206, A 61 B 10/00, G 01 N 38/16, dated 30.05.81, Bull. 20).
Применение этого способа в клинических лабораториях при массовых обследованиях достаточно сложно. The application of this method in clinical laboratories during mass screening is quite difficult.
При выявлении малых количеств патогенных микроорганизмов в исследуемых материалах используют метод избирательной сорбции микробов на иммуносорбенте с последующей их иммунофлюоресцентной и иммуноферментной индикацией. Получение иммуносорбентов осуществляется следующими методами: физической адсорбцией АГ или AT на эритроцитах, частицах целлюлозы, сефарозы и др.; химическими реакциями присоединения белковых молекул AT, полисахаридно-протеиновых молекул АГ к твердофазным сорбентам; поликонденсацией белковых молекул AT или белковых, липополисахаридных молекул АГ с помощью глютаральдегида, этилхлорформиата, борофторида, родаминизотиоцианата В, диазолил-черного С и других, веществ (В.М.Никитин, Справочник методов иммунологии, Кишинев, 1982, с.233-235). When detecting small amounts of pathogenic microorganisms in the studied materials, the method of selective sorption of microbes on an immunosorbent is used, followed by their immunofluorescence and enzyme immunoassay. Immunosorbents are prepared by the following methods: physical adsorption of AH or AT on red blood cells, cellulose particles, sepharose, etc .; chemical reactions of the addition of protein AT molecules, polysaccharide-protein AG molecules to solid phase sorbents; polycondensation of protein AT molecules or protein, lipopolysaccharide AG molecules using glutaraldehyde, ethyl chloroformate, borofluoride, rhodaminisothiocyanate B, diazolyl black C and others, substances (V.M. Nikitin, Handbook of immunological methods, Chisinau, 1982, pp. 233-235) .
Представляет интерес интенсивно развивающийся в области эпидемиологического мониторинга объектов внешней среды способ селективного концентрирования микроорганизмов на поверхности магноиммуносорбентов (МИС). При этом решается задача выявления возбудителя инфекции при низкой концентрации в исследуемом материале. Разработаны устройства и приспособления для манипуляций с МИС, начиная с отбора, транспортировки, хранения проб, переноса МИС, до проведения иммунологической реакции (Патент РФ 2098828, G 01 N 33/553, С 12 М 1/00, от 10.12.97, Бюл. 34). Of interest is the method of selective concentration of microorganisms on the surface of magnetic immunosorbents (MIS), which is intensively developing in the field of epidemiological monitoring of environmental objects. This solves the problem of identifying the causative agent of infection at a low concentration in the test material. Devices and devices have been developed for manipulating MIS, starting with the collection, transportation, storage of samples, transferring MIS, to carry out an immunological reaction (RF Patent 2098828, G 01 N 33/553, C 12 M 1/00, dated 10.12.97, Bull . 34).
Известна иммуноферментная диагностическая тест-система для выявления вируса гепатита А с использованием в качестве твердого носителя магносорбентов, сенсибилизированных антигепатитными (А) иммуноглобулинами (Патент РФ 2065164, G 01 N 33/53, от 10.08.96, Бюл. 22). An enzyme-linked immunosorbent diagnostic test system for the detection of hepatitis A virus using as a solid carrier of magnetosorbents sensitized with antihepatitis (A) immunoglobulins (RF Patent 2065164, G 01 N 33/53, from 10.08.96, Bull. 22).
Достоинствами этой тест-системы по сравнению с традиционным методом ИФА является возможность выявить наличие вируса при его дискретном поступлении и малой концентрации, селективно концентрировать вирусы непосредственно из выделений больных или других загрязненных проб и сократить время проведения анализа с 4 до 1 часа за счет поэтапного переноса МИС. The advantages of this test system compared to the traditional ELISA method are the ability to detect the presence of the virus during its discrete entry and low concentration, selectively concentrate viruses directly from the secretions of patients or other contaminated samples and reduce the analysis time from 4 to 1 hour due to the phased transfer of MIS .
Сдерживающими факторами использования МИС в диагностических тест-системах являются технологические трудности их производства. Constraining factors for the use of MIS in diagnostic test systems are the technological difficulties of their production.
В известных способах эпидемиологического мониторинга и диагностики вируса гепатита А используют МИС на основе полиакриламидных гранул, которые получают методом эмульсионной полимеризации смеси сомономеров полиакриламида и катализатора с магнитным порошком с последующими активацией поверхности магносорбентов глутаровым альдегидом в течение 18-20 часов и обработкой раствором альбумина в течение 1-3 часов (Патент РФ 2068703, А 61 К 39/395, С 12 N 11/00//G 01 N 33/53, от 10.11.96, Бюл. 31). Known methods for epidemiological monitoring and diagnosis of hepatitis A virus use MIS based on polyacrylamide granules, which are obtained by emulsion polymerization of a mixture of polyacrylamide comonomers and a catalyst with magnetic powder, followed by activation of the surface of the magnetosorbents with glutaraldehyde for 18-20 hours and treatment with an albumin solution for 1 -3 hours (RF Patent 2068703, A 61 K 39/395, C 12 N 11/00 // G 01 N 33/53, dated 10.11.96, Bull. 31).
Длительность и многостадийность процесса с использованием дорогостоящих импортных токсичных реактивов сдерживает организацию производства МИС. К тому же глутаровый альдегид гидролизуется в вoднoй среде, что приводит к неспецифической сорбции и снижению стабильности в биоспецифических процессах. The duration and multi-stage process using expensive imported toxic reagents inhibits the organization of IIA production. In addition, glutaraldehyde is hydrolyzed in an aqueous medium, which leads to nonspecific sorption and a decrease in stability in biospecific processes.
Известен способ получения иммуносорбента, в котором в качестве носителя используется силохром, обработанный аминопропилтриэтоксисиланом и активированный n-бензохиноном, с последующей иммобилизацией аминоацилазы и дополнительной стабилизирующей обработкой раствором глиоксала. А.С. СССР 1060676, С 12 N 11/14; C 12 N 9/78, от 15.12.83, Бюл. 46). A known method of producing an immunosorbent in which a silochrome is used as a carrier is treated with aminopropyltriethoxysilane and activated with n-benzoquinone, followed by immobilization of the aminoacylase and an additional stabilizing treatment with glyoxal solution. A.S. USSR 1060676, C 12 N 11/14; C 12 N 9/78, dated 12.15.83, Bull. 46).
Способ не предусматривает получение иммуносорбента с магнитными свойствами. The method does not provide for immunosorbent with magnetic properties.
Наиболее близкой к заявляемому способу является иммуноферментная тест-система для выявления антител к возбудителю сифилиса в сыворотке крови человека (Овчинников Н. М., Беднова В.Н., Делекторский В.В. Лабораторная диагностика заболеваний, передающихся половым путем. - М., 1987. - 303 с.). Closest to the claimed method is an enzyme-linked immunosorbent assay system for detecting antibodies to the causative agent of syphilis in human serum (Ovchinnikov N.M., Bednova V.N., Delektorsky V.V. Laboratory diagnosis of sexually transmitted diseases. - M., 1987 .-- 303 p.).
Диагностическая тест-система осуществляется следующим образом. В лунки полистироловых планшет, сенсибилизированных ультраозвученным антигеном из патогенных бледных трепонем, вносят исследуемую сыворотку, параллельно контрольные растворы и ингибируют в течение 30 минут при 37oС, отмывают, вносят конъюгат ферментный антиивидовой и выдерживают в термостате в течение 30 минут, промывают лунки и вносят субстрат - индикаторный реагент, планшет выдерживают в течение 1 часа при комнатной температуре в затемненном месте. Учет результатов реакции проводят по изменению окраски субстратной смеси.Diagnostic test system is as follows. The test serum is added to the wells of a polystyrene plate sensitized with an ultra-sonic antigen from pathogenic pale treponema, in parallel control solutions and inhibited for 30 minutes at 37 ° C, washed, the enzyme anti-species conjugate is introduced and the mixture is kept in an incubator for 30 minutes, the wells are washed and introduced the substrate is an indicator reagent, the tablet is incubated for 1 hour at room temperature in a darkened place. The reaction results are taken into account by changing the color of the substrate mixture.
Достоинства диагностической тест-системы по прототипу проявляются в повышении ее чувствительности за счет ферментного конъюгата, способного выявлять в сыворотке крови больных сифилисом антитела к Тrероnеmа Pallidum, которые аффинно взаимодействуют с высокоспецифичными клеточными структурами трепонемного антигена, сорбированного на поверхности полистиролового планшета. The advantages of the prototype diagnostic test system are manifested in an increase in its sensitivity due to an enzyme conjugate capable of detecting in the blood serum of patients with syphilis antibodies to Pallidum Teronema, which affinity interact with highly specific cell structures of treponemal antigen adsorbed on the surface of a polystyrene tablet.
Однако иммуносорбент, которым является сенсибилизированная антигеном полистироловая планшета, не обладает достаточной для надежной индикации микроорганизмов в малых количествах сорбционной емкостью. Кроме того, повышенная концентрация иммуноглобулинов на твердой фазе приводит к адсорбции свободносвязанных антител, которые элюируют на последующих стадиях инкубирования и отмывки и тем самым снижают чувствительность и специфичность диагностики. Процесс сорбции обратим, поэтому сенсибилизированные антигеном планшеты не подлежат долгому хранению (срок их хранения 20 дней на холоде в условиях герметизации). However, the immunosorbent, which is an antigen-sensitized polystyrene tablet, does not have a sorption capacity sufficient for reliable indication of microorganisms in small quantities. In addition, an increased concentration of immunoglobulins in the solid phase leads to the adsorption of freely bound antibodies, which elute in the subsequent stages of incubation and washing and thereby reduce the sensitivity and specificity of diagnosis. The sorption process is reversible, therefore, antigen-sensitized tablets are not subject to long-term storage (their shelf life is 20 days in the cold under sealing conditions).
ИФА тест-система не обеспечивает достаточной экспрессности диагностики, необходимой для массовых обследований. Продолжительность анализа без учета подготовительных мероприятий составляет более 2 часов. ELISA test system does not provide sufficient diagnostic rapidity necessary for mass examinations. The duration of the analysis, excluding preparatory measures, is more than 2 hours.
Целью изобретения является повышение чувствительности и специфичности диагностики на всех стадиях заболевания сифилисом, обеспечение надежности выявления инфекции при малом содержании антител в исследуемой сыворотке больного, сокращение времени анализа и снижение его трудоемкости. The aim of the invention is to increase the sensitivity and specificity of diagnosis at all stages of syphilis, ensuring the reliability of detection of infection with a low content of antibodies in the test serum of the patient, reducing analysis time and reducing its complexity.
Поставленная цель достигается двумя вариантами: ИФА и КИФА. По первому варианту, ИФА включает сенсибилизацию твердофазного носителя ультраозвученным аффинно-очищенным поливалентным трепонемным антигеном, инкубацию его с исследуемой сывороткой, а затем с моноклональными антивидовыми иммуноглобулинами пероксидазными с последующим нанесением субстрат-индикаторного реагента и промежуточные отмывки носителя при поэтапном переносе твердофазного носителя и учет результатов реакции. The goal is achieved in two ways: IFA and KIFA. According to the first option, ELISA involves sensitization of a solid-phase carrier by an ultra-sonic affinity-purified multivalent treponemal antigen, its incubation with test serum, and then with peroxidase monoclonal antispecies immunoglobulins, followed by application of a substrate-indicator reagent and intermittent washing of the carrier with the transfer of the medium and by transferring the medium to a separate transfer of the carrier .
По второму варианту, КИФА включает сенсибилизацию твердофазного носителя ультраозвученным аффинно-очищенным поливалентным трепонемным антигеном, инкубацию его с исследуемой сывороткой, а затем с иммуноглобулинами, люминесцирующими против глобулинов человека, и промежуточные отмывки носителя при поэтапном переносе твердофазного носителя и учет результатов реакции. According to the second option, KIFA includes sensitization of a solid-phase carrier by an ultra-sonicated affinity-purified multivalent treponemal antigen, its incubation with the test serum, and then with immunoglobulins luminescent against human globulins, and intermediate washing of the carrier during phased transfer of the solid-phase carrier.
По отношению к прототипу заявляемый способ диагностики, по первому варианту, имеет следующие отличительные признаки. Использование в качестве твердофазного носителя магноиммуносорбентов, сенсибилизированных трепонемным антигеном, обеспечивает селективное концентрирование на них антител против инфекции, в том числе при их малой концентрации в исследуемом материале. In relation to the prototype of the inventive diagnostic method, according to the first embodiment, has the following distinctive features. The use of magnetic immunosorbents sensitized with treponemal antigen as a solid-phase carrier provides selective concentration of anti-infection antibodies on them, including at their low concentration in the test material.
Выбор органокремнеземного сорбента - алюмосиликата с рыхлой структурой и хорошо развитой поверхностью обеспечивает в процессе гелеобразования с декстраном достаточно стабильное внедрение магнитных частиц в структуру сорбента и большую реакционную поверхность и сорбционную емкость. В совокупности с использованием для иммобилизации высокоспецифичного трепонемного антигена и конъюгата иммунопероксидазного моноклонального против глобулинов человека для образования иммунного комплекса предлагаемые твердофазные носители обеспечивают повышение надежности, чувствительности и специфичности диагностики. Возможность поэтапного переноса твердофазного носителя в исследуемый материал, конъюгирующий и субстратные реагенты, в промывочные растворы за счет их магнитных свойств обеспечивает сокращение времени анализа и снижение трудоемкости. The choice of organosilicon sorbent - aluminosilicate with a loose structure and a well-developed surface provides a fairly stable incorporation of magnetic particles into the sorbent structure and a large reaction surface and sorption capacity during gel formation with dextran. Together with the use for immobilization of a highly specific treponemal antigen and conjugate of immunoperoxidase monoclonal against human globulins for the formation of the immune complex, the proposed solid-phase carriers provide increased reliability, sensitivity and specificity of diagnosis. The possibility of phased transfer of the solid-phase carrier into the test material, conjugating and substrate reagents, in the washing solutions due to their magnetic properties, reduces the analysis time and reduces the complexity.
Кроме того, используемые композиционные магноиммуносорбенты (КМИС) при их лиофильном высушивании гораздо стабильнее в хранении, чем полистироловые планшеты. In addition, the composite magnetic immunosorbents (KIIS) used during their freeze drying are much more stable in storage than polystyrene tablets.
Способ получения КМИС заключается в следующем: смесь, состоящую из 2,5 г алюмосиликатного наполнителя и 0,5 г магнитного порошка, суспендировали в 40 мл 0,2-0,4%-ного водного раствора полиглюкина и далее выдерживали при комнатной температуре один час. Полученный сорбент высушивали при 100-110oС в течение 30 минут. К одному грамму полученного препарата добавляли 12 мл 23%-ного раствора хлорида натрия и 1 мл вторичного алкилсульфата натрия. Смесь инкубировали 1-2 часа при температуре 37oС, затем сорбент отмывали 100 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида и 100 мл дистиллированной воды. К 0,1 г активированною сорбента приливали 1 мл УЗТА с содержанием белка 3,5 мг/мл. Смесь оставляли при 37oС в течение одного часа. Далее надосадочную жидкость удаляли, а носитель промывали 0,9%-ным раствором натрия хлорида до "0" экстинции на спектрофотометре. Магноиммуносорбенты подвергали лиофилизации.The method of obtaining KIIS consists in the following: a mixture consisting of 2.5 g of aluminosilicate filler and 0.5 g of magnetic powder was suspended in 40 ml of a 0.2-0.4% aqueous solution of polyglucin and then kept at room temperature for one hour . The resulting sorbent was dried at 100-110 o C for 30 minutes. To one gram of the resulting preparation was added 12 ml of a 23% sodium chloride solution and 1 ml of secondary sodium alkyl sulfate. The mixture was incubated for 1-2 hours at a temperature of 37 o C, then the sorbent was washed with 100 ml of 0.9% sodium chloride solution and 100 ml of distilled water. To 0.1 g of activated sorbent was added 1 ml of UZTA with a protein content of 3.5 mg / ml. The mixture was left at 37 ° C. for one hour. Next, the supernatant was removed, and the carrier was washed with 0.9% sodium chloride solution to “0” extinction on a spectrophotometer. Magnoimmunosorbents were lyophilized.
Полученные композиционные алюмосиликатные магноиммуносорбенты представляли собой высокодисперсные микрогранулы неправильной формы с ярко выраженными магнитными свойствами, обладающие хорошей смачиваемостью и эффективным оседанием в растворе, отсутствием склонности к конгломерации. Сорбенты имели размеры гранул от 20 до 100 мкм. Среднее значение их удельной поверхности 117 м/г, средний радиус пор 35 нм, объем пор - 1,7 см/г. The obtained composite aluminosilicate magnetoimmunosorbents were highly dispersed irregularly shaped microspheres with pronounced magnetic properties, with good wettability and effective sedimentation in solution, and lack of tendency to conglomeration. Sorbents had granule sizes from 20 to 100 microns. The average value of their specific surface is 117 m / g, the average pore radius is 35 nm, and the pore volume is 1.7 cm / g.
Способ диагностики сифилиса осуществляют следующим образом: по первому варианту - во флаконы (типа пенициллиновых) вносили по 0,1 мл 10%-ной взвеси Треп-КМИС. Зачем в опытные флаконы вносили по 0,2 мл исследуемых сывороток, во флаконы с отрицательным контролем - 0,2 мл фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБ), во флаконы с положительным контролем - 0,2 мл положительно реагирующей сыворотки. Через 20-30 мин инкубации при температуре 37oС после тщательной промывки гранул сорбента с помощью постоянного магнита во все флаконы (опытные и контрольные) вносили по 0,2 мл конъюгата иммунопероксидазного моноклонального против глобулинов человека в рабочем разведении. Через 20-30 минут после отмывки гранул во флаконы вносили по 0,2 мл субстрат-индикаторного раствора (на 10 мл цитратного буферного раствора 10 мг орто-фенилендиамина и 40 мкл 33%-ной перекиси водорода). Реакцию останавливали внесением во флаконы 0,05 мл 2М серной кислоты. Учет результатов проводили визуально через 1-5 минут. При положительном результате происходило оранжево-коричневое окрашивание, при отрицательном раствор ингредиентов реакции оставался бесцветным. Для учета результатов на сканирующем устройстве "Мультискап" содержимое флаконов после остановки реакции переносили в микропланшеты и снимали показания прибора при 492 нм. Положительным считали пробы, показатели цвета которых в 1,5 и более раз превышали контрольные.A method for diagnosing syphilis is carried out as follows: according to the first embodiment, 0.1 ml of a 10% suspension of Trep-KMIS is added to vials (such as penicillin). Why 0.2 ml of test sera were added to the test bottles, 0.2 ml of phosphate-buffered saline (FSB) to the bottles with the negative control, and 0.2 ml of the positive reacting serum to the bottles with the positive control. After 20-30 min of incubation at a temperature of 37 o C after thorough washing of the sorbent granules with a permanent magnet, 0.2 ml of immunoperoxidase monoclonal conjugate against human globulins in working dilution was added to all bottles (experimental and control). After 20-30 minutes after washing the granules, 0.2 ml of substrate-indicator solution was added to the vials (10 ml of orthophenylenediamine and 40 μl of 33% hydrogen peroxide per 10 ml of citrate buffer solution). The reaction was stopped by adding 0.05 ml of 2M sulfuric acid to the vials. Analysis was carried out visually after 1-5 minutes. With a positive result, an orange-brown staining occurred, with a negative solution of the reaction ingredients remained colorless. To take into account the results on a Multiskap scanning device, the contents of the vials after stopping the reaction were transferred to microplates and the readings were taken at 492 nm. Samples were considered positive, the color indices of which were 1.5 times or more higher than the control ones.
Таким образом, магноиммуносорбенты при контакте со специфическими антителами осуществляли динамическое, селективное их концентрирование, образуя иммунный комплекс, в дальнейшем определяемый пероксидазной реакцией. Thus, in contact with specific antibodies, magneto-immunosorbents carried out their dynamic, selective concentration, forming an immune complex, which is further determined by the peroxidase reaction.
Сравнительную оценку эффективности и чувствительности разработанной тест-системы проводили с 539 сыворотками крови больных различными формами сифилиса: до лечения, в процессе и по окончании лечения. Треп-КМИС при серодиагностике сифилиса в ИФА на 0,9% выше по полному расхождению результатов и на 2,3% - по степени позитивности теста по сравнению с ультраозвученным трепонемным антигеном в реакции связывания комплемента (РСК). В том числе, при первичном серонегативном сифилисе полное расхождение результатов в пользу Треп-КМИС составило 8,3% случаев, а при сифилисе первичном серопозитивном - 1,8% случаев. A comparative assessment of the effectiveness and sensitivity of the developed test system was carried out with 539 blood serums of patients with various forms of syphilis: before treatment, during and after treatment. Trep-KIIS with serodiagnosis of syphilis in ELISA is 0.9% higher in the complete discrepancy between the results and 2.3% in the degree of positivity of the test compared to the ultra-sonic treponemal antigen in the complement binding reaction (CSC). Including, with primary seronegative syphilis, the complete discrepancy between the results in favor of Trep-KIIS was 8.3% of cases, and with primary seropositive syphilis - 1.8% of cases.
При исследовании 230 сывороток больных сифилисом в процессе и по окончании лечения удалось установить, что позитивность теста при использовании Треп-КМИС в ИФА выше на 4,3% случаев по сравнению с РСК и на 1,7% выше по полному расхождению результатов. In the study of 230 sera of patients with syphilis during and at the end of treatment, it was found that the test positiveness when using Trep-KIIS in ELISA is higher by 4.3% of cases compared with CSC and 1.7% higher by a complete discrepancy of results.
Контрольной группой служили сыворотки крови 209 лиц, свободных oт сифилитической инфекции. Установлена специфичность теста 99,7%, в то время как исследуемые сыворотки в РСК с УЗТА были специфичны в 99,2% случаев. The control group was the serum of 209 individuals free of syphilitic infection. The specificity of the test was found to be 99.7%, while the test sera in RSCs with USTA were specific in 99.2% of cases.
Способ диагностики сифилиса по второму варианту (КИФА) во флаконы (типа пенициллиновых) вносили по 0,1 мл 10% взвеси Треп-КМИС. Затем в опытные флаконы вносили по 0,2 мл исследуемых сывороток, во флаконы с отрицательным контролем - 0,2 мл фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБ), во флаконы с положительным контролем - 0,2 мл положительно реагирующей сыворотки. Через 20-30 минут инкубации при температуре 37oС после тщательной промывки гранул сорбента с помощью постоянного магнита во все флаконы (опытные и контрольные) вносили по 0,2 мл иммуноглобулинов, люминесцирующих против глобулинов человека. Инкубировали 30 минут, отмывали ЗФР трижды и один раз в дистиллированной воде, переносили содержимое флаконов на стекло и проводили учет результатов.The method for the diagnosis of syphilis according to the second variant (CIFA) in vials (such as penicillin) was introduced into 0.1 ml of 10% suspension Trep-KMIS. Then, 0.2 ml of the tested sera were added to the test bottles, 0.2 ml of phosphate-buffered saline (FSB) to the bottles with the negative control and 0.2 ml of the positively reacting serum to the bottles with the positive control. After 20-30 minutes of incubation at a temperature of 37 ° C after thorough washing of the sorbent granules with a permanent magnet, 0.2 ml of immunoglobulins luminescent against human globulins were introduced into all bottles (experimental and control). They were incubated for 30 minutes, washed with PBS three times and once in distilled water, the contents of the vials were transferred to glass and the results were recorded.
Количественный учет интенсивности флуоресценции гранул магнитных сорбентов осуществляли с помощью люминесцентного микроскопа с фотометрической насадкой. Разницу свечения гранул и фона, определяемую с помощью зонда, последовательно наведенного на гранулы сорбента, и промежуток между ними выражали в относительных единицах и принимали за величину, характеризующую интенсивность флуоресценции гранул. Положительным результатом считали разницу в интенсивности флюоресценции гранул магнитных сорбентов и контрольных проб более чем в два раза. Quantitative accounting of the fluorescence intensity of granules of magnetic sorbents was carried out using a luminescent microscope with a photometric nozzle. The difference between the luminescence of the granules and the background, determined using a probe sequentially directed to the sorbent granules, and the gap between them were expressed in relative units and were taken as a value characterizing the intensity of fluorescence of the granules. More than two times the difference in the fluorescence intensity of granules of magnetic sorbents and control samples was considered a positive result.
Таким образом, преимущества заявляемого способа диагностики в сопоставлении с коммерческими тест-системами для диагностики сифилиса проявляются в повышении чyвcтвитeльнocти на 1,5-1,7%, специфичности на 0,4-0,6%. Время анализа сокращено с 2 до 1 часа. Используемые КМИС позволят организовать выпуск высокочувствительных и специфичных тест-систем для диагностики сифилиса методами ИФА и КИФА. Thus, the advantages of the proposed diagnostic method in comparison with commercial test systems for the diagnosis of syphilis are manifested in an increase in sensitivity by 1.5-1.7%, specificity by 0.4-0.6%. Analysis time reduced from 2 to 1 hour. Used KIIS will organize the release of highly sensitive and specific test systems for the diagnosis of syphilis by ELISA and KIFA methods.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU99124840/14A RU2200327C2 (en) | 1999-11-25 | 1999-11-25 | Method for diagnostics of syphilis (variants) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU99124840/14A RU2200327C2 (en) | 1999-11-25 | 1999-11-25 | Method for diagnostics of syphilis (variants) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU99124840A RU99124840A (en) | 2001-08-20 |
| RU2200327C2 true RU2200327C2 (en) | 2003-03-10 |
Family
ID=20227380
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU99124840/14A RU2200327C2 (en) | 1999-11-25 | 1999-11-25 | Method for diagnostics of syphilis (variants) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2200327C2 (en) |
-
1999
- 1999-11-25 RU RU99124840/14A patent/RU2200327C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ДМИТРИЕВ Г.А. Тест-системы в лабораторной диагностике сифилиса. - Вестник дерматологии и венерологии, 1996, №6, с.34-37. * |
| ОВЧИННИКОВ Н.М. и др. Лабораторная диагностика заболеваний, передающихся половым путем. - М.: 1987. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0462644B1 (en) | Biologically active reagents prepared from carboxy-containing polymer, analytical element and methods of use | |
| US4407943A (en) | Immobilized antibody or antigen for immunoassay | |
| US4948726A (en) | Enzyme immunoassay based on membrane separation of antigen-antibody complexes | |
| EP0279517B1 (en) | Non-immunochemical binding of lipopolysaccharides and sandwich essays therefore | |
| EP0126772A1 (en) | Chromogenic support immunoassay | |
| US5075220A (en) | Determination of a chlamydial or gonococcal antigen using a positively-charged ionically binding support | |
| US5155022A (en) | Assay for lyme disease | |
| AU621310B2 (en) | Immunometric assay kit and method applicable to whole cells | |
| CA2046130A1 (en) | Biologically active reagent, analytical element and methods for use of the reagent | |
| JP2003215126A (en) | Method for extracting microbe antigen | |
| US3914400A (en) | Stable antigen-erythrocytes for measuring antibodies against toxoplasma organism | |
| US20080206790A1 (en) | Assay for determining the presence or amount of newly synthesized antibodies | |
| JPH0743384B2 (en) | Aqueous washing solution for assay, diagnostic test kit, and method for measuring herpes simplex virus | |
| WO2007013401A1 (en) | Immunoassay method and immunoassay kit to be used therein | |
| RU2200327C2 (en) | Method for diagnostics of syphilis (variants) | |
| WO1987006620A1 (en) | Diagnostic kit for sexually transmitted diseases | |
| Van der Sluis | Laboratory techniques in the diagnosis of syphilis: a review. | |
| EP0152254A2 (en) | Chromogenic support immunoassay utilizing labeled complement components | |
| RU2376604C2 (en) | Method for detection of antigen or antibody in immune-enzyme analysis | |
| JPH10339731A (en) | Method for detecting intestinal bleeding colon bacillus infection | |
| Lehman | Immunodiagnosis of Infectious Diseases | |
| AU2021100489A4 (en) | Ultra-High Sensitive Assay Kit for Brucellosis | |
| EP0233048A2 (en) | Method of detecting urinary tract infection or inflammation | |
| JPH0212062A (en) | Biological specificity assay using induced glass surface | |
| JP2892814B2 (en) | Assay method for anti-tuberculosis antibody-like substance |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20031126 |