RU2199730C2 - Система детектирования флуоресценции для определения значимых параметров растительности - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к оптике. Описана система для определения значимых параметров растительности, в базовую конфигурацию которой входят лазерный источник возбуждения с высокой частотой повторения импульсов, который стимулирует флуоресценцию молекул хлорофилла, детектор флуоресценции, включающий оптические системы формирования изображения и разделения измерительных каналов, электронный блок запуска и формирования задержки для соответствующей синхронизации лазера и детектора и электронный измерительный блок для детектирования сигнала флуоресценции, который представляет собой модуль регистрации и обработки сигнала. Технический результат - снижение влияния фонового сигнала на результаты определения. 51 з.п. ф-лы, 6 ил.

Description

Настоящее изобретение относится к системе детектирования флуоресценции для определения значимых параметров растительности, имеющей источник возбуждения, представляющий собой маломощный лазер, предназначенный для генерирования возбуждающего излучения в красной области спектра, лучеобразующее оптическое устройство, дихроичный делитель луча, базовый детектор флуоресценции, включающий входное оптическое устройство, предназначенное для приема излучения флуоресценции, прошедшего через дихроичный делитель луча, и интерференционный светофильтр, задерживающий сигнал упругорассеянного в обратном направлении света, а также имеющей электронный измерительный блок, предназначенный для детектирования сигнала флуоресценции, и электронный блок запуска и синхронизации.

Сначала рассмотрено явление флуоресценции молекул хлорофилла. Поглощенное растениями из спектра солнечного излучения (380 <λ <750 нм) фотосинтетически активное излучение (ФАИ) используется ими главным образом для преобразования поглощенной энергии света в энергию химических связей (фотосинтез) и накопления в виде химической энергии. Этот процесс напрямую связан с поглощением (ассимиляцией) диоксида углерода и высвобождением кислорода (что обычно называют продуктивностью). Существуют два других возможных пути, обеспечивающих поддержание энергетического равновесия у растений в результате поглощения энергии. Так, в частности, для подобного регулирования могут использоваться, во-первых, испускание тепловой энергии, а во-вторых, испускание излучения флуоресценции.

Тепловая энергия складывается из солнечной энергии видимой области (ВО) и коротковолновой инфракрасной (КВИК) области спектра солнечного излучения. КВИК-излучение напрямую поглощается водой, содержащейся в листьях. В отличие от этого при поглощении ВО-излучения происходит экситонный перенос энергии внутри служащего светособирающей антенной пигмента реакционных центров (фотосистема (ФС) I; фотосистема (ФС) II) и светособирающего комплекса (ССК). В этом процессе энергия поглощенного фотона преобразуется в энергию, необходимую фотосистемам ФС I и ФС II. Излишек энергии запасается на колебательных и вращательных энергетических уровнях и таким путем в конечном счете преобразуется в тепло.

В ФС I и ФС II поглощенная энергия может использоваться в так называемых фотореакциях, преобразовываться в тепло или в конечном итоге испускаться в виде излучения флуоресценции. Флуоресценцию в красной области спектра испускают молекулы хлорофилла, находящиеся в ФС I, ФС II и в ССК. Вероятность преобразования энергии в тепло и флуоресценцию считаются постоянными во времени, тогда как скорость преобразования энергии в фотореакции рассматривается как функция состояния реакционного центра (цепь переноса электронов) и степени фосфорилирования фотосинтетически активных клеточных мембран. Долю возбужденной солнечным светом флуоресценции F_солн(t), которая испускается реакционными центрами, можно описать следующим уравнением (1):

где k_i означают вероятность преобразования энергии во флуоресценцию, тепло и продукты фотосинтеза соответственно,
φ(t) означает состояние реакционного центра,
M(t) означает фосфорилирование мембраны,
I_{погл.солн} означает спектральную плотность потока поглощенного солнечного излучения.

Как следует из приведенного выше уравнения, характеристика зависящей от времени флуоресценции молекул хлорофилла позволяет судить об относительном изменении фотосинтетической активности, если предположить, что φ и М являются функциями времени.

Ниже рассмотрены основные принципы детектирования и анализа интенсивности флуоресценции молекул хлорофилла.

Сложность детектирования возбужденной солнечным светом флуоресценции молекул хлорофилла обусловлена тем, что на сигнал флуоресценции накладывается отраженный свет (пассивный спектр). На долю сигнала флуоресценции, испускаемой листьями или растительным покровом, приходится всего лишь порядка нескольких процентов от уровня полного сигнала. Поэтому для измерения флуоресценции молекул хлорофилла в самых разнообразных целях были разработаны различные методы измерений, в которых использовались дополнительные источники света.

Обычно к энергетической экспозиции солнечного излучения (инсоляции) I_{погл.солн} добавляется модулированный или импульсный источник света, индуцирующий появление модулированного или импульсного сигнала флуоресценции F_доп(t), который накладывается на сигнал F_солн(t) флуоресценции, возбужденной солнечным светом, и сигнал ОС(λ) отраженного света. При использовании для возбуждения лазерного источника возникает так называемая люминесценция с лазерным возбуждением (ЛЛВ). При этом уравнение (1) приобретает следующий вид:

Полный сигнал, который обычно детектируется, состоит из суммы всех сигналов флуоресценции и сигнала ОС(λ) отраженного света. Соответствующая техника позволяет отделить сигнал флуоресценции, возбужденной дополнительным источником света, от пассивного спектра и от флуоресценции, возбужденной солнечным светом, даже в условиях дневной освещенности на расстоянии в пределах от нулевого при прямом контакте с источником флуоресценции (патент DE 3518527 на имя Schreiber, 1986, заявка ЕР 0434644 В1 на имя Mazzinghi, 1991) до одного метра (патент US 5412219 на имя Chappelle, 1995) и даже нескольких сотен метров (заявка ЕР 0419425 В1 на имя Cecchi Pantani, 1995).

Важным техническим требованием, предъявляемым ко всем системам как для контактных, так и дистанционных измерений, является использование такого дополнительного источника света, который, с одной стороны, должен быть достаточно сильным для того, чтобы интенсивность сигнала возбужденной флуоресценции превышала интенсивность излучения пассивного спектра, но который, с другой стороны, должен быть достаточно слабым, чтобы не нарушалось физиологическое состояние фотосинтетической системы.

В хорошо известном флуориметре с амплитудно-импульсной модуляцией (АИМ) (патент DE 3518527 на имя Schreiber и др., 1986) флуоресценция молекул хлорофилла возбуждается слабым измерительным световым излучением (красный светоизлучающий диод (СИД)) через оптическое волокно без изменения фотосинтетического состояния растения. Флуоресценция передается по оптическому волокну к фотодиоду, который детектирует все излучение флуоресценции с длиной волны выше 700 нм. Включенное измерительное световое излучение не стимулирует никакой фотосинтетической активности в растениях, адаптированных к темноте.

Облучение листа, адаптированного к темноте, интенсивной световой вспышкой длительностью от нескольких миллисекунд до нескольких секунд (называемой насыщающим световым импульсом) вызывает максимально возможную флуоресценцию (обозначаемую Fm), но не индуцирует фотосинтез. Непрерывное облучение ненасыщающим светом (называемым актиничным светом) индуцирует фотосинтетическую активность. После облучения в течение определенного периода времени, составляющего от нескольких секунд до нескольких минут, все способствующие протеканию процесса фотосинтеза реакции приходят в равновесие с испускаемым источником света световым излучением, и интенсивность флуоресценции тем самым достигает установившегося значения Fs. Переходный процесс при флуоресценции, связанный с изменением ее интенсивности во время облучения адаптированных к темноте листьев, называется эффектом Каутцкого (Kautzky). На фиг. 1 в качестве примера приведена полученная в результате измерений диаграмма кинетики Каутского для огурца. Флуоресценция, обнаруженная на длине волны 685 нм, возбуждалась исключительно лазерными импульсами. Облучение светом от точечной галогенной лампы мощностью 500 Вт влияло только на фотосинтетическое состояние, а тем самым и на k_фото. На долю подобного света в сигнале флуоресценции, прежде всего в качестве возбуждающего источника, приходится пренебрежимо малая величина. АИМ-флуориметр обычно работает в прямом контакте с листьями, но может быть использован и для дистанционного измерения при удалении от исследуемого объекта на несколько сантиметров.

Ниже рассмотрены основные принципы детектирования и анализа соотношения интенсивностей красной флуоресценции.

При возбуждении УФ-излучением в типичном спектре флуоресценции растения присутствуют две доминирующие полосы (фиг. 2): одна в диапазоне от 400 до 600 нм (называемая сине-зеленой (СЗ) флуоресценцией), а другая в диапазоне от 650 до 800 нм (называемая красной флуоресценцией; F685, F730). На фиг. 2 в качестве примера приведена диаграмма, на которой показан спектр флуоресценции кукурузы, выращенной в теплице. Источником флуоресценции на длинах волн 685 нм и 730 нм (обозначается как F685 и F730) является только хлорофилл, содержащийся в листьях. Источником сине-зеленой (СЗ) флуоресценции являются главным образом фенольные компоненты клеточных стенок.

Характеристики эмиссии здоровых растений тесно связаны с морфологией растения, например с такими параметрами, как состав и концентрация пигментов. Если растения заражены грибами, то в спектре излучения возможно появление указывающих на это дополнительных признаков.

Из экспериментальных данных известно, что излучение на длинах волн 685 и 730 нм связано, как описано выше, с фотосинтезирующей системой, и поэтому его изменения во времени на обеих длинах волн практически одинаковы. И наоборот, отношение интенсивностей флуоресценции F685/F730 для отдельного растения или листа постоянно во времени и зависит только от оптических свойств листа (уравнение (2)):

где Ψ означает спектральную характеристику флуоресценции на длинах волн λ 685 и 730 нм,
β означает коэффициент рассеяния на длинах волн λ 685 и 730 нм,
с означает концентрацию хлорофилла,
α означает коэффициент удельного поглощения на длинах волн λ 685 и 730 нм,
d означает толщину листа,
А представляет собой константу, которая также содержит коэффициенты α, β, c, d.

Спектр излучения флуоресценции перекрывается с полосами поглощения пигмента при длине волны около 685 нм (фиг. 3), и поэтому испускаемые фотоны (флуоресценции) селективно повторно поглощаются при их прохождении через ткани листа, в результате чего отношение F685/F730 приобретает вид экспоненциальной зависимости от таких параметров, как средняя длина свободного пробега света в листе, коэффициент рассеяния и концентрация хлорофилла. На фиг. 3 показана диаграмма, отражающая форму кривой удельного поглощения (α) излучения молекулами хлорофилла и форму кривой соответствующего спектра флуоресценции (Ψ).

При переходе растений от полностью адаптированного к темноте состояния к адаптированному к свету состоянию проявляется единственное изменение описанной выше временной зависимости отношения интенсивностей флуоресценции. Было установлено, что подобное небольшое изменение происходит при переходе от темноты к освещенности, соответствующей раннему утру, от послеполуденной освещенности к вечерней освещенности и в кинетике Каутцкого. Никакой существенной зависимости или корреляции между соотношением интенсивностей красной флуоресценции и общей энергетической экспозицией при дневном освещении не было выявлено. Поэтому предполагается, что эти изменения связаны с изменениями оптических свойств листовых тканей. Подобное явление можно было бы объяснить изменением ориентации органелл растения (например, хлоропластов) в сторону источника освещения, однако этот вопрос остается объектом дальнейших исследований.

Тем не менее, это соотношение позволяет измерять относительные изменения концентрации хлорофилла для данного вида растений, если предположить, что отдельные растения одного вида имеют схожую морфологию. Это означает, что коэффициент рассеяния внутри листа и геометрия листа являются сравнимыми показателями.

У Mazzinghi (заявка ЕР 0434644 В1, 1991, и статься Р. Mazzinghi: "A laser diod fluorimeter for field measurements of the F685/F730 chlorophyll fluorescence ratio", опубликованная в "Review of Scientific Instruments", т. 67, 10, октябрь 1996, стр. 3737-3744, ХР000635835, Нью-Йорк, США) описан "прибор для двухканальных измерений флуоресценции молекул хлорофилла". Эта портативная компактная система предназначена для прямого контактного измерения соотношения интенсивностей флуоресценции F690/P730 (соответственно F685/F730), а также для измерения значения R_FD на обеих длинах волн с использованием гелий-неонового или диодного лазера в качестве источников непрерывного возбуждения. При работе в условиях полной освещенности солнечным светом в полученных при каждом измерении результатах необходимо отдельно учитывать (и затем вычитать) остаточный фоновый свет (пассивный спектр) из-за прямого отражения света от листа, поскольку подобное фоновое световое излучение невозможно полностью подавить с помощью фильтра, установленного на образце.

Ниже рассмотрена сине-зеленая (СЗ) флуоресценция.

Выявить происхождение и идентифицировать источник СЗ-флуоресценции значительно сложнее, и она все еще является предметом научных дискуссий. Источником сине-зеленой флуоресценции являются в основном стенки клеток в верхнем слое листьев, и лишь небольшая ее часть испускается клетками, расположенными на более глубоких слоях.

У хлоропластов синей флуоресценции не наблюдается, поскольку доминирующей является красная флуоресценция молекул хлорофилла. Однако известно, что НАДФ•Н в хлоропластах испускает синюю флуоресценцию. Было установлено также, что на клеточном уровне флуоресцирующие коферменты, такие как НАД•Н или НАД(Ф)•Н, являются исключительно чувствительными биоиндикаторами метаболических процессов, таких как расщепление глюкозы или дыхание. Таким образом, синее излучение НАДФ•Н зависит от физиологического состояния растения.

У листьев излучение, испускаемое ферментами и коферментами, полностью маскируется излучением, испускаемым клеточной стенкой, в которой присутствуют несколько компонентов растений. Хорошо известно, что растительные фенольные соединения, феруловая, хлорогеновая и кофеиновая кислоты, а также кумарины являются источниками синей флуоресценции, а алкалоиды и флавонолы являются источниками зеленой флуоресценции.

Далее рассмотрены основные принципы детектирования и анализа интенсивности СЗ-флуоресценции.

В настоящее время на основе существующих знаний о СЗ-флуоресценции не существует общепринятой методики анализа полной интенсивности СЗ-флуоресценции. При этом с высокой степенью надежности идентифицированы многие ее источники, однако их влияние на интенсивность полного сигнала до сих пор не известно.

Связь с механизмом фотосинтеза, сравнимая с описываемой уравнением (1), была выявлена только для флуоресценции НАДФ•Н. Если предположить, что СЗ-флуоресценция от всех других ее источников не зависит от времени, то можно контролировать и подобные переходные или неустойчивые процессы СЗ-флуоресценции.

В целом источником излучения являются другие компоненты растения, например эпидермальный слой клеток, прежде всего клеточные стенки, или же вакуоли, а также клетки мезофилла. Все эти компоненты не содержат хлорофилла, а следовательно, не влияют на фотосинтез. Однако основной информацией, которую можно получить на основе анализа интенсивности СЗ-флуоресценции, является оценка количества пигментов растения (ткани), излучающих в этой спектральной области.

Далее рассмотрены основные принципы детектирования и анализа параметров соотношения интенсивностей СЗ-флуоресценции.

Определение спектральных характеристик СЗ-флуоресценции при особом учете одновременно измеряемой красной флуоресценции предоставляет возможность нормировать интенсивность флуоресценции (на интенсивность флуоресценции молекул хлорофилла) и позволяет тем самым сделать процесс измерения менее чувствительным к калибровке и флуктуациям сигнала при последовательно проводимых измерениях.

В этом отношении были исследованы по крайней мере четыре различных аспекта, которые были подтверждены в сравнительных лабораторных или полевых экспериментах и которые можно дифференцировать по спектральным характеристикам в синей, зеленой и красной областях спектра:
- идентификация одно- и двудольных растений (синяя-зеленая-красная),
- синтез защищающих от УФ-излучения пигментов (УФ-стресс) (синяя-красная)
- заражение ложной мучнистой росой, ржавчиной и иными болезнями (грибами) (синяя-зеленая-красная),
- обнаружение некроза листа в иглах сосны (синяя-зеленая).

Когда поверхность листа покрыта другим органическим материалом, например в случае заражения грибами, спектр флуоресценции инфицированного листа изменяется двумя различными путями:
- собственная флуоресценция грибов селективно усиливает (или изменяет) СЗ-флуоресценцию,
- грибы на поверхности снижают интенсивность красной флуоресценции, поглощая возбуждающий свет и тем самым уменьшая глубину его проникновения. Аналогичный эффект наблюдается в том случае, если возбуждающий свет диффузно отражается дополнительным слоем ткани на поверхности растения.

Последний эффект известен также в случае образования внутри вакуолей эпидермальных клеток защищающих от УФ-излучения пигментов, которые препятствуют проникновению возбуждающего УФ-излучения в более глубокие клеточные слои и в результате селективно подавляют флуоресценцию молекул хлорофилла. Обычно эти пигменты (например, антоцианин) являются веществами, которые только поглощают излучение и не влияют поэтому на полный сигнал флуоресценции.

Для успешного сбора данных необходимо выполнение следующих предварительных условий.

В первую очередь следует учитывать, измеряется ли актиничный или неактиничный свет. В зависимости от целей исследования может возникнуть необходимость исключить влияние источника возбуждающего света на фотосистему. Во всех случаях, когда интенсивность флуоресценции имеет существенное значение при измерениях, возбуждение не должно влиять на состояние растения. Это состояние должно зависеть только от окружающих параметров, таких как инсоляция, жизнеспособность или состояние здоровья растения.

Возможность заранее исключить влияние возбуждения позволяет измерять освещенность и в результате оценивать соответственно жизнеспособность или состояние здоровья растения.

Сказанное практически не относится к измерению относительной концентрации хлорофилла, поскольку обе полосы излучения флуоресценции одинаково зависят от этой концентрации, однако уже при сравнении красной флуоресценции с синей флуоресценцией различие в происхождении полос излучения указывает на необходимость контролировать интенсивность излучения в максимально возможной степени.

С другой стороны, невозмущенная (возбуждающим светом) фотосистема позволяет получить характеризующую растения информацию за счет контроля параметров окружающей среды. Изменение, например, приходящей световой энергии или состояния здоровья растения позволяют установить правила проведения измерений, чтобы интерпретация флуктуаций интенсивности флуоресценции стала возможной. Подобный подход широко используется в уже упоминавшейся выше АИМ-флуорометрии или при ежедневных измерениях с помощью лидарных систем для проведения измерений в поле в дальней зоне (в зоне Фраунгофера).

Помимо этого необходимо учитывать отношение сигнал-фон. Отношение сигнал-фон для активно возбужденной флуоресценции определяется как сумма количества фотонов, пассивно отраженных листовыми тканями (ОС), фотонов возбужденной солнечным светом флуоресценции (F_солн) и фотонов излученной флуоресценции (стимулированной возбуждающим измерительным светом (F_доп)), деленная на сумму количества фотонов, пассивно отраженных тканями листа (ОС), и фотонов возбужденной солнечным светом флуоресценции (F_солн).

С целью определить вклад каждого из этих сигналов, т.е. полезного сигнала и фонового излучения, в полный детектируемый сигнал необходимо определять каждый из них. В технике лидарных систем для проведения измерений в поле в дальней зоне интенсивность возбуждающего импульса настолько высока, что интенсивность пассивного фона пренебрежимо мала в сравнении с возбужденной флуоресценцией. Однако основные недостатки этого метода заключаются в высокой стоимости соответствующей системы возбуждения (лазера), в исключительно высоких затратах на обеспечение работы лазера (энергопитание, ограничения по безопасности для зрения, использование высокоточной оптики) и в неопределенности условий освещенности в месте расположения растения при проведении измерений.

Кроме того, необходимо учитывать также отношение сигнал-шум. В моноимпульсном режиме работы отношением сигнал-шум определяется, способна ли система детектирования измерять сигнал флуоресценции от каждого возбуждающего импульса. Основными источниками шума, определяющими отношение сигнал-шум, являются следующие:
- чувствительность детектора фотонов,
- мощность фонового сигнала (S_t1),
- мощность сигнала активной флуоресценции (F_лазер),
- расстояние, на котором проводится измерение,
- входная апертура системы детектирования.

Первый источник определяется характеристиками детектора, тогда как остальные три зависят от так называемого "дробового шума".

Фотоэлектронные умножители (ФЭУ), прежде всего при работе в непрерывном режиме, являются детекторами с исключительно низким уровнем шумов, который значительно ниже уровня фотонного (дробового) шума даже при высоком коэффициенте усиления. Оптическая система сравнительно больших размеров для того чтобы она была способна собирать фотоны флуоресценции в количестве, достаточном для исключения вносимых дробовым шумом искажений сигнала, позволяет работать в моноимпульсном режиме. Сказанное является обязательным условием во всех случаях, когда положение исследуемого объекта (мишени) быстро изменяется.

Если мишень неподвижна относительно системы детектирования, то можно использовать, например, метод вхождения в синхронизм с целью отделить зашумленный сигнал флуоресценции от шумов, вносимых любым иным источником, независимо от того, является ли они дробовыми шумами или шумами детектора. В этом случае можно снизить требования к оптической системе (уменьшение апертуры) или заменить фотоэлектронный умножитель на более дешевый лавинный или обычный фотодиод.

В патенте US 5426306 описан флуориметр с высокой частотой повторения импульсов, предназначенный для измерений in vivo флуоресценции фитопланктона или высших растений с использованием серий повторяющихся с высокой частотой возбуждающих вспышек. Подобная система возбуждает изменяющуюся во времени флуоресценцию, что позволяет определять параметры фотосинтеза, такие как сама изменяющаяся во времени флуоресценция, эффективное сечение поглощения, скорость потока электронов и повторяемость процессов фотосинтеза. Описанное в указанном патенте устройство используется для измерения флуоресценции образцов как функции от серии возбуждающих вспышек.

В WO 91/10352 описан способ автоматического обнаружения растений путем измерения интенсивности флуоресценции молекул хлорофилла. Согласно этому способу флуоресценция возбуждается источником света с длиной волны менее 550 нм. Излучение флуоресценции детектируется камерой, оснащенной широкополосным режекторным фильтром (пропускающим излучение с длинами волн более 600 нм и задерживающим излучение с длинами волн менее 600 нм). При этом активное подавление фонового излучения не используется. Поэтому рекомендуется применять достаточно сильный источник света для получения информативного изображения, при этом излучение от источника света, непосредственно отраженное от растения или субстрата, не попадает в камеру.

В основу настоящего изобретения была положена задача разработать более дешевую высокоэффективную систему детектирования флуоресценции, которая позволяла бы снизить необходимую мощность возбуждения за счет использования лазера малой мощности, которой, однако, достаточно для стимулирования эмиссии в измеримых количествах, и которая позволяла бы снизить влияние фонового сигнала на результаты измерений.

Еще одной задачей настоящего изобретения являлась разработка нового технического подхода к измерению хорошо известных физиологических параметров растений при некоторых условиях с наиболее высокой точностью определения соответствующих условий измерения и окружающих условий.

Согласно настоящему изобретению предлагаемая в нем система детектирования флуоресценции для определения значимых параметров растительности отличается тем, что маломощный лазер, используемый в качестве источника возбуждения, представляет собой импульсный лазер с высокой частотой повторения импульсов длительностью в несколько наносекунд, генерирующий возбуждающее излучение предпочтительно в красной области спектра с длиной волны предпочтительно 670 нм, дихроичный делитель луча служит для направления сформированного возбуждающего луча коаксиально оптической оси приемной оптики без использования световодов на растительную мишень, являющуюся исследуемым объектом, базовый детектор флуоресценции служит для формирования изображения пятна возбуждающего излучения на чувствительной поверхности детектора, электронный измерительный блок выполнен с возможностью работы на частоте, равной удвоенной частоте повторения импульсов лазерного источника возбуждения, и дискретизации активного сигнала флуоресценции синхронно с лазерным излучением, с одной стороны, и пассивного фонового сигнала с фиксированной задержкой в микросекундном интервале перед или после активного сигнала, с другой стороны, путем регистрации этих сигналов с помощью быстродействующей схемы с дискретизацией и сохранением отсчетов, связанной с аналого-цифровым преобразователем, обеспечивающим цифровую обработку сигналов, при этом указанный электронный измерительный блок имеет также средства для выделения чистого сигнала флуоресценции вычитанием фонового сигнала из активного сигнала флуоресценции электронным путем или при последующей обработке, и электронный блок запуска и синхронизации служит для синхронизации лазерных импульсы с интервалами дискретизации электронного измерительного блока.

Таким образом, эта система позволяет точно измерять фоновый сигнал. Представляющий интерес сигнал флуоресценции F_лазер рассчитывается путем вычитания пассивного сигнала из полного сигнала:
F_лазер=S_t2-S_t1,
где S означает величину сигнала в моменты времени t1 и t2 (нижние индексы):
S_t1 = I_R+F_λсолн
S_t2 = I_R+F_λсолн+F_λлазер.
В момент t1 активное возбуждение равно нулю, а в момент t2 активный сигнал флуоресценции добавляется к пассивному сигналу.

С целью снизить необходимую мощность возбуждающего излучения размеры измерительного пятна, а тем самым и пятна возбуждающего излучения можно уменьшать до тех пор, пока доля фонового сигнала в полном сигнале не снизится до уровня активного сигнала флуоресценции.

Эти и другие отличительные особенности и преимущества изобретения более подробно рассмотрены ниже на примере некоторых вариантов его выполнения со ссылкой на прилагаемые чертежи.

На прилагаемых к описанию чертежах показано:
на фиг. 1 - рассмотренная выше диаграмма кинетики Каутцкого,
на фиг. 2 - рассмотренный выше типичный спектр флуоресценции,
на фиг. 3 - рассмотренная выше диаграмма, отражающая форму кривой удельного поглощения (α) излучения молекулами хлорофилла и форму кривой соответствующего спектра флуоресценции (Ψ),
на фиг. 4 - схематичное изображение базовой конфигурации одноканальной системы по изобретению для определения интенсивностей флуоресценции,
на фиг. 5 - временная диаграмма, иллюстрирующая работу предлагаемой системы при оперативной коррекции на фоновый сигнал (с изображением запускающего сигнала диодного лазера и запускающего сигнала электронного измерительного блока при измерении активных и пассивных сигналов),
на фиг. 6а и 6б - изображения, на которых соответственно в виде сбоку и спереди показано расположение элементов оптической части детекторного модуля, предназначенной для регистрации дополнительных спектральных характеристик флуоресценции и сигналов упругорассеянного в обратном направлении света.

На фиг. 4 показана система в базовой конфигурации, предназначенная для детектирования интенсивности флуоресценции молекул хлорофилла и состоящая из пяти аппаратных компонентов, которыми являются лазерный источник 1 возбуждения, в качестве которого используется диодный лазер, генерирующий излучение с длиной волны 670 нм и оснащенный лучеобразующей оптикой 2, детектор 3 флуоресценции с приемной оптикой 4, формирующей изображение, и с оптическим устройством 5 разделения каналов, электронный блок 6 запуска и формирования задержки для синхронизации лазера и детектора, электронный измерительный блок 7, представляющий собой модуль регистрации и обработки сигнала, и блок 8 электропитания.

Источником 1 возбуждения служит маломощный лазер (максимальная мощность >0,5 Вт) с высокой частотой повторения (1-50 кГц) импульсов длительностью несколько десятков наносекунд (10-50 нс). Для эффективной стимуляции флуоресценции молекул хлорофилла предпочтительно использовать возбуждающее излучение с длиной волны 670 нм. С излучением этой длины волны в 670 нм совпадает полоса сильного поглощения молекулами хлорофилла излучения в красной области спектра, благодаря чему и обеспечивает высокоэффективное возбуждение. Лазерный луч формируется с помощью лучеобразующей оптики 2, состоящей из линзы с коррекцией астигматизма (цилиндрической линзы) и блока расширения/сжатия пучка в точечное пятно. После излучения луч поступает коаксиально оптической оси 9 в приемную оптику 4 детектора, проходя через дихроичный делитель луча (дихроичное зеркало), образующий оптическое устройство 5 разделения каналов.

В качестве детектора 3 можно использовать фотоэлектронный умножитель (ФЭУ), работающий в непрерывном режиме, когда с помощью описанной системы измерения проводятся в моноимпульсном режиме на быстро изменяющих свое положение исследуемых объектах (мишенях). В качестве детектора можно использовать и лавинный или обычный фотодиод, если мишень неподвижна, при этом для регистрации сигнала допустимо использование метода вхождения в синхронизм. Входную апертуру образует сферическая линза, которая формирует изображение точечного возбуждающего источника света (пятна возбуждающего излучения) на экранированной (в частности, полевой диафрагмой) чувствительной поверхности детектора. Сигнал упругорассеянного в обратном направлении света задерживается интерференционным (ИФ) светофильтром 10. Центральная длина волны пропускания ИФ-светофильтра 10 выбирается в соответствии с длинами волн представляющего интерес излучения в диапазоне 680-740 нм. Ширина полосы пропускания не имеет существенного значения, при этом рекомендуемая ширина полосы пропускания составляет 10 или 15 нм. Качество задерживания излучения вне полосы пропускания должно быть очень высоким (>10³), поскольку длины волны возбуждающего и детектируемого излучений располагаются очень близко друг к другу. Вероятность искажения сигнала не полностью задержанными фильтром возбуждающими фотонами высока, поскольку интенсивность сигнала рассеянного в обратном направлении света на несколько порядков превышает интенсивность сигнала флуоресценции.

Электронный блок 6 запуска и синхронизации должен управлять включением лазера и синхронизовать лазерный импульс с интервалом дискретизации в электронном измерительном блоке 7. Для применения в сельском хозяйстве, садоводстве и тепличном хозяйстве задержку на прохождение импульса можно отрегулировать на постоянное значение благодаря неизменной геометрии расположения всех элементов измерительной системы. Изменениями во времени распространения сигнала из-за различий в расстояниях между детектором 3 и мишенью можно пренебречь, поскольку ожидаемое изменение расстояния в пределах порядка ±10 см (а тем самым и изменение задержки распространения луча) мало по сравнению с длительностью возбуждающего импульса (например, если τ_лазер = 20 нc, то допустимое изменение расстояния может составлять несколько метров, не приводя к ложному срабатыванию системы).

С целью обеспечить в режиме реального времени коррекцию сигнала с учетом отраженного солнечного света и флуоресценции, возбужденной солнечным светом, электронная система детектирования работает на частоте, равной удвоенной частоте повторения импульсов возбуждающего лазера. На фиг. 5 представлена временная диаграмма, иллюстрирующая работу системы в базовой конфигурации по фиг. 4 при оперативном устранении фонового излучения, при этом на диаграмме показаны запускающий сигнал диодного лазера и запускающий сигнал электронного измерительного блока при измерении активных и пассивных сигналов. Синхронно с началом излучения лазером импульса начинается интервал дискретизации для промежутка детектирования активного сигнала (лазер включается в момент S_t1). По истечении фиксированного времени задержки длительностью в несколько микросекунд регистрируется сигнал пассивного фона (лазер выключается в момент S_t2). В электронном измерительном блоке 7, показанном на фиг. 4, к регистратору сигналов, выполненному в виде быстродействующей схемы дискретизации с сохранением отсчетов (СДСО), имеющей аналоговую полосу пропускания 40-200 МГц, подключен аналого-цифровой преобразователь (АЦП), который позволяет обрабатывать сигнал в соответствии с конкретным применением системы. Если необходимость в работе в моноимпульсном режиме отсутствует, то электронный измерительный блок 7 выполняют в виде синхронного усилителя. И, наконец, назначение блока 8 электропитания состоит в обеспечении электроэнергией всех аппаратных компонентов системы.

В одном из конкретных вариантов выполнения предлагаемой системы ее рабочее расстояние, т.е. расстояние до исследуемого объекта, является в большей или меньшей степени постоянным. Однако в зависимости от конкретной области применения системы это расстояние при различной аппаратной конфигурации может изменяться от нулевого при прямом контакте с исследуемым объектом до 1,0 м. Диапазон изменения рабочего расстояния определяется в процессе калибровки при комплектации и сборке системы.

Тип выходного сигнала электронного измерительного блока 7 зависит от режима работы системы. Для последующей обработки зарегистрированного сигнала флуоресценции генерируется пропорциональный ему цифровой сигнал ЦС в виде дискретного числа, тогда как для управления подключенными к системе аппаратными средствами генерируется аналоговый сигнал.

Ниже рассмотрен процесс определения соотношения интенсивностей флуоресценции молекул хлорофилла.

Описанную выше "базовую конфигурацию" системы можно модифицировать таким образом, чтобы контролировать спектральные характеристики излучения флуоресценции. В этом случае к базовой конфигурации добавляются дополнительные чувствительные элементы, в том числе фотодетекторы и электронные схемы дискретизации (дискретизаторы). Как показано на фиг. 6а (вид сбоку) и 6б (вид спереди), оптическая схема модифицирована за счет добавления дихроичного(ых) зеркала (зеркал) 11, установленного(ых) на оптической оси 12 на приемной стороне. Дихроичное(ые) зеркало(а) разделяет(ют) падающий на них свет на спектральные компоненты. Кроме того, при такой конфигурации обеспечивается работа всех дискретизаторов с одинаковыми временными характеристиками. Помимо этого, предлагаемая в изобретении система может работать в оперативном режиме в отличие от описанных в патенте US 5412219 способа и устройства, когда для получения полной информации о спектральном составе необходимо последовательно устанавливать в устройство целый ряд фильтров.

Фоточувствительные поверхности дополнительного(ых) детектора(ов) 13 снабжены ИФ-светофильтрами 14 и дополнительными режекторными фильтрами в соответствии с требуемым режимом работы.

Число измерительных каналов зависит от целей исследования. Для измерения концентрации хлорофилла при возбуждении диодным лазером 15, работающим на длине волны 670 нм, достаточно двух каналов (предпочтительно на длинах волн 685 нм и 730 нм с шириной полосы пропускания ±5 нм).

Для контроля синей и/или зеленой флуоресценции необходимо дополнительно установить второй лазер. Длина волны возбуждающего излучения в этом случае может лежать в диапазоне от 355 до 400 нм при примерно той же мощности и временных характеристиках, что и для красного диодного лазера, используемого для возбуждения хлорофилла. Возбуждающим излучением обеих длин волн должна облучаться одна и та же область исследуемого объекта. Использование двух различных лазеров позволяет улучшить технологию измерений, применяемую согласно US 5412219 и ЕР 0419425 В1.

Применение только одного источника возбуждающего излучения, работающего только в Уф/синей областях спектра (355 нм <λ <400 нм), не рекомендуется. Как указано выше, защищающие от УФ-излучения пигменты внутри вакуолей эпидермальных клеток растений, растущих под открытым небом, препятствуют проникновению УФ/синего возбуждающего излучения в более глубокие клеточные слои и тем самым селективно подавляют флуоресценцию молекул хлорофилла. В большинстве проведенных в полевых условиях исследованиях было установлено, что сигнал красной флуоресценции не удается отделить от длинноволнового "хвоста" сине/зеленой флуоресценции.

Для детектирования синей и/или зеленой флуоресценции необходимы три, соответственно четыре детектора.

При идентификации растения необходим дополнительный детектор для регистрации сигнала упругорассеянного в обратном направлении света на длине волны красного диодного лазера (670 нм).

Для выявления наличия покрытий на поверхности листьев или инфекций (см. ниже) может быть добавлен еще один детектор для регистрации сигнала упругорассеянного в обратном направлении возбуждающего УФ-излучения.

Для измерения рассеяния света внутри листа можно дополнительно предусмотреть диодный лазер, генерирующий излучение с длинами волн в ближней инфракрасной области спектра (800 нм <λ <1000 нм), и соответствующий детектор для измерения сигнала упругорассеянного в обратном направлении света.

Все сигналы регистрируются схожими электронными схемами детектирования. Для применения в научных целях сигналы для их последующего анализа предварительно обрабатываются с помощью аналого-цифрового преобразования и передаются в компьютер. Если система используется для управления (автоматизации) каким-либо оборудованием, то набор зарегистрированных и записанных данных будет анализироваться и интерпретироваться внутренним микроконтроллером, который вырабатывает соответствующий управляющий сигнал, выдаваемый на связанное с системой измерения оборудование.

Ниже рассмотрен процесс регистрации вспомогательных параметров.

В зависимости от области применения необходимо дополнительно определять параметры окружающей среды (Е), растения (Р) и системы (S), такие, например, как:
- величина энергии импульса диодного лазера (S),
- поверхностная плотность потока (солнечного) излучения в месте расположения датчика (Е),
- верхний уровень растительного покрова (Р),
- высота растительного покрова (Р).

Энергию в лазерном импульсе необходимо измерять в том случае, если стабильность от импульса к импульсу (СИИ) или долговременная стабильность источника возбуждающего излучения невысоки. СИИ у красного диодного лазера, используемого для возбуждения флуоресценции молекул хлорофилла, составляет около 3%. Следовательно, такой стабильности вполне достаточно для получения достоверных результатов, и поэтому устанавливать регистратор энергии не требуется.

В тех же случаях, когда необходимо контролировать энергию импульса, на оптическом пути со стороны источника возбуждения устанавливают дополнительный фотодиод, который детектирует любое рассеянное световое излучение (обычно этого вполне достаточно для отслеживания флуктуации энергии). Выходной сигнал фотодиода подается также в электронный модуль, где осуществляется коррекция с поправкой на энергию сигналов флуоресценции и рассеянного в обратном направлении света.

Поверхностная плотность потока (солнечного) излучения (ФАИ) в месте расположения системы имеет непосредственное отношение к интерпретации интенсивности флуоресценции молекул хлорофилла. Поэтому в незатемненном месте следует установить еще один ФАИ-датчик, расположив его выше растительного покрова. ФАИ-сигнал датчика флуоресценции (установленного внутри растительного покрова), регистрируемый электронными схемами детектирования (в конкретных диапазонах длин волн и без возбуждения, т.е. фоновый сигнал), служит в качестве дополнительного источника информации при последующей обработке сигнала или используется в алгоритмах, которые применяются в работе микроконтроллера.

Для правильной интерпретации данных о флуоресценции растений часто необходимо знать, где проводились измерения (расположение датчика над растительным покровом или внутри него). Поэтому, если система детектирования флуоресценции используется в сельском хозяйстве (например установлена на транспортном средстве), то она должна быть определенным образом сориентирована относительно верхнего уровня растительного покрова. Положение верхнего уровня растительного покрова непрерывно контролируется с помощью перемещаемой в вертикальном направлении световой полосы, ориентированной горизонтально относительно поверхности растительного покрова. Положение световой полосы, а тем самым и положение детектора флуоресценции изменяются за счет их перемещения в вертикальном направлении в соответствии с коэффициентом заполнения (импульсной последовательности). Коэффициентом заполнения, который равен количеству переходов от затененных или затемненных участков к освещенным участкам и наоборот за интервал времени, соответствующий длительности сигнала световой полосы, определяется направление перемещения световой полосы вниз или вверх. При настройке коэффициента заполнения необходимо учитывать скорость движения транспортного средства. Если коэффициент заполнения меньше некоторого заданного числа (в предположении, что при расположении датчика над растительным покровом переход от затененного или затемненного участка к освещенному участку и наоборот не происходит), то датчик медленно перемещают вниз до тех пор, пока коэффициент заполнения не превысит максимального значения. В качестве приводов для вертикального перемещения узла, состоящего из генератора световой полосы и датчика, можно использовать гидравлические, пневматические или механические устройства.

Измеряя с помощью описанной выше аппаратуры относительное расположение верхнего уровня растительного покрова, можно определить его абсолютную высоту, если известно расстояние от датчика до земли.

Ниже рассмотрено устройство, предназначенное для обнаружения содержащих хлорофилл растений или растительных органов и роботизированной идентификации растений.

Устройство для обнаружения зеленой растительности (характеризующейся наличием хлорофилла) можно реализовать с использованием одного источника возбуждения, предпочтительно диодный лазер, генерирующий излучение с длиной волны 670 нм, и один детектор (ФЭУ или диод) с интерференционным светофильтром, пропускающим излучение с длиной волны в диапазоне от 680 до 740 нм и имеющим спектральную ширину полосы пропускания от 5 до 25 нм.

При использовании описанной выше электроники, предназначенной для оперативного детектирования и оперативной автоматической коррекции с поправкой на фоновые сигналы, датчик может работать при полном солнечном свете. Задав приемлемую пороговую величину сигнала, растительность можно идентифицировать без дальнейшей обработки этого сигнала. В этом диапазоне длин волн (в естественных условиях) сигнал флуоресценции формируется практически только молекулами хлорофилла. При этом контраст между растительными и нерастительными мишенями чрезвычайно велик. При этом нет необходимости контролировать энергию возбуждающего излучения и условия освещенности в месте произрастания растения. Место произрастания растения определяется положением и ориентацией детекторной головки, которые известны заранее.

Подобную систему детектирования можно использовать в следующих целях:
- в качестве следящих систем для робототехнических устройств, используемых в тепличном хозяйстве или в садоводстве,
- в качестве систем обнаружения растений (сорняков) с последующим их уничтожением; такая сенсорная система представляет интерес с точки зрения быстрой и непрерывной идентификации сорной растительности, произрастающей на железнодорожном полотне, и для оперативной очистки железнодорожного полотна от подобной растительности путем обработки специальными химикатами, горячей водой и т.п.

Применение в первом из рассмотренных случаев представляет интерес в сочетании с любым датчиком расстояния или системами трехмерного мониторинга местности, поскольку при этом становится возможным определить, является ли мишень зеленой растительностью (растением) или нет.

Преимущество этого метода обнаружения растений подтверждается тем фактом, что в нем не требуется применение систем распознавания образов или спектрального анализа.

Ниже рассмотрено устройство для определения концентраций хлорофилла.

В первой модификации описанной выше системы создается возможность определять относительные изменения (хронологическое или локальное распределение) концентрации хлорофилла по листовой площади. Для реализации этого к базовой конфигурации системы добавляется второй измерительный канал, как это описано выше. Для детектирования используются спектральные полосы в диапазоне 680-690 ± 5 нм и 720-740 ± 5 или 10 нм. Сигналы флуоресценции корректируются в оперативном режиме с учетом фоновых сигналов (пассивный сигнал) и затем скорректированные на фон сигналы делятся друг на друга. Умножение полученного отношения на калибровочный коэффициент, характерный для исследуемых растений, позволяет получить абсолютные значения концентрации хлорофилла:

Следует отметить, что используемые для калибровки значения зависят от адаптации растений к свету. Если уровень окружающей освещенности изменяется таким образом, что растения переходят из адаптированного к свету к адаптированному к темноте фотосинтетическому состоянию и наоборот, то используемые для калибровки значения могут оказаться ошибочными.

Система в подобной конфигурации может найти применение, например, для роботов, используемых в теплицах, когда для определения стадии роста (развития) или условий долговременного стресса растений с ее помощью регистрируется уровень хлорофилла. Такой же подход применим также в отношении любого содержащего хлорофилл материала, например в отношении содержащих хлорофилл эпидермальных слоев кожицы плодов в процессе их развития. Так, в частности, можно определять спелость плодов, когда последние теряют их типичный зеленый цвет (например, вишни, бананы, яблоки, орехи и т.д.). Контроль концентрации хлорофилла по флуоресценции позволяет также следить за порчей свежих плодов (если в их кожуре или кожице присутствует хлорофилл) и за развитием растений, если их старение (например, время хранения) сопровождается хлорозом (распадом хлорофилла на химические фрагменты). В качестве примера можно назвать огурцы, некоторые типы яблок или листья салата.

Ниже описано устройство, позволяющее управлять направленным внесением удобрений.

Известно, что концентрация хлорофилла в листьях зависит и тем самым коррелирует с концентрацией азота и серы во всем растении. Недостаток в питательных веществах, вносимых с удобрениями, проявляется в характерном снижении концентрации хлорофилла (за исключением азотных удобрений, вносимых в дозе, превышающей уровень насыщения). У пшеницы подобное воздействие удобрений является специфичным в отношении тех или иных питательных веществ, которые преимущественно локализуются либо в верхних (азот), либо в нижних (сера) слоях листьев растительного покрова.

При внесении удобрений в различных дозах наблюдается также два других эффекта. Во-первых, ускоряется рост растений (увеличиваются размеры растения), а во-вторых, у растений проявляются некоторые характерные изменения в образовании биомассы и в плотности стояния растений (связанной с густотой лиственного покрова).

Для контроля всех этих параметров можно использовать предусматривающий подход, который также основан на использовании описанного выше двухканального флуорометрического датчика с диодным лазером. При этом детекторную головку устанавливают на подвижной механической руке, которая монтируется на перемещающейся платформе (например, на транспортном средстве). Вертикальное положение руки регулируется описанной выше световой полосой, которая определяет фактическое положение "поверхности" всего растительного покрова. В результате можно легко определить абсолютную высоту растительного покрова, если известна начальная высота расположения детектора относительно земли. Детекторная головка устанавливается в определенное положение относительно уровня этой поверхности или периодически перемещается в каком-либо направлении в пределах расстояния между землей и уровнем этой поверхности. Такое периодическое движение может представлять собой вертикальное возвратно-поступательное перемещение или вращение на крутящемся диске. С учетом горизонтального движения платформы-носителя (трактора) можно получать двух- или при вращении трехмерный профиль, отражающий наличие или отсутствие растительности (регистрация сигнала флуоресценции по принципу ДА/НЕТ, т.е. по принципу наличие/отсутствие сигнала флуоресценции), а также получать данные о концентрации хлорофилла (соотношение сигналов двух измерительных каналов детектирования флуоресценции). Предварительно определенные для каждого процесса измерения данные о положении, данные о высоте растительного покрова и параметры листьев в совокупности позволяют рассчитать все рассмотренные выше показатели растительного покрова, а именно его высоту и густоту и концентрацию хлорофилла, а также распределение этих показателей по двум или трем координатам в пределах вертикального анализируемого слоя, соответственно в пределах измерительного объема.

Ниже описано устройство, позволяющее отличать однодольные растения от двудольных с целью регулируемого внесения гербицидов для селективной борьбы с сорняками.

В тех случаях, когда сорняки являются единственными растениями на какой-либо отведенной под сельскохозяйственные культуры площади или на садовом участке (например, при появлении сорняков еще до начала роста культурных растений), для надлежащей обработки достаточно знать точное местоположение растений. В этих целях достаточно использовать систему в базовой конфигурации, дополненной сканером.

Если оба вида растений произрастают одновременно на одном и том же участке (конкурируя друг с другом), то сорняки необходимо отличать от культурных растений. Во многих случаях эти типы растений подразделяются на однодольные (ОД) и двудольные (ДД) растения, что позволяет применять селективные гербициды.

При исследовании спектров флуоресценции в диапазоне длин волн от 400 до 750 нм было установлено, что ДД-растения обычно характеризуются значительно менее интенсивной синей флуоресценцией по сравнению с ОД-растениями. Подобное свойство и используется для различения растений этих двух типов.

Для эффективного возбуждения синей флуоресценции в систему необходимо добавить дополнительный источник возбуждения. Было установлено, что идеальным источником является лазер, генерирующий излучение с длиной волны около 400 нм. Более коротковолновое возбуждающее излучение поглощается в основном верхними слоями листа и в результате не возбуждает с достаточной степенью эффективности фотосистемы (красную флуоресценцию). При этом только источники излучения с длинами волн около 400 нм достаточно эффективно возбуждают и синюю, и красную флуоресценцию, и поэтому подобные источники наиболее целесообразно использовать во всей системе в целом, хотя в настоящее время их нет на рынке. Тем не менее эту проблему можно решить за счет одновременного использования двух возбуждающих лазеров. Для этой цели можно использовать компактный лазер на иттрий-алюминиевом гранате с неодимом (Nd:YAG-лазер), работающий на длине волны 355 нм, или любой иной генерирующий УФ-излучение лазер, а для возбуждения красной флуоресценции в системе имеется красный диодный лазер. В этом случае необходимо проводить взаимную калибровку обоих источников возбуждения с целью нормировать интенсивности флуоресценции, что является обязательным условием для интерпретации данных о соотношении интенсивностей флуоресценции.

На приемной стороне необходимо установить по крайней мере один дополнительный детекторный модуль, настроенный на работу в диапазоне длин волн от 430 до 460 нм (ширина полосы пропускания не имеет существенно значения и может составлять от 10 до 50 нм). Четвертый детекторный модуль может контролировать сигнал флуоресценции на длине волны, лежащей в зеленой области спектра, поскольку благодаря характерной флуоресценции (в этом диапазоне длин волн), присущей некоторым типам растительности, возможно эффективное распознавание растений.

Предназначенная для работы в открытом поле система должна представлять собой в этом случае сканирующую систему, которая монтируется (как и для контролируемого внесения удобрений) на механической руке, которая устанавливается в положения, отрегулированное относительно одновременно контролируемого верхнего уровня растительного покрова.

Соотношения зарегистрированных интенсивностей флуоресценции Р400+х(синяя) - F680+х(красная) и F500+х(зеленая) - F680+х(красная) интерпретируются с учетом условий окружающего освещения, поскольку интенсивность красной флуоресценции в отличие от синей/зеленой флуоресценции зависит от состояния реакционных центров.

Для определения густоты сорняков или при сканировании по всей площади земельного участка для получения точных данных о распределении растений по поверхности (типы растений [X, Y, Z]) используется сравнение с заданными (калибровочными) пороговыми значениями для спектральных характеристик. Эта информация о расположении растений передается в управляющее устройство системы уничтожения сорняков.

Ниже рассмотрено устройство, позволяющее выявлять заражение различными фитопатогенными грибами и управлять обработкой фунгицидами.

Для выявления заражения фитопатогенными грибами необходима система с двумя источниками возбуждения с соответствующим вторым измерительным каналом для детектирования излучения флуоресценции во второй полосе красной области спектра и один детектор сигнала упругорассеянного в обратном направлении света на длинах волн 355 или 670 нм. В качестве последнего можно использовать простой фотодиод благодаря высокому ожидаемому уровню сигнала по сравнению с сигналом флуоресценции.

Такая система позволяет контролировать целый ряд различных взаимодействий грибов с растениями.

Влияние на фотосинтезирующую систему можно распознать по изменению фотосинтетической активности, проявляющемуся в изменении интенсивности флуоресценции в одном из измерительных каналов детектирования красной флуоресценции. Подобный представитель грибковой инфекции такого типа уже был выявлен при заражении растений мучнистой росой, когда влияние грибов на ранней стадии их развития на фотосинтезирующую систему проявляется в существенном замедлении ее реакции в ответ на возбуждающее излучение в кинетике Каутцкого.

Заражение грибами может приводить к изменениям в морфологической структуре листа, к полному разрушению клеток или к изменениям в составе пигментов растения. Подобные морфологические изменения (а следовательно, и изменения оптических свойств листьев) или снижение содержания хлорофилла определяются по соотношению сигналов в измерительных каналах детектирования полос излучения красной флуоресценции. Так, в частности, при неравномерном поражении грибами (например, при заражении ржавчиной) можно определять распределение грибов по всей поверхности листа, что позволяет проводить анализ с использованием дополнительных (количественных) идентификационных критериев.

Изменения в составе пигментов, испускающих синюю и/или зеленую флуоресценцию (СЗ), выявляются по характеристикам сигналов в измерительных каналах в этих областях спектра. Подобный подход будет столь же успешным, как и при идентификации сорняков, если предположить, что растительный покров образован растениями одной культуры. Кроме того, некоторые грибы (например, мучнистая роса) сами являются источниками характерной СЗ-флуоресценции, и поэтому их можно обнаруживать непосредственно или даже идентифицировать по спектральным характеристикам их СЗ-флуоресценции.

Мучнистая роса на поздней стадии развития покрывает поверхность листа дополнительным слоем тканей, что придает ему характерный белесый цвет. В результате отражательная способность листа существенно возрастает, что можно определить по сигналу упругорассеянного в обратном направлении света на длинах волн возбуждающего излучения в красной или в УФ-областях спектра.

Помимо этого система детектирования флуоресценции, когда она смонтирована на подвижной в вертикальном направлении (а возможно и подвижной в трех направлениях) механической руке, позволяет определять распределение грибов на пораженных растениях в вертикальном направлении, что также характерно для грибов некоторых типов.

В принципе идентифицировать паразитирующие на растениях грибы всех типов невозможно, однако при определенных условиях количество подобных грибов ограничено, и поэтому рассмотренный выше подход позволяет применять подобную систему в качестве системы раннего предупреждения о поражении растений грибами или в качестве следящего устройства системы защиты растений.

В заключение рассмотрено устройство, позволяющее контролировать фотосинтетическую активность растительности при циклическом или периодическом проведении измерений.

В этом варианте в системе детектирования предусмотрена интерпретация данных об интенсивности флуоресценции молекул хлорофилла. Ее техническая реализация зависит от требований, предъявляемых к измерениям. Подобная интерпретация может заключаться в простом сравнении относительных изменений интенсивностей флуоресценции, нормированных на относительное содержание хлорофилла, или в более совершенном, но вместе с тем и более сложном определении способности к фотосинтезу, как это имеет место, например, при использовании кинетики Каутцкого или АИМ-флуорометрии.

Измерять относительные изменения можно как в пространстве, так и во времени. В обоих случаях система с точки зрения аппаратного обеспечения аналогична системе в базовой конфигурации, однако алгоритм интерпретации изменяется на следующий:

В приведенной выше формуле ОФА означает относительную фотосинтетическую активность. Предполагается, что материал мишени распределен однородно. ОФА априори зависит от времени и геометрического местоположения, т.е. ОФА (t; x, у, z). Таким образом, соответствующий эксперимент должен проводиться при контролируемых окружающих условиях. Наличие ФАИ-датчика позволяет получить информацию об условиях окружающего освещения вблизи детекторной головки, на которые не должен влиять материал мишени (не затенять или не освещать отраженным светом).

Это устройство можно использовать в тех случаях, когда требуется контролировать состояние растений, т.е. их жизнеспособность, состояние здоровья и т. п. Одной из возможных целей применений является исследование долговременных процессов, когда наблюдают влияние изменяющихся окружающих условий на растение-образец (или набор образцов) с хорошо определенными параметрами. Другая цель применения может состоять в исследовании большого числа мишеней при контролируемых условиях освещенности, например в теплице или в лаборатории.

Для определения более сложных кинетических параметров фотосинтеза требования к условиям освещенности являются более строгими. Кинетику Каутцкого, а тем самым и все соответствующие параметры можно измерять только на растениях, адаптированных к темноте, т.е. в ночное время или в лаборатории. При проведении подобных измерений пятно возбуждения должно быть неподвижным, чтобы можно было наблюдать реакцию в ответ на воздействие актиничным светом во времени. Источником актиничного света может служить сам источник возбуждения, если частота повторения импульсов увеличена до уровня, при котором средняя освещенность инициирует актиничную (фотохимическую) реакцию. Актиничную реакцию можно вызвать также, включив дополнительный источник белого света, который по своему спектральному составу близок к идеальному белому свету, и облучая таким путем растение непрерывным потоком фотонов, начиная с некоторого точно заданного момента времени. В первом варианте (S_{λ(пассивн)} = 0) анализ сводится к арифметической обработке сигналов флуоресценции. Второй вариант также не требует каких-либо технических изменений, поскольку пассивный сигнал (S_{λ(пассивн)}>0) полностью контролируется системой.

Из АИМ-флуорометрии известно, что так называемый "показатель Женти" (Genty) (ПЖ) является приемлемой мерой квантового выхода ассимиляции СО₂. Показатель Женти можно получить, измеряя сигнал флуоресценции в установившемся состоянии (обозначаемой Fs), а также сигнал флуоресценции в установившемся состоянии, на который наложен насыщающий световой импульс (обозначаемый Fm'):

Высокое значение ПЖ указывает на интенсивный поток электронов в цепи их переноса, тогда как низкие значения могут указывать на наличие нарушений в фотосинтезирующей системе, если флуоресценция измеряется при одних и тех же окружающих условиях (прежде всего при одной и той же силе света, соответственно интенсивности освещения).

Установившаяся флуоресценция (Fs) возбуждается дистанционно диодным лазером, тогда как дополнительная лампа белого света или солнечный свет служат источниками актиничного света. Импульс Fm' генерируется дополнительным сильным источником света (импульсной лампой).

Благодаря наличию ФАИ-датчика и детектированию пассивного фонового сигнала такая система детектирования флуоресценции позволяет контролировать и измерять сигналы Fs и Fm'. Таким образом, ПЖ можно контролировать как функцию энергетической освещенности, отражающую ассимиляцию СО₂, без использования какого-либо оборудования для газового анализа. Переключение между актиничным и насыщающим светов предпочтительно осуществлять путем модуляции одного и того же источника, переключая его с режима непрерывного фонового освещения на импульсный режим, в котором генерируются световые импульсы для освещения потоком высокой интенсивности длительностью в несколько миллисекунд.

На основе предлагаемой в изобретении системы разработан новый методический подход к измерению хорошо известных физиологических параметров растений при определенных условиях с наиболее точным определением соответствующих условий измерения и окружающих условий.

Claims (52)

1. Система детектирования флуоресценции для определения значимых параметров растительности, имеющая источник 1 возбуждения, представляющий собой маломощный лазер, предназначенный для генерирования возбуждающего излучения в красной области спектра, лучеобразующее оптическое устройство 2, дихроичный делитель 5 луча, базовый детектор 3 флуоресценции, включающий входное оптическое устройство 4, предназначенное для приема излучения флуоресценции, прошедшего через дихроичный делитель 5 луча, и интерференционный светофильтр 10, задерживающий сигнал упругорассеянного в обратном направлении света, а также имеющая электронный измерительный блок 7, предназначенный для детектирования сигнала флуоресценции, и электронный блок 6 запуска и синхронизации, отличающаяся тем, что маломощный лазер, используемый в качестве источника 1 возбуждения, представляет собой импульсный лазер с высокой частотой повторения импульсов длительностью в несколько наносекунд, генерирующий возбуждающее излучение предпочтительно в красной области спектра с длиной волны предпочтительно 670 нм, дихроичный делитель 5 луча служит для направления сформированного возбуждающего луча коаксиально оптической оси 9 приемной оптики без использования световодов на растительную мишень, являющуюся исследуемым объектом, базовый детектор 3 флуоресценции служит для формирования изображения пятна возбуждающего излучения на чувствительной поверхности детектора, электронный измерительный блок 7 выполнен с возможностью работы на частоте, равной удвоенной частоте повторения импульсов лазерного источника 1 возбуждения, и дискретизации активного сигнала флуоресценции синхронно с лазерным излучением, с одной стороны, и пассивного фонового сигнала с фиксированной задержкой в микросекундном интервале перед или после активного сигнала, с другой стороны, путем регистрации этих сигналов с помощью быстродействующей схемы с дискретизацией и сохранением отсчетов, связанной с аналого-цифровым преобразователем, обеспечивающим цифровую обработку сигналов, при этом указанный электронный измерительный блок 7 имеет также средства для выделения чистого сигнала флуоресценции вычитанием фонового сигнала из активного сигнала флуоресценции электронным путем или при последующей обработке и электронный блок 6 запуска и синхронизации служит для синхронизации лазерных импульсов с интервалами дискретизации электронного измерительного блока 7.

2. Система детектирования флуоресценции по п.1, отличающаяся тем, что лазер 1 является диодным лазером, работающим в красной области спектра.

3. Система детектирования флуоресценции по п.1 или 2, отличающаяся тем, что максимальная мощность лазера 1 превышает 0,5 Вт.

4. Система детектирования флуоресценции по п.1, отличающаяся тем, что лучеобразующее устройство 2 имеет линзу с коррекцией астигматизма, т.е. цилиндрическую линзу, и блок расширения/сжатия пучка в точечное пятно.

5. Система детектирования флуоресценции по п.1, отличающаяся тем, что детектор 3 флуоресценции является фотоэлектронным умножителем, работающим в непрерывном режиме.

6. Система детектирования флуоресценции по п.1, отличающаяся тем, что детектор 3 флуоресценции является лавинным диодом.

7. Система детектирования флуоресценции по п.1, отличающаяся тем, что детектор 3 флуоресценции является обычным фотодиодом.

8. Система детектирования флуоресценции по п.1, отличающаяся тем, что входное оптическое устройство 4 имеет в качестве входной апертуры сферическую линзу, которая служит для формирования изображения пятна возбуждающего излучения на экранированной чувствительной поверхности детектора 3 флуоресценции.

9. Система детектирования флуоресценции по п.1, отличающаяся тем, что центральная длина волны и ширина полосы пропускания интерференционного светофильтра 10 выбираются соответствующим образом в диапазоне от 680 до 740 нм, при этом качество задерживания излучения вне полосы пропускания составляет более 10^-3.

10. Система детектирования флуоресценции по п.1, отличающаяся тем, что схема дискретизации с сохранением отсчетов имеет выбранную соответствующим образом аналоговую ширину полосы пропускания в диапазоне от 40 до 200 МГц.

11. Система детектирования флуоресценции по п.1, отличающаяся тем, что базовый детектор 3 флуоресценции снабжен дополнительными детекторами 13, а на оптической оси 12 на приемной стороне установлены дополнительные дихроичные делители луча для формирования измерительных каналов детектирования характерной флуоресценции, число, центральные длины волн и ширина полос пропускания которых зависят от целей и объема исследований.

12. Система детектирования флуоресценции по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что для контроля синей и/или зеленой флуоресценции предусмотрен второй лазер, генерируемое которым излучение имеет фиксированную длину волны в диапазоне от 350 до 400 нм и энергетические и временные характеристики которого аналогичны таковым у красного лазерного источника возбуждения.

13. Система детектирования флуоресценции по п.1, отличающаяся наличием двух дополнительных детекторов, регистрирующих сигналы упругорассеянного в обратном направлении света на длинах волн излучения лазерных источников возбуждения.

14. Система детектирования флуоресценции по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся наличием дополнительного фотодиода, установленного на оптическом пути со стороны источника возбуждения для контроля энергии лазерных импульсов.

15. Система детектирования флуоресценции по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся наличием датчика фотосинтетически активного излучения (ФАИ-датчика), размещенного выше исследуемого объекта, для контроля окружающих условий освещения.

16. Система детектирования флуоресценции по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся наличием генератора горизонтально ориентированной световой полосы, подвижной в вертикальном направлении, для определения верхнего уровня растительного покрова и тем самым высоты растений, при этом положение по вертикали детекторного узла, который может быть подвижным или неподвижным относительно световой полосы, связано с ее положением.

17. Система детектирования флуоресценции по п.15 или 16, отличающаяся тем, что в качестве приводов для перемещения световой полосы, а также детекторного узла используются гидравлические, пневматические или механические устройства.

18. Система детектирования флуоресценции по любому из пп.1-10, отличающаяся тем, что она предназначена для обнаружения содержащих хлорофилл растений или их органов (для распознавания растений) и имеет для обнаружения зеленой растительности один диодный лазер, генерирующий возбуждающее излучение на длине волны 670 нм, и детекторный модуль с интерференционным светофильтром, пропускающим излучение с длиной волны в диапазоне от 680 до 740 нм при ширине полосы пропускания от 5 до 25 нм, при этом для распознавания растительности задана некоторая пороговая величина, причем контраст между растительной и нерастительной мишенями настолько велик, что распознавание осуществляется без какой-либо дальнейшей обработки сигналов.

19. Система детектирования флуоресценции по п.18, отличающаяся тем, что при наличии управляемого движения платформы-носителя по двум или трем координатам положение растения определяется относительно положения детекторной головки, а также определяется распределение растительного материала.

20. Система детектирования флуоресценции по п.18 или 19, отличающаяся тем, что областью ее применения являются следящие системы для робототехнических устройств, используемых в тепличном хозяйстве или садоводстве.

21. Система детектирования флуоресценции по п.18 или 19, отличающаяся тем, что областью ее применения являются системы обнаружения растений (сорняков) с последующим их уничтожением.

22. Система детектирования флуоресценции по п.11, отличающаяся тем, что она предназначена для определения концентраций хлорофилла и имеет два детектора с измерительными каналами детектирования излучения с длинами волн 680-690±5 нм и 720-740±5 или 10 нм, при этом деление скорректированных на фон сигналов друг на друга позволяет определить относительное изменение в содержании хлорофилла по листовой площади, а умножение полученного отношения на заданный калибровочный коэффициент позволяет получить абсолютные значения концентрации хлорофилла.

23. Система детектирования флуоресценции по п.22, отличающаяся тем, что областью ее применения являются используемые в теплицах роботы, предназначенные для регистрации уровня хлорофилла в растениях и тем самым для определения стадии роста растений или условий долговременного стресса.

24. Система детектирования флуоресценции по п.22, отличающаяся тем, что областью ее применения является определение спелости любого содержащего хлорофилл материала по потере конкретными плодами (например вишней, бананами, яблоками, орехами и т.д.) характерной для них зеленой окраски.

25. Система детектирования флуоресценции по п.22, отличающаяся тем, что областью ее применения является наблюдение за изменениями в концентрации хлорофилла в любом содержащим хлорофилл материале, что позволяет контролировать порчу свежих плодов (если в их кожуре или кожице присутствует хлорофилл) и развитие растений (например огурцов, некоторых типов яблок или листьев салата).

26. Система детектирования флуоресценции по п.22, отличающаяся тем, что она предназначена для управления направленным внесением удобрений на основании того факта, что концентрация хлорофилла в листьях зависит и тем самым коррелирует с содержанием азота и серы во всем растении и поэтому недостаток в питательных веществах, вносимых с удобрениями, проявляется в характерном снижении концентрации хлорофилла и в изменении его распределения, что сопровождается замедлением роста растения и характерным изменением в плотности стояния растений (связанной с густотой лиственного покрова), и имеет детекторную головку, которая для возможности проведения измерений на пространственных структурах установлена на подвижной механической руке (обеспечивающей перемещение по двум координатам X-Y), смонтированной на подвижной платформе (например на транспортном средстве), движением которой определяется третья координата (координата Z).

27. Система детектирования флуоресценции по п.26, отличающаяся тем, что вертикальное положение механической руки регулируется световой полосой, которая определяет фактическое положение верхнего уровня растительного покрова, при этом детекторная головка установлена в определенное положение относительно этого верхнего уровня растительного покрова или перемещается между землей и уровнем этой поверхности.

28. Система детектирования флуоресценции по п.26 или 27, отличающаяся тем, что с учетом горизонтального движения платформы-носителя (трактора) получают трехмерный профиль значимых параметров растений.

29. Система детектирования флуоресценции по п.26, отличающаяся тем, что она предназначена для различения между однодольными и двудольными растениями на основании того факта, что однодольные (ОД) и двудольные (ДД) растения различаются по характерным для них спектрам флуоресценции в диапазоне от 400 до 750 нм, что проявляется при измерении интенсивности синей флуоресценции относительно интенсивности испускаемого молекулами хлорофилла излучения в красной области спектра, и имеет дополнительный источник возбуждения, служащий для эффективного возбуждения синей флуоресценции и взаимной калибровки обоих источников возбуждения для нормирования интенсивностей флуоресценции на мощность возбуждающего импульса, а также имеет дополнительный детекторный модуль, настроенный на работу в диапазоне длин волн от 430 до 460 нм (Δλ = 10-50 нм).

30. Система детектирования флуоресценции по п.29, отличающаяся тем, что дополнительным источником возбуждения является лазер на иттрий-алюминиевом гранате с неодимом с генератором третьей гармоники на длине волны излучения 355 нм.

31. Система детектирования флуоресценции по п.29 или 30, отличающаяся наличием дополнительных детекторных модулей для контроля, например, зеленой флуоресценции (500-550 нм; Δλ = 10-50 нм) с целью получения более полной информации о спектральных характеристиках излучения встречающихся типах растений.

32. Система детектирования флуоресценции по п.29, отличающаяся наличием только одного измерительного канала по п.18 для оценки красной флуоресценции молекул хлорофилла.

33. Система детектирования флуоресценции по п.29, отличающаяся наличием ФАИ-датчика для контроля окружающей освещенности и тем самым для интерпретации отношения интенсивностей полос с учетом условий окружающего освещения.

34. Система детектирования флуоресценции по п.29, отличающаяся тем, что предусмотрено использование заданной пороговой величины отношения интенсивностей, позволяющей определить, относится ли сигнал к ОД- или ДД-растению.

35. Система детектирования флуоресценции по п.29, отличающаяся тем, что для программируемой последующей обработки сигналов предусмотрен классификационный алгоритм, позволяющий определить, относится ли сигнал к ОД- или ДД-растению.

36. Система детектирования флуоресценции по любому из пп.29-35, отличающаяся тем, что областью ее применения является селективная обработка гербицидами с учетом местоположения и типа сорняков.

37. Система детектирования флуоресценции по п.29, отличающаяся тем, что в ней предусмотрен второй измерительный канал для детектирования излучения флуоресценции во второй полосе красной области спектра и один детектор сигнала упругорассеянного в обратном направлении света и она предназначена для обнаружения заражения растений различными грибами.

38. Система детектирования флуоресценции по п.37, отличающаяся тем, что воздействие на фотосинтезирующую систему распознается по изменению интенсивности флуоресценции.

39. Система детектирования флуоресценции по п.37, отличающаяся тем, что изменения в морфологической структуре листьев, полное разрушение клеток или изменения в составе пигментов растения определяются по отношению сигналов в измерительных каналах детектирования полос излучения красной флуоресценции, а неравномерное поражение грибами (например ржавчиной) и их характерное распределение по всей поверхности листа или по растительному покрову являются дополнительными (количественными) идентификационными критериями анализа.

40. Система детектирования флуоресценции по п.37, отличающаяся тем, что изменения в составе пигментов, испускающих синюю и/или зеленую флуоресценцию, в результате заражения растения выявляются по характеристикам сигналов в измерительных каналах в этих областях спектра, при этом некоторые грибы (например мучнистая роса) сами являются источниками характерной синей и/или зеленой флуоресценции, по которой их и можно обнаружить.

41. Система детектирования флуоресценции по п.37, отличающаяся тем, что при возможном наличии на поверхности листьев дополнительного слоя тканей (например мицелия мучнистой росы) отражательная способность поверхности листьев существенно возрастает, что определяется по сигналу упругорассеянного в обратном направлении света на длинах волн как красного, так и УФ-возбуждающего излучения.

42. Система детектирования флуоресценции по любому из пп.37-41, отличающаяся тем, что областью ее применения является направленная обработка фунгицидами с учетом местоположения и типа грибов.

43. Система детектирования флуоресценции по п.18, отличающаяся тем, что она предназначена для контроля фотосинтетической активности растительности при циклическом или периодическом проведении измерений, когда исследуемая мишень неподвижна, а наблюдаемые изменения зависят тем самым только от времени.

44. Система детектирования флуоресценции по п.22, отличающаяся тем, что она предназначена для контроля фотосинтетической активности растительности при циклическом или периодическом проведении измерений, когда положение исследуемой мишени изменяется (нормирование на относительное содержание хлорофилла).

45. Система детектирования флуоресценции по п.43 или 44, отличающаяся наличием ФАИ-датчика для определения условий окружающего освещения.

46. Система детектирования флуоресценции по п.43 или 44, отличающаяся тем, что оцифрованные значения интенсивностей флуоресценции интерпретируются при последующей обработке сигналов с учетом соответствующих условий освещенности и ее изменения во времени.

47. Система детектирования флуоресценции по любому из пп.43-46, отличающаяся тем, что областью ее применения являются научные исследования долговременных процессов, когда исследуется взаимодействие растений с изменяющимися окружающими условиями.

48. Система детектирования флуоресценции по любому из пп.43-46, отличающаяся тем, что областью ее применения являются научные исследования кинетики Каутцкого и всех соответствующих параметров, которые можно измерить только у растений, адаптированных к темноте и находящихся в фиксированном положении.

49. Система детектирования флуоресценции по п.48, отличающаяся тем, что источником актиничного света является сам источник возбуждения флуоресценции, если частота повторения его импульсов увеличена до уровня, при котором инициируются актиничные реакции.

50. Система детектирования флуоресценции по п.48, отличающаяся тем, что источником актиничного света является включаемый источник белого света, близкого по своему спектральному составу к идеальному белому свету, при этом такой источник белого света освещает растение в заданные моменты времени.

51. Система детектирования флуоресценции по любому из пп.43-46, отличающаяся тем, что областью ее применения являются научные исследования показателя Женти, который может быть определен измерением флуоресценции в установившемся состоянии, а также флуоресценции в установившемся состоянии, на которую наложен насыщающий световой импульс.

52. Система детектирования флуоресценции по п.51, отличающаяся тем, что установившаяся флуоресценция (Fs) возбуждается дистанционно диодным лазером, тогда как дополнительная лампа белого света или солнечный свет служат источниками актиничного света, а насыщающее световое излучение (Fm') генерируется дополнительным источником света, например импульсной лампой, таким образом, чтобы благодаря детектированию пассивного фонового сигнала эта система была способна контролировать величины Fs и Fm', а также интенсивность насыщающего светового излучения.

Images