RU2188031C1

RU2188031C1 - Phytocomplex of antioxidant activity and method for its embodiment

Info

Publication number: RU2188031C1
Application number: RU2001118227A
Authority: RU
Inventors: В.А. Бабкин; Л.А. Остроухова; Н.В. Иванова; Ю.А. Малков; С.З. Иванова; Н.А. Онучина
Original assignee: Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского СО РАН
Priority date: 2001-07-02
Filing date: 2001-07-02
Publication date: 2002-08-27

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: suggested antioxidant phytocomplex is prepared out of the bark of Siberian and Dahurian larch. The gum-free larch bark is treated with ethylacetate at raw material/extragent ratio of 1:3 - 10 at 20-75 C for 2-5 h. Extract is filtered, ethylacetate is distilled off, the residue is dried up to the powder-like state. The innovation favors to exclude seasonal storage of raw material and its special treatment and utilize the wastes of wood-processing industry. EFFECT: higher efficiency. 2 cl, 2 tbl

Description

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается способа получения нового фитокомплекса из коры лиственницы, обладающего антиоксидантной активностью. The invention relates to the pharmaceutical industry and relates to a method for producing a new phytocomplex from larch bark with antioxidant activity.

Известны способы получения из растительных источников как индивидуальных соединений, так и суммы экстрактивных веществ, обладающих антиоксидантной активностью. Экстракцией измельченной древесины лиственницы органическим растворителем и водой получают флавоноидное соединение - дигидрокверцетин, обладающее антиоксидантным и капилляроукрепляющим действием [Патент РФ 2158598, А 61 К 35/78, 2000], на его основе создан лекарственный препарат "Диквертин", рекомендованный МЗ РФ для использования при лечении сердечно-сосудистых и бронхо-легочных заболеваний. Known methods for producing from plant sources as individual compounds, and the amount of extractive substances with antioxidant activity. Extraction of crushed larch wood with an organic solvent and water gives a flavonoid compound, dihydroquercetin, which has antioxidant and capillary-strengthening effects [RF Patent 2158598, A 61 K 35/78, 2000], and based on it, the drug “Dikvertin”, recommended by the Ministry of Health of the Russian Federation for use with treatment of cardiovascular and broncho-pulmonary diseases.

Описана антиоксидантная активность суммы флавоноидных соединений, выделенных из маакии амурской [ХПС, 1985, 775с]. При изучении химического состава этого экстракта были идентифицированы изофлавоны - формононетин, генистеин, ретузин, стильбены - резвератрол, мааказин, 3,3',4',5'-тетрагидроксистильбен. The antioxidant activity of the sum of flavonoid compounds isolated from Amurian maakia has been described [CPS, 1985, 775c]. When studying the chemical composition of this extract, isoflavones - formononetin, genistein, retuzin, stilbenes - resveratrol, maacazine, 3,3 ', 4', 5'-tetrahydroxystilbene were identified.

Установлена антиоксидантная активность соединений фенольной природы, выделенных из Triadenum japonicum [ХПС, 1986, 4, с.376], а также из Apuncus dioicus и Adenocaulon adhaerescens [ХПС, 1986, 4, с. 506-507], таких как кофейная кислота, этиловый эфир кофейной кислоты, (+) - катехина, гиперина. The antioxidant activity of phenolic compounds isolated from Triadenum japonicum [CPS, 1986, 4, p. 376], as well as from Apuncus dioicus and Adenocaulon adhaerescens [CPS, 1986, 4, p. 506-507], such as caffeic acid, ethyl ester of caffeic acid, (+) - catechin, hyperin.

Наиболее близким к заявляемому по сути и используемому экстрактивному методу является способ получения растительного полифенольного экстракта, обладающего антиоксидантной активностью [Патент РФ 2133621, А 61 К 35/78, 1999] . В качестве сырьевого источника используют одревесневшие побеги и/или кору дальневосточного кустарника леспедецы двухцветной, заготавливаемого в зимний период. Сырье подвергают резке и дроблению на соответствующих дробильных устройствах или обрабатывают на специальной дробилке с рифлеными валками, вращающимися с разным числом оборотов, что позволяет отделить наружную кору от волокнистой древесной массы. Экстракцию полученной таким образом коры проводят этиловым спиртом троекратно. Затем экстрагент выпаривают и получают полифенольный экстракт с определенной антиоксидантной активностью. По оценке авторов, веществами, отвечающими за антиоксидантную активность экстракта, являются: кофейная кислота, ее этиловый эфир, кофеилбетулиновая, протекатеховая кислоты и серия пренилированных изофлавоноидов. Недостатками этого способа являются:
1. Сезонная заготовка сырья.The closest to the claimed essentially and used extractive method is a method of obtaining a plant polyphenolic extract with antioxidant activity [RF Patent 2133621, A 61 K 35/78, 1999]. As a raw material source, lignified shoots and / or the bark of the Far Eastern shrub of two-colored woodpeckers harvested in winter are used. Raw materials are subjected to cutting and crushing on the appropriate crushing devices or processed on a special crusher with corrugated rolls rotating with different speeds, which allows you to separate the outer bark from the fibrous wood pulp. The thus obtained bark is extracted three times with ethyl alcohol. Then the extractant is evaporated and a polyphenolic extract with a certain antioxidant activity is obtained. According to the authors, the substances responsible for the antioxidant activity of the extract are: caffeic acid, its ethyl ether, caffeyl betulinic, proteatechic acid and a series of prenylated isoflavonoids. The disadvantages of this method are:
1. Seasonal harvesting of raw materials.

2. Специальная механическая подготовка сырья. 2. Special mechanical preparation of raw materials.

3. Вследствие использования в качестве экстрагента этилового спирта требуются либо значительные энергетические затраты на его регенерацию, либо предварительная сушка сырья. 3. Due to the use of ethyl alcohol as an extractant, either significant energy costs for its regeneration or preliminary drying of the raw material are required.

Задачи настоящего изобретения:
1. Расширение сырьевой базы получения растительных антиоксидантов.Objectives of the present invention:
1. The expansion of the raw material base for the production of plant antioxidants.

2. Решение экологической задачи, связанной с утилизацией коры лиственницы. 2. The solution of the environmental problem associated with the disposal of larch bark.

3. Получение нового фитокомплекса, обладающего антиоксидантной активностью. 3. Obtaining a new phytocomplex with antioxidant activity.

4. Разработка способа получения фитокомплекса из коры лиственницы, обладающего антиоксидантной активностью. 4. Development of a method for producing a phytocomplex from larch bark with antioxidant activity.

Поставленные задачи решаются следующим образом: с помощью экстракционного метода, используя в качестве сырьевого источника измельченную кору лиственницы сибирской и/или даурской, получают комплекс соединений, обладающий антиоксидантной активностью (АОК). Используя в качестве позитивного эталона известный антиоксидант из древесины лиственницы - дигидрокверцетин, определено, что суммарная антиоксидантная активность получаемого фитокомплекса в 1,5 раза превышает эталонный. The tasks are solved as follows: using the extraction method, using the crushed larch of Siberian and / or Daurian larch as a raw material source, a complex of compounds with antioxidant activity (AOK) is obtained. Using a known antioxidant from larch wood - dihydroquercetin as a positive reference, it was determined that the total antioxidant activity of the resulting phytocomplex is 1.5 times higher than the reference.

По внешнему виду АОК представляет собой порошок насыщенного бордового цвета, без запаха, с горьковатым вкусом; растворим в спирте, этилацетате, ацетоне. In appearance, AOK is a powder of saturated burgundy color, odorless, with a bitter taste; soluble in alcohol, ethyl acetate, acetone.

По химическому составу АОК является смесью фенолокислот и флавоноидов. Методом обращенно-фазной ВЭЖХ идентифицированы кислоты: n-оксибензойная, протокатеховая, ванилиновая, сиреневая, n-кумаровая (цис-, транс-формы), феруловая (цис-, транс-формы) и кофейная. Флавоноидные соединения представлены мономерными, олигомерными и полимерными продуктами. Среди мономерных продуктов идентифицированы: флаванонон - нарингенин, флаванонолы - аромодендрин, дигидрокверцетин, флавонолы - кемпферол, кверцетин, изорамнетин, мирицетин, флаван-3-олы - (-)-эпифецелихин, (+)-катехин, (-)-эпикатехин, антоцианидин - листвинидин. В составе комплекса обнаружены димерные продукты - лиственол, а также полимерная часть, представленная проантоцианидинами и конденсированными таннинами. In terms of chemical composition, AOK is a mixture of phenolic acids and flavonoids. Acids were identified by reverse phase HPLC: n-hydroxybenzoic, protocatechuic, vanillic, lilac, n-coumaric (cis-, trans-forms), ferulic (cis-, trans-forms) and coffee. Flavonoid compounds are represented by monomeric, oligomeric and polymeric products. Among the monomeric products identified: flavanonone - naringenin, flavanonols - aromodendrin, dihydroquercetin, flavonols - kempferol, quercetin, isoramnetin, myricetin, flavan-3-oly - (-) - epifeceliquin, (+) - catechin, (-), epicene - listvinidin. The complex contains dimeric products - larch, as well as the polymer part represented by proanthocyanidins and condensed tannins.

При изучении токсичности АОК в опытах на мышах при внутрибрюшном введении было установлено, что доза 1500 мг/кг не токсична. Согласно современной классификации, вещества, имеющие ЛД₅₀ при внутрибрюшинном введении 101-1000 мг/кг, относятся к группе малотоксичных. Фитокомплекс из коры удовлетворяет этим условиям, а следовательно, является малотоксичным веществом.When studying the toxicity of AOK in experiments on mice with intraperitoneal administration, it was found that a dose of 1500 mg / kg is not toxic. According to the current classification, substances having an LD ₅₀ with an intraperitoneal injection of 101-1000 mg / kg belong to the group of low toxicity. The phytocomplex from the bark satisfies these conditions and, therefore, is a low-toxic substance.

Таким образом, решение поставленных целей достигается тем, что предварительно обессмоленную измельченную кору лиственницы дважды обрабатывают этилацетатом при определенном соотношении сырье/экстрагент (1:3-10), заданной температуре (20-75^oС), определенном количестве времени (1-5 ч). Затем экстракт отфильтровывают, этилацетатат отгоняют, остаток высушивают до порошкообразного состояния. Получают АОК с выходом 2,45-6,42% от массы абсолютно сухой коры.Thus, the goals are achieved by the fact that pre-tarred crushed larch bark is treated twice with ethyl acetate at a certain ratio of raw materials / extractant (1: 3-10), a given temperature (20-75 ^o C), a certain amount of time (1-5 hours ) Then the extract is filtered off, ethyl acetate is distilled off, the residue is dried to a powder state. Obtain AOK with a yield of 2.45-6.42% by weight of absolutely dry bark.

Предлагаемый способ получения нового антиоксидантного фитокомплекса имеет следующие преимущества перед прототипом:
1. В качестве исходного сырья используют кору лиственницы, являющуюся отходом деревоперерабатывающей промышленности.The proposed method for producing a new antioxidant phytocomplex has the following advantages over the prototype:
1. As the source of raw materials used bark of larch, which is a waste of the wood processing industry.

2. Используемое сырье не требует специальной сезонной заготовки. 2. The raw materials used do not require special seasonal harvesting.

3. Не требуется дополнительное измельчение сырья, так как этот параметр не оказывает существенного влияния на выход целевого продукта. 3. No additional grinding of raw materials is required, since this parameter does not have a significant effect on the yield of the target product.

4. В качестве экстрагента используют этилацетат (вместо этилового спирта в прототипе). Поскольку растворимость воды в этилацетате мала (7-8%), экстрагент легко регенерируется и полностью возвращается в технологический процесс. Не требуется предварительной сушки сырья. 4. As the extractant using ethyl acetate (instead of ethyl alcohol in the prototype). Since the solubility of water in ethyl acetate is small (7-8%), the extractant is easily regenerated and completely returned to the process. No preliminary drying of the raw material is required.

5. АОК имеет хорошо изученный химический состав, что позволяет обеспечить его надежную сертификацию. Химический состав АОК (комплекс известных флавоноидов и фенолокислот) обуславливает широту его биологического действия. 5. AOK has a well-studied chemical composition, which ensures its reliable certification. The chemical composition of AOK (a complex of known flavonoids and phenolic acids) determines the breadth of its biological effect.

Способ получения АОК демонстрируется следующими примерами. The method for producing AOK is demonstrated by the following examples.

Пример 1
100 г предварительно обессмоленной коры лиственницы помещают в круглодонную колбу, снабженную мешалкой, обратным холодильником и термометром, добавляют этилацетат в количестве 1000 мл (гидромодуль 1:10). Колбу помещают на водяную баню и термостатируют при температуре 60^oС в течение 3 ч при перемешивании. Затем экстракт отфильтровывают. Экстракцию повторяют при тех же условиях. Экстракты объединяют. Этилацетатат отгоняют на роторном испарителе, остаток высушивают на воздухе до порошкообразного состояния. Получают АОК с выходом 6,42% от а.с.н. коры.Example 1
100 g of the pre-tarred larch bark is placed in a round bottom flask equipped with a stirrer, reflux condenser and thermometer, ethyl acetate in the amount of 1000 ml is added (water module 1:10). The flask was placed in a water bath and thermostated at a temperature of 60 ^o C for 3 hours with stirring. Then the extract is filtered. The extraction is repeated under the same conditions. Extracts combine. Ethyl acetate was distilled off on a rotary evaporator, the residue was dried in air to a powder state. Get AOK with a yield of 6.42% of A.S. bark.

Пример 2
В условиях примера 1 обрабатывают кору лиственницы, подверженную дополнительному измельчению таким образом, чтобы частицы проходили через сито 1 см². Получают АОК с выходом 6.93% от а.с.н. коры.Example 2
In the conditions of example 1, the larch bark, which is subjected to additional grinding, is treated so that the particles pass through a 1 cm ² sieve. Obtain AOK with a yield of 6.93% of a.s. bark.

Примеры 3-11
Процесс проводят в условиях примера 1. Изменяемые параметры процессов и выход целевого продукта приведены в таблице 1.Examples 3-11
The process is carried out under the conditions of example 1. Variable process parameters and the yield of the target product are shown in table 1.

Антиоксидантную активность получаемого из коры лиственницы фитокомплекса определяли согласно [Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. // Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972, с.241-242]. В качестве субстрата использовали соевый лецетин (New Spirit Naturals С A, USA) в трис-HCl (10мМ) концентрацией 1мг/мл [Huang S.W., Frankel E.N. Antioxidant activity of tea catechins in different lipid systems//J. Agr. And Food Chem. , 1997, Vol. 45, 8, p.3033-3038]. Окисление индуцировали аскорбатом железа (200 мкМ). Инкубировали 1 ч при 25^oС при постоянном перемешивании. Процесс останавливали 30% трихлоруксусной кислотой. С помощью 0,06М тиобарбитуровой кислоты (ТБК) определяли количество образовавшегося в реакционной среде малонового альдегида. Контроль вели спектрофотометрически при λ 532 нм. Измерения проводили против контроля (среда с лецитином и без фенольных соединений) с индуцированным окислением. В качестве позитивного контроля использовали среду, содержащую дигидрокверцетин, выделенный из древесины лиственницы. Полученные результаты представлены в таблице 2.The antioxidant activity of the phytocomplex obtained from the larch bark was determined according to [Vladimirov Yu.A., Archakov A.I. // Lipid peroxidation in biological membranes. M .: Nauka, 1972, p.241-242]. Soya lecetin (New Spirit Naturals CA, USA) in Tris-HCl (10 mM) concentration of 1 mg / ml was used as a substrate [Huang SW, Frankel EN Antioxidant activity of tea catechins in different lipid systems // J. Agr. And Food Chem. 1997, Vol. 45, 8, p.3033-3038]. Oxidation was induced by iron ascorbate (200 μM). Incubated for 1 h at 25 ^o With constant stirring. The process was stopped with 30% trichloroacetic acid. Using 0.06 M thiobarbituric acid (TBA), the amount of malonic aldehyde formed in the reaction medium was determined. The control was conducted spectrophotometrically at λ 532 nm. Measurements were performed against the control (medium with lecithin and without phenolic compounds) with induced oxidation. As a positive control, a medium containing dihydroquercetin isolated from larch wood was used. The results are presented in table 2.

Claims

1. Phytocomplex with antioxidant activity, obtained from the bark of larch Siberian and / or Daurian by extraction with ethyl acetate at a ratio of raw materials / extractant 1: 3-10 at 20-75 ^o C for 1-5 hours with further evaporation of the extractant and drying of the product .

2. A method of obtaining an antioxidant phytocomplex from the bark of natural raw materials, including extraction of the raw materials with an organic solvent, followed by evaporation of the extractant and drying of the target product, characterized in that Siberian and / or Daurian larch bark is used as raw material, and ethyl acetate is used as the extractant, and extraction lead at a ratio of raw material / extractant 1: 3-10, a temperature of 20-75 ^o C for 1-5 hours