RU2187554C1 - Method of extracellular inulinase preparing - Google Patents
Method of extracellular inulinase preparing Download PDFInfo
- Publication number
- RU2187554C1 RU2187554C1 RU2001112339/13A RU2001112339A RU2187554C1 RU 2187554 C1 RU2187554 C1 RU 2187554C1 RU 2001112339/13 A RU2001112339/13 A RU 2001112339/13A RU 2001112339 A RU2001112339 A RU 2001112339A RU 2187554 C1 RU2187554 C1 RU 2187554C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- inulinase
- amount
- extracellular
- activity
- preparing
- Prior art date
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения экстрацеллюлярной инулиназы, применяемой в пищевой промышленности, в медицине и производстве диетических продуктов. The invention relates to biotechnology, and in particular to a method for producing extracellular inulinase used in the food industry, in medicine and in the production of dietary products.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения инулиназы, продуцируемой Bacillus subtilis B-3-3. Исследована связь синтеза инулиназы с условиями культивирования штамма (рН, концентрация субстрата, аэрация). Показано, что Bacillus subtilis B-3-3 продуцирует активную инулиназу (до 21 ед./см3) при культивировании в щелочной среде при высокой концентрации источников углерода и хорошей аэрации. Сахароза может заменять инулин в качестве источника углерода в синтезе инулиназы. Инулиназа проявляет максимальную активность при рН 6,5 и температуре 55oС и сохраняет стабильность при рН 6,0-8,0 и температуре 40-55oС. Штамм продуцирует и внутриклеточный, и внеклеточный фермент в соотношении 1:2 соответственно (Изучение условий продукции инулиназы. Исследование и характеристика инулиназы (продуцируемой) штаммом B-3-3 / Xu Chunlan, Gu Tianchen //Шипинь юй фацзяо тун'е = Food and Ferment. Ind. -1991. - Vol.1. 6-P. 16-21).The closest in technical essence and the achieved effect is a method for producing inulinase produced by Bacillus subtilis B-3-3. The relationship between the synthesis of inulinase and the conditions of cultivation of the strain (pH, substrate concentration, aeration) was studied. It was shown that Bacillus subtilis B-3-3 produces active inulinase (up to 21 units / cm 3 ) when cultured in an alkaline medium with a high concentration of carbon sources and good aeration. Sucrose can replace inulin as a carbon source in inulinase synthesis. Inulinase exhibits maximum activity at a pH of 6.5 and a temperature of 55 o C and remains stable at a pH of 6.0-8.0 and a temperature of 40-55 o C. The strain produces both intracellular and extracellular enzyme in a ratio of 1: 2, respectively (Study Inulinase production conditions Study and characterization of inulinase (produced) by strain B-3-3 / Xu Chunlan, Gu Tianchen // Shipin Yu Fajiao Tune = Food and Ferment. Ind. -1991. - Vol.1. 6-P. 16-21).
Недостатками известного способа являются использование в качестве источников углерода инулина или сахарозы, а также высокая их концентрация в питательной среде, что экономически нецелесообразно из-за их высокой стоимости и является неоправданным, так как при этом получают продуцируемую инулиназу с низкой активностью (до 21 ед./см3).The disadvantages of this method are the use of inulin or sucrose as carbon sources, as well as their high concentration in a nutrient medium, which is economically unreasonable because of their high cost and is unjustified, as this produces produced inulinase with low activity (up to 21 units. / cm 3 ).
Техническая задача изобретения - повышение активности экстрацеллюлярной инулиназы и снижение ее себестоимости. The technical task of the invention is to increase the activity of extracellular inulinase and reduce its cost.
Техническая задача достигается тем, что в способе получения экстрацеллюлярной инулиназы, включающем подготовку питательной среды, культивирование штамма-продуцента, новым является то, что в качестве штамма-продуцента инулиназы используется штамм Bacillus polymyxa 722, а в питательную среду в качестве источника углерода и витаминов вносится меласса в количестве 8-10 мас.%, в качестве источника аминного азота и фосфора - гидрофосфат аммония в количестве 0,5-1,0 мас.%; рН среды - 7,0. The technical problem is achieved by the fact that in the method of producing extracellular inulinase, including the preparation of a nutrient medium, the cultivation of a producer strain, it is new that a strain of Bacillus polymyxa 722 is used as a producer strain of inulinase, and introduced into the nutrient medium as a source of carbon and vitamins molasses in an amount of 8-10 wt.%, as a source of amine nitrogen and phosphorus - ammonium hydrogen phosphate in an amount of 0.5-1.0 wt.%; pH of the medium is 7.0.
Технический результат изобретения выражается в повышении активности экстрацеллюлярной инулиназы, снижение ее себестоимости. The technical result of the invention is expressed in increasing the activity of extracellular inulinase, reducing its cost.
Способ реализуется следующим образом. The method is implemented as follows.
Штамм Bacillus polymyxa 722 получен из Всероссийской Коллекции Микроорганизмов РАН, где хранится под ВКМ В-722. Чистую культуру выращивают на мясо-пептонном агаре в течение 3-4 суток при температуре 31-33oС. При культивировании продуцента в качестве источника углерода и витаминов используют мелассу - отход сахарного производства в количестве 8-10 мас.%, а в качестве источника аминного азота и фосфора - гидрофосфат аммония в количестве 0,5-1,0 мас.%.The strain Bacillus polymyxa 722 was obtained from the All-Russian Collection of Microorganisms of the Russian Academy of Sciences, where it is stored under VKM B-722. Pure culture is grown on meat-peptone agar for 3-4 days at a temperature of 31-33 o C. When cultivating the producer, molasses is used as a source of carbon and vitamins - sugar production waste in an amount of 8-10 wt.%, And as a source amine nitrogen and phosphorus - ammonium hydrogen phosphate in an amount of 0.5-1.0 wt.%.
Питательную среду, содержащую дигидрофосфат калия, хлорид калия, сульфат магния, сульфат железа, гидрофосфат аммония, мелассу и воду, инокулируют штаммом Bacillus polymyxa 722 и выращивают его в оптимальных (рН 7,0; 37oС; 72 ч) для используемого штамма условиях. После завершения культивирования культуральную жидкость отделяют от биомассы и определяют инулиназную активность.A nutrient medium containing potassium dihydrogen phosphate, potassium chloride, magnesium sulfate, ferrous sulfate, ammonium hydrogen phosphate, molasses and water is inoculated with the Bacillus polymyxa 722 strain and grown under optimal conditions (pH 7.0; 37 ° C; 72 hours) for the strain used . After completion of the cultivation, the culture fluid is separated from the biomass and inulinase activity is determined.
В предлагаемом изобретении для определения инулиназной активности использован метод, основанный на определении редуцирующих веществ, освобождающихся в процессе гидролиза субстрата под действием фермента инулиназы. В качестве субстрата используется инулин фирмы "ICN" (США). In the present invention, a method based on the determination of reducing substances released during the hydrolysis of the substrate by the inulinase enzyme is used to determine inulinase activity. Inulin is used as a substrate by the company "ICN" (USA).
За единицу инулиназной активности принято такое количество фермента, которое катализирует образование 1 мкм редуцирующих веществ (фруктозы) за 1 мин. Методика анализа следующая. Реакционную смесь, состоящую из 2 см3 раствора инулина с массовой долей 5 % в фосфатном буфере рН 7,0 и 1 см3 раствора фермента, инкубируют в течение 20 мин при 40oС. Параллельно готовят контрольный опыт: к 2 см3 раствора инулина с массовой долей 5 % в фосфатном буфере рН 7,0 добавляют 3 см3 щелочи (150 г NaOH и 200 г тартрата калия-натрия в 1 дм3 дистиллированной воды) и 1 см3 культуральной жидкости.The amount of enzyme that catalyzes the formation of 1 μm of reducing substances (fructose) in 1 min is taken as a unit of inulinase activity. The analysis procedure is as follows. The reaction mixture, consisting of 2 cm 3 of inulin solution with a mass fraction of 5% in phosphate buffer pH 7.0 and 1 cm 3 of the enzyme solution, is incubated for 20 minutes at 40 o C. In parallel, a control experiment is prepared: 2 cm 3 of inulin solution with a mass fraction of 5% in phosphate buffer pH 7.0 add 3 cm 3 alkali (150 g NaOH and 200 g potassium sodium tartrate in 1 dm 3 distilled water) and 1 cm 3 culture liquid.
В опытной пробе по истечении 20 мин реакцию останавливают добавлением раствора щелочи 3 см3. После чего в опытную и контрольную пробы приливают по 3 см3 раствора медного купороса с массовой долей 4 %. Затем пробирки с содержимым взбалтывают и погружают сначала в кипящую водяную баню на 6 мин, потом в сосуд с холодной водой и определяют количество редуцирующих веществ полумикрометодом Бертрана. Инулиназную активность рассчитывают по формуле:
где А - активность инулиназы, ед./см3; А0 - количество редуцирующих веществ, образующихся в результате гидролиза инулина, мкг; Ак - количество редуцирующих веществ в контрольной пробе, мкг; n - количество культуралъной жидкости, см3; τ - время гидролиза, мин; 180 - молекулярная масса фруктозы.In the experimental sample after 20 minutes the reaction is stopped by adding an alkali solution of 3 cm 3 . Then, 3 cm 3 of copper sulfate solution with a mass fraction of 4% is poured into the experimental and control samples. Then the tubes with the contents are shaken and immersed first in a boiling water bath for 6 min, then in a vessel with cold water and the amount of reducing substances is determined by the Bertrand semi-micrometer. Inulinase activity is calculated by the formula:
where a is the activity of inulinase, units / cm 3 ; And 0 - the amount of reducing substances resulting from the hydrolysis of inulin, mcg; And to - the amount of reducing substances in the control sample, mcg; n is the amount of culture fluid, cm 3 ; τ is the hydrolysis time, min; 180 - molecular weight of fructose.
Состав питательной среды обеспечивает интенсификацию накопления инулиназной активности. The composition of the nutrient medium provides an intensification of the accumulation of inulinase activity.
Способ поясняется примерами. The method is illustrated by examples.
Пример 1. Готовят питательную среду следующего состава, мас.%:
Меласса - 6,0
(NH4)2HPO4 - 0,25
KCl - 0,05
MgSO4•7H2O - 0,05
КН2РO4 - 0,1
FeSO4•7H2O - 0,01
Вода - Остальное
Готовят водно-споровую суспензию штамма Bacillus polymyxa 722. Для этого 4-суточную культуру штамма переносят со скоса в колбу емкостью 250 см3, содержащую 50 см3 стерильной воды. В колбы Эрленмейера емкостью 500 см3 вносят по 120 см3 питательной среды (рН 7,0), засевают водно-споровой суспензией в количестве 1 % к объему среды и инкубируют на качалке при скорости 1,7-1,8 с-1, температуре 37±1oС в течение 72 ч. По окончании выращивания бактерии отделяют от культуральной жидкости центрифугированием (10000g, 10мин).Example 1. Prepare a nutrient medium of the following composition, wt.%:
Molasses - 6.0
(NH 4 ) 2 HPO 4 - 0.25
KCl - 0.05
MgSO 4 • 7H 2 O - 0.05
KN 2 PO 4 - 0.1
FeSO 4 • 7H 2 O - 0.01
Water - Else
An aqueous-spore suspension of the Bacillus polymyxa 722 strain is prepared. For this, the 4-day culture of the strain is transferred from the bevel to a 250 cm 3 flask containing 50 cm 3 of sterile water. In Erlenmeyer flasks with a capacity of 500 cm 3 , 120 cm 3 of nutrient medium (pH 7.0) is added, inoculated with a spore suspension in an amount of 1% by volume of the medium and incubated on a rocking chair at a speed of 1.7-1.8 s -1 , temperature 37 ± 1 o C for 72 hours. At the end of cultivation, the bacteria are separated from the culture fluid by centrifugation (10000g, 10min).
После завершения культивирования инулиназная активность культуральной жидкости составляет 52,6 ед./см3.After completion of the cultivation, the inulinase activity of the culture fluid is 52.6 units / cm 3 .
Пример 2. Готовят питательную среду следующего состава, мас.%:
Меласса - 8,0
(NH4)2HPO4 - 0,5
КСl - 0,05
MgSO4•7H2O - 0,05
KH2PO4 - 0,1
FeSO4•7H2O - 0,01
Вода - Остальное
Выращивание биомассы: инокуляцию посевного материала, соблюдение условий культивирования продуцента, определение активности проводят аналогично примеру 1.Example 2. Prepare a nutrient medium of the following composition, wt.%:
Molasses - 8.0
(NH 4 ) 2 HPO 4 - 0.5
KCl - 0.05
MgSO 4 • 7H 2 O - 0.05
KH 2 PO 4 - 0.1
FeSO 4 • 7H 2 O - 0.01
Water - Else
Cultivation of biomass: inoculation of seed, compliance with the conditions of cultivation of the producer, the determination of activity is carried out analogously to example 1.
После завершения культивирования инулиназная активность культуральной жидкости составляет 67,0 ед./см3.After completion of the cultivation, the inulinase activity of the culture fluid is 67.0 units / cm 3 .
Пример 3. Готовят питательную среду следующего состава, маc.%:
Меласса - 10,0
(NH4)2HPO4 - 1,0
КСl - 0,05
MgSO4•7H2O - 0,05
КН2РO4 - 0,1
FeSO4•7H2O - 0,01
Вода - Остальное
Выращивание биомассы: инокуляцию посевного материала, соблюдение условий культивирования продуцента, определение активности проводят аналогично примеру 1.Example 3. Prepare a nutrient medium of the following composition, wt.%:
Molasses - 10.0
(NH 4 ) 2 HPO 4 - 1.0
KCl - 0.05
MgSO 4 • 7H 2 O - 0.05
KN 2 PO 4 - 0.1
FeSO 4 • 7H 2 O - 0.01
Water - Else
Cultivation of biomass: inoculation of seed, compliance with the conditions of cultivation of the producer, the determination of activity is carried out analogously to example 1.
После завершения культивирования инулиназная активность культуральной жидкости составляет 76,2 ед./см3.After cultivation, the inulinase activity of the culture fluid is 76.2 units / cm 3 .
Пример 4. Готовят питательную среду следующего состава, мас.%:
Меласса - 12,0
(NH4)2HPO4 - 1,5
КСl - 0,05
MgSO4•7H2O - 0,05
КН2РO4 - 0,1
FеSO4•7Н2О - 0,01
Вода - Остальное
Выращивание биомассы: инокуляцию посевного материала, соблюдение условий культивирования продуцента, определение активности проводят аналогично примеру 1.Example 4. Prepare a nutrient medium of the following composition, wt.%:
Molasses - 12.0
(NH 4 ) 2 HPO 4 - 1.5
KCl - 0.05
MgSO 4 • 7H 2 O - 0.05
KN 2 PO 4 - 0.1
FeSO 4 • 7H 2 O - 0.01
Water - Else
Cultivation of biomass: inoculation of seed, compliance with the conditions of cultivation of the producer, the determination of activity is carried out analogously to example 1.
После завершения культивирования инулиназная активность культуральной жидкости составляет 65,6 ед./см3.After completion of the cultivation, the inulinase activity of the culture fluid is 65.6 units / cm 3 .
Как видно из примеров, при культивировании Bacillus polymyxa 722 наиболее эффективным является внесение в питательную среду мелассы в количестве 8-10 маc. % и гидрофосфата аммония в количестве 0,5-1,0 маc.%. Активность экстрацеллюлярной инулиназы повышается с 21 ед./см3 до 67,0-76,2 ед./см3 культуральной жидкости по сравнению с известным способом.As can be seen from the examples, during the cultivation of Bacillus polymyxa 722, the most effective is the introduction of molasses in the amount of 8-10 wt. % and ammonium hydrogen phosphate in an amount of 0.5-1.0 wt.%. The activity of extracellular inulinase increases from 21 units / cm 3 to 67.0-76.2 units / cm 3 of culture fluid compared with the known method.
Таким образом, предложенный способ получения экстрацеллюлярной инулиназы дает возможность получить фермент с высокой активностью и при этом снизить ее себестоимость. Thus, the proposed method for producing extracellular inulinase makes it possible to obtain an enzyme with high activity and at the same time reduce its cost.
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2001112339/13A RU2187554C1 (en) | 2001-05-04 | 2001-05-04 | Method of extracellular inulinase preparing |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2001112339/13A RU2187554C1 (en) | 2001-05-04 | 2001-05-04 | Method of extracellular inulinase preparing |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2187554C1 true RU2187554C1 (en) | 2002-08-20 |
Family
ID=20249325
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2001112339/13A RU2187554C1 (en) | 2001-05-04 | 2001-05-04 | Method of extracellular inulinase preparing |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2187554C1 (en) |
-
2001
- 2001-05-04 RU RU2001112339/13A patent/RU2187554C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
XU CHUNLAN, GU TIANCHEN. Исследование и характеристика инулиазы (продуцируемой) штаммом В-3-3. Шипинь юй фатзяо тун'е=Food and Ferment Ind. 1991. vol.1, №6, p.16-21. КОРНЕЕВА О.С. и др. Инулаза микромицета Aspergillus awamori 808. Препаративное получение и физико-химические свойства. Биотехнология, 1993, №7, с.31-38. РЖ БИОЛОГИЯ, №3. - М.: ВИНИТИ, 1996. О4Р. с.27. реф.3Р 1245. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5827699A (en) | Strain of Rhodococcus rhodochrous as a producer of nitrile hydratase | |
Zhu et al. | Hydrogen production by four cultures with participation by anoxygenic phototrophic bacterium and anaerobic bacterium in the presence of NH4+ | |
JPH0789946B2 (en) | Method for producing L-ascorbic acid by microorganism | |
JP2016503651A (en) | Rhodococcus aetherivorans VKMac-2610D strain producing nitrile hydratase, its culture method and method for producing acrylamide | |
CA1110189A (en) | Process for the continuous fermentation of micro- organisms with simultaneous conversion of sucrose into isomaltulose | |
CN105950590B (en) | A kind of preparation method of ι-carrageenase | |
KR102198203B1 (en) | Method for culturing a strain producing psicose epimerase | |
EP1616018A1 (en) | METHOD OF PRODUCING 1,2-PROPANEDIOL USING i KLEBSIELLA PNEUMONIAE /i | |
US4443545A (en) | Process for producing heparinase | |
RU2187554C1 (en) | Method of extracellular inulinase preparing | |
US4929557A (en) | Thermostable amylases and pullulanases from two anaerobic microorganisms | |
Moat et al. | Factors affecting the formation of acetylmethylcarbinol by lactobacillus arabinosus | |
Cánovas et al. | Limonin consumption at acidic pH values and absence of aeration by Rhodococcus fascians cells in batch and immobilized continuous systems | |
RU2096461C1 (en) | Yeast strain yarrowia lipolytica - producer of citric acid and method of citric acid production | |
JP2005518780A (en) | Metabolically controlled fermentation process for pseudomonic acid production | |
Molina et al. | Effect of corn steep liquor on xanthan production by Xanthomonas campestris | |
Ghosh et al. | Alkaline phosphatase derepression in vegetative cells of Bacillus subtilis by glucose and its reversal by lactate | |
KR900007000B1 (en) | Novel candida utilis and process for production of protein | |
SU1112057A1 (en) | Method for culturing bacilus subtilis producing alpha-amylase | |
Morinaga et al. | Homocysteine transmethylation in methanol-utilizing bacteria and its application to L-methionine production | |
RU2186850C2 (en) | Method of citric acid producing | |
JPH02100674A (en) | Culture of bacterium | |
SU1479513A1 (en) | Method of producing formate dehydrogenase | |
JP2800005B2 (en) | Method for producing deoxyribonucleic acid | |
SU1433981A1 (en) | Method of producing enzymic preparation of l-lysine-decarboxylase |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20030505 |