RU2180922C1

RU2180922C1 - Method of assay of chemokine receptor ccr2 gene alleles at polymorphous site v64i

Info

Publication number: RU2180922C1
Application number: RU2001106928A
Authority: RU
Inventors: М.И. Воевода; С.Н. Устинов; Н.С. Юдин; Т.Н. Кузнецова; В.Ф. Кобзев; А.Г. Ромащенко
Original assignee: Ромащенко Аида Герасимовна; Воевода Михаил Иванович
Priority date: 2001-03-14
Filing date: 2001-03-14
Publication date: 2002-03-27

Abstract

FIELD: molecular biology, medicine. SUBSTANCE: to assay chemokine receptor gene polymorphism DNA is isolated from a sample to be studied followed by DNA amplification by polymerase chain reaction method using allele-specific primers. To identify the wide-spread allele CCR2 64V the direct primer 5'- TGCGCATTTATTAAGATGAGGTC-3' is used; to identify the rare allele CCR2 64I the direct primer 5'-TGCGCAGTTTATTAAGATGAGGCT-3' is used; in both cases the sequence 5'- GTGTGGTCATCATTTTGTTCTTTG-3; is used as the reverse primes. The presence of gene alleles CCR2 in sample is proved by appearance amplified DNA fragment of size 296 nucleotide pairs on gele after electrophoresis carrying out. The detection of indicated fragment after DNA amplification with both primer pairs indicates the presence of both alleles while amplification of fragment with one pair of primers only indicates the presence of one corresponding allele of CCR2. Invention provides possibility to perform highly precise, simple and cheap analysis of chemokine receptor gene variants useful for total application in clinical laboratory. EFFECT: improved method of gene allele assay. 2 dwg, 1 ex

Description

Изобретение относится к молекулярной биологии и медицине и может быть использовано для быстрого и массового определения аллелей и генотипов гена хемокинового рецептора CCR2 по полиморфизму V64I. The invention relates to molecular biology and medicine and can be used for rapid and mass determination of alleles and genotypes of the chemokine receptor CCR2 gene by V64I polymorphism.

Полиморфизм гена хемокинового рецептора CCR2, обусловленный заменой G на А в 190-й позиции кодирующей части, приводящей соответственно к замене валина (V) на изолейцин (I) в 64-й позиции полипептида (обозначаемый как CCR2 64I), широко изучен в связи с генетически обусловленными различиями в развитии симптомов СПИД после заражения вирусом ВИЧ. Популяционная частота более редкого аллеля CCR2 64I для европеоидов составляет 9,8%, афроамериканцев - 15,1%, монголоидов - 25% (Smith et al., Science, 1997, v.277, p.959-964). Анализ генетических ассоциаций показал, что у ВИЧ-инфицированных индивидуумов, несущих аллель CCR2 64I, развитие симптомов СПИД задерживается на 2-4 года по сравнению с нормой. Имеются работы по ассоциации этого аллеля с сахарным диабетом (Szalai С et al., Pediatr Res, 1999, v.46(1), р.82-4) и астмой (Romano-Spica et al., Amer J Hum Genet., 2000, v.67(4), p.238). The polymorphism of the chemokine receptor gene CCR2, due to the replacement of G by A in the 190th position of the coding part, resulting in the replacement of valine (V) by isoleucine (I) in the 64th position of the polypeptide (denoted as CCR2 64I), has been widely studied in connection with genetically determined differences in the development of AIDS symptoms after infection with the HIV virus. The population frequency of the rarer CCR2 64I allele for Caucasians is 9.8%, African Americans 15.1%, Mongoloids 25% (Smith et al., Science, 1997, v.277, p.959-964). Analysis of genetic associations has shown that HIV-infected individuals carrying the CCR2 64I allele have a 2-4 year delay in the development of AIDS symptoms compared to normal. There is work on the association of this allele with diabetes mellitus (Szalai C et al., Pediatr Res, 1999, v. 46 (1), p. 82-4) and asthma (Romano-Spica et al., Amer J Hum Genet., 2000, v. 67 (4), p. 238).

Все известные способы выявления аллелей гена CCR2 основаны на использовании ПЦР в сочетании с анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (Michael et al., Nature Med, 1997, v.3(10), р.1160-1162; Smith et al., Nature Med, 1997, v.3, p.1052-1053) либо на использовании анализа конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК (SSCP) или секвенирования (Smith et al., Science, 1997, v.277, р.959-964). All known methods for detecting alleles of the CCR2 gene are based on the use of PCR in combination with restriction fragment length polymorphism analysis (Michael et al., Nature Med, 1997, v. 3 (10), p. 1160-1162; Smith et al., Nature Med , 1997, v.3, p.1052-1053) or using a single-stranded DNA conformational polymorphism (SSCP) analysis or sequencing (Smith et al., Science, 1997, v.277, p.959-964).

Наиболее близким к заявляемому способу (прототипом) является способ, основанный на двухэтапной процедуре амплификации ДНК с последующим расщеплением амплифицированного фрагмента рестриктазой BsaBI (Michael et al., Nature Med, 1997, v.3(10), p.1160-1162). В данном способе используют праймер, содержащий замену для генерации искусственного сайта рестрикции, отсутствующего в нуклеотидной последовательности гена CCR2. Closest to the claimed method (prototype) is a method based on a two-step DNA amplification procedure followed by cleavage of the amplified fragment with BsaBI restriction enzyme (Michael et al., Nature Med, 1997, v. 3 (10), p. 1160-1162). In this method, a primer containing a substitute is used to generate an artificial restriction site that is not present in the nucleotide sequence of the CCR2 gene.

Режим амплификации в прототипе: 94^oС в течение 4 мин, затем 5 циклов 30 с при 94^oС, 30 с при 65^oС, 30 с при 72^oС, затем 21 цикл 30 с при 94^oС, 30 с при 65^oС с последующим понижением температуры на 0,5^oС в каждом цикле до 55^oС, 30 с при 72^oС, затем 15 циклов 30 с при 94^oС, 30 с при 55^oС, 30 с при 72^oС, затем прогрев 10 мин при 72^oС. Амплификация с праймерами CCR2B-forward 5'-TTGTGGGCAACATGaTGG-3' (позиции 170-187) и CCR2B-reverse 5'-GAGCCCACAATGGGAGAGTA-3' (позиции 335-352) приводит к наработке фрагмента размером 183 п. н. Здесь и далее нумерация соответствует последовательности кДНК CCR2 из GenBank ( U03882), в которой отсчет идет от аденина инициирующего кодона трансляции. Выделенный аденин в первом праймере (см. выше) указывает на произведенную искусственную замену С на А (поз. 184 в кДНК), что в случае редкого аллеля, у которого в поз. 190 вместо G находится А, ведет к синтезу и амплификации фрагмента ДНК с сайтом рестрикции для эндонуклеазы BsaBI (GA¹⁸⁴TNN^ NNA¹⁹⁰TC). При добавлении рестриктазы BsaBI к ПЦР-продукту в случае аллеля CCR2 64I происходит расщепление ДНК с образованием двух фрагментов различной длины, 165 и 18 п.н., а в случае распространенного аллеля CCR2 64V этого не наблюдается. Таким образом, в результате электрофоретического анализа ДНК в 4% агарозе от генотипов, гомозиготных по распространенному аллелю (CCR2 64V), идентифицируется только полоса, соответствующая фрагменту ДНК длиной 183 п.н.; от гомозигот по редкому аллелю (CCR2 64I) - две полосы - 165 и 18 п.н., а от гетерозигот - три полосы - 183, 165 и 18 п.н.The amplification mode in the prototype: 94 ^o C for 4 min, then 5 cycles 30 s at 94 ^o C, 30 s at 65 ^o C, 30 s at 72 ^o C, then 21 cycle 30 s at 94 ^o C, 30 s at 65 ^o C followed by a decrease in temperature by 0.5 ^o C in each cycle to 55 ^o C, 30 s at 72 ^o C, then 15 cycles 30 s at 94 ^o C, 30 s at 55 ^o C, 30 s at 72 ^o C, then warming up for 10 min at 72 ^o С. Amplification with primers CCR2B-forward 5'-TTGTGGGCAACATGaTGG-3 '(positions 170-187) and CCR2B-reverse 5'-GAGCCCACAATGGGAGAGTA-3' (positions 335-352) leads to operating time fragment size 183 bp Hereinafter, the numbering corresponds to the CCR2 cDNA sequence from GenBank (U03882), in which the count comes from the adenine of the translation initiation codon. The isolated adenine in the first primer (see above) indicates the artificial replacement of C by A (pos. 184 in cDNA), which is the case with a rare allele in which in pos. 190 instead of G is A, leads to the synthesis and amplification of the DNA fragment with the restriction site for the BsaBI endonuclease (GA ¹⁸⁴ TNN ^ NNA ¹⁹⁰ TC). When BsaBI restriction enzyme is added to the PCR product in the case of the CCR2 64I allele, DNA is cleaved to form two fragments of different lengths, 165 and 18 bp, but this is not observed in the case of the common CCR2 64V allele. Thus, as a result of electrophoretic analysis of DNA in 4% agarose of genotypes homozygous for the common allele (CCR2 64V), only the band corresponding to the DNA fragment 183 bp in length is identified; from the homozygotes for the rare allele (CCR2 64I) - two bands - 165 and 18 bp, and from heterozygotes - three bands - 183, 165 and 18 bp

К недостаткам метода следует отнести: возможность ошибочного генотипирования гомозигот и гетерозигот по редкому аллелю CCR2 64I в случае неполного расщепления амплифицированного фрагмента ДНК рестриктазой BsaBI; необходимость проведения большого числа циклов амплификации для визуализации при электрофорезе фрагментов ДНК; усложненный температурный профиль ПЦР, обусловленный неполным соответствием структуры праймера нуклеотидной последовательности гена; относительная трудоемкость анализа и, наконец, необходимость применения рестриктазы, что существенно удорожает анализ. The disadvantages of the method include: the possibility of erroneous genotyping of homozygotes and heterozygotes for the rare allele CCR2 64I in the case of incomplete cleavage of the amplified DNA fragment with BsaBI restrictase; the need for a large number of amplification cycles for visualization during electrophoresis of DNA fragments; complicated temperature profile of PCR due to incomplete correspondence of the primer structure of the nucleotide sequence of the gene; the relative complexity of the analysis and, finally, the need for restriction enzymes, which significantly increases the cost of analysis.

Технической задачей предлагаемого изобретения является повышение точности и надежности выявления аллельных вариантов и генотипов CCR2, упрощение и удешевление анализа для массового использования в клинических лабораториях. The technical task of the invention is to increase the accuracy and reliability of the detection of allelic variants and genotypes of CCR2, simplify and reduce the cost of analysis for mass use in clinical laboratories.

Предлагаемый способ заключается в следующем:
Геномную ДНК из крови выделяют из 5-10 мл периферической крови по стандартной методике с использованием протеиназы К с последующей экстракцией фенол/хлороформом (Смит К., Клко С., Кантор Ч. В сб. Анализ генома. Под ред. К. Дейвиса. , М. : Мир, 1990. С.58-94). Для амплификации распространенного аллеля (CCR2 64V) с G в 190-й позиции используют прямой праймер 5'-TGCGCAGTTTATTAAGATGAGGTC-3' (позиции 213-190) с цитозином на 3' конце. Для амплификации более редкого аллеля (CCR2 64I) с А в 190-й позиции прямой праймер имеет структуру 5'-TGCGCAGTTTATTAAGATGAGGCT-3' (позиции 213-190) с тимином на 3' конце. В качестве обратного праймера для амплификации обоих аллелей используют праймер 5'-GTGTGGTCATCATTTTGTTCTTTG-3'.The proposed method is as follows:
Genomic DNA from the blood is isolated from 5-10 ml of peripheral blood according to a standard method using proteinase K followed by extraction with phenol / chloroform (Smith K., Klko S., Kantor Ch. In Sat. Genome analysis. Edited by K. Davis. , M.: Mir, 1990. P. 58-94). For amplification of the common allele (CCR2 64V) with G at the 190th position, a direct primer 5'-TGCGCAGTTTATTAAGATGAGGTC-3 '(positions 213-190) with cytosine at the 3' end is used. For amplification of the rarer allele (CCR2 64I) with A at the 190th position, the forward primer has the structure 5'-TGCGCAGTTTATTAAGATGAGGCT-3 '(positions 213-190) with thymine at the 3' end. A 5'-GTGTGGTCATCATTTTTGTTCTTTG-3 'primer is used as the reverse primer for amplification of both alleles.

Используемый режим амплификации включает стадии: начальную денатурацию при 95^oС в течение 5 мин, затем 32 цикла - с денатурацией в течение 1 мин при 95^oС; отжигом в течение 0,9 мин при 55^oС и синтезом в течение 1,2 мин при 72^oС. Продукты ПЦР анализируют электрофорезом в 4% полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием.The amplification mode used includes the steps of: initial denaturation at 95 ^° C for 5 minutes, then 32 cycles - with denaturation for 1 minute at 95 ^° C; annealing for 0.9 min at 55 ^o C and synthesis for 1.2 min at 72 ^o C. PCR products are analyzed by electrophoresis in 4% polyacrylamide gel, followed by staining with ethidium bromide.

Определение аллелей гена CCR2 проводят по наличию или отсутствию в геле фрагмента размером 296 п.н. В случае, если фрагмент выявляется при амплификации ДНК с обеими парами праймеров, это свидетельствует о присутствии обеих аллелей в генотипе индивида. Следовательно, носитель образца ДНК - гетерозигота. Амплификация фрагмента только с одной парой праймеров и отсутствие амплификата при использовании другой пары свидетельствует о гомозиготном состоянии по соответствующему аллелю. Alleles of the CCR2 gene are determined by the presence or absence of a 296 bp fragment in the gel. If a fragment is detected during DNA amplification with both pairs of primers, this indicates the presence of both alleles in the individual's genotype. Therefore, the carrier of the DNA sample is heterozygote. Amplification of a fragment with only one pair of primers and the absence of amplification when using another pair indicates a homozygous state for the corresponding allele.

С помощью предлагаемого способа обследованы 93 русских и 20 якутов. В результате среди русских выявлены 19 гетерозиготных и 1 гомозиготный по аллелю CCR2 64I индивидуум. У якутов число гетеро- и гомозигот составляет 9 и 1 соответственно. Частота редкого аллеля для европеоидов (русские) составляет 11,3%, для монголоидов (якуты) - 27,5%. Using the proposed method examined 93 Russian and 20 Yakuts. As a result, among the Russians, 19 heterozygous and 1 individuals homozygous for the CCR2 64I allele were identified. In Yakuts, the number of hetero- and homozygotes is 9 and 1, respectively. The frequency of the rare allele for Caucasians (Russians) is 11.3%, for Mongoloids (Yakuts) - 27.5%.

Определяющим существенным отличием заявляемого способа по сравнению с прототипом является то, что в прототипе проводят стандартную амплификацию ДНК с использованием пары праймеров, фланкирующих интересующий фрагмент. В заявляемом способе используют другой подход - аллель-специфическую амплификацию. При таком анализе амплификацию проводят в двух параллельных пробах: в одной - в качестве прямого праймера используют олигонуклеотид с концевым нуклеотидом (Т), комплиментарным аденину (А) в 190 позиции редкого аллеля гена (CCR2 64I), а в другой - праймер с концевой дезоксицитидиловой кислотой (С), комплиментарной гуанину (G) в 190 позиции распространенного аллеля (CCR2 64V). Такой подход позволяет значительно увеличить точность и надежность выявления соответствующих аллелей гена CCR2 и упростить процедуру анализа продуктов амплификации. Кроме того, в заявляемом способе отсутствует этап обработки рестриктазой амплифицированного фрагмента ДНК. Это снижает вероятность субъективной ошибки при интерпретации результатов генотипирования, поскольку идентификации подлежит одна полоса, а не несколько, как имеет место быть в случае прототипа. The determining significant difference of the proposed method compared with the prototype is that in the prototype conduct standard amplification of DNA using a pair of primers flanking the fragment of interest. In the inventive method, a different approach is used - allele-specific amplification. In this analysis, amplification is carried out in two parallel samples: in one, an oligonucleotide with a terminal nucleotide (T) complementary to adenine (A) at the 190th position of the rare gene allele (CCR2 64I) is used as a direct primer, and in the other, a primer with terminal deoxycytidyl acid (C), complementary to guanine (G) in the 190th position of the common allele (CCR2 64V). This approach can significantly increase the accuracy and reliability of detection of the corresponding alleles of the CCR2 gene and simplify the analysis of amplification products. In addition, in the claimed method there is no stage of restriction enzyme treatment of the amplified DNA fragment. This reduces the likelihood of a subjective error in interpreting the results of genotyping, since identification is subject to one strip, and not several, as is the case in the case of the prototype.

Изобретение иллюстрируется следующим примером конкретного выполнения. The invention is illustrated by the following specific embodiment.

Геномную ДНК трех индивидуумов выделяли из периферической крови с использованием протеиназы К и экстракции фенол/хлороформом. Смесь для амплификации объемом 25 мкл содержала: 67мМ Трис-HCl, рН 8,8, 50 мМ КСl, 98мМ β-меркаптоэтанол, 0,01% Tween-20, 0,5 мкг тотальной ДНК, по 0,5 мкМ прямого и обратного праймера, 0,2 мМ каждого из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, 1,5мМ MgCl₂, 10% глицерин и 1,25 е.а. Taq-полимеразы. Для идентификации распространенного аллеля (CCR2 64V) использовали прямой праймер 5'-TGCGCAGTTTATTAAGATGAGGTC-3'. Для идентификации редкого аллеля (CCR2 64I) использовали прямой праймер 5'-TGCGCAGTTTATTAAGATGAGGCT-3'. В качестве обратного праймера для амплификации обоих аллелей использовали олигонуклеотид 5'-GTGTGGTCATCATTTTGTTCTTTG-3'. Режим амплификации: начальная денатурация при 95^oС - 5 мин, затем 32 цикла, каждый из которых состоял из денатурации - 1 мин при 95^oС; отжига - 0,9 мин при 55^oС и синтеза - 1,2 мин при 72^oС. Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 4% полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием. На гель наносили 5 мкл амплификата. Электрофорез проводили в течение 30 мин при напряжении 300 В.The genomic DNA of three individuals was isolated from peripheral blood using proteinase K and phenol / chloroform extraction. The amplification mixture with a volume of 25 μl contained: 67 mM Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM KCl, 98 mM β-mercaptoethanol, 0.01% Tween-20, 0.5 μg total DNA, 0.5 μM forward and reverse primer, 0.2 mM each of the four deoxynucleoside triphosphates, 1.5 mM MgCl ₂ , 10% glycerol and 1.25 ea Taq polymerase. The 5'-TGCGCAGTTTATTAAGATGAGGTC-3 'direct primer was used to identify the common allele (CCR2 64V). The 5'-TGCGCAGTTTATTAAGATGAGGCT-3 'direct primer was used to identify the rare allele (CCR2 64I). A 5'-GTGTGGTCATCATTTTTTTTTTTG-3 'oligonucleotide was used as the reverse primer for amplification of both alleles. Amplification mode: initial denaturation at 95 ^o C - 5 min, then 32 cycles, each of which consisted of denaturation - 1 min at 95 ^o C; annealing - 0.9 min at 55 ^o C and synthesis - 1.2 min at 72 ^o C. PCR products were analyzed by electrophoresis in 4% polyacrylamide gel followed by staining with ethidium bromide. 5 μl of amplification was applied to the gel. Electrophoresis was carried out for 30 min at a voltage of 300 V.

Электрофореграмма приведена на фиг. 1. Образец 1 взят от индивидуума, гомозиготного по аллелю 64V/64V. На это указывает наличие фрагмента ДНК размером 296 п.н. только на одной из пары дорожек в случае амплификации фрагмента ДНК CCR2 с парой праймеров, один из которых имеет 3'-концевой нуклеотид, комплиментарный гуанину в поз.190 распространенного аллеля (CCR2 64V) - (дорожки 1 и 2). Образец 2 принадлежит индивидууму с гетерозиготным генотипом 64V/64I (фрагмент размером 296 п.н. выявляется при амплификации с обоими парами праймеров - дорожки 3 и 4 соответственно). Образец 3 получен от индивидуума, гомозиготного по аллелю 64I/64I. На это указывает наличие фрагмента только при амплификации с той парой праймеров, где прямой имеет 3'-концевой нуклеотид, комплиментарный аденину в позиции 190 редкого аллеля (CCR2 64I) (дорожки 5 и 6). Electrophoregram is shown in FIG. 1. Sample 1 was taken from an individual homozygous for the 64V / 64V allele. This is indicated by the presence of a 296 bp DNA fragment. only on one of the pair of tracks in the case of amplification of a CCR2 DNA fragment with a pair of primers, one of which has a 3'-terminal nucleotide complementary to guanine in pos. 190 of the common allele (CCR2 64V) - (lanes 1 and 2). Sample 2 belongs to an individual with the heterozygous 64V / 64I genotype (a fragment of 296 bp is detected by amplification with both primer pairs — lanes 3 and 4, respectively). Sample 3 was obtained from an individual homozygous for the 64I / 64I allele. This is indicated by the presence of a fragment only during amplification with that pair of primers where the straight line has a 3'-terminal nucleotide complementary to adenine at position 190 of the rare allele (CCR2 64I) (lanes 5 and 6).

Правильность определения генотипов заявляемым способом была подтверждена независимо с помощью полимеразной цепной реакции и гидролиза продукта ПЦР рестриктазой Bse8 I (СибЭнзим, Новосибирск, изошизомер рестриктазы BsaBI) по способу, взятому в качестве прототипа (Smith et al., Science 1997, v.277, р. 959-965), а также с помощью прямого секвенирования (фиг.2). Из фиг.2 видно, что результаты анализа, выполненного заявляемым способом и с помощью прямого секвенирования, полностью совпадают. The correctness of the determination of genotypes by the claimed method was confirmed independently by polymerase chain reaction and hydrolysis of the PCR product with Bse8 I restriction enzyme (SibEnzyme, Novosibirsk, BsaBI restriction enzyme isoschisomer) by the method taken as a prototype (Smith et al., Science 1997, v.277, p . 959-965), as well as using direct sequencing (figure 2). From figure 2 it is seen that the results of the analysis performed by the claimed method and using direct sequencing, completely coincide.

Claims

A method for determining the alleles of the CCR2 chemokine receptor gene by the V64I polymorphic site, including sampling material from a patient, amplifying a CCR2 gene fragment using a pair of primers, characterized in that the amplification is carried out by allele-specific PCR using two pairs of primers, while identifying the common CCR2 64V allele use the direct primer 5'-TGCGCAGTTTATTAAGATGAGGTC-3 ', to identify the rare allele CCR2 64I use the direct primer 5'-TGCGCAGTTTATTAAGATGAGGCT-3', and as the reverse primer for identification both alleles use a 5'-GTGTGGTCATCATTTTTTTTTTTTG-3 'primer.