RU2177803C1

RU2177803C1 - Agent eliciting immunostimulating activity

Info

Publication number: RU2177803C1
Application number: RU2000127222A
Authority: RU
Inventors: В.Л. Цепелев; С.Л. Цепелев; Н.Н. Цыбиков
Original assignee: Цепелев Виктор Львович; Цепелев Сергей Львович
Priority date: 2000-10-30
Filing date: 2000-10-30
Publication date: 2002-01-10

Abstract

FIELD: medicine, peptides, biochemistry. SUBSTANCE: invention relates to novel peptide agents eliciting immunostimulating activity. Invention proposes to use the novel synthetic peptide of structural formula: Trp-Thr-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu as an agent with immunostimulating activity. Activity of peptide Trp-Thr-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu is evident in 10-fold less doses as compared with prototype. Agent can be used in medicine for prophylaxis and treatment of patients with extended immunodeficient states of different etiology and designated for control of immunodeficiency. EFFECT: new peptide indicated above, broadened arsenal, enhanced biological activity. 6 tbl

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к новым пептидным средствам, обладающим иммуностимулирующей активностью. The invention relates to medicine, namely to new peptide agents having immunostimulating activity.

Известны вещества пептидной природы, обладающие иммуностимулирующей активностью. К ним относятся препараты, полученные из тимуса животных, такие как тимозин [1] , Т-активин [2] , тималин [3] , а также выделенные из костного мозга и бурсы Фабрициуса: миелопид, бурсилин, гемалин [4] . Эти препараты состоят из комплекса веществ пептидной природы, которые способны регулировать различные этапы пролиферации и созревания лимфоцитов, воздействовать на различные звенья иммунного ответа. Использование их в качестве иммуностимулирующих средств затруднено в связи со сложностью способов получения, малым выходом активных веществ, значительной вариабельностью их физико-химических свойств, а также из-за наличия нежелательных побочных эффектов ввиду присутствия в природных препаратах тимуса балластных высокомолекулярных компонентов. Предпочтительнее использовать низкомолекулярные синтетические пептиды. Они эффективны в чрезвычайно малых дозах и не оказывают вредного воздействия на организм. Known substances of peptide nature with immunostimulating activity. These include preparations obtained from the thymus of animals, such as thymosin [1], T-activin [2], thymalin [3], as well as those isolated from the bone marrow and bursa of Fabricius: myelopid, bursilin, hemalin [4]. These drugs consist of a complex of substances of peptide nature, which are able to regulate the various stages of proliferation and maturation of lymphocytes, act on various parts of the immune response. Their use as immunostimulating agents is difficult due to the complexity of the preparation methods, the low yield of active substances, the significant variability of their physicochemical properties, and also due to the presence of undesirable side effects due to the presence of high-molecular weight ballast components in natural preparations of the thymus. It is preferable to use low molecular weight synthetic peptides. They are effective in extremely small doses and do not have a harmful effect on the body.

Известны синтетические пептиды, обладающие иммуностимулирующей активностью. К ним относятся пептид Glu-Asp-Ser-Ser-Thr-Gly-Trp-Asp-OH (патент США 4478828, А 61 К 37/00, С 07 С 103/52, 1984); тимопентин Arg-Lys-Asp-Val-Thr (Goldstein G. , Audhya Т. К. . Thymopoietin to Thymopentin: Experimental Studies. Survey of immunologic Research. (1985), 4: suppl. 1, pp. 1-10); аналоги тимопентина (патент ЕР 1450798, С 07 К 7/64, 1985; патент США 5013723, А 61 К 37/02, 1991); пептид общей формулы R-NH-CH-(-COOH)-
(CH₂-)_n-CO-X, где n = 1, 2, R - водород, низший ацил или низший алкил, Х-гетероароматическая аминокислота (патент РФ 2142958, С 07 К 5/037, А 61 К 38/05, 1999); пептид формулы R-Arg-X-Y-Z-R₁, где R - водород, ацетил, формил; Х - пролин, Y - L-Ala, L-Asp, L-Val; Z - L-Val, L-Ala; R₁ - H, OH, NH₂, NH (СН₃), NНСН(СН₃)₂ (патент РФ 2060998, С 07 К 5/068, А 61 К 38/07, 1996); пептид L-Lys-L-Glu (патент РФ 2080120, А 61 К 38/05, 1997); гексапептид структурной формулы: аргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин (патент РФ 2062096, А 61 К 38/08, 1996); лизинсодержащий пептид, имеющий формулу: R₁-L-Glx-L-Glx-L-Lys-R₂, где Glx - это Gln или Glu (патент WO 94/09804, А 61 К 37/00, 73/02, С 07 К 5/00, 1994); пептид Tyr-Gly (патент США 5100663, А 61 К 37/02, 1992); пептид, имеющий формулу L-Thr-L-Ala-L-Glx-L-Glx-L-Lys, где Glx - это Gln или Glu (патент WO 95/12810, А 61 К 37/02, С 07 К 7/06, 1993); аналог гормона тимуса, имеющий формулу Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (патент WO 95/01182, А 61 К 37/00, 37/02, С 07 R 5/00, 7/00, 15/00, 17/00, 1995); пептид, обладающий иммуномодуляторной активностью Н-Lys-Asn-Pro-Tyr-OH (патент США 5980913, А 61 К 38/04, 1999); трипептид Arg-Lys-Glu, обладающий иммуностимулирующей активностью и действующий в основном на Т-клеточное звено иммунитета (патент США 4874844, С 07 К 5/08, 1989); нонапептид формулы Glu-Asp-Ser-Ser-Ser-Thr-Gly-Trh-Asn-OH (патент США 4478828, А 61 К 37/00, 1984); пептид формулы А-В-С-И-Д, где А - Lys или Arg, В - Lys или Arg, С - Asp или Glu, И - Val или Тyr, Тгр, Д - Тгр или Phe (патент США 4650788, А 61 К 37/02, 1987); пептид, имеющий в своем составе аминокислотную последовательность пролил-глицил (патент США 4399124, А 61 К 37/00, 1983); пептид формулы A-X-Lys-Y-B, где А - Н, или трипептид Arg-Ala-Arg, или гексапептид Glu-Lys-Arg-Arg-Ala-Arg, Х и Y - аргинин или глутаминовая кислота, В-ОН, или трипептид Arg-Ala-Arg (патент США 5079231, А 61 К 37/02, 1992); аналог сывороточного тимического фактора общей формулы A-Gly-Gly-Ser-Asn-B-C-NH-R, где А - Glu, Gln, Ala-Lys-Ser или Glu-Ala-Lys-Ser; В и С - Gly, Phe, Leu, Ala (патент ЕР 0201646, С 07 К 07/06, 1986); иммуностимулирующий пептид (патент ЕР 0353565, С 07 К 07/06 1990), миелопептиды (WO 98/30581, С 07 К 7/06, 1998).Synthetic peptides having immunostimulating activity are known. These include the peptide Glu-Asp-Ser-Ser-Thr-Gly-Trp-Asp-OH (US patent 4478828, A 61 K 37/00, C 07 C 103/52, 1984); thymopentin Arg-Lys-Asp-Val-Thr (Goldstein G., Audhya T.K. Thymopoietin to Thymopentin: Experimental Studies. Survey of immunologic Research. (1985), 4: suppl. 1, pp. 1-10); thymopentin analogues (patent EP 1450798, C 07 K 7/64, 1985; US patent 5013723, A 61 K 37/02, 1991); peptide of the general formula R-NH-CH - (- COOH) -
(CH ₂ -) _n -CO-X, where n = 1, 2, R is hydrogen, lower acyl or lower alkyl, X-heteroaromatic amino acid (RF patent 2142958, C 07 K 5/037, A 61 K 38/05 , 1999); a peptide of the formula R-Arg-XYZR ₁ , where R is hydrogen, acetyl, formyl; X is proline, Y is L-Ala, L-Asp, L-Val; Z is L-Val, L-Ala; R ₁ is H, OH, NH ₂ , NH (CH ₃ ), NCH (CH ₃ ) ₂ (RF patent 2060998, C 07 K 5/068, A 61 K 38/07, 1996); L-Lys-L-Glu peptide (RF patent 2080120, A 61 K 38/05, 1997); hexapeptide of the structural formula: arginyl-alpha-aspartyl-lysyl-valyl-tyrosyl-arginine (RF patent 2062096, A 61 K 38/08, 1996); a lysine-containing peptide having the formula: R ₁ -L-Glx-L-Glx-L-Lys-R ₂ , where Glx is Gln or Glu (patent WO 94/09804, A 61 K 37/00, 73/02, C 07 K 5/00, 1994); Tyr-Gly peptide (US Pat. No. 5,100,663, A 61 K 37/02, 1992); a peptide having the formula L-Thr-L-Ala-L-Glx-L-Glx-L-Lys, where Glx is Gln or Glu (patent WO 95/12810, A 61 K 37/02, C 07 K 7 / 06, 1993); thymus hormone analogue having the formula Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (patent WO 95/01182, A 61 K 37/00, 37/02, C 07 R 5/00, 7/00, 15/00, 17/00, 1995); a peptide having immunomodulatory activity of H-Lys-Asn-Pro-Tyr-OH (US patent 5980913, A 61 K 38/04, 1999); Arg-Lys-Glu tripeptide having immunostimulatory activity and acting mainly on the T-cell immunity (US patent 4874844, C 07 K 5/08, 1989); a nonapeptide of the formula Glu-Asp-Ser-Ser-Ser-Thr-Gly-Trh-Asn-OH (US Pat. No. 4,478,828, A 61 K 37/00, 1984); a peptide of formula ABC-I-D, where A is Lys or Arg, B is Lys or Arg, C is Asp or Glu, And Val or Tyr, Tg, D is Tg or Phe (US Pat. No. 4,650,788, A 61 K 37/02, 1987); a peptide containing the amino acid sequence of prolyl-glycyl (US patent 4399124, A 61 K 37/00, 1983); a peptide of the formula AX-Lys-YB, where A is H, or an Arg-Ala-Arg tripeptide, or a Glu-Lys-Arg-Arg-Ala-Arg hexapeptide, X and Y are arginine or glutamic acid, B-OH, or a tripeptide Arg-Ala-Arg (US Pat. No. 5,079,231, A 61 K 37/02, 1992); an analogue of a serum thymic factor of the general formula A-Gly-Gly-Ser-Asn-BC-NH-R, where A is Glu, Gln, Ala-Lys-Ser or Glu-Ala-Lys-Ser; B and C - Gly, Phe, Leu, Ala (patent EP 0201646, C 07 K 07/06, 1986); immunostimulating peptide (patent EP 0353565, C 07 K 07/06 1990), myelopeptides (WO 98/30581, C 07 K 7/06, 1998).

Известно иммуностимулирующее средство тимоген [5, 6] , синтезированный на основе выделенной из тималина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии иммуноактивной фракции, представляющей собой дипептид Glu-Trp. Данное вещество по технической сущности и достигаемому эффекту является наиболее близким к предлагаемому решению и является его прототипом. Однако данный пептид обладает низкой биологической активностью, что требует применения больших доз препарата и влечет появление нежелательных побочных эффектов. The immunostimulating agent thymogen is known [5, 6], synthesized on the basis of the immunoactive fraction, which is a Glu-Trp dipeptide, isolated from thymalin by high performance liquid chromatography. This substance in terms of technical nature and the achieved effect is the closest to the proposed solution and is its prototype. However, this peptide has low biological activity, which requires the use of large doses of the drug and entails the appearance of undesirable side effects.

Настоящее изобретение направлено на расширение арсенала и повышение биологической активности средств, обладающих иммуностимулирующим действием. The present invention is directed to expanding the arsenal and increasing the biological activity of agents having an immunostimulating effect.

Решение поставленной задачи достигается тем, что в качестве средства, обладающего иммуностимулирующим действием, предлагается использовать новый синтетический пептид структурной формулы Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu. The solution of this problem is achieved by the fact that as a means of having an immunostimulating effect, it is proposed to use a new synthetic peptide of the structural formula Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu.

Пептид формулы Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu был обнаружен в ткани бурсы Фабрициуса - центральном органе гуморального иммунитета птиц, и в дальнейшем синтезирован. Пептид синтезировали стандартной методикой твердофазного синтеза путем наращивания пептидной цепи с N-конца [7] . A peptide of the formula Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu was found in the fabric of Bursa Fabricius, the central organ of humoral immunity of birds, and was further synthesized. The peptide was synthesized by the standard method of solid-phase synthesis by expanding the peptide chain from the N-terminus [7].

При экспериментальном изучении биологической активности заявляемого средства, проведенном в сравнении с тимогеном, выявлена его способность стимулировать иммунитет. Это подтверждается следующими примерами. In an experimental study of the biological activity of the claimed drug, carried out in comparison with thymogen, its ability to stimulate immunity is revealed. This is confirmed by the following examples.

1. Влияние пептида Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu на экспрессию Е-рецепторов "трипсинизированных" тимоцитов. С целью получения суспензии лимфоидных клеток тимус интактных морских свинок-самцов гомогенизировали в среде 199. Затем полученную суспензию тимоцитов обрабатывали протеолитическим ферментом трипсином ("Sigma"), разрушающим большую часть Е-рецепторов на поверхности клеток к эритроцитам кролика, в результате чего снижается процентное содержание клеток, выявляемых в реакции розеткообразования. В суспензии интактных тимоцитов и тимоцитов, обработанных трипсином, определяли процентное содержание "активных" Т-лимфоцитов (Еа-РОК) методом розеткообразования с эритроцитами кролика [8, 9] . 1. The effect of the Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu peptide on the expression of trypsinized thymocyte E receptors. In order to obtain a suspension of lymphoid cells, the thymus of intact male guinea pigs was homogenized in medium 199. Then, the resulting suspension of thymocytes was treated with the trypsin proteolytic enzyme (Sigma), which destroys most of the E-receptors on the surface of the rabbit erythrocytes, resulting in a decrease in the percentage cells detected in the reaction of rosette formation. In the suspension of intact thymocytes and thymocytes treated with trypsin, the percentage of “active” T-lymphocytes (Ea-ROCK) was determined by rosette formation with rabbit erythrocytes [8, 9].

Установлено, что обработка трипсином приводит к снижению более чем в 2 раза количества тимоцитов, имеющих на поверхности Е-рецепторы. Добавление пептида Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu в концентрации 0,1-0,001 мкг/мл и тимогена в концентрации 0,1-0,01 мкг/мл приводило к восстановлению количества Е-рецепторов лимфоидных клеток тимуса (табл. 1). It was found that trypsin treatment leads to a more than 2-fold decrease in the number of thymocytes with E-receptors on the surface. The addition of the peptide Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu at a concentration of 0.1-0.001 μg / ml and thymogen at a concentration of 0.1-0.01 μg / ml led to the restoration of the number of E-lymphoid cell receptors thymus (table. 1).

Таким образом, минимальная концентрация, в которой заявляемое средство способствует усилению экспрессии Е-рецепторов тимоцитов, в 10 раз меньше, чем у тимогена, что указывает на более высокую иммуностимулирующую активность пептида Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu. Thus, the minimum concentration in which the claimed agent enhances the expression of thymocyte E-receptors is 10 times lower than that of thymogen, which indicates a higher immunostimulating activity of the Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu peptide .

2. Влияние пептида Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu на экспрессию иммуноглобулиновых рецепторов В-лимфоцитов. Известно, что IgM является маркером зрелой В-клетки и определяется на завершающем этапе антигеннезависимой дифференцировки и пролиферации В-лимфоцитов [10] . Лимфоциты выделяли из гепаринизированной (25 ЕД/мл) периферической крови больных с ожогами IIIб-IV степени 15-30% поверхности тела, поскольку известно, что при ожоговой болезни нарушается дифференцировка лимфоцитов и в периферической крови появляется большое количество незрелых или "нулевых" клеток [11, 12] . Выделенные клетки инкубировали в течение 2 часов при температуре 37^oС в полной питательной среде с пептидом Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu и тимогеном в концентрациях от 0,001 до 1 мкг/мл. Уровень экспрессии IgM-рецепторов оценивали методом непрямой мембранной иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител СН2 ("Сорбент", Москва) [13] .2. The effect of the peptide Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu on the expression of immunoglobulin receptors of b-lymphocytes. It is known that IgM is a marker of mature B-cells and is determined at the final stage of antigen-independent differentiation and proliferation of B-lymphocytes [10]. Lymphocytes were isolated from heparinized (25 IU / ml) peripheral blood of patients with burns of IIIb-IV degree 15-30% of the body surface, since it is known that with burn disease lymphocyte differentiation is disturbed and a large number of immature or "zero" cells appear in the peripheral blood [ 11, 12]. The isolated cells were incubated for 2 hours at a temperature of 37 ^° C in a complete nutrient medium with the peptide Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu and thymogen in concentrations from 0.001 to 1 μg / ml. The level of expression of IgM receptors was assessed by the indirect membrane immunofluorescence method using monoclonal antibodies CH2 (Sorbent, Moscow) [13].

Установлено, что у больных с ожогами более чем в 1,5 раза снижено количество лимфоцитов, несущих поверхностный IgM, что, вероятно, связано с дефектом дифференцировки лимфоцитов в костном мозге. Предлагаемый пептид Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu дозозависимо стимулирует экспрессию иммуноглобулиновых рецепторов. Так, заявляемое средство эффективно в концентрациях 0,1-1 мкг/мл. В то же время известное средство тимоген проявляет слабую активность лишь в концентрации 1 мкг/мл (табл. 2). It was found that in patients with burns, the number of lymphocytes carrying surface IgM was reduced by more than 1.5 times, which is probably due to a defect in the differentiation of lymphocytes in the bone marrow. The proposed peptide Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu dose-dependently stimulates the expression of immunoglobulin receptors. So, the claimed tool is effective in concentrations of 0.1-1 μg / ml. At the same time, the known agent thymogen exhibits weak activity only at a concentration of 1 μg / ml (table. 2).

Таким образом, заявляемое средство синтетический пептид Тrр-Тrе-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu увеличивает экспрессию IgM-рецепторов В-лимфоцитов в дозах, в 10 раз меньших, чем тимоген. Thus, the claimed agent synthetic peptide Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu increases the expression of IgM receptors of B-lymphocytes in doses 10 times lower than thymogen.

3. Влияние пептида Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu на экспрессию дифференцировочных антигенов лимфоцитов больных с ожогами in vitro. Оценка действия заявляемого средства на субпопуляции лимфоцитов проводилась методом непрямой мембранной иммунофлюоресценции с моноклональными антителами LT3, LT4, LT8, LT19 и LT21 к дифференцировочным антигенам CD3, CD4, CDS, CD19 и CD21 соответственно ("Сорбент", Москва) [13] . Лимфоциты больных с ожогами, сопровождающимися вторичным иммунодефицитом, выделяли на градиенте плотности фиколл-верографин. Полученную суспензию клеток инкубировали с пептидом Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu и тимогеном в течение 60 минут при 37^oС в полной питательной среде RPMI-1640 ("Flow") с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки ("Flow"), 2 мМ L-глутамина ("Flow"), 40 мкг/мл гентамицина ("Фармахим") и 5 мМ HEPES-буфера. В качестве контроля использовали физиологический раствор в соответствующем объеме.3. The effect of the peptide Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu on the expression of differentiation antigens of lymphocytes of patients with burns in vitro. Evaluation of the effect of the claimed drug on subpopulations of lymphocytes was carried out by the method of indirect membrane immunofluorescence with monoclonal antibodies LT3, LT4, LT8, LT19 and LT21 to differentiation antigens CD3, CD4, CDS, CD19 and CD21, respectively (Sorbent, Moscow) [13]. Lymphocytes of patients with burns accompanied by secondary immunodeficiency were isolated on the density gradient ficoll-verographin. The resulting cell suspension was incubated with Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu peptide and thymogen for 60 minutes at 37 ^{° C.} in RPMI-1640 complete culture medium (“Flow”) with 5% fetal calf serum ("Flow"), 2 mM L-glutamine ("Flow"), 40 μg / ml gentamicin (Farmahim) and 5 mM HEPES buffer. As a control, physiological saline was used in an appropriate volume.

Установлено, что у больных с ожогами резко снижено количество всех изучаемых субпопуляций лимфоцитов, исключая СD8⁺-клетки. Тимоген восстанавливал содержание СD3⁺- и CD4⁺-лимфoцитoв в концентрациях 1,0-0,01 мкг/мл, а заявляемое средство оказалось активно в дозах 1,0-0,001 мкг/мл. Оба средства достоверного изменения количества СD8⁺-лимфоцитов не вызывали (табл. 3).It was found that in patients with burns, the number of all studied lymphocyte subpopulations studied was sharply reduced, with the exception of CD8 ⁺ cells. Timogen restored the content of CD3 ⁺ and CD4 ⁺ lymphocytes in concentrations of 1.0-0.01 μg / ml, and the claimed drug was active in doses of 1.0-0.001 μg / ml. Both agents did not significantly change the number of CD8 ⁺ lymphocytes (Table 3).

Инкубация лимфоцитов ожоговых больных с пептидом Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu приводит к достоверному увеличению числа CD19⁺ и CD21⁺ клеток в концентрации от 0,05 до 1 мкг/мл, приближая эти показатели к нормальным, причем максимальная активность пептида Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu наблюдается в концентрации 0,1 мкг/мл. В то же время известное средство тимоген проявляет свою активность лишь в концентрации 1 мкг/мл (табл. 4).Incubation of lymphocytes of burn patients with the peptide Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu leads to a significant increase in the number of CD19 ⁺ and CD21 ⁺ cells at a concentration of from 0.05 to 1 μg / ml, bringing these indicators closer to normal, moreover, the maximum activity of the Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu peptide is observed at a concentration of 0.1 μg / ml. At the same time, the known agent thymogen is only active at a concentration of 1 μg / ml (table. 4).

Таким образом, пептид Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu увеличивает экспрессию дифференцировочных антигенов в дозах, в 10 раз меньших, чем тимоген, что является отражением его высокой иммуностимулирующей активности. Thus, the Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu peptide increases the expression of differentiation antigens in doses 10 times lower than thymogen, which reflects its high immunostimulating activity.

4. Влияние пептида Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu на иммунный ответ у тимэктомированных крыс (табл. 5). Биологическую активность заявляемого средства изучали на модели тимэктомированных крыс [14] . В трехмесячном возрасте производили оперативное удаление тимуса. Контрольная группа крыс подверглась ложной операции. Через 2 месяца после оперативного вмешательства тимэктомированным животным вводили пептид Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu и тимоген в дозах от 0,001 до 1 мкг/кг веса тела в течение недели. Контролем служили тимэктомированные животные, получавшие физиологический раствор в аналогичном объеме. Крыс иммунизировали эритроцитами барана и через 5 суток определяли состояние иммунитета. 4. The effect of the Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu peptide on the immune response in thymectomized rats (Table 5). The biological activity of the claimed drug was studied on the model of thimectomized rats [14]. At the age of three months, surgical removal of the thymus was performed. The control group of rats underwent a false operation. 2 months after surgery, the peptides Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu and thymogen in doses from 0.001 to 1 μg / kg of body weight for a week were administered to thimectomized animals. The control was thimectomized animals that received physiological saline in a similar volume. Rats were immunized with sheep red blood cells and after 5 days the state of immunity was determined.

Установлено, что у тимэктомированных крыс снижается титр гемагглютининов на ксеногенные эритроциты, уменьшается количество антителобразующих клеток в селезенке и число лейкоцитов в крови. При введении пептида Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu восстанавливается иммунный ответ на тимусзависимый антиген, что выражается в увеличении титра гемагглютининов и гемолизинов, АОК, восстанавливается количество лейкоцитов и возрастает масса селезенки. Максимальная активность заявляемого средства проявляется в концентрации 0,1 мкг/кг веса, в то время как тимоген обладает подобным действием в концентрации 1 мкг/кг веса тела. It was found that in thymectomized rats, the hemagglutinin titer for xenogenic red blood cells decreases, the number of antibody-forming cells in the spleen and the number of leukocytes in the blood decrease. With the introduction of the Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu peptide, the immune response to the thymus-dependent antigen is restored, which is expressed in an increase in the titer of hemagglutinins and hemolysins, AOK, the number of leukocytes is restored and the spleen mass increases. The maximum activity of the claimed drug is manifested in a concentration of 0.1 μg / kg of body weight, while thymogen has a similar effect in a concentration of 1 μg / kg of body weight.

5. Влияние пептида Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu на иммунный ответ у бурсэктомированных цыплят. Специфическую биологическую активность заявляемого средства изучали также в опытах in vivo на модели эмбриональной бурсэктомии [14] . Известно, что бурса Фабрициуса -центральный орган иммунитета птиц, аналог которого у млекопитающих отсутствует. В бурсе происходит антигеннезависимая дифференцировка В-лимфоцитов и ее удаление сопровождается нарушением этого процесса. При этом наблюдается выраженное угнетение гуморального иммунитета, что связано с отсутствием у бурсэктомированных птиц зрелых В-лимфоцитов, способных вовлекаться в иммунный ответ. Бурсэктомированные цыплята значительно отстают в росте и практически полностью погибают после 7-8 недели жизни. 5. The effect of the Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu peptide on the immune response in bursectomized chickens. The specific biological activity of the claimed drug was also studied in in vivo experiments on an embryonic bursectomy model [14]. It is known that the bursa of Fabricius is the central organ of immunity of birds, an analogue of which is absent in mammals. In the bursa, antigen-independent differentiation of B-lymphocytes occurs and its removal is accompanied by a violation of this process. At the same time, pronounced inhibition of humoral immunity is observed, which is associated with the absence of mature B-lymphocytes in bursectomized birds that can be involved in the immune response. Bursectomized chickens are significantly stunted and die almost completely after 7-8 weeks of life.

Эмбриональную бурсэктомию выполняли хирургическим путем на 19 день эмбрионального развития, контрольная группа эмбрионов в эти же сроки подвергалась ложной операции с воспроизведением всех этапов оперативного вмешательства за исключением удаления бурсы Фабрициуса. An embryonic bursectomy was performed surgically on the 19th day of embryonic development, the control group of embryos underwent a false operation at the same time with the reproduction of all stages of the surgical intervention, with the exception of the removal of the Fabricius bursa.

Начиная с месячного возраста в течение недели бурсэктомированные цыплята внутримышечно получали пептид Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu и тимоген в дозах от 0,001 до 1 мкг/кг массы тела 1 раз в сутки в течение недели. Контролем служили бурсэктомированные цыплята, получавшие физиологический раствор в аналогичном объеме. Затем птиц иммунизировали эритроцитами барана и через 5 суток определяли состояние иммунитета (табл. 6). Starting from one month of age, bursectomized chickens intramuscularly received the peptide Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu and thymogen in doses from 0.001 to 1 μg / kg body weight 1 time per day for a week. The control was bursectomized chickens receiving physiological saline in a similar volume. Then the birds were immunized with sheep erythrocytes and after 5 days the state of immunity was determined (Table 6).

Установлено, что у эмбрионально бурсэктомированных птиц снижается иммунный ответ на введение ксеногенных эритроцитов, это проявляется в резком снижении титра гемагглютининов и гемолизинов, антителобразующих клеток селезенки. У бурсэктомированных цыплят снижается вес тела, селезенки, наблюдается лейкопения. Введение пептида Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu приводит к повышению титра гемагглютининов и гемолизинов, числа антителобразующих клеток. У птиц, получавших предлагаемое средство, увеличивалось количество лейкоцитов, возрастал вес тела и селезенки. Максимальная активность пептида Тrр-Тrе-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu зарегистрирована в концентрации 0,1 мкг/кг веса тела. Аналогичный эффект достигнут введением тимогена. Максимальная активность последнего проявлялась лишь в концентрации 1 мкг/кг веса. It has been established that in embryonic bursectomized birds the immune response to the administration of xenogenic red blood cells decreases, this is manifested in a sharp decrease in the titer of hemagglutinins and hemolysins, antibody-forming spleen cells. In bursectomized chickens, the weight of the body, spleen decreases, leukopenia is observed. The introduction of the peptide Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu leads to an increase in the titer of hemagglutinins and hemolysins, the number of antibody-forming cells. In birds receiving the proposed tool, the number of leukocytes increased, the weight of the body and spleen increased. The maximum activity of the Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu peptide was recorded at a concentration of 0.1 μg / kg body weight. A similar effect was achieved by the introduction of thymogen. The maximum activity of the latter was manifested only at a concentration of 1 μg / kg of weight.

Таким образом, результаты экспериментального изучения заявляемого средства свидетельствуют о его высокой иммуностимулирующей активности, превосходящей таковую известного иммуностимулятора тимогена. По сравнению с тимогеном заявляемый пептид Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu способен стимулировать иммунитет в 10 раз меньших дозах. Уменьшение дозировки иммуностимулирующего средства для достижения аналогичного эффекта дает возможность уменьшить риск побочного влияния. Thus, the results of an experimental study of the claimed drug indicate its high immunostimulating activity, superior to that of the known immunostimulant thymogen. Compared with thymogen, the claimed peptide Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu is able to stimulate the immune system in 10 times lower doses. Reducing the dosage of an immunostimulating agent to achieve a similar effect makes it possible to reduce the risk of side effects.

Таким образом, установлено, что пептид Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu обладает выраженным иммуностимулирующим действием и может найти применение в медицине для профилактики и лечения широкого круга иммунодефицитных состояний различной этиологии. Thus, it was found that the peptide Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu has a pronounced immunostimulating effect and can be used in medicine for the prevention and treatment of a wide range of immunodeficiency states of various etiologies.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Goldstein A. L. , Guba A. , Zatz M. M. et al. Purification and biological activity of thymosin, a hormone of the thymus gland // Proc. Nat. Acad. USA 1972. Vol. 69. N 7. P. 1800-1803.SOURCES OF INFORMATION
1. Goldstein AL, Guba A., Zatz MM et al. Purification and biological activity of thymosin, a hormone of the thymus gland // Proc. Nat. Acad USA 1972. Vol. 69. N 7. P. 1800-1803.

2. Арион В. Я. Т-активин и его иммунобиологические свойства: Автореф. дис. док. биол. наук. -М, 1990. -52 с. 2. Arion V. Ya. T-activin and its immunobiological properties: Abstract. dis. doc biol. sciences. -M, 1990. -52 p.

3. Машковский М. Д. Лекарственные средства. М. : Медицина, 1988 - т. 2, гл. 9, с 168-175. 3. Mashkovsky M. D. Drugs. M.: Medicine, 1988 - v. 2, Ch. 9, p. 168-175.

4. Кузник Б. И. , Степанов А. В. , Цыбиков Н. Н. и др. Влияние полипептидов из вилочковой железы, костного мозга и сумки Фабрициуса на иммуногенез и гемостаз у неонатально тимэктомированных и эмбрионально бурсэктомированных цыплят // Бюл. экспер. биологии и медицины. -1987. - 4. - С. 449-451. 4. Kuznik B. I., Stepanov A. V., Tsybikov N. N. et al. Effect of polypeptides from the thymus gland, bone marrow and Fabricius bag on immunogenesis and hemostasis in neonatally thimectomized and embryo bursectomized chickens // Bull. an expert. biology and medicine. -1987. - 4. - S. 449-451.

5. Яковлев Г. М. , Хавинсон В. Х. , Морозов В. Г. и др. Сравнительное изучение биологической активности тималина и синтетического пептида тимуса // Тез. докл. науч. конф. "Биохимия медицине", Л. 1988, с. 217 - 218. 5. Yakovlev G. M., Havinson V. Kh., Morozov V. G. et al. A comparative study of the biological activity of thymalin and a synthetic thymus peptide // Tez. doc. scientific conf. "Biochemistry of Medicine", L. 1988, p. 217 - 218.

6. Хавинсон В. Х. , Синакевич Н. В. , Серый С. В. Тимоген. -СПб, 1991. -48 с. 6. Havinson V. Kh., Sinakevich N. V., Gray S. V. Timogen. -SPb, 1991. -48 p.

7. Steward J. M. , Young J. D. Solid phase peptide synthesis, San Francisco, 1969. 7. Steward J. M., Young J. D. Solid phase peptide synthesis, San Francisco, 1969.

8. Nekam К. , Fudenberg Н. Н. , Strelkanskas A. J. Identification of "activ" T-lymphocytes among effector cells in guinea pigs // Immunopharmacol. -1982-Vol. 5, 1. -P. 85-94. 8. Nekam K., Fudenberg N. N., Strelkanskas A. J. Identification of "activ" T-lymphocytes among effector cells in guinea pigs // Immunopharmacol. -1982-Vol. 5, 1. -P. 85-94.

9. Stadecker M. J. , Bishop G. , Wortis H. H. Rosette formation by guinea pig thymocytes and thymus derived lymphocytes with rabbit red blood cells // J. Immunol. -1973. Vol. 111, 6. -P. 1834-1837. 9. Stadecker M. J., Bishop G., Wortis H. H. Rosette formation by guinea pig thymocytes and thymus derived lymphocytes with rabbit red blood cells // J. Immunol. -1973. Vol. 111, 6. -P. 1834-1837.

10. Ling N. R. Immunoglobulin as a differentiation and clonal marker // J. Immunol. Methods. -1983. - Vol. 65. - P. 1-25. 10. Ling N. R. Immunoglobulin as a differentiation and clonal marker // J. Immunol. Methods -1983. - Vol. 65. - P. 1-25.

11. П. Колкер И. И. , Вишневская С. М. , Панова Ю. М. и др. Содержание Т- и В-лимфоцитов у больных с термическими ожогами // Клинич. медицина. -1985. - 7. -С. 87-93. 11. P. Kolker I.I., Vishnevskaya S.M., Panova Yu.M. et al. Content of T- and B-lymphocytes in patients with thermal burns // Klinich. the medicine. -1985. - 7. -C. 87-93.

12. Белоцкий С. М. , Борисова Т. Г. , Снастина Т. И. и др. Характеристика фагоцитов, Т- и В-лимфоцитов у обожженных // Иммунология. -1983. - 6. - С. 51-54. 12. Belotsky S. M., Borisova T. G., Snastina T. I. et al. Characterization of phagocytes, T- and B-lymphocytes in calves // Immunology. -1983. - 6. - S. 51-54.

13. Лимфоциты: Методы. Пер. с англ. / Под ред. Дж. Клауса. -М. : Мир, 1990, 395 с. 13. Lymphocytes: Methods. Per. from English / Ed. J. Klaus. -M. : World, 1990, 395 p.

14. Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля, Пер. с нем. А. П. Тарасова. - М. : Медицина, 1987, 472 с. 14. Immunological methods / Ed. G. Frimel, Per. with him. A.P. Tarasova. - M.: Medicine, 1987, 472 p.

Claims

A peptide of the formula Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu having immunostimulating activity.