RU2165256C2

RU2165256C2 - 1,2,5-oxadiazolo[3,4-d]pyridazine-5,6-dioxide derivatives as activators of soluble form of guanylate-cyclase and agents active in treatment of central nervous system, and compositions based on these compounds

Info

Publication number: RU2165256C2
Application number: RU97122020/14A
Authority: RU
Inventors: А.Я. Коц; Ю.В. Хропов; М.А. Графов; А.С. Куликов; И.В. Овчинников; Н.Н. Белушкина; О.Г. Бусыгина; С.А. Гаврилова; Н.Н. Махова; Н.А. Медведева; Т.В. Буларгина; И.С. Северина
Original assignee: Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова
Priority date: 1997-12-26
Filing date: 1997-12-26
Publication date: 2001-04-20

Abstract

FIELD: pharmaceutical chemistry. SUBSTANCE: invention provides compounds of general formula I:

Description

Изобретение относится к биохимии и фармакологии, в частности к применению известных производных 1,2,5-оксадиазоло[3,4-d]пиридазин-5,6-диоксида общей формулы I

(I)
где R = CH₃ или C₆H₅ и n = 0 или 1, для специфической активации растворимой формы гуанилатциклазы (рГЦ) и лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы и фармацевтическим композициям на их основе.The invention relates to biochemistry and pharmacology, in particular to the use of known derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide of the general formula I

(I)
where R = CH ₃ or C ₆ H ₅ and n = 0 or 1, for the specific activation of the soluble form of guanylate cyclase (rHC) and the treatment of diseases of the cardiovascular system and pharmaceutical compositions based on them.

Гуанилатциклаза/КФ 4.6.1.2; гуанозин-5'-трифосфат-пирофосфатлиаза (циклизующая)/является ферментом, катализирующим биосинтез гуанозин-3',5'-циклофосфата (цГМФ) - универсального регулятора внутриклеточного метаболизма [1]. Guanylate cyclase / CF 4.6.1.2; guanosine-5'-triphosphate-pyrophosphatliase (cyclizing) / is an enzyme that catalyzes the biosynthesis of guanosine-3 ', 5'-cyclophosphate (cGMP) - a universal regulator of intracellular metabolism [1].

ГЦ существует в двух формах - мембранной и растворимой. В настоящее время установлено, что рГЦ является основной мишенью фармакологического действия наиболее распространенных нитровазодилятаторов (нитроглицерина, нитросорбида, нитропруссида натрия) и играет ключевую роль в регуляции таких физиологических процессов, как сокращение и расслабление гладких мышц кровеносных сосудов и агрегация тромбоцитов. Показано, что лечебный эффект вышеуказанных фармпрепаратов связан со стимуляцией активности рГЦ в результате взаимодействия оксида азота, образующегося при их биотрансформации, с атомом железа гема, входящего в состав фермента, и образования комплекса нитрозил-гем. HZ exists in two forms - membrane and soluble. It has now been established that RHC is the main target of the pharmacological action of the most common nitrovasodilators (nitroglycerin, nitrosorbide, sodium nitroprusside) and plays a key role in the regulation of physiological processes such as the contraction and relaxation of the smooth muscles of blood vessels and platelet aggregation. It was shown that the therapeutic effect of the above pharmaceuticals is associated with the stimulation of the activity of RHCs as a result of the interaction of nitric oxide formed during their biotransformation with the heme iron atom, which is part of the enzyme, and the formation of the nitrosyl-heme complex.

Существенным недостатком известных вазодилятаторов на основе органических нитратов является возникновение толерантности при их длительном применении. В связи с этим изучение механизма действия новых соединений, способных генерировать NO в живом организме и/или вызывать активацию фермента NO-независимым путем, является перспективным подходом для поиска и создания новых более эффективных антигипертензивных и антиагрегантных фармпрепаратов. A significant drawback of the known organic nitrate-based vasodilators is the occurrence of tolerance during prolonged use. In this regard, the study of the mechanism of action of new compounds that can generate NO in a living organism and / or cause activation of the enzyme in an NO-independent way is a promising approach for the search and creation of new, more effective antihypertensive and antiaggregant pharmaceuticals.

Известен фармпрепарат "миноксидил" - 6-(1-пиперидинил)пирролидин-2,4,-диамин-3-оксид формулы II

(II)
являющийся периферическим вазодилятатором [2] и повышающий уровень цГМФ в клетках гладких мышц кровеносных сосудов [3].Known pharmaceutical preparation "minoxidil" - 6- (1-piperidinyl) pyrrolidin-2,4, -diamine-3-oxide of the formula II

(Ii)
which is a peripheral vasodilator [2] and increases the level of cGMP in the smooth muscle cells of blood vessels [3].

Известны различные N-оксиды и близкие к ним по строению соединения, являющиеся донорами оксида азота и/или его биологически активных форм (восстановленной формы - NO^-/HNO, нитрозотиолов) и активаторами рГЦ и оказывающими фармакологическое действие на сердечно-сосудистую систему [4].Various N-oxides and structurally similar compounds are known that are donors of nitric oxide and / or its biologically active forms (reduced form — NO ^- / HNO, nitrosothiols) and activators of RHCs and having a pharmacological effect on the cardiovascular system [4] .

Так, известны 3,4-дизамещенные фурокcаны, в частности 1,2,5-оксадиазол-3,4-динитрил-2-оксид, 3-фенил-1,2,5-оксадиазол-4-нитрил-2-оксид и его изомер общей формулы III

(III)
где R¹ = CN и R² = CN или C₆H₅ или R¹ = C₆H₅ и R² = CN, являющиеся донорами оксида азота и активаторами рГЦ из легких крысы (в 12-37 раз), а также обладающие выраженным вазорелаксантным действием на кольцах аорты кролика, сокращенных под действием фенилэфрина (IC₅₀ = 0,005-0,016 мкМ) и ингибирующих агрегацию тромбоцитов, вызванную под действием коллагена (IC₅₀ = 0,24-0,84 мкМ) [5].Thus, 3,4-disubstituted furocans are known, in particular 1,2,5-oxadiazole-3,4-dinitrile-2-oxide, 3-phenyl-1,2,5-oxadiazole-4-nitrile-2-oxide and its isomer of the general formula III

(III)
where R ¹ = CN and R ² = CN or C ₆ H ₅ or R ¹ = C ₆ H ₅ and R ² = CN, which are nitric oxide donors and activators of RHC from rat lungs (12-37 times), as well as a pronounced vasorelaxant effect on rabbit aortic rings, reduced by phenylephrine (IC ₅₀ = 0.005-0.016 μM) and inhibiting platelet aggregation induced by collagen (IC ₅₀ = 0.24-0.84 μM) [5].

Однако данные соединения обладают повышенной токсичностью (см. пример 12), а их синтез достаточно сложен. However, these compounds have increased toxicity (see example 12), and their synthesis is quite complicated.

Известны соли N-нитрозо-N-замещенных производных гидроксиламина общей формулы IV

(IV)
где R = O^-, SO₃ ^-, C₆H₅ и др., являющиеся донорами NO в условиях in vitro и обладающие антигипертензивным действием [6].Known salts of N-nitroso-N-substituted hydroxylamine derivatives of General formula IV

(Iv)
where R = O ^- , SO ₃ ^- , C ₆ H ₅ and others, which are NO donors in vitro and have antihypertensive effect [6].

Согласно приведенным данным, наибольшей активностью в условиях in vivo обладала соль Анжели/K₂(O₃SN₂O₂)/, которая в дозе 9 мг/кг понижала артериальное давление у нормотензивных крыс на 84 мм рт. ст. В условиях in vitro на изолированных кольцах аорты крысы, сокращенных под действием фенилэфрина, величина IC₅₀ для данного соединения составила 3,16·10^-7 М [7].According to the data presented, the greatest activity in vivo was possessed by the Angeli salt / K ₂ (O ₃ SN ₂ O ₂ ) /, which at a dose of 9 mg / kg lowered blood pressure in normotensive rats by 84 mm RT. Art. Under in vitro conditions on isolated rat aortic rings contracted by phenylephrine, the IC ₅₀ value for this compound was 3.16 · 10 ^-7 M [7].

Недостатками данного соединения являются его неустойчивость в результате быстрого гидролиза при физиологических значениях pH и сравнительно невысокая антигипертензивная активность. The disadvantages of this compound are its instability as a result of rapid hydrolysis at physiological pH values and a relatively low antihypertensive activity.

Известны соли диазенийдиолатов(NONOаты) общей формулы V

(V)
где R и R¹> - алкил, замещенный алкил, представляющие собой димерные аддукты NO с азотсодержащими нуклеофилами [4]. Данные соединения являются спонтанными донорами NO или NO^-, повышают уровень цГМФ в клетке и обладают вазорелаксантным действием.Known salts of diazhenediolates (NONOates) of general formula V

(V)
where R and R ¹ > is alkyl, substituted alkyl, which are dimeric adducts of NO with nitrogen-containing nucleophiles [4]. These compounds are spontaneous donors of NO or NO ^- , increase the level of cGMP in the cell and have a vasorelaxant effect.

Их недостатками являются относительная сложность синтеза (автоклавирование под давлением в атмосфере NO в течение 1-3 дней), сравнительная неустойчивость в водной среде при физиологических значениях pH, а также возможность образования канцерогенных N-нитрозодиалкиламинов при их разложении в аэробных условиях [4]. Their disadvantages are the relative complexity of the synthesis (autoclaving under pressure in an NO atmosphere for 1-3 days), comparative instability in an aqueous medium at physiological pH values, and the possibility of the formation of carcinogenic N-nitrosodialkylamines upon decomposition under aerobic conditions [4].

Известны замещенные 1,2-диазетин-1,2-диоксиды общей формулы VI

(VI)
где R¹ - H или Br, R² - алкил или фенил, R³ - алкил и R⁴ - H или алкил, генерирующие оксид азота при нагревании (80^oC), активирующие рГЦ из тромбоцитов человека, обладающие спазмолитическим и гипотензивным действием [8, 9] и ингибирующие агрегацию тромбоцитов под действием АДФ [10]. Наиболее активное соединение, 1-бром-6-метил-7,8-диазабицикло[4,2,0]октен-7,8- диоксид, в условиях in vitro на изолированных кольцах аорты крысы, сокращенных под действием норадреналина, имело IC₅₀, в 2 раза превышавшее IC₅₀ для нитроглицерина.Substituted 1,2-diazetin-1,2-dioxides of the general formula VI are known

(Vi)
where R ¹ - H or Br, R ² - alkyl or phenyl, R ³ - alkyl and R ⁴ - H or alkyl, generating nitric oxide when heated (80 ^o C), activating RHC from human platelets, with antispasmodic and hypotensive effects [ 8, 9] and inhibiting platelet aggregation under the action of ADP [10]. The most active compound, 1-bromo-6-methyl-7,8-diazabicyclo [4.2.0] octene-7.8-dioxide, in vitro on isolated rat aortic rings contracted by norepinephrine, had IC ₅₀ 2 times the IC ₅₀ for nitroglycerin.

В целом данные соединения проявляют недостаточно высокую спазмолитическую и антиагрегантную активность, а также обладают пониженной устойчивостью при хранении при комнатной температуре, что связано с их способностью спонтанно генерировать оксид азота. In general, these compounds exhibit insufficiently high antispasmodic and antiplatelet activity, and also have reduced storage stability at room temperature, due to their ability to spontaneously generate nitric oxide.

Известны 3,6-дизамещенные пиридазин-1,2-диоксиды общей формулы VII

(VII)
где R¹ и R² - CH₃ или C₆H₅ [II].Known 3,6-disubstituted pyridazine-1,2-dioxides of General formula VII

(Vii)
where R ¹ and R ² - CH ₃ or C ₆ H ₅ [II].

Однако биохимические свойства и фармакологическое действие данных соединений не изучены. However, the biochemical properties and pharmacological effects of these compounds have not been studied.

Запатентованы замещенные пирроло[2,3-d] пиридазин-5,6- диоксиды в ряду других аналогов общей формулы VIII

(VIII)
где A, R¹ - R⁵, X имеют указанные в патенте значения, m = 0 или 1 и n = 0 или 1, в качестве средств для лечения язвы желудка, вызванной Helicobacter pylori [12].Substituted patented substituted pyrrolo [2,3-d] pyridazine-5,6-dioxides among other analogues of the general formula VIII

(Viii)
where A, R ¹ - R ⁵ , X have the meanings indicated in the patent, m = 0 or 1 and n = 0 or 1, as means for treating gastric ulcer caused by Helicobacter pylori [12].

Влияние данных соединений на активность рГЦ и возможность применения для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы не изучены. The effect of these compounds on the activity of RHC and the possibility of using it to treat diseases of the cardiovascular system have not been studied.

Известен 4,4,7,7- гетраметил-4,7-дигидро-1,2,5-оксадиазоло[3,4-d]пиридазин-1,5,6- триоксид формулы IX

(IX)
в качестве фотоактивируемого донора оксида азота [13].Known 4,4,7,7-heteromethyl-4,7-dihydro-1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-1,5,6-trioxide of the formula IX

(Ix)
as a photoactivated nitric oxide donor [13].

Однако биохимические свойства и фармакологическое действие данного соединения не изучены. However, the biochemical properties and pharmacological effects of this compound have not been studied.

Наиболее близкими к производным 1,2,5-оксадиазоло[3,4-d]пиридазин-5,6-диоксида вышеуказанной общей формулы I являются 3,5-дизамещенные пиразол-3-он-1,2-диоксиды общей формулы X

(X)
где R¹ - алкил (CH₃), арил (C₆H₅), замещенный арил и др., R² - арил (C₆H₅), замещенный арил и др., являющиеся тиол-зависимыми донорами NO, активаторами рГЦ и средствами для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы [14].Closest to the derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazin-5,6-dioxide of the above general formula I are 3,5-disubstituted pyrazol-3-one-1,2-dioxides of the general formula X

(X)
where R ¹ is alkyl (CH ₃ ), aryl (C ₆ H ₅ ), substituted aryl, etc., R ² is aryl (C ₆ H ₅ ), substituted aryl and others, which are thiol-dependent NO donors, activators of rHC and agents for the treatment of diseases of the cardiovascular system [14].

Недостатками данных соединений, в частности 3,5-дифенилпиразол-3-он-1,2-диоксида (соединение 5), являются невысокая степень активации рГЦ (в 2,5 раза в концентрации 10 мкМ, см. пример 6), ингибирование агрегации тромбоцитов человека при использовании относительно высоких концентраций (IC₅₀ = 1,5 мкМ в модели с коллагеном в качестве индуктора агрегации [15]), а также низкая эффективность сосудорасширяющего действия в условиях in vitro на изолированных кольцах аорты крысы, сокращенных под действием фенилэфрина (IC₅₀ = 1,5 мкМ).The disadvantages of these compounds, in particular 3,5-diphenylpyrazol-3-one-1,2-dioxide (compound 5), are the low degree of activation of rHC (2.5 times at a concentration of 10 μM, see example 6), inhibition of aggregation human platelets when using relatively high concentrations (IC ₅₀ = 1.5 μM in the model with collagen as an aggregation inducer [15]), as well as the low efficiency of the vasodilator effect in vitro on isolated rat aortic rings contracted by phenylephrine (IC ₅₀ = 1.5 μM).

Известны производные 1,2,5-оксадиазоло[3,4-d] пиридазин- 5,6-диоксида общей формулы I в качестве продуктов химического синтеза [16-20]. Биохимические и фармакологические свойства данных соединений не изучены. Derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide of the general formula I are known as products of chemical synthesis [16-20]. Biochemical and pharmacological properties of these compounds have not been studied.

Целью изобретения является поиск новых активаторов рГЦ и средств для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы, обладающих более выраженными биохимическими и фармакологическими свойствами. The aim of the invention is the search for new activators of RHC and agents for the treatment of diseases of the cardiovascular system, with more pronounced biochemical and pharmacological properties.

Указанная цель достигается применением известных производных 1,2,5-оксадиазоло[3,4-d] пиридазин-5,6-диоксида вышеуказанной общей формулы I в качестве активаторов рГЦ и лекарственных средств для лечения заболеваний сердечно- сосудистой системы. This goal is achieved by using the known derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide of the above general formula I as activators of RHC and drugs for the treatment of diseases of the cardiovascular system.

Конкретными соединениями согласно общей формуле I являются 4,7-диметил-1,2,5-оксадиазоло[3,4-d] пиридазин-1,5,6-триоксид (4,7-диметилфуразано[3,4-d] пиридазин-1,5,6-триоксид; соединение 1); 4,7-диметил-1,2,5-оксадиазоло[3,4-d] пиридазин-5,6-диоксид (4,7-диметилфуразано[3,4-d]пиридазин-5,6-диоксид; соединение 2); 4,7-дифенил-1,2,5-оксадиазоло[3,4-d]пиридазин-1,5,6-триоксид (4,7-дифенилфуразано[3,4-d]пиридазин-1,5,6-триоксид; соединение 3); 4,7-дифенил-1,2,5-оксадиазоло[3,4-d]пиридазин- 5,6-диоксид(4,7-дифенилфуразано[3,4-d]пиридазин-5,6-диоксид; соединение 4). Particular compounds according to general formula I are 4,7-dimethyl-1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-1,5,6-trioxide (4,7-dimethylfurazano [3,4-d] pyridazine -1.5,6-trioxide; compound 1); 4,7-dimethyl-1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazin-5,6-dioxide (4,7-dimethylfurazano [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide; compound 2 ); 4,7-diphenyl-1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-1,5,6-trioxide (4,7-diphenylfurazano [3,4-d] pyridazine-1,5,6- trioxide; compound 3); 4,7-diphenyl-1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide (4,7-diphenylfurazano [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide; compound 4 )

Предпочтительно, производными 1,2,5-оксадиазоло[3,4-d] пиридазин-5,6-диоксида вышеуказанной общей формулы I являются 4,7-диметил-1,2,5-оксадиазоло[3,4-d] пиридазин-1,5,6- триоксид (соединение 1) и 4,7-диметил-1,2,5-оксадиазоло[3,4-d]пиридазин-5,6-диоксид (соединение 2). Preferably, the derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazin-5,6-dioxide of the above general formula I are 4,7-dimethyl-1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine -1.5,6-trioxide (compound 1) and 4,7-dimethyl-1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide (compound 2).

Данное изобретение относится к применению производных 1,2,5- -оксадиазоло[3,4-d] пиридазин-5,6-диоксида общей формулы I для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы, включая лечение артериальной гипертонии, застойной сердечной недостаточности при инфаркте миокарда, гипертонических кризов, рефрактерной сердечной недостаточности, инфаркта миокарда и острого инфаркта миокарда, стенокардии, ишемической болезни сердца, хронической сердечной недостаточности, легочной гипертонии, острой недостаточности левого желудочка, легочного сердца, отека легких, периферической артериальной эмболии, токсикогенных спазмов сосудов, для профилактики и купирования приступов стенокардии и спазмов коронарных артерий при использовании сердечных катетеров, ангиографии и ангиопластике, а также других заболеваний сердечно-сосудистой системы, при которых положительный лечебный эффект достигается при снижении кровяного давления, нормализации сократительной способности миокарда и/или ингибировании активности тромбоцитов, за исключением тех заболеваний, при которых противопоказано снижение кровяного давления и/или ингибирование агрегации тромбоцитов (например, артериальной гипотонии, кардиогенного шока, острого инфаркта миокарда с пониженным давлением наполнения левого желудочка, общего снижения функции левого желудочка с низким давлением наполнения, гипертрофической обструктивной кардиомиопатии, сосудистого коллапса, токсического отека легких, геморрагического инсульта, гемофилии, геморрагического диатеза, гипопротромбинемии). This invention relates to the use of derivatives of 1,2,5-α-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide of general formula I for the treatment of diseases of the cardiovascular system, including the treatment of arterial hypertension, congestive heart failure with myocardial infarction , hypertensive crises, refractory heart failure, myocardial infarction and acute myocardial infarction, angina pectoris, coronary heart disease, chronic heart failure, pulmonary hypertension, acute left ventricular failure, pulmonary heart , pulmonary edema, peripheral arterial embolism, toxicogenic spasms of blood vessels, for the prevention and relief of angina attacks and spasms of the coronary arteries using cardiac catheters, angiography and angioplasty, as well as other diseases of the cardiovascular system, in which a positive therapeutic effect is achieved with a decrease in blood pressure normalization of myocardial contractility and / or inhibition of platelet activity, with the exception of those diseases in which a decrease is contraindicated lowering blood pressure and / or inhibiting platelet aggregation (e.g., arterial hypotension, cardiogenic shock, acute myocardial infarction with reduced left ventricular filling pressure, a general decrease in left ventricular function with low filling pressure, hypertrophic obstructive cardiomyopathy, vascular collapse, toxic pulmonary edema, hemorrhagic pulmonary edema, hemorrhagic stroke, hemophilia, hemorrhagic diathesis, hypoprothrombinemia).

Данное изобретение также относится к применению 4,7-диметил-1,2,5-оксадиазоло[3,4-d] пиридазин-1,5,6-триоксида для профилактики и купирования приступов стенокардии и для лечения острого инфаркта миокарда. This invention also relates to the use of 4,7-dimethyl-1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-1,5,6-trioxide for the prevention and relief of angina attacks and for the treatment of acute myocardial infarction.

Соединения 1, 3, 4 были синтезированы в 1925-1927 гг. [16, 17] (соединение 2 в 1899 г. [18]), однако их химическая структура была однозначно установлена значительно позднее [19, 20]. Compounds 1, 3, 4 were synthesized in 1925-1927. [16, 17] (compound 2 in 1899 [18]), however, their chemical structure was unambiguously established much later [19, 20].

В общем случае соединения 1, 3, 4 получают окислением диоксимов соответствующих 3,4-диацилпроизводных фуроксана или фуразана (схема 1). В зависимости от строения исходного диоксима в качестве окислителя используют четырехокись азота, азотную кислоту или разбавленный раствор перманганата калия. In the general case, compounds 1, 3, 4 are obtained by oxidizing the dioximes of the corresponding 3,4-diacyl derivatives of furoxan or furazan (Scheme 1). Depending on the structure of the initial dioxime, nitrogen tetroxide, nitric acid, or a diluted solution of potassium permanganate are used as an oxidizing agent.

Другой способ синтеза соединений 1 и 3 основан на реакции 2-замещенных 1-галогенглиоксимов с нитритом серебра в среде эфира [21, 22]. Another method for the synthesis of compounds 1 and 3 is based on the reaction of 2-substituted 1-halogen glyoximes with silver nitrite in ether [21, 22].

Соединение 2 было получено обработкой диоксима 3,4- диацетилфуроксана водным раствором гидроокиси натрия [16, 20] (схема 1). Compound 2 was obtained by treating 3,4-diacetylfuroxane dioxime with an aqueous solution of sodium hydroxide [16, 20] (Scheme 1).

Исходные диоксимы 3,4-диацилфуроксанов синтезируют из гидроксиламина и соответствующих диацилфуроксанов, которые, в свою очередь, получают с высоким выходом обработкой ацетона четырехокисью азота или при взаимодействии ацетофенона с азотной кислотой. The starting dioxides of 3,4-diacylfuroxanes are synthesized from hydroxylamine and the corresponding diacylfuroxanes, which, in turn, are obtained in high yield by treating acetone with nitrogen tetroxide or by reacting acetophenone with nitric acid.

Данное изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим в качестве активного компонента производные 1,2,5-оксадиазоло[3,4-d] пиридазин-5,6-диоксида общей формулы I вместе с соответствующими добавками. В качестве добавок используются компоненты, общепринятые для приготовления лекарственных форм для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы. The present invention also relates to pharmaceutical compositions comprising, as an active component, derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide of the general formula I together with corresponding additives. As additives, components are used that are conventional for the preparation of dosage forms for the treatment of diseases of the cardiovascular system.

В зависимости от вида введения препарата и цели его применения лекарственные формы могут быть выполнены в виде таблеток, капсул, гранул, драже, пилюль для постепенного дозирования (при необходимости из полимерного материала, например из ацетилфталоилцеллюлозы, или другого пригодного для данной цели материала, например желатина), а также в качестве порошков, растворов, суспензий или эмульсий. Depending on the type of administration of the drug and the purpose of its use, the dosage forms can be made in the form of tablets, capsules, granules, dragees, pills for gradual dosing (if necessary, from a polymeric material, for example, from acetyl phthaloyl cellulose, or other suitable material, for example, gelatin ), as well as powders, solutions, suspensions or emulsions.

Твердая форма для приема внутрь может содержать в качестве добавок инертный наполнитель (например, лактозу, сахарозу, сорбит, крахмал, маннит), поверхностно-активные вещества (например, стеарат магния или кальция, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль) и фармакологически приемлемые неорганические соли (например, хлорид натрия). A solid oral dosage form may contain, as additives, an inert excipient (e.g. lactose, sucrose, sorbitol, starch, mannitol), surfactants (e.g. magnesium or calcium stearate, polyvinylpyrrolidone, polyethylene glycol, polypropylene glycol) and pharmacologically acceptable inorganic salts ( e.g. sodium chloride).

Жидкие композиции могут быть получены при растворении или диспергировании активного компонента в водном или неводном растворителе (например, этаноле, растительном масле) в присутствии стабилизирующих добавок (например, компонентов буферных смесей, поверхностно-активных веществ, пищевых углеводов), консервантов, пищевых красителей. Жидкие композиции могут быть использованы для различных способов введения, в частности, в форме капель или аэрозолей, а также в ампульной форме для внутривенного или внутримышечного введения. Liquid compositions can be prepared by dissolving or dispersing the active component in an aqueous or non-aqueous solvent (e.g. ethanol, vegetable oil) in the presence of stabilizing additives (e.g., components of buffer mixtures, surfactants, food carbohydrates), preservatives, food colors. Liquid compositions can be used for various methods of administration, in particular in the form of drops or aerosols, as well as in ampoule form for intravenous or intramuscular administration.

Другой возможной формой применения производных 1,2,5-оксадиазоло[3,4-d] пиридазин-5,6-диоксида общей формулы I являются трансдермальные терапевтические композиции в виде мазей и пластырей, в том числе обеспечивающие дозированное чрескожное поступление активных компонентов в организм. Another possible form of application of derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide of the general formula I are transdermal therapeutic compositions in the form of ointments and plasters, including those providing dosed transdermal delivery of active components to the body .

Вышеуказанные фармацевтические композиции на основе производных 1,2,5-оксадиазоло[3,4-d] пиридазин-5,6-диоксида общей формулы I могут быть получены комбинированием соединений 1-4 с активными компонентами других известных фармпрепаратов для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы. В частности, с этой целью можно использовать блокаторы α₁-адренергических рецепторов (празозин), агонисты центральных α₂- адренергических и I₁ имидазолиновых рецепторов (клофелин, моксонидин), блокаторы β-(β₁-) адренергических рецепторов (пропранолол, атенолол, метопролол), блокаторы кальциевых каналов (нифедипин, дилтиазем), ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента (лизиноприл), коронарорасширяющие препараты (карбокромен), диуретики (дихлортиазид), сердечные гликозиды (дигитоксин), антигипертензивные средства (безафибрат, гемфиброзил).The above pharmaceutical compositions based on derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide of the general formula I can be obtained by combining compounds 1-4 with the active components of other known pharmaceutical preparations for the treatment of cardiovascular diseases system. In particular, for this purpose, α ₁ -adrenergic receptor blockers (prazosin), central α ₂ -adrenergic and I ₁ imidazoline receptor agonists (clofelin, moxonidine), β- (β ₁ -) adrenergic receptor blockers (propranolol, atenolol, metoprolol), calcium channel blockers (nifedipine, diltiazem), angiotensin-converting enzyme inhibitors (lisinopril), coronary expansion drugs (carbocromene), diuretics (dichlorothiazide), cardiac glycosides (digitoxin), antihypertensive drugs (befibrat zil).

Описание данного изобретения содержит 16 примеров и фиг. 1-4, иллюстрирующих экспериментальный материал. The description of the present invention contains 16 examples and FIG. 1-4 illustrating the experimental material.

Примеры 1-5 отражают химические основы молекулярного механизма действия производных 1,2,5-оксадиазоло[3,4-d]пиридазин-5,6-диоксида общей формулы I, преимущественно заключающиеся в генерации оксида азота и его активных форм (восстановленной формы и S-нитрозотиолов), модификации сульфгидрильных групп и взаимодействии с атомом железа гемовой группы белков. Examples 1-5 reflect the chemical basis of the molecular mechanism of action of derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazin-5,6-dioxide of the general formula I, mainly consisting in the generation of nitric oxide and its active forms (reduced form and S-nitrosothiols), modifications of sulfhydryl groups and interaction with the iron atom of the heme group of proteins.

Примеры 6 и 7 показывают биохимические эффекты производных 1,2,5-оксадиазоло[3,4-D] пиридазин-5,6- диоксида общей формулы I, опосредованные генерацией оксида азота и его активных форм, - активацию рГЦ и повышение уровня цГМФ в тромбоцитах человека. Примеры 8-11 и фиг. 1-4 иллюстрируют фармакологические свойства производных 1,2,5-оксадиазоло[3,4- d]пиридазин-5,6-диоксида общей формулы I - сосудорасширяющую и гипотензивную активности, - в условиях in vitro и in vivo, а также ингибирование агрегации тромбоцитов, вызванной - под действием АДФ, и дезагрегацию агрегированных тромбоцитов, то есть способность одновременно как снижать кровяное давление, так и ингибировать активность тромбоцитов. Examples 6 and 7 show the biochemical effects of derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-D] pyridazine-5,6-dioxide of the general formula I, mediated by the generation of nitric oxide and its active forms, activation of rHCs and an increase in the level of cGMP in human platelets. Examples 8-11 and FIG. 1-4 illustrate the pharmacological properties of derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide of the general formula I — vasodilator and hypotensive activity — in vitro and in vivo, as well as aggregation inhibition platelet caused by - under the influence of ADP, and the disaggregation of aggregated platelets, that is, the ability to simultaneously reduce blood pressure and inhibit platelet activity.

Пример 12 включает изучение острой токсичности производных 1,2,5-оксадиазоло[3,4-d]пиридазин-5,6-диоксида общей формулы I. Example 12 includes a study of the acute toxicity of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide derivatives of general formula I.

Пример 13 содержит описание некоторых, ранее не изученных физико-химических свойств производных 1,2,5-оксадиазоло[3,4-d]пиридазин-5,6-диоксида общей формулы I (растворимость, стабильность водных растворов и др.). Example 13 contains a description of some previously not studied physicochemical properties of derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide of the general formula I (solubility, stability of aqueous solutions, etc.).

Примеры 14-16 описывают состав различных фармацевтических композиций на основе производных 1,2,5-оксадиазоло[3,4-d]пиридазин-5,6- диоксида общей формулы I. Examples 14-16 describe the composition of various pharmaceutical compositions based on derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide of the general formula I.

Пример 1. Образование оксида азота из производных 1,2,5-оксадиазоло[3,4-d]пиридазин-5,6-диоксида. Example 1. The formation of nitric oxide from derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide.

Для определения оксида азота использовали известный способ, основанный на реакции оксида азота с кислородом воздуха в водной среде с образованием нитрита, количество которого измеряли по интенсивности окрашивания пробы продуктом реакции азосочетания с помощью спектрофотометра. В качестве доказательства того, что данный способ дает возможность измерить именно оксид азота, выделяющийся из соединения в результате химической реакции, а не нитрит, реакцию проводят в присутствии оксигемоглобина, который количественно реагирует с оксидом азота (но не нитритом), образуя нитрат, который не вступает в реакцию азосочетания. To determine nitric oxide, a known method was used, based on the reaction of nitric oxide with atmospheric oxygen in an aqueous medium to form nitrite, the amount of which was measured by the intensity of staining of the sample with the product of the azo coupling reaction using a spectrophotometer. As evidence that this method makes it possible to measure precisely nitric oxide released from the compound as a result of a chemical reaction rather than nitrite, the reaction is carried out in the presence of oxyhemoglobin, which quantitatively reacts with nitric oxide (but not nitrite), forming nitrate, which does not enters into an azo coupling reaction.

Проба конечным объемом 1 мл содержала 50 мМ калий-фосфатный буфер (pH 7,4) или 20 мМ калий-цитратный буфер (pH 5,0), 0,5 мМ цистеин или глутатион, изучаемое соединение в концентрации 0,1 мМ и 0,2% диметилсульфоксид (ДМСО), а при инкубации с оксигемоглобином его концентрация составляла 0,1 мМ. В качестве отрицательного контроля использовали водный раствор ДМСО в концентрации 0,2%, а в качестве положительного контроля 0,1 мМ нитрит натрия, содержащий 0,2% ДМСО. Пробы инкубировали 30 мин при 37^oC и добавляли последовательно 100 мкл 3 М ацетата натрия, 400 мкл 0,92% раствора сульфаниловой кислоты в 30% уксусной кислоте и 400 мкл 0,05% N-нафтилэтилендиамина. Пробы инкубировали 10 мин и измеряли оптическую плотность при длине волны 554 нм на спектрофотометре.The sample with a final volume of 1 ml contained 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4) or 20 mM potassium citrate buffer (pH 5.0), 0.5 mM cysteine or glutathione, the studied compound at a concentration of 0.1 mM and 0 , 2% dimethyl sulfoxide (DMSO), and when incubated with oxyhemoglobin, its concentration was 0.1 mM. An aqueous solution of DMSO at a concentration of 0.2% was used as a negative control, and 0.1 mM sodium nitrite containing 0.2% DMSO was used as a positive control. Samples were incubated for 30 min at 37 ^° C and 100 μl of 3 M sodium acetate, 400 μl of a 0.92% solution of sulfanilic acid in 30% acetic acid and 400 μl of 0.05% N-naphthylethylenediamine were successively added. Samples were incubated for 10 min and absorbance was measured at a wavelength of 554 nm on a spectrophotometer.

В вышеуказанных условиях при pH 7,4 не наблюдалось образование заметного количества нитрита (< 0,01 моль нитрита/моль исходного соединения (исх.с.)) в отсутствие тиолов. В присутствии тиолов соединение 1 генерировало 0,32 моль нитрита на моль исх.с. в присутствии цистеина и 0,43 моль нитрита на моль исх. с. в присутствии глутатиона; соединение 2 генерировало 0,02 моль нитрита на моль исх.с. в присутствии цистеина и 0,01 моль нитрита на моль исх.с. в присутствии глутатиона. В тех же условиях, но при pH 5,0 происходило образование из соединения 1 0,72 моль нитрита на моль исх.с. в присутствии цистеина и 0,75 моль нитрита на моль исх.с. в присутствии глутатиона; в случае соединения 2 соответствующие значения составляли 0,13 и 0,14 моль нитрита на моль исх.с. Дальнейшая инкубация не приводила к дополнительному образованию нитрита. При инкубации в вышеуказанных условиях при pH 7,4 в присутствии оксигемоглобина соединение 1 генерировало 0,04 и 0,05 моль нитрита на моль исх.с. в присутствии цистеина и глутатиона соответственно, а оптическая плотность положительной контрольной пробы не изменялась. Это свидетельствует о том, что до 90% нитрита, определяемого по этому способу, является продуктом окисления оксида азота при pH 7,4. При pH 5,0 нитрит реагирует с оксигемоглобином, что затрудняет однозначное определение образования оксида азота при этом значении pH. Известный аналог (соединение 5) в указанных условиях в присутствии тиолов генерировал 0,08 моль нитрита на моль исх.с. Under the above conditions, at pH 7.4, the formation of a noticeable amount of nitrite was not observed (<0.01 mol of nitrite / mol of the starting compound (ref.s.)) in the absence of thiols. In the presence of thiols, compound 1 generated 0.32 mol of nitrite per mol of ref. in the presence of cysteine and 0.43 mol of nitrite per mol ref. from. in the presence of glutathione; Compound 2 generated 0.02 mol of nitrite per mol of ref. in the presence of cysteine and 0.01 mol of nitrite per mol ref. in the presence of glutathione. Under the same conditions, but at pH 5.0, the formation of 0.72 moles of nitrite per mole of ex.s. in the presence of cysteine and 0.75 mol of nitrite per mol ref. in the presence of glutathione; in the case of compound 2, the corresponding values were 0.13 and 0.14 mol of nitrite per mol ref. Further incubation did not lead to additional nitrite formation. Upon incubation under the above conditions at a pH of 7.4 in the presence of oxyhemoglobin, compound 1 generated 0.04 and 0.05 mol of nitrite per mole of ex. in the presence of cysteine and glutathione, respectively, and the optical density of the positive control sample did not change. This indicates that up to 90% of nitrite, determined by this method, is a product of the oxidation of nitric oxide at a pH of 7.4. At pH 5.0, nitrite reacts with oxyhemoglobin, which makes it difficult to unambiguously determine the formation of nitric oxide at this pH value. The known analogue (compound 5) under the indicated conditions in the presence of thiols generated 0.08 mol of nitrite per mol of ref.

Пример 2. Образование S-нитрозотиолов (S-нитрозоглутатиона) производными 1,2,5-оксадиазоло[3,4-d]пиридазин-5,6-диоксида. Example 2. The formation of S-nitrosothiols (S-nitrosoglutathione) derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide.

Для определения S-нитрозотиолов использовали известный способ, основанный на реакции с хлоридом ртути (II), в ходе которой происходит образование нитрита. Для учета образования нитрита в ходе реакции соединения 1 с глутатионом реакцию проводили, как описано в примере 1, а затем определяли нитрит по способу, описанному в примере 1, в отсутствие и в присутствии хлорида ртути (II) в концентрации 0,1%. Разность полученных значений соответствует количеству S-нитрозоглутатиона. To determine S-nitrosothiols, a known method was used, based on a reaction with mercury (II) chloride, during which nitrite is formed. To take into account the formation of nitrite during the reaction of compound 1 with glutathione, the reaction was carried out as described in example 1, and then nitrite was determined by the method described in example 1, in the absence and in the presence of mercury (II) chloride at a concentration of 0.1%. The difference in the obtained values corresponds to the amount of S-nitrosoglutathione.

В вышеуказанных условиях происходит образование 0,17 моль S-нитрозоглутатиона на моль соединения 1. Образование S-нитрозотиолов известным аналогом (соединением 5) не исследовано. Under the above conditions, 0.17 mol of S-nitrosoglutathione per mole of compound 1 is formed. The formation of S-nitrosothiols by a known analogue (compound 5) has not been investigated.

Пример 3. Образование восстановленной формы оксида азота производными 1,2,5- оксадиазоло[3,4-d]пиридазин-5,6-диоксида. Example 3. The formation of a reduced form of nitric oxide derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide.

Для определения восстановленной формы оксида азота (NO^-/HNO) использовали известный способ, основанный на том, что образовавшийся в ходе реакции нитроксил реагирует с тиолами с образованием гидроксиламина (или происходит конкурентное образование N₂O), который после окисления ионами I₃ ^- дает нитрит, определяемый по реакции азосочетания (см. пример 1). Поскольку соединения 1 и 2 также генерируют и нитрит, который также вступает в реакцию азосочетания на заключительном этапе, в качестве положительного контроля использовали гидроксиламина гидрохлорид и нитрит натрия в концентрации 0,1 мМ, а инкубацию проводили так же, как описано в примере 1, при pH 7,4. После инкубации в пробы добавляли 100 мкл 3 М ацетата натрия, 400 мкл 0,92% раствора сульфаниловой кислоты в 30% уксусной кислоте, 100 мкл 1,25% I₂ в 2% KI, 30 мкл 0,5 М 2-меркаптоэтанола и 400 мкл 0,05% N-нафтилэтилендиамина. Пробы инкубировали 15 мин и измеряли оптическую плотность при длине волны 554 нм на спектрофотометре. Параллельно с этим опытом проводили измерения образования нитрита, как описано в примере 1. Содержание гидроксиламина рассчитывали по формуле X = (A- Y·N)/H, где X соответствует концентрации гидроксиламина, мкМ; A - оптическая плотность пробы, содержащей исследуемое соединение, Y - концентрация образовавшегося нитрита натрия, определенная, как описано в примере 1, мкМ; N - оптическая плотность положительного контроля, содержащего нитрит натрия, мкМ^-1; и H - оптическая плотность положительного контроля, содержащего гидроксиламина гидрохлорид, мкМ^-1.To determine the reduced form of nitric oxide (NO ^- / HNO), a known method was used, based on the fact that the nitroxyl formed during the reaction reacts with thiols to form hydroxylamine (or competitive formation of N ₂ O occurs), which after oxidation with I ₃ ^- ions gives nitrite, determined by the azo coupling reaction (see example 1). Since compounds 1 and 2 also generate nitrite, which also enters into the azo coupling reaction at the final stage, hydroxylamine hydrochloride and sodium nitrite at a concentration of 0.1 mM were used as a positive control, and the incubation was carried out as described in example 1, with pH 7.4. After incubation, 100 μl of 3 M sodium acetate, 400 μl of a 0.92% solution of sulfanilic acid in 30% acetic acid, 100 μl of 1.25% I ₂ in 2% KI, 30 μl of 0.5 M 2-mercaptoethanol and 400 μl of 0.05% N-naphthylethylenediamine. Samples were incubated for 15 min and the absorbance was measured at a wavelength of 554 nm on a spectrophotometer. In parallel with this experiment, nitrite formation was measured as described in Example 1. The hydroxylamine content was calculated by the formula X = (A-Y · N) / H, where X corresponds to the concentration of hydroxylamine, μM; A is the optical density of the sample containing the test compound, Y is the concentration of the formed sodium nitrite, determined as described in example 1, μm; N is the optical density of the positive control containing sodium nitrite, μm ^-1 ; and H is the optical density of the positive control containing hydroxylamine hydrochloride, μM ^-1 .

В вышеуказанных условиях происходит образование 0,18 моль гидроксиламина на моль соединения 1 в присутствии цистеина и 0,34 моль гидроксиламина на моль соединения 1 в присутствии глутатиона. В данных условиях из соединения 2 в присутствии или в отсутствие тиолов не происходит образования гидроксиламина. Возможность генерации известным аналогом (соединением 5) восстановленной формы оксида азота не исследована. Under the above conditions, 0.18 mol of hydroxylamine per mole of compound 1 is formed in the presence of cysteine and 0.34 mol of hydroxylamine per mole of compound 1 in the presence of glutathione. Under these conditions, the formation of hydroxylamine does not occur from compound 2 in the presence or absence of thiols. The possibility of generating a known analogue (compound 5) of the reduced form of nitric oxide has not been investigated.

Пример 4. Образование метгемоглобина из оксигемоглобина под действием производных 1,2,5-оксадиазоло[3,4-d]пиридазин-5,6- диоксида. Example 4. The formation of methemoglobin from oxyhemoglobin under the action of derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide.

Образование метгемоглобина из оксигемоглобина изучали известным способом с помощью спектрофотометра. The formation of methemoglobin from oxyhemoglobin was studied in a known manner using a spectrophotometer.

Пробы конечным объемом 1 мл содержали 50 мМ калий-фосфатный буфер (pH 7,4), 40 мкМ оксигемоглобин, 50 мкМ соединения 1 или 2 (в контрольные пробы добавляли ДМСО до концентрации 0,2%) и 0,25 мМ цистеин или воду. Пробы инкубировали 60 мин при 37^oC и измеряли оптическую плотность при длинах волн 577, 630 и 700 нм, рассчитывая концентрации оксигемоглобина, метгемоглобина и холеглобина (см. табл. 1).Samples with a final volume of 1 ml contained 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4), 40 μM oxyhemoglobin, 50 μM compound 1 or 2 (DMSO was added to the control samples to a concentration of 0.2%) and 0.25 mm cysteine or water . Samples were incubated for 60 min at 37 ^° C and the absorbance was measured at wavelengths of 577, 630 and 700 nm, calculating the concentrations of oxyhemoglobin, methemoglobin and choleglobin (see Table 1).

В вышеуказанных условиях соединения 1 и 2 вызывали образование метгемоглобина из оксигемоглобина, причем данный эффект усиливался в присутствии цистеина. Это свидетельствует о способности указанных соединений взаимодействовать с атомом железа гемовой группы белков. Аналогичный эффект известного аналога (соединения 5) не исследовался. Under the above conditions, compounds 1 and 2 caused the formation of methemoglobin from oxyhemoglobin, and this effect was enhanced in the presence of cysteine. This indicates the ability of these compounds to interact with the iron atom of the heme group of proteins. A similar effect of the known analogue (compound 5) has not been investigated.

Пример 5. Модификация сульфгидрильных групп низкомолекулярных тиолов под действием производных 1,2,5-оксадиазоло[3,4-d]пиридазин-5,6-диоксида. Концентрацию SH-групп определяли известным способом Эллмана. Пробы конечным объемом 0,2 мл содержали 50 мМ калий-фосфатный буфер (pH 7,4), тиолы в концентрации 0,5 мМ и соединения 1 или 2 в концентрации 0,05 мМ. Контрольные пробы содержали соответствующее количество ДМСО (0,2%). Инкубацию проводили в течение 20 мин при 37^oC и добавляли 1,8 мл 0,5 мМ раствора 5,5'-дитиобис(2-нитробензойной) кислоты в 50 мМ калий-фосфатном буфере (pH 7,4). Через 5 мин измеряли оптическую плотность при длине волны 412 ими рассчитывали концентрацию SH-групп (см. табл. 2)
Взаимодействие известного аналога (соединения 5) с низкомолекулярным тиолами не исследовано.Example 5. Modification of sulfhydryl groups of low molecular weight thiols under the action of derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide. The concentration of SH-groups was determined in a known manner by Ellman. Samples with a final volume of 0.2 ml contained 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4), thiols at a concentration of 0.5 mM, and compounds 1 or 2 at a concentration of 0.05 mM. Control samples contained the corresponding amount of DMSO (0.2%). Incubation was carried out for 20 min at 37 ^° C and 1.8 ml of a 0.5 mM solution of 5.5'-dithiobis (2-nitrobenzoic) acid in 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4) was added. After 5 min, the optical density was measured at a wavelength of 412; they calculated the concentration of SH-groups (see table. 2)
The interaction of the known analogue (compound 5) with low molecular weight thiols has not been investigated.

Пример 6. Активация растворимой формы гуанилатциклазы производными 1,2,5- оксадиазоло[3,4-d]пиридазин-5,6-диоксида общей формулы I. Example 6. Activation of a soluble form of guanylate cyclase derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide of the General formula I.

Активность рГЦ измеряли в препаратах цитозоля тромбоцитов человека и легких крысы известными способами. The activity of RHCs was measured in rat and human platelet cytosol preparations by known methods.

В первом случае для получения препарата рГЦ выделяли тромбоциты из венозной крови здоровых доноров известным способом с применением разделения форменных элементов крови в градиенте плотности фиколла. Тромбоциты промывали 3 раза 20 мМ трис-HCl-буфером (pH 7,5), содержащим 150 мМ NaCl и 5 мМ ЭДТА, центрифугируя при 1 000 g в течение 15 мин, а затем суспендировали в 50 мМ трис-HCl-буфере (pH 7,6), содержащем 0,2 мМ дитиотреитол, и озвучивали ультразвуком с помощью ультразвукового генератора MSE 7-78 (Великобритания) в течение 20 сек при 4^oC. Суспензию разрушенных клеток центрифугировали при 100 000 g в течение 1 ч, супернатант разводили до концентрации белка 1 мг/мл, добавляли дитиотреитол до концентрации 0,2 мМ и определяли активность фермента по количеству цГМФ, образовавшегося из гуанозин-5'-трифосфата (ГТФ), иммуноферментным способом с использованием наборов реактивов для количественного определения цГМФ (АО "Биоген", Россия). Инкубационная смесь для определения активности конечным объемом 0,15 мл готовилась при 4^oC и содержала 50 мМ трис-HCl (pH 7,6), 1 мМ ГТФ, 4 мМ MgCl₂, 4 мМ креатинфосфат, 100 мкг (50 ед/мг) креатинфосфокиназы, 10 мМ теофиллин и ферментный препарат (10-20 мкг белка супернатанта). При определении активирующего действия в среду инкубации вносили изучаемое соединение в концентрации 10 мкМ в виде раствора в водном ДМСО и, при необходимости, другие соединения, например 0,3 мкМ 1H-[1,2,4]оксадиазол[4,3-a]хиноксалин-1-он (ОДХ; специфический ингибитор гем-зависимой активации рГЦ) или 1 мМ цистеин, а в контрольные пробы добавляли ДМСО до концентрации 0,02%. Контрольная проба показала отсутствие влияния ДМСО в указанной концентрации на базальную активность рГЦ. Пробы инкубировали при 37^oC в течение 15 мин. Реакцию останавливали кипячением проб в течение 2 мин с последующим охлаждением в ледяной бане. После отделения денатурировавшего белка при центрифугировании (10 мин при 1 500 g) в супернатанте определяли количество образовавшегося цГМФ вышеуказанным способом.In the first case, to obtain the RHC preparation, platelets were isolated from the venous blood of healthy donors in a known manner using separation of blood cells in a density gradient of ficoll. Platelets were washed 3 times with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 150 mM NaCl and 5 mM EDTA, centrifuged at 1,000 g for 15 min, and then suspended in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.6) containing 0.2 mM dithiothreitol and sonicated by ultrasound using an MSE 7-78 ultrasound generator (UK) for 20 seconds at 4 ^° C. The cell suspension was centrifuged at 100,000 g for 1 hour, the supernatant was diluted to a protein concentration of 1 mg / ml, dithiothreitol was added to a concentration of 0.2 mM and the enzyme activity was determined by the amount of cGMP formed axis from guanosine 5'-triphosphate (GTP), by enzyme-linked immunosorbent assay using reagent kits for the quantitative determination of cGMP (JSC "Biogen", Russia). An incubation mixture for determining activity with a final volume of 0.15 ml was prepared at 4 ^° C and contained 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 1 mM GTP, 4 mM MgCl ₂ , 4 mM creatine phosphate, 100 μg (50 u / mg ) creatine phosphokinase, 10 mM theophylline and an enzyme preparation (10-20 μg supernatant protein). When determining the activating effect, the studied compound was introduced into the incubation medium at a concentration of 10 μM in the form of a solution in aqueous DMSO and, if necessary, other compounds, for example, 0.3 μM 1H- [1,2,4] oxadiazole [4,3-a] quinoxalin-1-one (ODC; specific inhibitor of heme-dependent activation of rHC) or 1 mM cysteine, and DMSO was added to control samples to a concentration of 0.02%. A control sample showed no effect of DMSO in the indicated concentration on the basal activity of the RHC. Samples were incubated at 37 ^° C for 15 minutes. The reaction was stopped by boiling samples for 2 min, followed by cooling in an ice bath. After separation of the denatured protein by centrifugation (10 min at 1,500 g), the amount of cGMP formed in the above method was determined in the supernatant.

Для получения препарата рГЦ из легких крысы ткань гомогенизировали в 5 объемах 50 мМ трис-HCl-буфера (pH 7,6), содержащего 10 мМ MgCl₂, с помощью гомогенизатора "стекло-стекло". Гомогенат центрифугировали в течение 30 мин при 30 000 g, супернатант отбирали и определяли активность фермента по количеству [³²P]цГМФ, образовавшегося из [α-³²P]ГТФ известным способом. Инкубационная смесь конечным объемом 100 мкл содержала 50 мМ трис-HCl-буфер (pH 7,6), 5 мМ MgCl₂, 5 мМ креатинфосфат, 0,4 мг/мг креатинфосфокиназы, 1 мМ 3-изобутил-1-метилксантин, 2 мМ цГМФ, 0,2 мМ ГТФ (около 200 000 имп/мин на пробу) и ферментный препарат (40-50 мкг белка). При определении активирующего действия в среду инкубации вносили изучаемое соединение в концентрации 10 мкМ в виде раствора в водном ДМСО и, при необходимости, другие соединения, например 3 мкМ ОДХ или 5 мМ цистеин, а в контрольные пробы добавляли ДМСО до концентрации 0,02%. Контрольная проба показала отсутствие влияния ДМСО в указанной концентрации на базальную активность рГЦ. Пробы инкубировали при 37^oC в течение 15 мин. Реакцию останавливали кипячением проб в течение 2 мин. После охлаждения до комнатной температуры в пробы добавляли 0,5 мл 30 мМ Na₂CO₃ и 0,6 мл 36 мМ Zn(CH₃COO)₂, перемешивали, инкубировали при 4^oC в течение 10 мин и центрифугировали при 15000 g в течение 5 мин. Супернатант наносили на колонки с подкисленной известным способом окисью алюминия, которые промывали водой. Элюцию [³²P]цГМФ проводили 0,2 М формиатом аммония во флаконы для сцинтилляционного счета и радиоактивность измеряли с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика известным способом Черенкова.To obtain the RHC preparation from rat lungs, the tissue was homogenized in 5 volumes of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.6) containing 10 mM MgCl ₂ using a glass-glass homogenizer. The homogenate was centrifuged for 30 min at 30,000 g, the supernatant was selected and enzyme activity was determined by the amount of [ ³² P] cGMP formed from [α- ³² P] GTP in a known manner. The incubation mixture with a final volume of 100 μl contained 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.6), 5 mM MgCl ₂ , 5 mM creatine phosphate, 0.4 mg / mg creatine phosphokinase, 1 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine, 2 mM cGMP, 0.2 mM GTP (about 200,000 cpm / sample) and an enzyme preparation (40-50 μg protein). When determining the activating effect, the studied compound was introduced into the incubation medium at a concentration of 10 μM in the form of a solution in aqueous DMSO and, if necessary, other compounds, for example, 3 μM ODC or 5 mm cysteine, and DMSO was added to control samples to a concentration of 0.02%. A control sample showed no effect of DMSO in the indicated concentration on the basal activity of the RHC. Samples were incubated at 37 ^° C for 15 minutes. The reaction was stopped by boiling samples for 2 minutes. After cooling to room temperature, 0.5 ml of 30 mM Na ₂ CO ₃ and 0.6 ml of 36 mM Zn (CH ₃ COO) ₂ were added to the samples, mixed, incubated at 4 ^° C for 10 min and centrifuged at 15000 g in within 5 minutes The supernatant was applied onto alumina columns acidified in a known manner, which were washed with water. Elution of [ ³² P] cGMP was carried out with 0.2 M ammonium formate in scintillation counting bottles and radioactivity was measured using a liquid scintillation counter in a known manner by Cherenkov.

Определение белка проводили по известному способу Лоури с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта. Protein determination was performed according to the known Lowry method using bovine serum albumin as a standard.

Соединения 1 и 2 активировали рГЦ из тромбоцитов человека и легких крысы. Активация снижалась в присутствии ОДХ, что указывает на гем-зависимую природу эффекта. Активация практически полностью ингибировалась в присутствии цистеина, что указывает на предпочтительное действие указанных производных 1,2,5-оксадиазоло[3,4-d] пиридазин-5,6-диоксида общей формулы I на рГЦ в клетках с пониженным содержанием свободных тиолов. В вышеописанных условиях известный аналог (соединение 5) активировал рГЦ тромбоцитов человека в 2,5 раза (250%). Compounds 1 and 2 activated rHC from human platelets and rat lungs. Activation decreased in the presence of ODC, indicating a heme-dependent nature of the effect. Activation was almost completely inhibited in the presence of cysteine, which indicates the preferred effect of these derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide of general formula I on RHC in cells with a low content of free thiols. Under the conditions described above, the known analogue (compound 5) activated the human blood platelet RHC by 2.5 times (250%).

Пример 7. Повышение содержания цГМФ в тромбоцитах человека производными 1,2,5-оксадиазоло[3,4-d]пиридазин-5,6-диоксида общей формулы I. Example 7. An increase in the content of cGMP in human platelets derived from 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide of the General formula I.

Определение цГМФ в тромбоцитах человека проводили известным способом. Обогащенную тромбоцитами плазму разводили обедненной тромбоцитами плазмой до концентрации 10⁹ клеток/мл. Пробы конечным объемом 4 мл содержали 1 мл суспензии тромбоцитов (2,5·10⁸ клеток/мл), 3 мл обедненной тромбоцитами плазмы, соединения 1 или 2 в концентрации 10 мкМ или 0,02% ДМСО. Пробы инкубировали 10 мин при 37^oC, центрифугировали 5 мин при 1 500 g, осадок суспендировали в 100 мМ трис-HCl-буфере (pH 7,6), содержащем 8 мМ ЭДТА, озвучивали ультразвуком в течение 20 сек при 4^oC, кипятили 2 мин и снова центрифугировали при 2 000 g в течение 10 мин. Концентрацию цГМФ определяли в супернатанте иммуноферментным способом с использованием наборов реактивов для количественного определения цГМФ (АО "Биоген", Россия).The determination of cGMP in human platelets was carried out in a known manner. Platelet-rich plasma was diluted with platelet-poor plasma to a concentration of 10 ⁹ cells / ml. Samples with a final volume of 4 ml contained 1 ml of a platelet suspension (2.5 × 10 ⁸ cells / ml), 3 ml of platelet-poor plasma, compound 1 or 2 at a concentration of 10 μM or 0.02% DMSO. Samples were incubated for 10 min at 37 ^° C, centrifuged for 5 min at 1,500 g, the precipitate was suspended in 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.6) containing 8 mM EDTA, sonicated by ultrasound for 20 s at 4 ^o C, boiled for 2 minutes and centrifuged again at 2,000 g for 10 minutes. The concentration of cGMP was determined in the supernatant by an enzyme-linked immunosorbent assay using reagent kits for the quantitative determination of cGMP (JSC Biogen, Russia).

В контрольной пробе, содержащей 0,02% ДМСО, содержание цГМФ составляло 10,2 пмоль/10⁹ тромбоцитов. В пробах, содержащих соединения 1 и 2, содержание цГМФ составляло 15,4 и 13,6 пмоль/10⁹ тромбоцитов (151% и 133%) соответственно. Таким образом, соединения 1 и 2 повышают содержание цГМФ в интактных тромбоцитах человека. Аналогичный эффект соединения 5 не изучен.In a control sample containing 0.02% DMSO, the cGMP content was 10.2 pmol / 10 ⁹ platelets. In samples containing compounds 1 and 2, the cGMP content was 15.4 and 13.6 pmol / 10 ⁹ platelets (151% and 133%), respectively. Thus, compounds 1 and 2 increase the content of cGMP in intact human platelets. A similar effect of compound 5 has not been studied.

Пример 8. Сосудорасширяющее действие производных 1,2,5- оксадиазоло[3,4-d]пиридазин-5,6-диоксида общей формулы I. Example 8. Vasodilator effect of derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide of the general formula I.

Под сосудорасширяющим действием здесь и далее понимали уменьшение изометрического сокращения гладких мышц изолированного сегмента оарты крысы. Активность производных 1,2,5-оксадиазоло [3,4-d]пиридазин-5,6-диоксида общей формулы I определяли в условиях in vitro на кольцах торакальной аорты крыс-самцов линии Вистар средней массой 280 г (210-330 г) известным способом. Крыс декапитировали, вырезали торакальную аорту и очищали от жировой ткани. Затем вырезали кольца толщиной 3,5 мм, которые подвешивали на двух параллельных крючках из нержавеющей стали. Один из крючков закрепляли на стенке камеры, а другой соединяли с изометрическим датчиком DY1, соединенным с двухканальным самописцем Gemini (фирмы Ugo Basile, Италия). Камера содержала 30 мл раствора Кребса (130 мМ NaCl, 4,7 мМ KCl, 2,5 мМ CaCl₂, 1,18 мМ KH₂PO₄, 14,9 мМ NaHCO₃, 1,2 мМ MgSO₄, 11 мМ глюкоза) при 37^oC, который находился в условиях постоянной аэрации 95% O₂/5% CO₂ для поддержания pH 7,4. В раствор Кребса добавляли индометацин до концентрации 1 мкМ. При необходимости эндотелий удаляли механическим способом. Кольца перед опытом уравновешивали в течение часа под нагрузкой 1,2 г. Сокращение препарата вызывали добавлением норадреналина в концентрации 0,5 мкМ, добавляли 0,1 мМ N^-G-нитро-L-аргинин(L-NNA; ингибитор эндотелий-зависимого образования оксида азота), и после стабилизации состояния мышцы сосуда регистрировали ее расслабление в ответ на кумулятивные дозы соединений в диапазоне концентраций от 0,003 нМ до 50 000 нМ. В отдельных экспериментах для установления роли NO или рГЦ в механизмах действия соединений добавляли 0,01 мМ оксигемоглобин (ловушка оксида азота) или 3 мкМ 1H-[1,2,4]оксадиазол[4,3-a]хиноксалин-1-он (ОДХ; специфический ингибитор гем-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы; смотри Пример 6). Наличие или отсутствие эндотелия контролировали расширением изолированных сегментов в ответ на 1 мкМ ацетилхолин, а интактное состояние гладкой мышцы сосуда контролировали с использованием 0,5 мкМ нитропруссида натрия.Hereinafter, vasodilating action was understood to mean a decrease in the isometric contraction of the smooth muscles of an isolated rat oartic segment. The activity of derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide of the general formula I was determined in vitro on thoracic aortic rings of male Wistar rats with an average weight of 280 g (210-330 g) in a known manner. Rats were decapitated, the thoracic aorta was excised and purified from adipose tissue. Then 3.5 mm thick rings were cut which were hung on two parallel stainless steel hooks. One of the hooks was mounted on the wall of the chamber, and the other was connected to an isometric sensor DY1 connected to a two-channel Gemini recorder (Ugo Basile, Italy). The chamber contained 30 ml of Krebs solution (130 mm NaCl, 4.7 mm KCl, 2.5 mm CaCl ₂ , 1.18 mm KH ₂ PO ₄ , 14.9 mm NaHCO ₃ , 1.2 mm MgSO ₄ , 11 mm glucose ) at 37 ^o C, which was under conditions of constant aeration of 95% O ₂ /5% CO ₂ to maintain a pH of 7.4. Indomethacin was added to Krebs solution to a concentration of 1 μM. If necessary, the endothelium was removed mechanically. Rings were equilibrated before the experiment within one hour under a load of 1.2 g of the drug caused by adding a reduction in norepinephrine concentration of 0.5 uM, 0.1 mM N ^-G -nitro-L-arginine (L-NNA; inhibitor of endothelium-dependent formation nitric oxide), and after stabilization of the state of the muscle of the vessel, its relaxation was recorded in response to cumulative doses of the compounds in the concentration range from 0.003 nM to 50,000 nM. In separate experiments, 0.01 mM oxyhemoglobin (nitric oxide trap) or 3 μM 1H- [1,2,4] oxadiazole [4,3-a] quinoxalin-1-one (3, 1) was added to establish the role of NO or RHC in the mechanisms of action of compounds ODC; specific inhibitor of heme-dependent activation of soluble guanylate cyclase; see Example 6). The presence or absence of endothelium was controlled by the expansion of isolated segments in response to 1 μM acetylcholine, and the intact state of the smooth muscle of the vessel was controlled using 0.5 μM sodium nitroprusside.

Соединения 1 и 2 вызывали уменьшение изометрического сокращения сосуда с интакным эндотелием в присутствии норадреналина и L-NNA (фиг. 1 и 2). При этом концентрация соединения 1, соответствующая 50%-ному снижению исходного сосудистого тонуса (IC₅₀), составляла 3,51±0,5 нМ (средняя величина ± среднеквадратичное отклонение по данным трек экспериментов), а максимальное расслабление на 100% наблюдалось при концентрации 10 мкМ. Соединение 2 в тех же условиях имело IC₅₀ = 2,29 мкМ, а расслабление на 100% наблюдалось при концентрации 50 мкМ. Данные о влиянии интактного эндотелия, оксигемоглобина и ОДХ на IC₅₀ и максимальное расслабление при действии соединений 1 и 2 представлено в таблице 4. Полученные данные указывают на то, что соединения 1 и 2 являются эндотелий-независимыми релаксантами, действуют непосредственно на гладкомышечные клетки аорты, а механизм их действия обусловлен образованием оксида азота (ингибирование оксигемоглобином) и активацией растворимой формы гуанилатциклазы (ингибирование ОДХ).Compounds 1 and 2 caused a decrease in the isometric contraction of the vessel with intact endothelium in the presence of norepinephrine and L-NNA (Figs. 1 and 2). In this case, the concentration of compound 1, corresponding to a 50% decrease in the initial vascular tone (IC ₅₀ ), was 3.51 ± 0.5 nM (average value ± standard deviation according to the track experiments), and the maximum relaxation of 100% was observed at a concentration 10 μM. Compound 2 under the same conditions had an IC ₅₀ = 2.29 μM, and 100% relaxation was observed at a concentration of 50 μM. Data on the effect of intact endothelium, oxyhemoglobin and ODC on IC ₅₀ and maximum relaxation under the action of compounds 1 and 2 are presented in table 4. The data obtained indicate that compounds 1 and 2 are endothelium-independent relaxants, act directly on smooth muscle cells of the aorta, and their mechanism of action is due to the formation of nitric oxide (inhibition by oxyhemoglobin) and the activation of the soluble form of guanylate cyclase (inhibition of ODC).

Согласно данным прототипа, соединение 5 в условиях in vitro, близких к вышеописанным, при использовании в качестве вазоконстриктора фенилэфрина обладало сосудорасширяющим действием; при этом значение IC₅₀ составляло 1,5 мкМ. Влияние дополнительных факторов на активность соединения 5 не исследовалось.According to the data of the prototype, compound 5 in vitro, close to the above, when used as a vasoconstrictor phenylephrine had a vasodilating effect; wherein the IC ₅₀ value was 1.5 μM. The effect of additional factors on the activity of compound 5 has not been studied.

Пример 9. Гипотензивная активность производных 1,2,5-оксадиазоло [3,4-d] пиридазин-5,6-диоксида общей формулы I. Example 9. Antihypertensive activity of derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide of the general formula I.

Активность производных 1,2,5-оксадиазоло[3,4-d]пиридазин-5,6- диоксида общей формулы I определяли в условиях in vivo нa самцах крыс линии Вистар средней массой 320 г известным способом. Для измерения среднего артериального давления и частоты сердечных сокращений и для введения препарата в кровоток за сутки до эксперимента животным имплантировали полиэтиленовые катетеры (марки РЕ-10, РЕ -50) в бедренную артерию и бедренную вену. Свободные концы катетеров выводили и закрепляли на голове. Операция проводилась под гексеналовым наркозом (150 мг/кг). The activity of derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazin-5,6-dioxide of the general formula I was determined in vivo on male Wistar rats with an average weight of 320 g in a known manner. To measure the average blood pressure and heart rate and to introduce the drug into the bloodstream the day before the experiment, the animals were implanted with polyethylene catheters (PE-10, PE-50 brands) in the femoral artery and femoral vein. The free ends of the catheters were removed and secured to the head. The operation was performed under hexenal anesthesia (150 mg / kg).

Через сутки крысу брали в опыт. В ходе эксперимента регистрировали артериальное давление датчиком фирмы Stadham (США) с последующей регистрацией данных с помощью компьютера (программа Bioshell, Факультет Фундаментальной Медицины, МГУ им. Ломоносова, Россия). Соединение 1 вводили болюсно внутривенно в дозе 2,5 мг/кг в объеме 0,2 мл в 5% ДМСО. Во время всего эксперимента животные находились в состоянии бодрствования и могли свободно перемещаться по клетке. В течение часа животные свободно адаптировались к условиям эксперимента, а затем начинали регистрацию гемодинамических показателей, которая велась непрерывно в течение всего опыта. Исходные значения среднего артериального давления и частоты сердечных сокращений составляли 98,3 мм рт. ст. и 315,6 ударов/мин соответственно. A day later, the rat was taken into the experiment. During the experiment, blood pressure was recorded by a Stadham sensor (USA) followed by data recording using a computer (Bioshell program, Faculty of Fundamental Medicine, Lomonosov Moscow State University, Russia). Compound 1 was administered bolus intravenously at a dose of 2.5 mg / kg in a volume of 0.2 ml in 5% DMSO. During the entire experiment, the animals were awake and could freely move around the cell. Within an hour, the animals freely adapted to the experimental conditions, and then began recording hemodynamic parameters, which was carried out continuously throughout the experiment. Baseline mean arterial pressure and heart rate were 98.3 mmHg. Art. and 315.6 beats / min, respectively.

Болюсное введение соединения 1 в дозе 2,5 мг/кг вызывало двухфазный ответ среднего артериального давления: быстрое понижение до 16,1 мм рт. ст., которое сменялось компенсаторным повышением артериального давления до 121,4 мм рт. ст. через 2,5 мин после введения соединения 1. Частота сердечных сокращений изменялась разнонаправленно по отношению к артериальному давлению, повышаясь до 663,6 ударов/мин через 10 сек после инъекции, а затем снижаясь до 205,7 уд/мин через 3 мин после инъекции. Таким образом, очевидна высокая эффективность и отсутствие временной задержки сосудорасширяющего действия соединения 1 при внутривенном введении. Действие известного аналога (соединения 5) на артериальное давление in vivo не изучалось. The bolus administration of compound 1 at a dose of 2.5 mg / kg caused a biphasic response of mean arterial pressure: a rapid decrease to 16.1 mmHg. Art., which was replaced by a compensatory increase in blood pressure to 121.4 mm RT. Art. 2.5 min after administration of Compound 1. The heart rate varied in different directions with respect to blood pressure, increasing to 663.6 beats / min 10 seconds after injection, and then decreasing to 205.7 beats / min 3 minutes after injection . Thus, the high efficiency and lack of time delay of the vasodilating effect of compound 1 with intravenous administration is obvious. The effect of the known analogue (compound 5) on blood pressure in vivo has not been studied.

Пример 10. Ингибирование агрегации тромбоцитов человека под действием производных 1,2,5-оксадиазоло[3,4-d]пиридазин-5,6-диоксида общей формулы I. Example 10. Inhibition of aggregation of human platelets under the action of derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide of the general formula I.

Влияние производных 1,2,5-оксадиазоло[3,4-d] пиридазин- 5,6-диоксида общей формулы I на агрегацию тромбоцитов человека изучали известным турбидиметрическим способом Борна. Для этого венозную кровь, взятую в 8 ч утра у здоровых доноров, центрифугировали при 450 g при комнатной температуре в пластиковой посуде в течение 10 мин, используя в качестве антикоагулянта цитрат натрия. Супернатант, то есть богатую тромбоцитами плазму, отбирали и центрифугировали при 650 g в течение 30 мин, получая бедную тромбоцитами плазму. Концентрацию тромбоцитов доводили в богатой тромбоцитами плазме до 2,5·10⁸ клеток/мл с помощью разведения бедной тромбоцитами плазмой и приливали полученную суспензию в кювету объемом 0,5 мл. Агрегацию индуцировали добавлением АДФ до концентрации 2-5 мкМ. Концентрацию АДФ подбирали в каждом эксперименте так, чтобы агрегация была обратимой, и максимум приходился на 2 мин после добавления АДФ, не превышая 50%. Светорассеяние суспензии тромбоцитов измеряли с помощью агрегометра, разработанного в Лаборатории Биоорганической Химии, Биологического Факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (Россия). Соединения 1, 2 и их известный аналог (соединение 5) добавляли до АДФ.The effect of derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide of the general formula I on the aggregation of human platelets was studied by the known Born turbidimetric method. For this, venous blood taken at 8 am from healthy donors was centrifuged at 450 g at room temperature in a plastic dish for 10 min using sodium citrate as an anticoagulant. The supernatant, i.e. platelet-rich plasma, was collected and centrifuged at 650 g for 30 minutes to obtain platelet-poor plasma. The platelet concentration was adjusted to 2.5 × 10 ⁸ cells / ml in platelet-rich plasma by diluting with platelet-poor plasma and the resulting suspension was poured into a 0.5 ml cuvette. Aggregation was induced by the addition of ADP to a concentration of 2-5 μM. The concentration of ADP was selected in each experiment so that the aggregation was reversible, and the maximum was 2 min after the addition of ADP, not exceeding 50%. The light scattering of platelet suspension was measured using an aggregometer developed at the Laboratory of Bioorganic Chemistry, Faculty of Biology, Moscow State University M.V. Lomonosov (Russia). Compounds 1, 2 and their known analogue (compound 5) were added before ADP.

Соединения 1 и 2 ингибировали агрегацию тромбоцитов, как показано на фиг. 3. Соответствующие значения концентраций, при которых достигается полумаксимальное ингибирование (IC₅₀), составляли 0,43 и 0,49 мкМ соответственно. Максимальное ингибирование на 100% наблюдалось при концентрации обоих соединений, равной 10 мкМ. Известный аналог (соединение 5) в вышеописанных условиях имел значение IC₂₀ = 10 мкМ. Согласно опубликованным данным, в модели агрегации тромбоцитов, вызванной под действием коллагена, значение IC₅₀ для соединения 5 составляло 1,5 мкМ.Compounds 1 and 2 inhibited platelet aggregation, as shown in FIG. 3. The corresponding concentration values at which half-maximal inhibition is achieved (IC ₅₀ ) were 0.43 and 0.49 μM, respectively. 100% maximum inhibition was observed at a concentration of both compounds equal to 10 μM. The known analogue (compound 5) under the above conditions had an IC ₂₀ value of 10 μM. According to published data, in the model of platelet aggregation induced by collagen, the IC ₅₀ for compound 5 was 1.5 μM.

Пример 11. Дезагрегация агрегированных тромбоцитов под действием производных 1,2,5-оксадиазоло[3,4-d]пиридазин-5,6- диоксида общей формулы I. Example 11. Disaggregation of aggregated platelets by the action of derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide of the general formula I.

Влияние производных 1,2,5- оксадиазоло[3,4-d]пиридазин-5,6-диоксида общей формулы I на дезагрегацию агрегированных тромбоцитов изучали в условиях, описанных в примере 10, за исключением того, что указанные соединения добавляли после АДФ на максимуме обратимой агрегации. The effect of derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide of general formula I on the disaggregation of aggregated platelets was studied under the conditions described in example 10, except that these compounds were added after ADP on maximum reversible aggregation.

Соединения 1 и 2 вызывали дезагрегацию агрегированных тромбоцитов, как показано на фиг. 4. Соответствующие значения концентраций, при которых достигается полумаксимальная дезагрегация, составляли 1,4 и 1,2 мкМ, и максимальная (полная) дезагрегация наблюдалась при концентрации обоих соединений, равной 10 мкМ. Аналогичный эффект известного аналога (соединения 5) не исследован. Compounds 1 and 2 caused disaggregation of aggregated platelets, as shown in FIG. 4. The corresponding concentrations at which half-maximum disaggregation is achieved were 1.4 and 1.2 μM, and the maximum (complete) disaggregation was observed at a concentration of both compounds of 10 μM. A similar effect of the known analogue (compound 5) has not been investigated.

Пример 12. Определение острой токсичности производных 1,2,5-оксадиазоло[3,4-d]пиридазин-5,6-диоксида общей формулы I. Example 12. Determination of acute toxicity of derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide of the general formula I.

Острую токсичность определяли известным способом по ЛД₅₀ с использованием беспородных мышей обоего пола средней массой 21 г при комнатной температуре; стандартное питание и воду давали ad libitum в течение всего эксперимента; подвижность животных не ограничивали. Растворы соединений в ДМСО вводили с помощью стерильного шприца внутрибрюшинно. После инъекции за животными вели наблюдение в течение 48 ч; по истечении этого времени за мышами наблюдали дополнительно в течение 72 ч (ни одно из животных не погибло в течение дополнительного промежутка времени).Acute toxicity was determined in a known manner by LD ₅₀ using outbred mice of both sexes with an average weight of 21 g at room temperature; standard food and water were given ad libitum throughout the experiment; the mobility of animals was not limited. Solutions of the compounds in DMSO were injected intraperitoneally with a sterile syringe. After injection, animals were monitored for 48 hours; after this time, the mice were observed for an additional 72 hours (none of the animals died during an additional period of time).

Данные указывают на то, что ЛД₅₀ для соединения 1 составляет 100 мг/кг, для соединения 2 - от 200 до 250 мг/кг. Острая токсичность известного аналога (соединения 5) не изучена. Для известного фармпрепарата - тринитроглицерина - значение ЛД₅₀ при внутрибрюшинном введении мышам обоего пола составляла 104-110 мг/кг [23]. Один из наиболее активных вазодилятаторов в ряду фуроксанов - 1,2,5-оксадиазол-3,4-динитрил-2-оксид(дицианофуроксан) [5] в вышеуказанных условиях имел ЛД₅₀ < 50 мг/кг. Сравнение физиологической активности и токсичности соединений 1 и 2 показывает, что терапевтические концентрации этих соединений значительно ниже, чем ЛД₅₀.The data indicate that the LD ₅₀ for compound 1 is 100 mg / kg, for compound 2 is from 200 to 250 mg / kg. The acute toxicity of the known analogue (compound 5) has not been studied. For a well-known pharmaceutical product, trinitroglycerin, the LD ₅₀ value upon intraperitoneal administration to mice of both sexes was 104–110 mg / kg [23]. One of the most active vasodilators in the furoxane series - 1,2,5-oxadiazole-3,4-dinitrile-2-oxide (dicyanofuroxan) [5] under the above conditions had an LD of ₅₀ <50 mg / kg. A comparison of the physiological activity and toxicity of compounds 1 and 2 shows that therapeutic concentrations of these compounds are significantly lower than LD ₅₀ .

Пример 13. Растворимость производных 1,2,5-оксадиазоло[3,4-d]пиридазин-5,6-диоксида общей формулы I и стабильность водных растворов и растворов, приготовленных с использованием различных органических растворителей. Example 13. The solubility of derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide of General formula I and the stability of aqueous solutions and solutions prepared using various organic solvents.

Растворимость производных 1,2,5-оксадиазоло[3,4-d]пиридазин-5,6- диоксида общей формулы I и известного аналога (соединения 5) определяли путем внесения аликвоты концентрированного 50 мМ раствора в смешивающемся с водой органическом растворителе (ДМСО, диметилформамиде, диоксане, ацетоне, метаноле) в воду до той конечной концентрации, при которой происходило образование нерастворившихся частиц и хлопьев. The solubility of derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazin-5,6-dioxide of the general formula I and the known analogue (compound 5) was determined by adding an aliquot of a concentrated 50 mM solution in a water-miscible organic solvent (DMSO, dimethylformamide, dioxane, acetone, methanol) in water to the final concentration at which the formation of insoluble particles and flakes occurred.

Установлено, что в указанных условиях растворимость в воде соединения 1 составляет 250 мкмоль/л, соединения 2 - 1000 мкмоль/л, известного аналога (соединения 5) - 50 мкмоль/л. It was found that under the indicated conditions, the solubility in water of compound 1 is 250 μmol / L, of compound 2 - 1000 μmol / L, of the known analogue (compound 5) - 50 μmol / L.

Стабильность в растворах органических растворителей изучалась на примере 50 мМ раствора соединения 1 в ДМСО и 0,25 мМ раствора в воде, содержащей 0,5% ДМСО. Снижение концентрации соединения оценивали с помощью спектроскопии, используя величины молярного коэффициента поглощения при 353 нм (ε = 5 320 М^-1·см^-1) в воде.Stability in solutions of organic solvents was studied using an example of a 50 mM solution of compound 1 in DMSO and a 0.25 mM solution in water containing 0.5% DMSO. The decrease in the concentration of the compound was evaluated using spectroscopy using the values of the molar absorption coefficient at 353 nm (ε = 5,320 M ^-1 · cm ^-1 ) in water.

Раствор соединения 1 в ДМСО был стабилен в течение 1 месяца при комнатной температуре при хранении в защищенном от света месте и в замороженном виде при -20^oC до 6 месяцев. Водный раствор соединения 1 достаточно стабилен при комнатной температуре при хранении в защищенном от света месте при нейтральных или слабокислых значениях pH (τ 1/2 > 4,2 мес). Водный раствор соединения 1 нестабилен при слабощелочных и щелочных значениях pH (pH > 9), на ярком свету и в присутствии тиолов. В сухом виде соединение 1 устойчиво при комнатной температуре при хранении в защищенном от света месте в течение как минимум двух лет.A solution of compound 1 in DMSO was stable for 1 month at room temperature when stored in a dark place and frozen at -20 ^° C for up to 6 months. The aqueous solution of compound 1 is quite stable at room temperature when stored in a dark place at neutral or slightly acidic pH values (τ 1/2> 4.2 months). An aqueous solution of compound 1 is unstable at weakly alkaline and alkaline pH values (pH> 9), in bright light and in the presence of thiols. When dry, compound 1 is stable at room temperature when stored in a dark place for at least two years.

Пример 14. Раствор соединений 1-4 для сублингвальных инъекций. Example 14. A solution of compounds 1-4 for sublingual injection.

Компоненты - мас.%
Активный компонент - 1
Этиловый спирт - 99
Пример 15. Таблетки соединений 1-4 для приема внутрь.Components - wt.%
Active component - 1
Ethyl Alcohol - 99
Example 15. Tablets of compounds 1-4 for oral administration.

Компоненты - мг/1 таблетку
Активный компонент - 0,5
Лактоза - 50
Микрокристаллическая целлюлоза - 50
Стеарат магния - 0,5
Поливинилпирролидон - 10
Общая масса - 111
Пример 16. Раствор соединений 1-4 в рафинированном подсолнечном масле в желатиновых капсулах по 0,001 и 0,0005 г.Components - mg / 1 tablet
Active ingredient 0.5
Lactose - 50
Microcrystalline Cellulose - 50
Magnesium Stearate - 0.5
Polyvinylpyrrolidone - 10
Total weight - 111
Example 16. A solution of compounds 1-4 in refined sunflower oil in gelatin capsules of 0.001 and 0.0005 g.

Компоненты - мас.%/капсулу
Активный компонент - 1
Рафинированное подсолнечное масло - 99
Из вышеприведенных примеров 1-5 следует вывод о том, что соединения 1 и 2 являются значительно более эффективными донорами оксида азота, чем известный аналог (соединение 5). Кроме того, соединение 1 генерирует биологически активные формы оксида азота, включая восстановленную форму NO и нитрозотиолы, а так же, как и соединение 2, является модификатором SH-групп и атома железа гемовой группы белков. Из примеров 6 и 7 следует, что производные 1,2,5-оксадиазоло[3,4-d]пиридазин-5,6-диоксида общей формулы I гем-зависимо активируют рГЦ значительно эффективнее, чем их известный аналог (соединение 5), и повышают уровень цГМФ в тромбоцитах. Из примеров 8 и 9 следует вывод о том, что производные 1,2,5-оксадиазоло[3,4-d]пиридазин-5,6-диоксида общей формулы I обладают выраженным сосудорасширяющим и гипотензивным действием, причем соединение 1 in vitro превосходит аналогичное действие известного аналога (соединения 5) и известного фармпрепарата - тринитроглицерина (ср. IC₅₀ = 3,5 нМ для соединения 1, 1500 нМ для соединения 5 и 11,3 нМ для тринитроглицерина). Сосудорасширяющий эффект соединения 2 в вышеуказанных условиях был сравним с аналогичным эффектом соединения 5 (ср. IC₅₀ = 2,3 и 1,5 мкМ соответственно).Components - wt.% / Capsule
Active component - 1
Refined Sunflower Oil - 99
From the above examples 1-5, it follows that compounds 1 and 2 are significantly more effective nitric oxide donors than the known analogue (compound 5). In addition, compound 1 generates biologically active forms of nitric oxide, including the reduced form of NO and nitrosothiols, and, as well as compound 2, it is a modifier of SH groups and the iron atom of the heme group of proteins. From examples 6 and 7 it follows that the derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide of the general formula I heme-dependently activate rHCs much more efficiently than their known analogue (compound 5), and increase the level of cGMP in platelets. From examples 8 and 9 it follows that the derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide of the general formula I have a pronounced vasodilating and hypotensive effect, and compound 1 in vitro is superior to the similar the action of the known analogue (compound 5) and the known pharmaceutical preparation trinitroglycerin (cf. IC ₅₀ = 3.5 nM for compound 1, 1500 nM for compound 5 and 11.3 nM for trinitroglycerin). The vasodilating effect of compound 2 under the above conditions was comparable to the similar effect of compound 5 (cf. IC ₅₀ = 2.3 and 1.5 μM, respectively).

Из примеров 10 и 11 следует, что производные 1,2,5-оксадиазоло[3,4-d] пиридазин-5,6-диоксида общей формулы I превосходят по антиагрегантной активности аналогичный эффект соединения 5 (ср. IC₅₀ = 0,43, 0,49 и > 10 мкМ соответственно), а также обладают дезагрегантным действием на агрегированные тромбоциты.From examples 10 and 11 it follows that the derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide of the general formula I are superior in antiplatelet activity to the analogous effect of compound 5 (cf. IC ₅₀ = 0.43 , 0.49 and> 10 μM, respectively), and also have a disaggregant effect on aggregated platelets.

Пример 12 показывает, что острая токсичность соединений общей формулы I сравнима или ниже токсичности известного фармпрепарата - тринитроглицерина. Example 12 shows that the acute toxicity of the compounds of the general formula I is comparable to or lower than the toxicity of the known pharmaceutical preparation trinitroglycerin.

Соединения общей формулы I получают из доступных исходных продуктов - ацетона и ацетофенона. Compounds of general formula I are prepared from available starting materials acetone and acetophenone.

Таким образом, применение производных 1,2,5-оксадиазоло[3,4-d]пиридазин- -5,6-диоксида общей формулы I может расширить спектр эффективных активаторов рГЦ и лекарственных средств для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы. Thus, the use of derivatives of 1,2,5-oxadiazolo [3,4-d] pyridazine-5,6-dioxide of the general formula I can expand the range of effective activators of RHC and drugs for the treatment of diseases of the cardiovascular system.

Claims

1. The use of derivatives of formula I

where R = CH ₃ or C ₆ H ₅ and n = 0 or 1,
as vasodilator, hypotensive, antispasmodic, antianginal agents and platelet aggregation inhibitors.

2. The use of compounds according to claim 1 for the prevention and relief of angina attacks and the treatment of acute myocardial infarction.

3. A pharmaceutical composition having a vasodilating, antihypertensive, antispasmodic, antianginal and antiplatelet inhibiting action of the platelet containing the active component and additives, characterized in that derivatives of the formula I are used as the active component, where R = CH ₃ or C ₆ H ₅ and n = 0 or 1.