RU2156302C1 - Method of producing 1,2-dehydroderivatives of 4-delta-3-keto-steroids - Google Patents
Method of producing 1,2-dehydroderivatives of 4-delta-3-keto-steroids Download PDFInfo
- Publication number
- RU2156302C1 RU2156302C1 RU98123648/13A RU98123648A RU2156302C1 RU 2156302 C1 RU2156302 C1 RU 2156302C1 RU 98123648/13 A RU98123648/13 A RU 98123648/13A RU 98123648 A RU98123648 A RU 98123648A RU 2156302 C1 RU2156302 C1 RU 2156302C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hydrocortisone
- substrate
- transformation
- prednisolone
- cells
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения дегидропроизводных стероидных соединений с помощью клеток микроорганизмов, и может быть использовано в микробиологической и фармацевтической промышленностях. The invention relates to biotechnology, and in particular to methods for producing dehydroderivative steroid compounds using microorganism cells, and can be used in the microbiological and pharmaceutical industries.
Дегидропроизводные кортикостероидные соединения, например преднизон, преднизолон, 6α-метилпреднизолон, обладают более высокой физиологической активностью по сравнению с исходными субстратами, такими как кортизон, гидрокортизон, 6α-метилгидрокортизон, и широко используются в качестве эффективных лекарственных препаратов при раковых заболеваниях, заболеваниях ревматического характера, бронхиальной астмы, аллергических реакциях. Другие дегидропроизводные, например андроста-1,4-диен-3,17-дион (АДД), 1,2-дегидрокортексолон могут быть использованы в качестве полупродуктов для синтеза других стероидных соединений-эстрогенов и кортикостероидов ряда прегнана [1, 2]. Dehydroderivatives of corticosteroids, for example, prednisone, prednisolone, 6α-methylprednisolone, have a higher physiological activity compared to the starting substrates, such as cortisone, hydrocortisone, 6α-methylhydrocortisone, and are widely used as effective drugs for cancer, rheumatic diseases, bronchial asthma, allergic reactions. Other dehydro derivatives, for example, androsta-1,4-diene-3,17-dione (ADD), 1,2-dehydrocortexolone can be used as intermediates for the synthesis of other steroid compounds estrogen and corticosteroids of the pregnane series [1, 2].
В качестве биокатализаторов процесса 1,2-дегидрирования используют культуры родов: Arthrobacter, Corynebacterium, Bacillus, Nocardia, Streptomyces и др. [3]. As biocatalysts of the 1,2-dehydrogenation process, cultures of childbirth are used: Arthrobacter, Corynebacterium, Bacillus, Nocardia, Streptomyces, etc. [3].
Основной проблемой промышленного получения 1,2-дегидрированных кортикостероидов путем микробиологической трансформации является малая эффективность процесса, обусловленная необходимостью использования субстрата в низких концентрациях для достижения его полного превращения в конечный продукт. The main problem of the industrial production of 1,2-dehydrogenated corticosteroids by microbiological transformation is the low efficiency of the process, due to the need to use the substrate in low concentrations to achieve its complete conversion to the final product.
Известен способ получения преднизолона в непрерывном режиме при вводе растворенного субстрата в реактор с иммобилизованными клетками сверху или снизу [4, 5]. A known method of producing prednisone in continuous mode by introducing a dissolved substrate into a reactor with immobilized cells from above or below [4, 5].
При непрерывном потоке (от 5 до 300 мл/мин) растворенного гидрокортизона (0,4 г/л) через реактор с иммобилизованными в полиакриламидный гель (ПААГ) клетками Arthrobacter globiformis 193 из-за недостаточной аэрации степень превращения субстрата не превышает 50-60%. With a continuous flow (from 5 to 300 ml / min) of dissolved hydrocortisone (0.4 g / l) through a reactor with Arthrobacter globiformis 193 cells immobilized in a polyacrylamide gel (PAGE) due to insufficient aeration, the degree of substrate conversion does not exceed 50-60% .
При проведении трансформации с восходящим потоком субстрата (до 20 мл/ч) и при продуве воздуха, т.е. при имитации условий периодического культивирования, отмечена полная конверсия растворенного гидрокортизона в преднизолон. During the transformation with an upward flow of the substrate (up to 20 ml / h) and with air blowing, i.e. when simulating the conditions of periodic cultivation, a complete conversion of dissolved hydrocortisone to prednisolone was noted.
Недостатком данного способа получения преднизолона является его малая производительность, обусловленная низкой концентрацией растворенного субстрата и низкими скоростями его протока. Осуществление этого способа требует специального технологического оборудования, осложняет масштабирование. Совокупность указанных признаков фактически исключает практическую реализацию данного способа. The disadvantage of this method of producing prednisolone is its low productivity, due to the low concentration of the dissolved substrate and low flow rates. The implementation of this method requires special technological equipment, complicates scaling. The combination of these features virtually eliminates the practical implementation of this method.
В литературе описан способ получения преднизолона при трансформации растворенного гидрокортизона свободными и иммобилизованными клетками Arthrobacter globiformis 193 в периодических условиях культивирования [6]. В соответствии с этим способом достигается полное превращение растворенного (0,4 г/л) гидрокортизона в преднизолон. Основным недостатком данного способа является малая производительность процесса из-за невозможности полного превращения субстрата при более высоких исходных концентрациях субстрата. В связи с этим способ не имеет практической значимости. The literature describes a method for producing prednisolone by transforming dissolved hydrocortisone with free and immobilized Arthrobacter globiformis 193 cells under periodic cultivation conditions [6]. In accordance with this method, complete conversion of dissolved (0.4 g / l) hydrocortisone to prednisolone is achieved. The main disadvantage of this method is the low productivity of the process due to the impossibility of complete conversion of the substrate at higher initial concentrations of the substrate. In this regard, the method does not have practical significance.
С целью повышения эффективности процесса получения преднизолона субстрат вносят в реакционную среду в виде кристаллов или микрокристаллов. В этом случае в процессе микробиологической трансформации субстрат и образующийся продукт находятся фактически в твердой фазе. Процесс микробиологической трансформации протекает по схеме, предложенной Кондо и Масуо [7]. In order to increase the efficiency of the prednisolone preparation process, the substrate is introduced into the reaction medium in the form of crystals or microcrystals. In this case, during the microbiological transformation, the substrate and the resulting product are actually in the solid phase. The process of microbiological transformation proceeds according to the scheme proposed by Kondo and Masuo [7].
Гидрокортизон (кристаллы) ⇐⇒ Гидрокортизон (раствор) ⇒ Преднизолон (раствор) ⇐⇒ Преднизолон (кристаллы)
При исходной нагрузке субстрата 1-50 г/л содержание остаточного гидрокортизона в конечном продукте возрастает от 2 до 20%. Необходима очистка получаемого технического преднизолона от остаточного гидрокортизона, содержание которого наряду с другими побочными продуктами по данным Российской Фармакопеи 42-2780-91 не должно превышать 3%.Hydrocortisone (crystals) ⇐⇒ Hydrocortisone (solution) ⇒ Prednisolone (solution) ⇐⇒ Prednisolone (crystals)
When the initial load of the substrate is 1-50 g / l, the content of residual hydrocortisone in the final product increases from 2 to 20%. It is necessary to purify the resulting technical prednisone from residual hydrocortisone, the content of which, along with other by-products, according to the Russian Pharmacopoeia 42-2780-91, should not exceed 3%.
Известен способ получения преднизолона в непрерывных условиях, заключающийся в непрерывной подаче суспензии микрокристаллического гидрокортизона (0,3-1,0 г/л) в фосфатном буфере в реактор, в котором происходит турбулентное перемешивание иммобилизованных в полиакриламидный гель клеток Arthrobacter globiformis 193, субстрата и образующегося преднизолона [8]. Получаемый продукт на выходе из реактора, содержащий 95% преднизолона и 5% гидрокортизона, охлаждают в холодильной камере с целью осаждения продукта в виде кристаллов, а жидкую фазу непрерывно возвращают в емкость с суспендированным гидрокортизоном. A known method for producing prednisolone under continuous conditions, which consists in continuously feeding a suspension of microcrystalline hydrocortisone (0.3-1.0 g / l) in a phosphate buffer into a reactor in which turbulent mixing of Arthrobacter globiformis 193 cells immobilized in a polyacrylamide gel, the substrate and the resulting prednisone [8]. The resulting product at the outlet of the reactor, containing 95% prednisolone and 5% hydrocortisone, is cooled in a refrigerator to precipitate the product in the form of crystals, and the liquid phase is continuously returned to the container with suspended hydrocortisone.
Основной недостаток данного способа заключается в проскоке из реактора субстрата и десорбированных из носителя клеток микроорганизмов и попадание их в холодильную камеру, где во влажной массе накапливающихся кристаллов продукта в отсутствие аэрации активируется 1,2-гидрогеназная активность клеток, определяющая превращение преднизолона в гидрокортизон. В результате суммарное содержание остаточного гидрокортизона в осадке кристаллов продукта увеличивается на 7-10% и достигает 12-15%. Высокое содержание остаточного гидрокортизона в продукте, определяющее значительные (до 30%) потери преднизолона в процессе его очистки, а также низкая концентрация субстрата, характеризуют данный способ получения преднизолона как малоэффективный, не имеющий практической значимости. The main disadvantage of this method is the breakthrough of the substrate from the reactor and microorganisms desorbed from the carrier and their entry into the refrigerator, where in the wet mass of the accumulating product crystals in the absence of aeration, the 1,2-hydrogenase activity of the cells is activated, which determines the conversion of prednisolone to hydrocortisone. As a result, the total content of residual hydrocortisone in the precipitate of product crystals increases by 7-10% and reaches 12-15%. The high content of residual hydrocortisone in the product, which determines significant (up to 30%) losses of prednisolone during its purification, as well as a low substrate concentration, characterize this method of producing prednisolone as ineffective, not having practical significance.
Указанный основной недостаток рассмотренного способа получения преднизолона устраняется при другом способе получения преднизолона, также с использованием иммобилизованных в ПААГ клеток A. globiformis 193 [9]. В соответствии с этим способом трансформацию гидрокортизона в концентрации от 0,6 до 1,2 г/л осуществляют в реакторе периодического действия. После завершения процесса степень превращения субстрата в продукт составляет 97-98%. Получаемую суспензию или раствор продукта при выходе из реактора кратковременно прогревают до 80-95oC с целью инактивации ферментативной активности клеток, десорбированных из носителя, и подают в холодильную камеру для образования и накопления кристаллов продукта.The indicated main drawback of the considered method for producing prednisolone is eliminated with another method for producing prednisolone, also using A. globiformis 193 cells immobilized in PAGE [9]. In accordance with this method, the transformation of hydrocortisone in a concentration of from 0.6 to 1.2 g / l is carried out in a batch reactor. After completion of the process, the degree of conversion of the substrate to the product is 97-98%. The resulting suspension or solution of the product at the exit from the reactor is briefly heated to 80-95 o C in order to inactivate the enzymatic activity of cells desorbed from the carrier, and served in a refrigerator to form and accumulate product crystals.
Способ позволяет осуществлять все операции, начиная со слива суспензии продукта, в непрерывном режиме, совмещая их во времени. Получаемый продукт без дополнительной очистки по содержанию остаточного гидрокортизона соответствует требованиям Фармакопеи. The method allows for all operations, starting with the discharge of the suspension of the product, in a continuous mode, combining them in time. The resulting product without additional purification according to the content of residual hydrocortisone meets the requirements of the Pharmacopoeia.
Недостатком данного способа является малая эффективность, обусловленная необходимостью использования субстрата в концентрации, не превышающей 1,2 г/л. При увеличении нагрузки субстрата получаемый продукт по содержанию остаточного гидрокортизона не отвечает требованиям Фармакопеи. The disadvantage of this method is its low efficiency, due to the need to use a substrate in a concentration not exceeding 1.2 g / L. With an increase in substrate load, the resulting product does not meet the requirements of the Pharmacopoeia in terms of the residual hydrocortisone content.
Известен способ получения преднизолона с помощью иммобилизованных в ПААГ клеток Arthrobacter globiformis 193 при нагрузке микрокристаллического гидрокортизона 5,0 г/л [10]. Способ осуществляют в реакторе промышленного типа специальной конструкции с коэффициентом заполнения 0,8. При соотношении клетки (сухой вес)/субстрат (вес/вес) = 5:1 и при длительности процесса 7-8 ч выход преднизолона на стадии микробиологической трансформации составляет 88-90% и при продолжении процесса не увеличивается, содержание остаточного гидрокортизона 10-12%. Выход преднизолона, соответствующего по качеству требованиям Фармакопеи, не превышает 56%. A known method for producing prednisolone using Arthrobacter globiformis 193 cells immobilized in PAG with a load of microcrystalline hydrocortisone of 5.0 g / l [10]. The method is carried out in a specially designed industrial type reactor with a fill factor of 0.8. With a ratio of cells (dry weight) / substrate (weight / weight) = 5: 1 and with a process duration of 7-8 hours, the yield of prednisolone at the stage of microbiological transformation is 88-90% and does not increase when the process continues, the residual hydrocortisone content is 10-12 % The yield of prednisone corresponding in quality to the requirements of the Pharmacopoeia does not exceed 56%.
Способ позволяет осуществлять превращение гидрокортизона при его повышенной нагрузке и эффективном использовании технологического оборудования. Специальная конструкция реактора, обеспечивающая интенсивный массообмен, позволяет снизить на 3-5% содержание остаточного гидрокортизона в получаемом продукте. The method allows the conversion of hydrocortisone with its increased load and efficient use of technological equipment. The special design of the reactor, providing intensive mass transfer, allows to reduce the content of residual hydrocortisone in the resulting product by 3-5%.
Основным недостатком данного способа является высокое содержание остаточного гидрокортизона, что определяет значительные потери преднизолона на стадии химической очистки. The main disadvantage of this method is the high content of residual hydrocortisone, which determines the significant loss of prednisolone at the stage of chemical purification.
Описан способ получения преднизолона в периодических условиях с помощью клеток Arthrobacter simplex АТСС 6946 [11]. В соответствии с этим способом содержание в среде субстрата - микронизированного гидрокортизона составляет 20,0 г/л. Для достижения степени превращения 95% используют искусственный акцептор электронов - менадион (0,25-0,3 мг/г гидрокортизона) и поверхностно-активное вещество - сахарозопальмитат-стеарат (0,1 г/л). Процесс трансформации проводят в ферментере с рабочим объемом 100 л в водной среде в присутствии глюкозы (1,25 г/л) в течение 16-18 ч. В результате из 2,0 кг гидрокортизона получают 1,415 кг технического преднизолона (70,75% от исходного количества субстрата) с 95% содержанием продукта. Остаточный гидрокортизон в продукте составляет 5%. A method for producing prednisolone under periodic conditions using Arthrobacter simplex ATCC 6946 cells has been described [11]. In accordance with this method, the content in the medium of the substrate - micronized hydrocortisone is 20.0 g / L. To achieve a conversion level of 95%, an artificial electron acceptor - menadione (0.25-0.3 mg / g hydrocortisone) and a surfactant - sucrose palmitate stearate (0.1 g / l) are used. The transformation process is carried out in a fermenter with a working volume of 100 l in an aqueous medium in the presence of glucose (1.25 g / l) for 16-18 hours. As a result, from 1.4 kg of hydrocortisone get 1.415 kg of technical prednisolone (70.75% of initial amount of substrate) with 95% product content. The residual hydrocortisone in the product is 5%.
Получаемый продукт требует дальнейшей очистки от остаточного гидрокортизона, что повлечет дальнейшее снижение его выхода. Для осуществления данного способа необходимо использование глюкозы, ПАВ, искусственного акцептора электронов, что снижает экономическую эффективность технологии. Применение детергентов приводит к интенсивному пенообразованию, что обусловливает необходимость специальных методов для его устранения или предотвращения. The resulting product requires further purification from residual hydrocortisone, which will entail a further decrease in its yield. To implement this method, it is necessary to use glucose, a surfactant, an artificial electron acceptor, which reduces the economic efficiency of the technology. The use of detergents leads to intense foaming, which necessitates special methods to eliminate or prevent it.
В литературе представлены и обсуждаются несколько точек зрения относительно причин неполного превращения гидрокортизона в преднизолон:
1) стерические ограничения доступа субстрата в клетки микроорганизмов, создаваемые кристаллами образующегося продукта-преднизолона [1]; 2) сокристаллизация гидрокортизона с преднизолоном и образование смешанных кристаллов [12] ; 3) восстановление преднизолона, приводящая к образованию гидрокортизона из преднизолона [13].Several points of view regarding the causes of the incomplete conversion of hydrocortisone to prednisolone are presented and discussed in the literature:
1) steric restrictions on the access of the substrate to the cells of microorganisms created by crystals of the resulting prednisolone product [1]; 2) co-crystallization of hydrocortisone with prednisolone and the formation of mixed crystals [12]; 3) reduction of prednisolone, leading to the formation of hydrocortisone from prednisolone [13].
С целью устранения возможной сокристаллизации субстрата и продукта используют органические растворители, смешивающиеся и несмешивающиеся с водой [14]. In order to eliminate the possible co-crystallization of the substrate and the product, organic solvents miscible and immiscible with water are used [14].
Токсичность органических растворителей (этанола, метанола, диметилсульфоксида, диметилформамида, наиболее часто используемых для растворения стероидных субстратов) по отношению к микроорганизмам и их ингибирующее воздействие на ферментативую активность ограничивают их применение в процессах микробиологической трансформации областью низких концентраций субстрата. Такой подход в настоящее время не имеет практической значимости. The toxicity of organic solvents (ethanol, methanol, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, most often used to dissolve steroid substrates) with respect to microorganisms and their inhibitory effect on enzymatic activity limit their use in microbiological transformation processes to low substrate concentrations. This approach is currently of no practical importance.
В двухфазных системах на основе несмешивающихся с водой органических растворителей при распределении микроорганизмов в водной фазе, а гидрофобных субстратов в органической фазе возможно снижение токсичного воздействия органических растворителей, с одной стороны, и, с другой стороны, увеличение растворимости субстрата и продукта [15]. In two-phase systems based on water-immiscible organic solvents during the distribution of microorganisms in the aqueous phase and hydrophobic substrates in the organic phase, it is possible to reduce the toxic effects of organic solvents, on the one hand, and, on the other hand, increase the solubility of the substrate and product [15].
Известен способ получения 1,2-дегидропроизводных ряда прегнана в двухфазной системе, представленной 50% (об/об) фосфатным буфером, pH 7,0 и 50% (об/об) n-октанолом, или хлороформом, или толуолом, используя клетки Arthrobacter simplex АТСС 6946 [16]. При концентрации 21-ацетата-6α-метигидрокортизона 4,5 г/л выход 1,2-дегидрированного продукта составил 90%. Добавление в систему ПАВ ускоряло скорость реакции, но не приводило к увеличению выхода продукта. A known method of producing 1,2-dehydro derivatives of a series of pregnane in a two-phase system represented by 50% (v / v) phosphate buffer, pH 7.0 and 50% (v / v) n-octanol, or chloroform, or toluene using Arthrobacter cells simplex ATCC 6946 [16]. At a concentration of 21-acetate-6α-methyhydrocortisone 4.5 g / l, the yield of 1,2-dehydrogenated product was 90%. Adding surfactants to the system accelerated the reaction rate, but did not lead to an increase in the yield of the product.
Недостатками рассматриваемого способа получения 1,2-дегидрированного производного гидрокортизона является высокое содержание остаточного субстрата, а также необходимость использования больших объемов органических растворителей, что повышает степень экологической опасности, пожароопасности и производства. Указанные недостатки, а также необходимость применения специального оборудования, ограничивают возможность масштабирования процесса и его промышленную реализацию. The disadvantages of this method of obtaining a 1,2-dehydrogenated hydrocortisone derivative is the high content of residual substrate, as well as the need to use large volumes of organic solvents, which increases the degree of environmental hazard, fire hazard and production. These shortcomings, as well as the need to use special equipment, limit the ability to scale the process and its industrial implementation.
Известен способ получения 1,2-дегидрированного 21 ацетата 16 метил - вещества "S" Рейхштейна в микроэмульсионной двухфазной системе с использованием клеток Arthrobacter simplex АТСС 6946 [17]. Микроэмульсионная система содержит органическую фазу, представленную производными бензола или фосфолипидами (75-95%, об/об) со стероидом (1-60 г/л) и водную фазу (5-25%, об/об) с клетками микроорганизмов (5-30 г/л). Процесс осуществляют в присутствии неионогенных ПАВ и акцептора электронов - менадиона. В указанных условиях за 14-16 ч достигают 98% превращения субстрата. A known method of producing 1,2-dehydrogenated 21 acetate 16 methyl - substance "Reichstein" S in a microemulsion two-phase system using Arthrobacter simplex ATCC 6946 cells [17]. The microemulsion system contains an organic phase represented by benzene derivatives or phospholipids (75-95%, v / v) with a steroid (1-60 g / l) and an aqueous phase (5-25%, v / v) with microorganism cells (5- 30 g / l). The process is carried out in the presence of nonionic surfactants and an electron acceptor - menadione. Under these conditions, in 14-16 hours, 98% conversion of the substrate is achieved.
К недостаткам рассматриваемого способа следует отнести использование органических растворителей и, следовательно, пожароопасность производства, многокомпонентность системы и, следовательно, экономическую нецелесообразность, технологические трудности осуществления метода, необходимость использования специального оборудования. The disadvantages of this method include the use of organic solvents and, therefore, the fire hazard of production, the multicomponent system and, therefore, economic inappropriateness, technological difficulties in implementing the method, the need to use special equipment.
Альтернативным подходом снижения сокристаллизации субстрата с продуктом и уменьшения остаточного субстрата в продукте является использование синтетических полимеров и сополимеров, например полидиметилсилоксана с полиэтиленгликолем [18]. Синтетические полимеры, благодаря способности их гидрофобных циклов образовывать комплексы с гидрокортизоном и другими кортикостероидами, являются солюбилизирующими агентами и способствуют повышению эффективности процессов трансформации. An alternative approach to reducing the co-crystallization of the substrate with the product and reducing the residual substrate in the product is the use of synthetic polymers and copolymers, for example polydimethylsiloxane with polyethylene glycol [18]. Synthetic polymers, due to the ability of their hydrophobic cycles to form complexes with hydrocortisone and other corticosteroids, are solubilizing agents and contribute to increasing the efficiency of transformation processes.
Известен способ получения преднизолона, 6α-метилпреднизолона с помощью клеток Arthrobacter globiformis 193 в присутствии синтетических полимеров, таких как гомо- и сополимеры N-винилкапролактама [19]. В присутствии 2%-ного поливинилкапролактама (ПВК) с мол.м. 900 тыс. трансформацию гидрокортизона в концентрации 7,0 г/л осуществляют за 6-8 ч. Выход преднизолона составляет 98%. Содержание остаточного гидрокортизона не превышает 1%. Превращение 6α-метилгидрокортизона в концентрации 5,0 г/л завершают за 24 часа. Содержание в культуральной жидкости 1,2-дегидрированного продукта по данным метода ТСХ составляет - 97%, нетрансформированного субстрата - 2%. При повышении концентрации ПВК до 5% выход продукта снижается до 96%. При использовании сополимера (1%) винилкапролактама (ВК) с виниловым спиртом (ВС) в процентном соотношении 72:28 степень превращения 6α-метилгидрокортизона в 6α-метилпреднизолон составляет 99%. Длительность процесса - 8 ч. 1,2-Дегидрирование 21 ацетата 6α-метилгидрокортизона (5,0 г/л) в присутствии ПВК (1%) протекает значительно более медленно и заканчивается за 140 ч. По данным ТСХ после завершения процесса в культуральной среде содержится 90% 6α-метилпреднизолона, 5% исходного субстрата и 2% 20β-оксипроизводного 6α-метилпреднизолона. A known method for producing prednisolone, 6α-methylprednisolone using Arthrobacter globiformis 193 cells in the presence of synthetic polymers such as homo- and copolymers of N-vinylcaprolactam [19]. In the presence of 2% polyvinylcaprolactam (PVC) with a mol.m. 900 thousand transformation of hydrocortisone in a concentration of 7.0 g / l is carried out for 6-8 hours. The yield of prednisolone is 98%. The content of residual hydrocortisone does not exceed 1%. The conversion of 6α-methylhydrocortisone at a concentration of 5.0 g / l is completed in 24 hours. The content of 1,2-dehydrogenated product in the culture fluid according to the TLC method is 97%, and the non-transformed substrate is 2%. With an increase in the concentration of PVC to 5%, the yield of the product decreases to 96%. When using a copolymer (1%) of vinylcaprolactam (VK) with vinyl alcohol (BC) in a percentage of 72:28, the degree of conversion of 6α-methylhydrocortisone to 6α-methylprednisolone is 99%. The duration of the process is 8 hours. 1,2-Dehydrogenation of 21 6α-methylhydrocortisone acetate (5.0 g / l) in the presence of PVC (1%) proceeds much more slowly and ends in 140 hours. According to TLC after completion of the process in the culture medium contains 90% of 6α-methylprednisolone, 5% of the starting substrate and 2% of the 20β-hydroxy derivative of 6α-methylprednisolone.
Среди недостатков рассматриваемого способа получения 1,2-дегидропроизводных 3-кетостероидов в присутствии гомо- и сополимеров N-поливинилкапролактама следует отметить недостаточно высокую концентрацию субстратов: гидрокортизона - до 7,0 г/л, 6α-метилпреднизолона - до 12,5 г/л, 21-ацетат-6α-метилгидрокортизона - до 5,0 г/л, что не позволяет значительно повысить производительность процесса. Технологичность метода ограничена высокой степенью пенообразования, а также снижением эффективности массообмена вследствие высокой вязкости среды в присутствии полимеров. Существенным недостатком данного способа является отсутствие в России промышленного производства синтетических полимеров. Among the disadvantages of the considered method for producing 1,2-dehydro derivatives of 3-ketosteroids in the presence of homo- and copolymers of N-polyvinylcaprolactam, an insufficiently high concentration of substrates should be noted: hydrocortisone - up to 7.0 g / l, 6α-methylprednisolone - up to 12.5 g / l , 21-acetate-6α-methylhydrocortisone - up to 5.0 g / l, which does not significantly increase the productivity of the process. The manufacturability of the method is limited by a high degree of foaming, as well as by a decrease in the efficiency of mass transfer due to the high viscosity of the medium in the presence of polymers. A significant disadvantage of this method is the lack of industrial production of synthetic polymers in Russia.
Известны подходы проведения процессов микробиологической трансформации стероидных соединений, основанные на использовании α,-β- и γ-циклодекстринов (ЦД) [20]. Указанные циклодестрины, представляющие собой циклические структуры, состоящие соответственно из 6, 7, 8 остатков глюкозы, способны образовывать комплексы включения с субстратами и продуктами. Образование комплексов может сопровождаться изменением свойств исходного соединения: химической стабильности, увеличением смачиваемости, снижением токсичности и др. Known approaches to the processes of microbiological transformation of steroid compounds based on the use of α, β and γ cyclodextrins (CD) [20]. These cyclodextrins, which are cyclic structures consisting of 6, 7, 8 glucose residues, respectively, are capable of forming inclusion complexes with substrates and products. The formation of complexes may be accompanied by a change in the properties of the starting compound: chemical stability, increase in wettability, decrease in toxicity, etc.
В литературе описан способ получения преднизолона, согласно которому трансформацию гидрокортизона (4,0 г/л) свободными отмытыми клетками Arthrobacter simplex АТСС 6946 осуществляют в ферментере с рабочим объемом 100 л в присутствии β-циклодекстрина (12,0 г/л) и искусственного акцептора электронов-менадиона (0,01 г/л) [21] . Субстрат вносят растворенным в метаноле (конечная концентрация - 4%), содержащем 0,4 г/л хлористого кальция. В указанных условиях достигается растворение субстрата и продукта, что исключает риск образования смешанных кристаллов. В результате из 400 г гидрокортизона получают 375 г преднизолона, содержащего остаточный гидрокортизон - 1,2%. Выход преднизолона составляет 93,75%. The literature describes a method for producing prednisone, according to which the transformation of hydrocortisone (4.0 g / l) with free washed Arthrobacter simplex ATCC 6946 cells is carried out in a fermenter with a working volume of 100 l in the presence of β-cyclodextrin (12.0 g / l) and an artificial acceptor Menadione electrons (0.01 g / L) [21]. The substrate is added dissolved in methanol (final concentration 4%) containing 0.4 g / l of calcium chloride. Under these conditions, dissolution of the substrate and product is achieved, which eliminates the risk of the formation of mixed crystals. As a result, from 400 g of hydrocortisone get 375 g of prednisone containing residual hydrocortisone - 1.2%. The yield of prednisolone is 93.75%.
Недостатком описываемого способа получения преднизолона является относительно низкая концентрация растворенного гидрокортизона, определяющая малую эффективность процесса. Использование менадиона и метанола в сочетании с низкими нагрузками субстрата в значительной степени снижает экономическую целесообразность и степень экологической безопасности. The disadvantage of the described method for producing prednisone is the relatively low concentration of dissolved hydrocortisone, which determines the low efficiency of the process. The use of menadione and methanol in combination with low substrate loads significantly reduces economic feasibility and the degree of environmental safety.
Описан способ получения преднизолона клетками Arthrobacter simplex АТСС 6946 в присутствии α-ЦД [21] α-ЦД в концентрации 20,0 г/л вносят в 20-кратно разбавленную культуральную жидкость с растущей культурой и добавляют гидрокортизон (2,0 г/л), растворенный в метаноле (конечная концентрация - 2%), содержащий 10% по весу хлористого кальция. Процесс проводят в течение 5 ч, в отсутствие альфа-ЦД - за 8 ч. Получают из 2 г гидрокортизона 1,92 г (96%) преднизолона, 8,0 мг/л (0,4%) гидрокортизона и 40 мг (2%) 20β-восстановленного преднизолона. A method for the preparation of prednisone by Arthrobacter simplex ATCC 6946 cells in the presence of α-CD [21] α-CD at a concentration of 20.0 g / l is introduced into a 20-fold diluted culture fluid with a growing culture and hydrocortisone (2.0 g / l) is described. dissolved in methanol (final concentration 2%) containing 10% by weight of calcium chloride. The process is carried out for 5 hours, in the absence of alpha-CD - for 8 hours. 1.92 g (96%) of prednisolone, 8.0 mg / l (0.4%) of hydrocortisone and 40 mg (2) are obtained from 2 g of hydrocortisone %) 20β-reduced prednisolone.
Практическая значимость способа в значительной степени ограничена использованием 20,0 г/л концентраций α-ЦД - одного из наиболее дорогостоящих ЦД, низкой концентрацией субстрата, необходимостью применения метанола и содержанием в конечном продукте примесных соединений. The practical significance of the method is largely limited by the use of 20.0 g / l of α-CD concentrations - one of the most expensive CDs, low substrate concentration, the need to use methanol and the content of impurity compounds in the final product.
В литературе описан способ получения преднизолона из гидрокортизона отмытыми клетками Corynebacterium simplex [22]. Гидрокортизон, растворенный в метаноле, вносят в предварительно приготовленный раствор β-ЦД, содержащий клетки микроорганизмов. При содержании гидрокортизона в среде 2,0 г/л и в присутствии β-ЦД в концентрации 6,33 г/л и 12,66 г/л выход преднизолона через 3,5 часа трансформации в обоих вариантах составляет 1,3 г/л (65%). Содержание гидрокортизона 4,5 и 9,0% соответственно, т.е. с увеличением концентрации β-ЦД возрастает в 2 раза количество нетрансформированного гидрокортизона. При дальнейшем повышении концентрации β-ЦД в среде до 18,99 г/л резко снижается скорость реакции 1,2-дегидрирования, увеличивается количество нетрансформированного гидрокортизона и резко нарушается баланс стероидов. После 3,5 ч трансформации в среде накапливается лишь 0,63 г/л (32,5%) преднизолона. Содержание гидрокортизона составляет 0,23 г/л (11,5%). Сумма стероидов: гидрокортизона и преднизолона соответствует 43%, в тоже время в отсутствие β-ЦД - 83%. Причиной снижения скорости реакции, выхода преднизолона, увеличения содержания гидрокортизона в продукте и нарушения баланса стероидов является образование нерастворимых гидрокортизон-β-ЦД комплексов, в результате гидрокортизон выводится из зоны реакции. Образование комплекса наблюдалось при концентрации β-ЦД 18,99 г/л, превышающей его растворимость (15,0 г/л). Образование гидрокортизон-β-ЦД нерастворимых комплексов авторы отмечают также при внесении в раствор β-ЦД (15 г/л) гидрокортизона в концентрации выше 7,0 г/л. The literature describes a method for producing prednisolone from hydrocortisone with washed Corynebacterium simplex cells [22]. Hydrocortisone, dissolved in methanol, is added to a pre-prepared β-CD solution containing microorganism cells. When the hydrocortisone content in the medium is 2.0 g / l and in the presence of β-CD at a concentration of 6.33 g / l and 12.66 g / l, the yield of prednisolone after 3.5 hours of transformation in both cases is 1.3 g / l (65%). The content of hydrocortisone is 4.5 and 9.0%, respectively, i.e. with an increase in the concentration of β-CD, the amount of untransformed hydrocortisone increases by 2 times. With a further increase in the concentration of β-CD in the medium to 18.99 g / l, the rate of the 1,2-dehydrogenation reaction sharply decreases, the amount of untransformed hydrocortisone increases, and the balance of steroids is sharply disturbed. After 3.5 hours of transformation, only 0.63 g / l (32.5%) of prednisolone accumulates in the medium. The content of hydrocortisone is 0.23 g / l (11.5%). The sum of steroids: hydrocortisone and prednisone corresponds to 43%, while in the absence of β-CD, it is 83%. The reason for the decrease in the reaction rate, the yield of prednisone, the increase in the hydrocortisone content in the product, and the imbalance of steroids is the formation of insoluble hydrocortisone-β-CD complexes, as a result of which hydrocortisone is removed from the reaction zone. The formation of the complex was observed at a concentration of β-CD of 18.99 g / l, exceeding its solubility (15.0 g / l). The formation of hydrocortisone-β-CD insoluble complexes was also noted by the authors when hydrocortisone was added to a solution of β-CD (15 g / l) in a concentration above 7.0 g / l.
По данным других авторов предельно возможная растворимость гидрокортизона в растворе β-ЦД составляет 4,5 г/л [20]. According to other authors, the maximum possible solubility of hydrocortisone in a solution of β-CD is 4.5 g / l [20].
Недостатком рассматриваемых способов получения преднизолона с использованием β-ЦД является их низкая эффективность, обусловленная низкой растворимостью β-ЦД и комплексов гидрокортизон-β-ЦД. Применение метанола также ограничивает практическую реализацию этих способов. The disadvantage of the considered methods for producing prednisone using β-CD is their low efficiency, due to the low solubility of β-CD and complexes of hydrocortisone-β-CD. The use of methanol also limits the practical implementation of these methods.
Наиболее близким к предлагаемому по совокупности существенных признаков и достигаемому эффекту является способ получения 1,2-дегидропроизводных кортикостероидов, относящихся к 4-дельта-3-кетостероидам, путем трансформации кортикостероидов с помощью микроорганизма Arthrobacter globiformis 193 в присутствии β-ЦД и снимающих трансмембранный потенциал клеток веществ, обеспечивающих полноту превращения гидрокортизона в преднизолон и подавление обратной реакции - реакции 1,2-гидрирования [23]. В качестве таких веществ используют аминокислоты: глицин, оксипролин, глутаминовую кислоту; кетокислоту -α-кетоглутаровую; а также никотинамид, ацетат ретинола и др. Процесс проводят при исходной концентрации гидрокортизона 5,0 и 10,0 г/л, весовом соотношении субстрат: клетки (сухой вес) 6,25:1 и 2,77:1, и при концентрации бета-ЦД 15,0 и 60,0 г/л соответственно. При трансформации гидрокортизона в концентрации 5,0 г/л выход преднизолона составляет 98-99%. Содержание остаточного гидрокортизона - 1,0-1,5%. Длительность процесса - 4 - 6 ч в зависимости от используемого вещества, снимающего трансмембранный потенциал клетки. При трансформации гидрокортизона иммобилизованными клетками достигают выход преднизолона 96,5%. Содержание остаточного гидрокортизона и 20β-восстановленного производного преднизолона составляет 1,5% и не более 2% соответственно. Расчеты показывают, что производительность процесса составляет 0,82-1,23 г•л-1•ч-1.The closest to the proposed combination of essential features and the achieved effect is a method for producing 1,2-dehydro derivatives of corticosteroids belonging to 4-delta-3-ketosteroids by transforming corticosteroids using the microorganism Arthrobacter globiformis 193 in the presence of β-CD and removing the transmembrane potential of cells substances that ensure the complete conversion of hydrocortisone to prednisone and suppression of the reverse reaction — the 1,2-hydrogenation reaction [23]. The following amino acids are used as such substances: glycine, hydroxyproline, glutamic acid; keto-α-ketoglutaric acid; as well as nicotinamide, retinol acetate, etc. The process is carried out at an initial concentration of hydrocortisone of 5.0 and 10.0 g / l, a weight ratio of substrate: cells (dry weight) of 6.25: 1 and 2.77: 1, and at a concentration beta-CD 15.0 and 60.0 g / l, respectively. When hydrocortisone is transformed at a concentration of 5.0 g / l, the yield of prednisolone is 98-99%. The content of residual hydrocortisone is 1.0-1.5%. The duration of the process is 4-6 hours, depending on the substance used, which removes the transmembrane potential of the cell. During the transformation of hydrocortisone by immobilized cells, the yield of prednisolone reaches 96.5%. The content of residual hydrocortisone and the 20β-reduced derivative of prednisolone is 1.5% and not more than 2%, respectively. Calculations show that the productivity of the process is 0.82-1.23 g • l -1 • h -1 .
Трансформацию гидрокортизона в концентрации 10,0 г/л завершают за 3 часа и достигают выхода преднизолона 97-99%. Содержание остаточного гидрокортизона и 20β-восстановленного производного преднизолона не превышает 2 и 1% соответственно. Сокращение времени трансформации до 3 ч обусловлено увеличением количества клеток микроорганизмов более чем в 2 раза по сравнению с их содержанием при трансформации гидрокортизона в концентрации 5,0 г/л. Производительность процесса - 3,31 г•л-1•ч-1. Указанный эффект достигается в условиях сохранения гетерофазности среды вследствие ограниченной растворимости β-ЦД и его комплексов с субстратами и продуктами реакции, поскольку известно, что растворимость β-ЦД в водных растворах не превышает 15,0 г/л, в этих же пределах находится растворимость его комплексов с рассматриваемыми стероидами.The transformation of hydrocortisone at a concentration of 10.0 g / l is completed in 3 hours and a yield of prednisolone of 97-99% is achieved. The content of residual hydrocortisone and 20β-reduced derivative of prednisolone does not exceed 2 and 1%, respectively. The reduction of the transformation time to 3 hours is due to an increase in the number of microorganism cells by more than 2 times compared with their content during the transformation of hydrocortisone at a concentration of 5.0 g / L. The productivity of the process is 3.31 g • l -1 • h -1 . This effect is achieved under conditions of maintaining heterophasicity of the medium due to the limited solubility of β-CD and its complexes with substrates and reaction products, since it is known that the solubility of β-CD in aqueous solutions does not exceed 15.0 g / l, its solubility is in the same range complexes with the steroids in question.
Основной недостаток рассматриваемого способа - невозможность для повышения производительности процесса увеличивать концентрацию субстрата из-за ограниченной растворимости β-ЦД и образующихся гидрокортизон-β-ЦД комплексов, что по данным литературы приводит к снижению скорости реакции, выхода преднизолона, нарушению балланса стероидов [20, 21]. Необходимость достижения массообменных характеристик, достаточных для обеспечения высокой скорости реакции в условиях гетерофазности снижает технологичность способа. Кроме того, использование соединений, снижающих величину трансмембранного потенциала клеток микроорганизмов и устраняющих протекание побочной восстановительной реакции, усложняет и удоражает технологию процесса. The main disadvantage of this method is the inability to increase the concentration of the substrate due to the limited solubility of β-CD and the resulting hydrocortisone-β-CD complexes, which, according to the literature, leads to a decrease in the reaction rate, yield of prednisolone, and impaired steroid balance [20, 21 ]. The need to achieve mass transfer characteristics sufficient to ensure a high reaction rate under heterophasic conditions reduces the manufacturability of the method. In addition, the use of compounds that reduce the magnitude of the transmembrane potential of microorganism cells and eliminate the occurrence of an adverse recovery reaction complicates and militates the process technology.
Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, заключается в создании эффективного способа получения 1,2-дегидропроизводных 4-дельта-3-кетостероидов, обеспечивающего высокий выход продукта при высоких нагрузках субстрата и высокой степени селективности процесса, а также отсутствие остаточного субстрата в продукте. The problem to which the invention is directed is to create an effective method for producing 1,2-dehydro derivatives of 4-delta-3-ketosteroids, which provides a high yield of the product under high substrate loads and a high degree of process selectivity, as well as the absence of residual substrate in the product.
Технический результат, который может быть получен при осуществлении этого изобретения, заключается в повышении производительности процесса за счет значительного увеличения нагрузки субстрата при полном его превращении в продукт. The technical result that can be obtained by implementing this invention is to increase the productivity of the process by significantly increasing the load of the substrate when it is completely converted into a product.
Сущность способа заключается в том, что согласно способу получения 1,2-дегидропроизводных путем микробиологической трансформации 4-дельта-3-кетостероидов с помощью Arthrobacter globiformis 193 в присутствии циклодекстрина в качестве циклодекстрина используют водорастворимые химически модифицированные производные β-циклодекстрина. The essence of the method lies in the fact that according to the method for producing 1,2-dehydro derivatives by microbiological transformation of 4-delta-3-ketosteroids using Arthrobacter globiformis 193 in the presence of cyclodextrin, water-soluble chemically modified derivatives of β-cyclodextrin are used.
В качестве производных β-циклодекстрина могут быть использованы оксипропилциклодекстрин (ОПЦД), метилциклодекстрин (метилЦД) и др. Использование модифицированных ЦД обеспечивает перевод 3-кетостероидов в растворимую форму и проведение процесса в водной фазе процесса даже при высоких (свыше 20,0 г/л) нагрузках субстрата исключает феномен твердофазной ферментации или псевдокристаллотрансформации, возможность образования смешанных кристаллов, что позволяет значительно увеличить производительность процесса при полном превращении субстрата в продукт. Способ не требует использования для достижения полного превращения субстрата дополнительных добавок (в виде искусственных акцепторов электронов или соединений, снижающих трансмембранный потенциал клеток). Hydroxypropylcyclodextrin (OPCD), methylcyclodextrin (methylCD), etc. can be used as derivatives of β-cyclodextrin. The use of modified CDs allows the conversion of 3-ketosteroids to a soluble form and the process in the aqueous phase of the process even at high (over 20.0 g / l ) substrate loads excludes the phenomenon of solid-phase fermentation or pseudo-crystallotransformation, the possibility of the formation of mixed crystals, which can significantly increase the productivity of the process with the complete conversion of substrates ata to the product. The method does not require the use of additional additives (in the form of artificial electron acceptors or compounds that reduce the transmembrane potential of cells) to achieve complete conversion of the substrate.
В литературе отсутствуют сведения об использовании модифицированных β-ЦД в процессах 1,2-дегидрирования стероидных соединений, и о возможном влиянии их на полноту превращения субстрата в продукт, соотношение скоростей прямой и обратной реакций, образование побочных продуктов. Описано использование химически модифицированных производных β-ЦД в процессах трансформации стеринов растительного и животного происхождения (ситостерина, холестерина) до стероидов андостанового ряда с помощью микроорганизмов рода Mycobacterium [24] . Однако в этих процессах интенсификация деградации боковой цепи стеринов обусловлена, главным образом, не использованием субстрата в растворимой форме, а образованием комплексов конечных продуктов с производным β-ЦД и устранением вследствие этого эффекта ингибирования процесса и/или деструкции образующихся продуктов. Основная масса субстрата при этом находится в твердом, нерастворимом состоянии. There is no information in the literature on the use of modified β-CDs in the processes of 1,2-dehydrogenation of steroid compounds, and on their possible effect on the completeness of conversion of the substrate into a product, the ratio of the rates of direct and reverse reactions, and the formation of by-products. The use of chemically modified β-CD derivatives in the processes of transformation of sterols of plant and animal origin (sitosterol, cholesterol) to androstane steroids using microorganisms of the genus Mycobacterium has been described [24]. However, in these processes, the intensification of degradation of the side chain of sterols is mainly caused not by the use of a substrate in soluble form, but by the formation of complexes of final products with a β-CD derivative and the elimination of the effect of inhibition of the process and / or destruction of the resulting products. The bulk of the substrate is in a solid, insoluble state.
Анализ продуктов трансформации в динамике процесса проводят методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Для этого пробы культуральной жидкости заливают 10-кратным объемом этилацетата и проводят экстракцию стероидных соединений при интенсивном перемешивании в течение 3 мин при нагревании до 40oC. Аликвоты экстракта, содержащие 5 или 50 мкг вещества наносят на пластинку Силуфол UV 254 (15 х 15 см). Разделение стероидных соединений проводят в системе органических растворителей - бензол:ацетон (об/об) = 3:1. Оценку содержания стероидов проводят путем сравнения хроматографической подвижности (Rf), площади пятна и интенсивности поглощения в ультрахемископе "(Desaga") с образцами стандарта.Analysis of transformation products in the dynamics of the process is carried out by thin layer chromatography (TLC). For this, samples of the culture fluid are poured with a 10-fold volume of ethyl acetate and steroid compounds are extracted with vigorous stirring for 3 minutes while heating to 40 ° C. Aliquots of the extract containing 5 or 50 μg of the substance are applied onto a Silufol UV 254 plate (15 x 15 cm ) The separation of steroid compounds is carried out in a system of organic solvents - benzene: acetone (v / v) = 3: 1. The steroid content is estimated by comparing the chromatographic mobility (Rf), spot area and absorption intensity in the Ultrashemiscope "(Desaga") with standard samples.
Определение содержания продуктов в момент завершения процесса трансформации осуществляют методом ВЭЖХ с использованием оборудования фирм Хьюлетт-Паккард (США) и Фармация-LKB (Швеция), на колонке типа C18 (5 мкм, 3 х 250 мм) в системе ацетонитрил: вода (40:60 об/об) при скорости протока 1 мл/мин, температуре 20oC; детекция - по поглощению при 240 нм.Determination of the content of products at the time of completion of the transformation process is carried out by HPLC using equipment from Hewlett-Packard (USA) and Pharmacy-LKB (Sweden), on a C18 (5 μm, 3 x 250 mm) column in an acetonitrile: water system (40: 60 rpm) at a flow rate of 1 ml / min, a temperature of 20 o C; detection - by absorption at 240 nm.
В качестве субстрата используют микронизированный гидрокортизон 98% чистоты фирмы "Russel Uclaf" (Франция), вещество "S" Рейхштейна 97% чистоты, полученное с завода "Акрихин" (Россия), анростендион (АД) 98% чистоты. As a substrate, micronized hydrocortisone 98% pure by Russel Uclaf (France), Reichstein S substance 97% pure, obtained from Akrikhin plant (Russia), 98% pure anrostenedione (AD) are used.
Выход продукта выражают в % от загруженного субстрата или в % от теоретически возможного выхода. Эти величины фактически совпадают, поскольку различие в молекулярной массе субстратов и продуктов составляет 2 единицы. The product yield is expressed as% of the loaded substrate or% of the theoretically possible yield. These values actually coincide, since the difference in the molecular weight of the substrates and products is 2 units.
Полученные предлагаемым способом 1,2-дегидрированные 4-дельта-3-кетостероиды могут быть выделены любым из известных методов, предусматривающих экстракцию продуктов органическим растворителем (наиболее часто используется этилацетат), отгонку растворителя и последующую кристаллизацию конечного продукта. Obtained by the proposed method, 1,2-dehydrogenated 4-delta-3-ketosteroids can be isolated by any of the known methods involving extraction of products with an organic solvent (ethyl acetate is most often used), distillation of the solvent and subsequent crystallization of the final product.
Способ иллюстрируется примерами. The method is illustrated by examples.
Пример 1. Бактерии Arthrobacter globiformis 193 культивируют на среде следующего состава, (г/л): кукурузный экстракт - 10,0; глюкоза - 10,0, водопроводная вода, pH 7,0-7,2, в присутствии индуктора стероид-1,2 дегидрогеназы - ацетата кортизона 20 мг/% в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 150 мл среды, на качалке (220 об/мин) при 30oC в течение 24 часов. Клетки отделяют от среды центрифугированием при 5000 g, дважды отмывают 0,01 М фосфатным буферным раствором, pH 7,2, и готовят суспензию клеток 50 или 100 мг (сухой вес)/мл буферного раствора, pH 7,0-7,2.Example 1. Bacteria Arthrobacter globiformis 193 are cultured in a medium of the following composition, (g / l): corn extract - 10.0; glucose - 10.0, tap water, pH 7.0-7.2, in the presence of a steroid-1,2 dehydrogenase inducer - cortisone acetate 20 mg /% in 750 ml Erlenmeyer flasks containing 150 ml of medium on a rocking chair (220 rpm) at 30 o C for 24 hours. Cells are separated from the medium by centrifugation at 5000 g, washed with 0.01 M phosphate buffer solution, pH 7.2 twice, and a cell suspension of 50 or 100 mg (dry weight) / ml buffer solution, pH 7.0-7.2, is prepared.
Трансформацию гидрокортизона проводят в колбах Эрленмейера, объемом 750 мл, содержащих 80 мл 0,01 М Na-фосфатного буфера, pH 7,0-7,2. Последовательно вносят 1,0 г микронизированного гидрокортизона и 5,67 г метил-ЦД, фирмы Wacker-Chemie GmbH, Германия, добавляют бактериальные клетки в виде суспензии в объеме 2,0 мл (0,2 г, вес сухой биомассы) и доводят объем реакционной среды до 100 мл фосфатным буфером. Концентрация субстрата - 10,0 г/л, соотношение субстрат:клетки (вес/вес) составляет 5:1. Трансформацию проводят в аэрируемых условиях при 220 об/мин, 30oC в течение 5 ч. Процесс останавливают при отсутствии в среде гидрокортизона, т.е. при его полном превращении. По данным ВЭЖХ выход преднизолона составляет 95% (9,44 г/л). Производительность процесса - 1,88 г•л-1•ч-1.The transformation of hydrocortisone is carried out in Erlenmeyer flasks, a volume of 750 ml, containing 80 ml of 0.01 M Na-phosphate buffer, pH 7.0-7.2. Subsequently add 1.0 g of micronized hydrocortisone and 5.67 g of methyl CD, Wacker-Chemie GmbH, Germany, add the bacterial cells as a suspension in a volume of 2.0 ml (0.2 g, dry biomass weight) and adjust the volume reaction medium to 100 ml with phosphate buffer. The concentration of the substrate is 10.0 g / l, the ratio of substrate: cells (weight / weight) is 5: 1. The transformation is carried out under aerated conditions at 220 rpm, 30 o C for 5 hours. The process is stopped in the absence of hydrocortisone in the medium, i.e. with its complete transformation. According to HPLC, the yield of prednisolone is 95% (9.44 g / l). The productivity of the process is 1.88 g • l -1 • h -1 .
Пример 2. Способ осуществляют по примеру 1, но в трансформационную среду вносят 4,72 г метил-ЦД. Длительность процесса - 6 ч. Выход преднизолона составляет 95% (9,44 г/л). Гидрокортизон в среде отсутствует. Производительность процесса - 1,57 г•л-1•ч-1.Example 2. The method is carried out as in example 1, but 4.72 g of methyl CD are added to the transformation medium. The duration of the process is 6 hours. The yield of prednisolone is 95% (9.44 g / l). Hydrocortisone is absent in the medium. The productivity of the process is 1.57 g • l -1 • h -1 .
Пример 3. Способ осуществляют по примеру 1, но в трансформационную среду вносят 2,0 г гидрокортизона, 11,32 г метил-ЦД и 4 мл суспензии клеток (0,4 г). Концентрация субстрата - 20,0 г/л. Процесс останавливают на 5 ч при отсутствии гидрокортизона в среде. Выход преднизолона - 97% (19,2 г/л). Производительность процесса - 3,85 г•л-1•ч-1.Example 3. The method is carried out as in example 1, but 2.0 g of hydrocortisone, 11.32 g of methyl CD and 4 ml of a cell suspension (0.4 g) are added to the transformation medium. The concentration of the substrate is 20.0 g / l. The process is stopped for 5 hours in the absence of hydrocortisone in the medium. The yield of prednisolone is 97% (19.2 g / l). The productivity of the process is 3.85 g • l -1 • h -1 .
Пример 4. Способ осуществляют по примеру 1, но в трансформационную среду вносят 9,44 г метил-ЦД. Полное превращение гидрокортизона осуществляют за 6 ч. Выход преднизолона - 97% (19,2 г/л). Производительность процесса - 3,21 г•л-1•ч-1.Example 4. The method is carried out as in example 1, but 9.44 g of methyl CD are added to the transformation medium. The complete conversion of hydrocortisone is carried out in 6 hours. The yield of prednisolone is 97% (19.2 g / l). The productivity of the process is 3.21 g • l -1 • h -1 .
Пример 5. Способ осуществляют по примеру 1, но в трансформационную среду вносят 5,0 г гидрокортизона, 28,35 г метил-ЦД и 10 мл суспензии клеток (1,0 г клеток). Концентрация субстрата - 50,0 г/л. Процесс останавливают на 8 ч при отсутствии гидрокортизона в среде. Выход преднизолона составляет 96% (47,7 г/л). Производительность процесса - 5,96 г•л-1•ч-1.Example 5. The method is carried out as in example 1, but 5.0 g of hydrocortisone, 28.35 g of methyl CD and 10 ml of a cell suspension (1.0 g of cells) are added to the transformation medium. The concentration of the substrate is 50.0 g / l. The process is stopped for 8 hours in the absence of hydrocortisone in the medium. The yield of prednisolone is 96% (47.7 g / l). The productivity of the process is 5.96 g • l -1 • h -1 .
Пример 6. Способ осуществляют по примеру 1, но в трансформационную среду вносят 23,63 г метил-ЦД. Процесс осуществляют за 8 ч и останавливают при отсутствии гидрокортизона. Выход преднизолона - 96% (47,7 г/л). Производительность процесса - 5,3 г•л-1•ч-1.Example 6. The method is carried out as in example 1, but 23.63 g of methyl CD are added to the transformation medium. The process is carried out for 8 hours and stopped in the absence of hydrocortisone. The yield of prednisolone is 96% (47.7 g / l). The productivity of the process is 5.3 g • l -1 • h -1 .
Пример 7. Способ осуществляют по примеру 1, но в трансформационную среду вносят 7,0 г гидрокортизона, 39,67 г метил-ЦД и 14 мл суспензии клеток (1,4 г клеток). Концентрация субстрата - 70,0 г/л. Полное превращение гидрокортизона осуществляют за 9 ч. Выход преднизолона составляет 95% (66,1 г/л). Производительность процесса - 7,42 г•л-1•ч-1.Example 7. The method is carried out as in example 1, but 7.0 g of hydrocortisone, 39.67 g of methyl CD and 14 ml of cell suspension (1.4 g of cells) are added to the transformation medium. The concentration of the substrate is 70.0 g / l. The complete conversion of hydrocortisone is carried out in 9 hours. The yield of prednisolone is 95% (66.1 g / l). The productivity of the process is 7.42 g • l -1 • h -1 .
Пример 8. Способ осуществляют по примеру 1, но в трансформационную среду вносят 2 г гидрокортизона и 12,9 г ОПЦД фирмы Wacher-Chemie GmbH. Концентрация субстрата - 20,0 г/л. Длительность процесса - 6 ч, выход преднизолона - 96% (19,0 г/л). Гидрокортизон отсутствует. Производительность процесса - 3,16 г•л-1•ч-1.Example 8. The method is carried out as in example 1, but 2 g of hydrocortisone and 12.9 g of OPCD from Wacher-Chemie GmbH are added to the transformation medium. The concentration of the substrate is 20.0 g / l. The duration of the process is 6 hours, the yield of prednisone is 96% (19.0 g / l). Hydrocortisone is absent. The productivity of the process is 3.16 g • l -1 • h -1 .
Пример 9. В ферментер, объемом 3,0 л, вносят 1,0 л 0,01 M Na-фосфатного буфера, pH 7,2 микрокристаллический гидрокортизон - 30,0 г, ОПЦД - 193,5 г и 6,0 г клеток в 60 мл буфера. Объем реакционной среды доводят до 1,5 л 0,01 M Na-фосфатным буфером. Концентрация субстрата - 20,0 г/л, соотношение субстрат: клетки (вес/вес) составляет 5:1. Трансформацию проводят при 30oC, pO2 80-90% в течение 5 ч. Выход преднизолона при отсутствии гидрокортизона 96% (19,0 г/л). Производительность процесса - 5,72 г•л-1•ч-1.Example 9. In a fermenter with a volume of 3.0 l, add 1.0 l of 0.01 M Na-phosphate buffer, pH 7.2 microcrystalline hydrocortisone - 30.0 g, OPCD - 193.5 g and 6.0 g of cells in 60 ml of buffer. The volume of the reaction medium was adjusted to 1.5 L with 0.01 M Na-phosphate buffer. The concentration of the substrate is 20.0 g / l, the ratio of substrate: cells (weight / weight) is 5: 1. The transformation is carried out at 30 o C, pO 2 80-90% for 5 hours. The yield of prednisone in the absence of hydrocortisone 96% (19.0 g / l). The productivity of the process is 5.72 g • l -1 • h -1 .
Пример 10. Способ осуществляют по примеру 9, но в трансформационную среду вносят 142,96 г метил-ЦД. Трансформацию проводят в течение 6 ч и останавливают при отсутствии гидрокортизона в среде. Выход преднизолона - 96% (19,0 г/л). Производительность процесса - 5,72 г•л-1•ч-1.Example 10. The method is carried out as in example 9, but 142.96 g of methyl CD are added to the transformation medium. The transformation is carried out for 6 hours and stopped in the absence of hydrocortisone in the medium. The yield of prednisolone is 96% (19.0 g / l). The productivity of the process is 5.72 g • l -1 • h -1 .
Пример 11. Способ осуществляют по примеру 1, но в трансформационную среду вносят 2 г вещества "S" Рейхштейна и 11,86 г метил-ЦД. Концентрация субстрата - 20,0 г/л. Процесс проводят за 8 ч и останавливают при отсутствии в среде субстрата. Выход 1,2-дегидрированного продукта 98% (19,48 г/л). Производительность процесса - 2,43 г•л-1•ч-1.Example 11. The method is carried out as in example 1, but 2 g of Reichstein substance “S” and 11.86 g of methyl CD are added to the transformation medium. The concentration of the substrate is 20.0 g / l. The process is carried out for 8 hours and stopped in the absence of substrate in the medium. The yield of 1,2-dehydrogenated product is 98% (19.48 g / l). The productivity of the process is 2.43 g • l -1 • h -1 .
Пример 12. Способ осуществляют по примеру 1, но в трансформационную среду вносят 2,0 г андростендиона (АД) и 14,36 г метил-ЦД. Полное превращение субстрата осуществляют за 6 ч. Выход андростадиендиона (АДД) - 95% (18,86 г/л). Производительность процесса - 3,14 г•л-1•ч-1.Example 12. The method is carried out as in example 1, but 2.0 g of androstenedione (AD) and 14.36 g of methyl CD are added to the transformation medium. Complete conversion of the substrate is carried out in 6 hours. The yield of androstadienedione (ADD) is 95% (18.86 g / l). The productivity of the process is 3.14 g • l -1 • h -1 .
Пример 13. Выращивание клеток осуществляют, как описано в примере 1. Иммобилизацию клеток A. globiformis проводят следующим образом. В предварительно охлажденную полимеризационную стеклянную камеру вносят 11 мл раствора, содержащего 1,9 г акриламида и 0,1 г N,N'-метиленбисакриламида, при перемешивании добавляют 3 мл раствора персульфата аммония (10 мг/мл), 6 мл суспензии клеток (50 мг/мл) и 3-4 капли концентрированного раствора N,N,N', N'-тетраметилэтилендиамина. Общий объем смеси - 20 мл. После начала гелеобразования полимеризационную камеру помещают в холодильную камеру с температурой минус 18oC и выдерживают в течение 7-10 мин до завершения процесса полимеризации. Образовавшийся блок геля фрагментируют на гранулы диаметром 0,8-1,0 мм, продавливая его через сито с соответствующим размером ячеек. Полученные гранулы тщательно промывают 0,01 М фосфатным буфером, pH 7,2, декантируют. Получают 30-35 мл гранул, содержащих по 6 мг клеток/мл гранул.Example 13. Cell cultivation is carried out as described in example 1. Immobilization of A. globiformis cells is carried out as follows. 11 ml of a solution containing 1.9 g of acrylamide and 0.1 g of N, N'-methylenebisacrylamide are added to a pre-cooled polymerization glass chamber, 3 ml of ammonium persulfate solution (10 mg / ml), 6 ml of cell suspension are added with stirring mg / ml) and 3-4 drops of a concentrated solution of N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine. The total volume of the mixture is 20 ml. After the start of gelation, the polymerization chamber is placed in a refrigerator with a temperature of minus 18 o C and kept for 7-10 minutes until the completion of the polymerization process. The resulting gel block is fragmented into granules with a diameter of 0.8-1.0 mm, forcing it through a sieve with an appropriate mesh size. The obtained granules are thoroughly washed with 0.01 M phosphate buffer, pH 7.2, decanted. Get 30-35 ml of granules containing 6 mg of cells / ml of granules.
Трансформацию гидрокортизона осуществляют по примеру 1, но в трансформационную среду вместо суспензии клеток вносят 34 мл гранул полиакриламидного геля (ПААГ). Соотношение гидрокортизон /иммобилизованные клетки - 5:1. Процесс проводят за 6 ч. Гидрокортизон в среде отсутствует. Выход преднизолона - 95% (9,44 г/л). Производительность процесса - 1,57 г•л-1•ч-1.The transformation of hydrocortisone is carried out as in example 1, but instead of a suspension of cells, 34 ml of polyacrylamide gel granules (PAAG) are introduced into the transformation medium. The ratio of hydrocortisone / immobilized cells is 5: 1. The process is carried out for 6 hours. Hydrocortisone is absent in the medium. The yield of prednisolone is 95% (9.44 g / l). The productivity of the process is 1.57 g • l -1 • h -1 .
Пример 14. Способ осуществляют по примеру 9, но в трансформационную среду вносят 15,0 г гидрокортизона и 86 г метил-ЦД. После доведения объема до 1,5 л добавляют 500 мл гранул ПААГ с включенными клетками. Полное превращение гидрокортизона завершают за 5 ч. Выход преднизолона - 96% (9,54 г/л). Производительность процесса - 2,83 г•л-1•ч-1.Example 14. The method is carried out as in example 9, but 15.0 g of hydrocortisone and 86 g of methyl CD are added to the transformation medium. After adjusting the volume to 1.5 L, add 500 ml PAAG pellets with included cells. Complete conversion of hydrocortisone is completed in 5 hours. The yield of prednisone is 96% (9.54 g / l). The productivity of the process is 2.83 g • l -1 • h -1 .
Пример 15. Способ осуществляют по примеру 9, но в трансформационную среду вносят гранулы ПААГ с включенными клетками, проводившими трансформацию гидрокортизона, описанную в примере 14. Полное превращение гидрокортизона в преднизолон осуществляют за 6 ч. Выход преднизолона - 95% (9,44 г/л). Производительность процесса - 2,35 г•л-1•ч-1.Example 15. The method is carried out as in example 9, but PAAG granules with the cells that underwent the hydrocortisone transformation described in Example 14 are introduced into the transformation medium. The complete conversion of hydrocortisone to prednisolone is carried out in 6 hours. Prednisolone yield is 95% (9.44 g / l). The productivity of the process is 2.35 g • l -1 • h -1 .
Пример 16. Способ осуществляют по примеру 14, но в трансформационную среду вносят гранулы ПААГ с включенными клетками после проведения двух повторных трансформаций гидрокортизона, представленных в примерах 14 и 15. Процесс проводят за 10 ч. Выход преднизолона - 95% (9,44 г/л). Гидрокортизон в среде отсутствует. Производительность процесса - 1,4 г•л-1•ч-1.Example 16. The method is carried out as in example 14, but the PAAG granules with the cells turned on are introduced into the transformation medium after two repeated transformations of hydrocortisone are presented in examples 14 and 15. The process is carried out in 10 hours. Prednisolone yield is 95% (9.44 g / l). Hydrocortisone is absent in the medium. The productivity of the process is 1.4 g • l -1 • h -1 .
Таким образом, предлагаемый способ позволяет значительно повысить производительность процессов получения 1,2-дегидрированных производных 4-дельта-3-кетостероидов за счет полного превращения используемого субстрата в продукт при высокой исходной концентрации субстрата в среде. Способ не требует применения соединений, снимающих трансмембранный потенциал микробной клетки. Способ также позволяет избежать использования органических растворителей, применяемых в большинстве известных способов получения дегидропроизводных 4-дельта-3-кетостероидров. Химически модифицированные ЦД могут быть регенерированы и многократно использованы. Thus, the proposed method can significantly increase the productivity of processes for producing 1,2-dehydrogenated derivatives of 4-delta-3-ketosteroids due to the complete conversion of the substrate used into the product at a high initial concentration of the substrate in the medium. The method does not require the use of compounds that remove the transmembrane potential of the microbial cell. The method also avoids the use of organic solvents used in most known methods for the preparation of 4-delta-3-ketosteroid dehydro derivatives. Chemically modified CDs can be regenerated and reused.
Литература
1. Ахрем A.A., Титов Ю.А. Стероиды и микроорганизмы. - М.: Наука, 1970.Literature
1. Ahrem AA, Titov Yu.A. Steroids and microorganisms. - M.: Science, 1970.
2. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Торсинг. Харьков, 1997, т.2, 590 с. 2. Mashkovsky M.D. Medicines Torsion. Kharkov, 1997, vol. 2, 590 s.
3. Charney W., Herzog H. Microbial transformation of Steroids. Academic Press. Inc. New York. 1967, pp.236-261. 3. Charney W., Herzog H. Microbial transformation of Steroids. Academic Press. Inc. New York 1967, pp. 236-261.
4. Кoщеенкo К.A. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Пущино. 1978, т.2, с.55. 4. Koschechenko K.A. Immobilized cells of microorganisms. Results of science and technology. VINITI. Pushchino. 1978, vol. 2, p. 55.
5. Аринбасарова А.Ю., Артемова А.А., Киселев А.В, Кощеенко К.А, Никитин Ю.С. Прикладн. биохим. микробиол. 1982, т.2, в.3, с. 331-338. 5. Arinbasarova A.Yu., Artemova A.A., Kiselev A.V., Koschechenko K.A., Nikitin Yu.S. Applied biochem. microbiol. 1982, v.2, v.3, p. 331-338.
6. Koshcheenko K.A., Sukhodolskaya G.V., Tyurin V.S., Skryabin G.K. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1981, V.12, pp. 161-169. 6. Koshcheenko K.A., Sukhodolskaya G.V., Tyurin V.S., Skryabin G.K. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1981, V.12, pp. 161-169.
7. Kondo E. , Masuo E. J. Gen. Appl. Microbiol. 1970, v.7, N 2, pp. 113-117. 7. Kondo E., Masuo E. J. Gen. Appl. Microbiol. 1970, v. 7, N 2, pp. 113-117.
8. Авторское свидетельство СССР N 1514780, кл. C 12 P 33/00, C 12 R 1: 0,6. БИ N 3, 1989. 8. Copyright certificate of the USSR N 1514780, cl. C 12 P 33/00, C 12 R 1: 0.6. BI N 3, 1989.
9. Патент РФ N 204195, кл. C 12 P 33/00, C 12 P 33/00//C 12 R 1:0,6. БИ N 23, 1995. 9. RF patent N 204195, cl. C 12 P 33/00, C 12 P 33/00 // C 12 R 1: 0.6. BI N 23, 1995.
10. Авторское свидетельство СССР N 1471561, кл. C 12 N 11/04, 1985. 10. Copyright certificate of the USSR N 1471561, cl. C 12 N 11/04, 1985.
11. Патент НРБ N 71159, 1985. 11. Patent NRB N 71159, 1985.
12. Goetschel R., Bar R. Enzyme and Microbiol. Technology. 1992, v. 14, N 6, pp. 462-469. 12. Goetschel R., Bar R. Enzyme and Microbiol. Technology 1992, v. 14, N 6, pp. 462-469.
13. Аринбасарова А.Ю., Меденцев А.Г., Акименко В.К., Кощеенко К.А. Биохимия. 1983, т. 48, N 10, с. 1726-1732. 13. Arinbasarova A.Yu., Medentsev A.G., Akimenko V.K., Koscheenko K.A. Biochemistry. 1983, t. 48, N 10, p. 1726-1732.
14. Аринбасарова К.А., Кощеенко К.А. Прикл. биохим. микробиол. 1983, т. 19, в.1, с. 20-31. 14. Arinbasarova K.A., Koscheenko K.A. Adj biochem. microbiol. 1983, v. 19, v. 1, p. 20-31.
15. Yamane T., Nakatani H., Sada E., Omata T., Tanaka A., Fukui S. Biotechnol. Biong. 1979, v.21, N 11, рр. 2133-2144. 15. Yamane T., Nakatani H., Sada E., Omata T., Tanaka A., Fukui S. Biotechnol. Biong. 1979, v. 21, No. 11, pp. 2133-2144.
16. Fernandes P., Cabral J.M.S., Pincheiro H.M. Enzyme Microbiol. Technology. 1995, v.17, N 2, pp.163-167. 16. Fernandes P., Cabral J.M.S., Pincheiro H.M. Enzyme Microbiol. Technology 1995, v.17, N 2, pp. 163-167.
17. Smolder A. S.S., Pinheiro H.M., Noronha P., Cabral J.M.S. Biotech. Bioeng. 1991, v.39, N.10, pp. 1210-1217. 17. Smolder A. S.S., Pinheiro H.M., Noronha P., Cabral J.M.S. Biotech Bioeng. 1991, v. 39, N.10, pp. 1210-1217.
18. Hoffman. Biotechnol. Lett. 1989, v.11, N 11, pp. 17-22. 18. Hoffman. Biotechnol. Lett. 1989, v. 11, N 11, pp. 17-22.
19. Патент РФ N 2042687. Способ получения дегидроаналогов. Кл. 12 N 11/00. БИ N 24, 1995. 19. RF patent N 2042687. A method of obtaining dehydroanalogs. Cl. 12 N 11/00. BI N 24, 1995.
20. Szejtli J. The use of cyclodextrins in biotechnological operations. Ed. D. Duchene, Published in France by Editions de Sante. 1991, 625 p. 20. Szejtli J. The use of cyclodextrins in biotechnological operations. Ed. D. Duchene, Published in France by Editions de Sante. 1991, 625 p.
21. Patent GB N 2108965. Intensification of microbiological conversion of steroids by using cyclodextrin additives. 1981. 21. Patent GB N 2108965. Intensification of microbiological conversion of steroids by using cyclodextrin additives. 1981.
22. Алехина T.M., Рыжкова В.М., Гусарова Т.И., Куракова В.В., Клубничкина Г.А. Химико-фармацев. журнал. 1993, N 4, с.59-62. 22. Alekhina T.M., Ryzhkova V.M., Gusarova T.I., Kurakova V.V., Klubnichkina G.A. Chemical Pharmacist. Journal. 1993, N 4, p. 59-62.
23. Патент РФ N 1830949. Способ получения 1,2-дегидрированных кортикостероидов. Кл. C 12 P 33/00. БИ N 19, 1995. 23. RF patent N 1830949. A method for producing 1,2-dehydrogenated corticosteroids. Cl. C 12 P 33/00. BI N 19, 1995.
24. Патент РФ N 2079258. Кл. C 12 P 33/16, C 07 J 1/00// (C 12 P 33/16, C 12 P 1:32). БИ N 3, 1997. 24. RF patent N 2079258. Cl. C 12 P 33/16, C 07 J 1/00 // (C 12 P 33/16, C 12 P 1:32). BI N 3, 1997.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU98123648/13A RU2156302C1 (en) | 1998-12-28 | 1998-12-28 | Method of producing 1,2-dehydroderivatives of 4-delta-3-keto-steroids |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU98123648/13A RU2156302C1 (en) | 1998-12-28 | 1998-12-28 | Method of producing 1,2-dehydroderivatives of 4-delta-3-keto-steroids |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2156302C1 true RU2156302C1 (en) | 2000-09-20 |
Family
ID=20213982
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU98123648/13A RU2156302C1 (en) | 1998-12-28 | 1998-12-28 | Method of producing 1,2-dehydroderivatives of 4-delta-3-keto-steroids |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2156302C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2447154C1 (en) * | 2010-09-09 | 2012-04-10 | Марина Викторовна Донова | Microbiological method of producing 1,2-dehydrogenated derivatives of δ4-3-keto-steroids of androstane family in aqueus organic media |
| RU2480475C1 (en) * | 2011-11-16 | 2013-04-27 | Российская Федерация, От Имени Которой Выступает Министерство Промышленности И Торговли Российской Федерации | Microbiological method of producing 21-acetoxypregna-1,4,9( 11 ),16-tetraene-3,20-dione from 21-acetoxypregna-4,9( 11 )16-triene-3,20-dione |
-
1998
- 1998-12-28 RU RU98123648/13A patent/RU2156302C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Szejtli J. The use of cyclodextrins in biotechnological operations. Ed. D. Duchene, Published in France by Editions de Sante. 1991, p.625. Кощеенко К.А. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Пущино, 1978, т.2, с.55. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2447154C1 (en) * | 2010-09-09 | 2012-04-10 | Марина Викторовна Донова | Microbiological method of producing 1,2-dehydrogenated derivatives of δ4-3-keto-steroids of androstane family in aqueus organic media |
| RU2480475C1 (en) * | 2011-11-16 | 2013-04-27 | Российская Федерация, От Имени Которой Выступает Министерство Промышленности И Торговли Российской Федерации | Microbiological method of producing 21-acetoxypregna-1,4,9( 11 ),16-tetraene-3,20-dione from 21-acetoxypregna-4,9( 11 )16-triene-3,20-dione |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Mahato et al. | Current trends in microbial steroid biotransformation | |
| Malaviya et al. | Androstenedione production by biotransformation of phytosterols | |
| Ohlson et al. | Steroid transformation by activated living immobilized Arthrobacter simplex cells | |
| Rohman et al. | Application of microbial 3-ketosteroid Δ1-dehydrogenases in biotechnology | |
| Wang et al. | Cloud point system as a tool to improve the efficiency of biotransformation | |
| US4524134A (en) | Process for preparing 1,2-dehydro steroids | |
| RU2156302C1 (en) | Method of producing 1,2-dehydroderivatives of 4-delta-3-keto-steroids | |
| NL8302596A (en) | METHOD FOR MICROBIOLOGICAL 1,2-DEHYDROGENATION OF STEROIDS. | |
| JPH01124393A (en) | Reaction process | |
| HU194318B (en) | Process for the delta 1-dehydrogenation of steroids in the presence of materials relieving from toxic kinds of oxygen | |
| US4528271A (en) | Process for the intensification of microbiological conversions of steroids using cyclodextrin additives | |
| Fokina et al. | Microbial conversion of pregna-4, 9 (11)-diene-17α, 21-diol-3, 20-dione acetates by Nocardioides simplex VKM Ac-2033D | |
| Wang et al. | Production of hydrocortisone from cortexolone-21-acetate by immobilized Absidia orchidis in cosolvent-containing media | |
| RU2039824C1 (en) | Method of manufacturing androst-1,4-diene-3,17-dione | |
| Savinova et al. | Microbial 1, 2-Dehydrogenation of 6 α-Methylhydrocortisone 11-Trifluoroacetate | |
| RU2236464C2 (en) | Method for preparing metandrostenolone | |
| RU2407800C1 (en) | METHOD FOR PREPARING 14α-HYDROXYDERIVATIVES OF Δ4-3,17-DIKETO-ANDROSTENE | |
| US4246346A (en) | Antibiotic and steroid transformation process | |
| US4684610A (en) | Process for converting 1,2-saturated steroids to 1,2-dehydro steroids | |
| JPH02219597A (en) | Production of 1,2-dehydrosteroids | |
| RU2042687C1 (en) | Method of synthesis of steroid dehydroanalogues | |
| GB1560850A (en) | Immobilized microorganisms | |
| EP1504021A1 (en) | Process for dehydrogenation of azaandrostane compounds | |
| RU2447154C1 (en) | Microbiological method of producing 1,2-dehydrogenated derivatives of δ4-3-keto-steroids of androstane family in aqueus organic media | |
| PATIL et al. | SUBSTRATE CARRIERS FOR C-1 (2)-DEHYDROGENATION OF 6-METHYLENE ANDROSTENEDIONE TO EXEMESTANE BY GROWING AND IMMOBILIZED ARTHROBACTER SIMPLEX NCIM 2449 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20041229 |