RU2146707C1 - Method of detection of analyzed sequence of nucleic acid - Google Patents

Method of detection of analyzed sequence of nucleic acid Download PDF

Info

Publication number
RU2146707C1
RU2146707C1 RU98100753A RU98100753A RU2146707C1 RU 2146707 C1 RU2146707 C1 RU 2146707C1 RU 98100753 A RU98100753 A RU 98100753A RU 98100753 A RU98100753 A RU 98100753A RU 2146707 C1 RU2146707 C1 RU 2146707C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
oligonucleotide
probe
sequence
complementary
oligonucleotides
Prior art date
Application number
RU98100753A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU98100753A (en
Inventor
В.Ф. Куликова
Е.М. Иванова
Д.В. Пышный
С.Г. Лохов
А.А. Кривенко
Г.М. Дымшиц
Original Assignee
Куликова Валентина Филипповна
Иванова Евгения Михайловна
Пышный Дмитрий Владимирович
Лохов Сергей Георгиевич
Кривенко Анжелика Анатольевна
Дымшиц Григорий Моисеевич
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Куликова Валентина Филипповна, Иванова Евгения Михайловна, Пышный Дмитрий Владимирович, Лохов Сергей Георгиевич, Кривенко Анжелика Анатольевна, Дымшиц Григорий Моисеевич filed Critical Куликова Валентина Филипповна
Publication of RU98100753A publication Critical patent/RU98100753A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2146707C1 publication Critical patent/RU2146707C1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

FIELD: molecular biology, medicinal genetics. SUBSTANCE: method involves hybridization of short oligonucleotide probe (length is 4-6 links) having flanking oligonucleotide sequences or their derivatives carrying polycyclic aromatic groups with complementary analyzed sequence of nucleic acids. Sequence can has point mutations. Mutation to be determined must be in site of probe binding. Invention can be used for diagnosis of genetic diseases and ensures to perform the high-selective diagnosis of diseases based on alternations of nucleic acid structure. EFFECT: improved method of detection. 3 cl, 1 tbl, 18 ex

Description

Область техники
Изобретение относится к молекулярной биологии и может быть использовано для диагностики генетических и других заболеваний, в основе которых лежат изменения в структуре нуклеиновых кислот, включая труднодиагностируемые точечные мутации, а также для выявления вирусных нуклеиновых кислот при диагностике вирусных заболеваний.Technical field
The invention relates to molecular biology and can be used to diagnose genetic and other diseases, which are based on changes in the structure of nucleic acids, including difficult to detect point mutations, as well as to detect viral nucleic acids in the diagnosis of viral diseases.

Уровень техники
Наиболее близким к предлагаемому является способ выявления анализируемых последовательностей нуклеиновых кислот, содержащих точечные мутации, с помощью комплементарного анализируемому участку ДНК олигонуклеотидного зонда, полученного легированием в комплементарном комплексе двух олигонуклеотидов (длиной 8 и 14 звеньев), один из которых несет 32P-метку. При наличии мутации в сайте комплементарного связывания олигонуклеотидов выход легированного в несовершенном комплексе олигонуклеотидного зонда уменьшается по сравнению со случаем образования правильного комплекса. Максимальный фактор дискриминации точечной мутации (3-5) наблюдается в том случае, когда несовершенный комплекс, образованный двумя олигонуклеотидами и ДНК, имеет один мисматч в точке легирования (Dan Y.Wu and R.Bruce Wallace. Specificity of the nick-closing activity of bacteriophage T4 DNK ligase. Gene (1989) 245-254.State of the art
Closest to the proposed one is a method for identifying the analyzed nucleic acid sequences containing point mutations using an oligonucleotide probe complementary to the analyzed DNA region, obtained by doping in a complementary complex of two oligonucleotides (8 and 14 units long), one of which carries a 32 P-tag. In the presence of a mutation in the site of complementary oligonucleotide binding, the yield of an oligonucleotide probe doped in an imperfect complex decreases compared with the case of the formation of the correct complex. The maximum discrimination factor for point mutations (3-5) is observed when an imperfect complex formed by two oligonucleotides and DNA has one mismatch at the doping point (Dan Y. Wu and R. Bruce Wallace. Specificity of the nick-closing activity of bacteriophage T4 DNK ligase. Gene (1989) 245-254.

Недостатком этого способа является низкая селективность легирования в случае образования неправильных комплексов при наличии точечной мутации в ДНК. Различие в количестве легированного продукта в случае "правильной" и "неправильной" ДНК (фактор дискриминации) составляет 3-5 раз. The disadvantage of this method is the low selectivity of doping in the case of the formation of abnormal complexes in the presence of a point mutation in DNA. The difference in the amount of doped product in the case of “right” and “wrong” DNA (discrimination factor) is 3-5 times.

Раскрытие изобретения
Задачей изобретения является разработка способа высокоселективной (с высоким фактором) диагностики вирусных, генетических и других заболеваний, в основе которых лежат изменения в структуре нуклеиновых кислот, включая точечные мутации.Disclosure of Invention
The objective of the invention is to develop a method of highly selective (with a high factor) for the diagnosis of viral, genetic and other diseases, which are based on changes in the structure of nucleic acids, including point mutations.

Поставленная задача достигается тем, что в качестве олигонуклеотидного зонда используют короткий олигонуклеотид, длиной 4-6 звеньев, который легируют с двух сторон с соответствующими анализируемой последовательности комплементарными олигонуклеотидами или их производными, содержащими полициклические ароматические группировки. При определении мутации последовательность короткого олигонуклеотида выбирают таким образом, что определяемая мутация находится в сайте его связывания. This object is achieved in that a short oligonucleotide of 4-6 units in length is used as an oligonucleotide probe, which is doped on both sides with complementary oligonucleotides or their derivatives containing polycyclic aromatic groups corresponding to the analyzed sequence. When determining a mutation, the sequence of the short oligonucleotide is chosen in such a way that the mutation to be determined is located at its binding site.

Суть предлагаемого подхода состоит в том, что в качестве олигонуклеотидного зонда используют короткий олигонуклеотид (тетра-, пента-, гекса-), который легируется с двумя фланкирующими его с двух сторон короткими олигонуклеотидами (или их производными, несущими полициклические ароматические группировки) в случае образования полного правильного комплементарного комплекса с анализируемой последовательностью ДНК. Обычно в качестве олигонуклеотидных зондов как при выявлении чужеродных нуклеиновых кислот методом гибридизации, так и при определении точечных мутаций с использованием лигазы, используют протяженные олигонуклеотиды, образующие прочные комплементарные комплексы с анализируемыми последовательностями НК. Однако такие олигонуклеотиды способны образовывать достаточно прочные несовершенные комплексы с НК, что приводит к снижению селективности выявления анализируемых последовательностей НК. The essence of the proposed approach is that a short oligonucleotide (tetra-, penta-, hexa-) is used as an oligonucleotide probe, which is doped with two short oligonucleotides flanking it on both sides (or their derivatives bearing polycyclic aromatic groups) in case of formation complete correct complementary complex with the analyzed DNA sequence. Typically, as oligonucleotide probes both in the detection of foreign nucleic acids by hybridization and in the determination of point mutations using ligase, extended oligonucleotides are used, which form strong complementary complexes with the analyzed NK sequences. However, such oligonucleotides are capable of forming fairly strong imperfect complexes with NK, which leads to a decrease in the selectivity of the identification of the analyzed NK sequences.

Короткие олигонуклеотиды, особенно тетрануклеотиды, в физиологических условиях обладают крайне низкими гибридизационными свойствами. В предлагаемом способе короткий олигонуклеотидный зонд (тетра- гекса- мер) фланкирован с двух сторон олигонуклеотидами или их производными, несущими стабилизирующий комплекс группами, что способствует образованию комплементарного комплекса олигонуклеотидного зонда с анализируемой последовательностью. Комплекс короткого олигонуклеотидного зонда (тетра- гекса- мера) стабилизируется кооперативными взаимодействиями между концевыми нуклеотидными остатками при образовании правильных тандемных комплексов. В случае наличия мутации в сайте связывания короткого олигонуклеотидного зонда стабильность его комплекса существенно снижается, что и является причиной высокой селективности данного подхода. Дополнительным фактором, способствующим повышению селективности легирования предложенных тандемов олигонуклеотидных зондов, является способность фермента узнавать неправильные комплементарные участки длиной в 2-3 нуклеотидных звена от точки легирования, как это было продемонстрировано в работе Kazuo Harada and Leslie E.Orgel "Unexpective substrate specificity of T4 DNA ligase revaled by in vitro selection. Nucleic Acids Research, 1993, 21, 2287-2291 при легировании модельных олигонуклеотидов, способных формировать шпилечные структуры. Short oligonucleotides, especially tetranucleotides, under physiological conditions have extremely low hybridization properties. In the proposed method, a short oligonucleotide probe (tetrahexamer) is flanked on both sides by oligonucleotides or their derivatives bearing stabilizing complex groups, which contributes to the formation of a complementary complex of the oligonucleotide probe with the analyzed sequence. The complex of a short oligonucleotide probe (tetrahexamer) is stabilized by cooperative interactions between terminal nucleotide residues during the formation of regular tandem complexes. In the case of a mutation in the binding site of a short oligonucleotide probe, the stability of its complex is significantly reduced, which is the reason for the high selectivity of this approach. An additional factor contributing to an increase in the selectivity of doping of the proposed tandems of oligonucleotide probes is the ability of the enzyme to recognize irregular complementary regions 2-3 nucleotide units long from the doping point, as was demonstrated by Kazuo Harada and Leslie E. Orgel "Unexpective substrate specificity of T4 DNA ligase revaled by in vitro selection Nucleic Acids Research, 1993, 21, 2287-2291 by doping model oligonucleotides capable of forming hairpin structures.

Способ экономичен, методически прост, работает в широком диапазоне температур и концентраций олигонуклеотидов. Фактор дискриминации последовательностей, содержащих мутации, превышает 100. The method is economical, methodologically simple, works in a wide range of temperatures and concentrations of oligonucleotides. The discrimination factor for sequences containing mutations exceeds 100.

Исследование проводили на нуклеиновых кислотах, являющихся продуктами симметричной амплификации ДНК (P0 - правильная мишень, P1-P4 - мишени, содержащие все двенадцать возможных точечных замен в центральной четырехнуклеотидной области) (см. схему в конце описания). The study was performed on nucleic acids, which are products of symmetric amplification of DNA (P0 is the correct target, P1-P4 are targets containing all twelve possible point substitutions in the central four-nucleotide region) (see the diagram at the end of the description).

pNn-олигонуклеотид или его производное, несущее полициклическую ароматическую группировку, (n ≥ 6).pN n is an oligonucleotide or its derivative bearing a polycyclic aromatic moiety (n ≥ 6).

Варианты осуществления изобретения
Пример 1. P0, концентрация от 10-8 до 10-5 M, последовательность тетрануклеотидного зонда и пары олигонуклеотидов (или их производных, несущих полициклические ароматические группировки) полностью комплементарна участку ДНК, концентрация зонда и олигонуклеотидов от 10-8 до 10-5 М. Зонд содержит 32P-метку или олигонуклеотид II содержит остаток флюоресцеина. Реакцию легирования проводили в лигазном буфере в 15 мл при T = 20, 25, 37oC в течение 15-30 мин. Анализ продуктов легирования проводили электрофорезом в 20% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.Embodiments of the invention
Example 1. P0, concentration from 10 -8 to 10 -5 M, the sequence of the tetranucleotide probe and a pair of oligonucleotides (or their derivatives carrying polycyclic aromatic groups) is completely complementary to the DNA site, the concentration of the probe and oligonucleotides from 10 -8 to 10 -5 M The probe contains a 32 P-tag or oligonucleotide II contains a fluorescein residue. The doping reaction was carried out in 15 ml ligase buffer at T = 20, 25, 37 o C for 15-30 minutes The analysis of doping products was carried out by electrophoresis in a 20% polyacrylamide gel under denaturing conditions.

Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 30- 40%. The yield of the doped product, according to electrophoresis, was 30-40%.

Пример 1а. Эксперименты проводили, как описано в примере 1. В качестве олигонуклеотидного зонда использовали тетрануклеотид, который легировали с парой производных олигонуклеотидов, несущих группировки на основе феназина. Example 1a The experiments were carried out as described in example 1. As the oligonucleotide probe, a tetranucleotide was used, which was doped with a pair of derivatives of oligonucleotides carrying phenazine-based groups.

Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 35-40%. The yield of the doped product, according to electrophoresis, was 35-40%.

Пример 2. Эксперименты проводили, как описано в примере 1. В качестве короткого олигонуклеотидного зонда использовали гексануклеотид. Выход легированного продукта составлял 50-60%. Example 2. The experiments were carried out as described in example 1. As a short oligonucleotide probe used hexanucleotide. The yield of the doped product was 50-60%.

Пример 3. Эксперименты проводили, как описано в примере 1. В качестве олигонуклеотидного зонда использовали додекануклеотид, который легировали с октануклеотидом (использовали олигонуклеотиды, близкие по длине к описанным в прототипе). Example 3. The experiments were carried out as described in example 1. As an oligonucleotide probe, a dodecanucleotide that was doped with an octanucleotide was used (oligonucleotides were used that were close in length to those described in the prototype).

Выход легированного продукта составлял 60-70%. The yield of the doped product was 60-70%.

Пример 4. Эксперименты проводили, как описано в примере 1. В качестве олигонуклеотидного зонда использовали тетрануклеотид, который легировали с одним октануклеотидом. Example 4. The experiments were carried out as described in example 1. As the oligonucleotide probe used tetranucleotide, which was doped with one octanucleotide.

Выход легированного продукта составлял 0%. The yield of the doped product was 0%.

Пример 5. P1 (X = A), концентрация от 10-8 до 10-5 M, комплементарный комплекс - P1 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Концентрация зонда и олигонуклеотидов от 10-8 до 10-5 М. Зонд содержит 32P-метку или олигонуклеотид II содержит остаток флюоресцеина. Реакцию легирования проводили в лигазном буфере в 15 мл при T = 20, 25, 37oC в течение 15-30 мин. Анализ продуктов легирования проводили электрофорезом в 20% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.Example 5. P1 (X = A), concentration from 10 -8 to 10 -5 M, complementary complex — P1 + oligonucleotide 1 + tetranucleotide probe + oligonucleotide II (or oligonucleotide derivatives bearing polycyclic aromatic groups). The concentration of the probe and oligonucleotides is from 10 -8 to 10 -5 M. The probe contains a 32 P-tag or oligonucleotide II contains a fluorescein residue. The doping reaction was carried out in 15 ml ligase buffer at T = 20, 25, 37 o C for 15-30 minutes The analysis of doping products was carried out by electrophoresis in a 20% polyacrylamide gel under denaturing conditions.

Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%. The yield of the doped product, according to electrophoresis, was 0%.

Пример 6. P1 (X = T), концентрация от 10-8 до 10-5 М, комплементарный комплекс - P1 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Эксперименты проводили, как описано в примере 5.Example 6. P1 (X = T), concentration from 10 -8 to 10 -5 M, complementary complex - P1 + oligonucleotide 1 + tetranucleotide probe + oligonucleotide II (or oligonucleotide derivatives bearing polycyclic aromatic groups). The experiments were carried out as described in example 5.

Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%. The yield of the doped product, according to electrophoresis, was 0%.

Пример 7. P1 (X = C), концентрация от 10-8 до 10-5 М, комплементарный комплекс - P1 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Эксперименты проводили, как описано в примере 5.Example 7. P1 (X = C), concentration from 10 -8 to 10 -5 M, complementary complex - P1 + oligonucleotide 1 + tetranucleotide probe + oligonucleotide II (or oligonucleotide derivatives bearing polycyclic aromatic groups). The experiments were carried out as described in example 5.

Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%. The yield of the doped product, according to electrophoresis, was 0%.

Пример 8. P1 (X = A), концентрация от 10-8 до 10-5 М, комплементарный комплекс - P1 + олигонуклеотид 1 + гексануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Эксперименты проводили, как описано в примере 5.Example 8. P1 (X = A), concentration from 10 -8 to 10 -5 M, complementary complex - P1 + oligonucleotide 1 + hexanucleotide probe + oligonucleotide II (or oligonucleotide derivatives bearing polycyclic aromatic groups). The experiments were carried out as described in example 5.

Выход легированного продукта составлял 5-7%. The yield of doped product was 5-7%.

Пример 9. P1 (X = A), концентрация от 10-8 до 10-5 М, комплементарный комплекс - P1 + додекануклеотид + октануклеотид (использовали олигонуклеотиды, близкие по длине к описанным в прототипе). Эксперименты проводили, как описано в примере 5 (X = A).Example 9. P1 (X = A), concentration from 10 -8 to 10 -5 M, complementary complex - P1 + dodecanucleotide + octanucleotide (used oligonucleotides close in length to those described in the prototype). The experiments were carried out as described in example 5 (X = A).

Выход легированного продукта составлял 30-40%. The yield of the doped product was 30-40%.

Пример 10. P2 (X = A), концентрация от 10-8 до 10-5 М, комплементарный комплекс - P2 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Концентрация зонда и олигонуклеотидов от 10-8 до 10-5 M. Зонд содержит 32P-метку или олигонуклеотид II содержит остаток флюоресцеина. Реакцию легирования проводили в лигазном буфере в 15 мл при T = 20, 25, 37oC в течение 15-30 мин. Анализ продуктов легирования проводили электрофорезом в 20% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.Example 10. P2 (X = A), concentration from 10 -8 to 10 -5 M, complementary complex - P2 + oligonucleotide 1 + tetranucleotide probe + oligonucleotide II (or derivatives of oligonucleotides bearing polycyclic aromatic groups). The concentration of the probe and oligonucleotides is from 10 -8 to 10 -5 M. The probe contains a 32 P-tag or oligonucleotide II contains a fluorescein residue. The doping reaction was carried out in 15 ml ligase buffer at T = 20, 25, 37 o C for 15-30 minutes The analysis of doping products was carried out by electrophoresis in a 20% polyacrylamide gel under denaturing conditions.

Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%. The yield of the doped product, according to electrophoresis, was 0%.

Пример 11. P2 (X = T), концентрация от 10-8 до 10-5 М, комплементарный комплекс - P2 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид III (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Эксперименты проводили, как описано в примере 10.Example 11. P2 (X = T), concentration from 10 -8 to 10 -5 M, complementary complex - P2 + oligonucleotide 1 + tetranucleotide probe + oligonucleotide III (or derivatives of oligonucleotides bearing polycyclic aromatic groups). The experiments were performed as described in example 10.

Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%. The yield of the doped product, according to electrophoresis, was 0%.

Пример 12. P2 (X = G), концентрация от 10-8 до 10-5 М, комплементарный комплекс - P2 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Эксперименты проводили, как описано в примере 10.Example 12. P2 (X = G), concentration from 10 -8 to 10 -5 M, complementary complex - P2 + oligonucleotide 1 + tetranucleotide probe + oligonucleotide II (or derivatives of oligonucleotides bearing polycyclic aromatic groups). The experiments were performed as described in example 10.

Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%. The yield of the doped product, according to electrophoresis, was 0%.

Пример 13. P3 (X = A), концентрация от 10-8 до 10-5 М, комплементарный комплекс - P3 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Концентрация зонда и олигонуклеотидов от 10-8 до 10-5 М. Зонд содержит 32P или олигонуклеотид II содержит остаток флюоресцеина. Реакцию легирования проводили в лигазном буфере в 15 мл при T = 20, 25, 37oC в течение 15-30 мин. Анализ продуктов легирования проводили электрофорезом в 20% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.Example 13. P3 (X = A), concentration from 10 -8 to 10 -5 M, complementary complex - P3 + oligonucleotide 1 + tetranucleotide probe + oligonucleotide II (or oligonucleotide derivatives bearing polycyclic aromatic groups). The concentration of the probe and oligonucleotides is from 10 -8 to 10 -5 M. The probe contains 32 P or oligonucleotide II contains a fluorescein residue. The doping reaction was carried out in 15 ml ligase buffer at T = 20, 25, 37 o C for 15-30 minutes The analysis of doping products was carried out by electrophoresis in a 20% polyacrylamide gel under denaturing conditions.

Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%. The yield of the doped product, according to electrophoresis, was 0%.

Пример 14. P3 (X = C), концентрация от 10-8 до 10-5 М, комплементарный комплекс - P3 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Эксперименты проводили, как описано в примере 13.Example 14. P3 (X = C), concentration from 10 -8 to 10 -5 M, complementary complex - P3 + oligonucleotide 1 + tetranucleotide probe + oligonucleotide II (or oligonucleotide derivatives carrying polycyclic aromatic groups). The experiments were carried out as described in example 13.

Выход легированного продукта, по данным электрофореза составлял 0%. The yield of the doped product, according to electrophoresis, was 0%.

Пример 15. P3 (X = G), концентрация от 10-8 до 10-5 М, комплементарный комплекс - P3 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Эксперименты проводили, как описано в примере 13.Example 15. P3 (X = G), concentration from 10 -8 to 10 -5 M, complementary complex - P3 + oligonucleotide 1 + tetranucleotide probe + oligonucleotide II (or oligonucleotide derivatives carrying polycyclic aromatic groups). The experiments were carried out as described in example 13.

Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%. The yield of the doped product, according to electrophoresis, was 0%.

Пример 16. P4 (X = A), концентрация от 10-8 до 10-5 М, комплементарный комплекс - P4 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II. Концентрация зонда и олигонуклеотидов от 10-8 до 10-5 М. Зонд содержит 32P или олигонуклеотид II содержит остаток флюоресцеина. Реакцию легирования проводили в лигазном буфере в 15 мл при T = 20, 25, 37oC в течение 15-30 мин. Анализ продуктов легирования проводили электрофорезом в 20% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.Example 16. P4 (X = A), concentration from 10 -8 to 10 -5 M, complementary complex - P4 + oligonucleotide 1 + tetranucleotide probe + oligonucleotide II. The concentration of the probe and oligonucleotides is from 10 -8 to 10 -5 M. The probe contains 32 P or oligonucleotide II contains a fluorescein residue. The doping reaction was carried out in 15 ml ligase buffer at T = 20, 25, 37 o C for 15-30 minutes The analysis of doping products was carried out by electrophoresis in a 20% polyacrylamide gel under denaturing conditions.

Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%. The yield of the doped product, according to electrophoresis, was 0%.

Пример 17. P4 (X = T), концентрация от 10-8 до 10-5 М, комплементарный комплекс - P4 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Эксперименты проводили, как описано в примере 16.Example 17. P4 (X = T), concentration from 10 -8 to 10 -5 M, complementary complex - P4 + oligonucleotide 1 + tetranucleotide probe + oligonucleotide II (or oligonucleotide derivatives bearing polycyclic aromatic groups). The experiments were performed as described in example 16.

Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%. The yield of the doped product, according to electrophoresis, was 0%.

Пример 18. P4 (X = C), концентрация от 10-8 до 10-5 М, комплементарный комплекс - P4 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Эксперименты проводили, как описано в примере 16.Example 18. P4 (X = C), concentration from 10 -8 to 10 -5 M, complementary complex - P4 + oligonucleotide 1 + tetranucleotide probe + oligonucleotide II (or oligonucleotide derivatives bearing polycyclic aromatic groups). The experiments were performed as described in example 16.

Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%. The yield of the doped product, according to electrophoresis, was 0%.

Эффективность метода выявления точечных мутаций в последовательностях нуклеиновых кислот определяют по фактору дискриминации, который рассчитывают как отношение выхода легированного продукта в случае полной комплементации с последовательностью, не содержащей точечную мутацию, к выходу легированного продукта в случае последовательности, содержащей точечную мутацию. Чем выше фактор дискриминации, тем эффективнее метод выявления мутации, тем точнее определение последовательности НК. The effectiveness of the method for detecting point mutations in nucleic acid sequences is determined by the discrimination factor, which is calculated as the ratio of the yield of the doped product in the case of full complementation with the sequence that does not contain a point mutation, to the yield of the doped product in the case of a sequence containing point mutation. The higher the discrimination factor, the more effective the method for detecting mutations, the more accurate the determination of the sequence of NK.

Как видно из приведенных в таблице данных, использование короткого тетрануклеотидного зонда дает наиболее высокий фактор дискриминации, во много раз превышающий фактор дискриминации, полученный в прототипе или в условиях, описанных в прототипе. Это обеспечивает надежность выявления заранее заданных последовательностей в нуклеиновых кислотах, в том числе содержащих точечные мутации. As can be seen from the data in the table, the use of a short tetranucleotide probe gives the highest discrimination factor, many times higher than the discrimination factor obtained in the prototype or under the conditions described in the prototype. This ensures the reliability of detection of predetermined sequences in nucleic acids, including those containing point mutations.

Claims (3)

1. Способ выявления анализируемой последовательности нуклеиновых кислот, включающий гибридизацию комплементарной анализируемой последовательности олигонуклеотидного зонда, несущего репортерную группу, отличающийся тем, что детекция любой последовательности осуществляется по факту лигирования короткого олигонуклеотида (длиной 4 - 6 звеньев) с фланкирующими олигонуклеотидными последовательностями или их производными, несущими полициклические ароматические группировки. 1. A method for detecting an analyzed nucleic acid sequence, including hybridization of a complementary analyzed sequence of an oligonucleotide probe carrying a reporter group, characterized in that any sequence is detected by ligating a short oligonucleotide (4-6 units long) with flanking oligonucleotide sequences or their derivatives, polycyclic aromatic groups. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что выявляют последовательности нуклеиновых кислот, включающие точечные мутации. 2. The method according to claim 1, characterized in that detect nucleic acid sequences, including point mutations. 3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что при определении мутации последовательность короткого олигонуклеотида выбирают таким образом, что определяемая мутация находится в сайте его связывания. 3. The method according to PP. 1 and 2, characterized in that when determining the mutation, the sequence of the short oligonucleotide is chosen in such a way that the mutation to be determined is located at its binding site.
RU98100753A 1996-04-11 1996-04-11 Method of detection of analyzed sequence of nucleic acid RU2146707C1 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU1996/000087 WO1997038131A1 (en) 1996-04-11 1996-04-11 Method for detecting a nucleic acid chain to be analysed

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU98100753A RU98100753A (en) 1999-12-10
RU2146707C1 true RU2146707C1 (en) 2000-03-20

Family

ID=20129992

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU98100753A RU2146707C1 (en) 1996-04-11 1996-04-11 Method of detection of analyzed sequence of nucleic acid

Country Status (3)

Country Link
FR (1) FR2747396B3 (en)
RU (1) RU2146707C1 (en)
WO (1) WO1997038131A1 (en)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7108973B2 (en) * 2002-03-20 2006-09-19 Ken-Shwo Dai Human PEN11B-related gene variant associated with lung cancers
US8586301B2 (en) 2010-06-30 2013-11-19 Stratos Genomics, Inc. Multiplexed identification of nucleic acid sequences

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4935341A (en) * 1986-06-04 1990-06-19 Whitehead Institute For Biomedical Research Detection of point mutations in neu genes
SU1678838A1 (en) * 1989-05-03 1991-09-23 Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения Method for detection of nucleotide sequence
FR2663040B1 (en) * 1990-06-11 1995-09-15 Bio Merieux METHOD OF DETECTING A NUCLEOTIDE SEQUENCE ACCORDING TO THE SANDWICH HYBRIDIZATION TECHNIQUE.
NZ240079A (en) * 1990-10-09 1993-07-27 Boehringer Mannheim Gmbh Method for the detection of a nucleic acid or part thereof
EP0557456A4 (en) * 1990-11-14 1995-11-15 Siska Diagnostics Inc Non-isotopic detection of nucleic acids using a polystyrene support-based sandwich hybridization assay and compositions useful therefor

Also Published As

Publication number Publication date
FR2747396A1 (en) 1997-10-17
FR2747396B3 (en) 1998-07-17
WO1997038131A1 (en) 1997-10-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Millan et al. Sequence-selective biosensor for DNA based on electroactive hybridization indicators
Sawadogo Multiple forms of the human gene-specific transcription factor USF. II. DNA binding properties and transcriptional activity of the purified HeLa USF.
US9938573B2 (en) Methods and kits for nucleic acid sequencing
Xu et al. Nonenzymatic autoligation in direct three-color detection of RNA and DNA point mutations
US8969002B2 (en) Methods and systems for electronic sequencing
Drobyshev et al. Sequence analysis by hybridization with oligonucleotide microchip: identification of β-thalassemia mutations
Sforza et al. Food analysis and food authentication by peptide nucleic acid (PNA)-based technologies
US20110210017A1 (en) Fabrication of electrochemical biosensors via click chemistry
US10131944B2 (en) Molecular adapter for capture and manipulation of transfer RNA
JPH07184698A (en) Composition for labelling
JP2009148284A (en) Electrochemically active compound
WO2000079008B1 (en) High throughput assay system
US20100092972A1 (en) Assay for gene expression
Chen et al. Sequence-specific scission of DNA by the chemical nuclease activity of 1, 10-phenanthroline-copper (I) targeted by RNA.
US20210017580A1 (en) Small rna detection method based on small rna primed xenosensor module amplification
JP2005508198A (en) System for detecting biological material in a sample
Goldman et al. High affinity γPNA sandwich hybridization assay for rapid detection of short nucleic acid targets with single mismatch discrimination
Bartošík et al. Electrochemical detection of 5-methylcytosine in bisulfite-treated DNA
RU2146707C1 (en) Method of detection of analyzed sequence of nucleic acid
WO2005005952A2 (en) Electrocatalytic nucleic acid hybridization detection
WO2021155166A1 (en) A cas9-pdbd base editor platform with improved targeting range and specificity
US20030013671A1 (en) Genomic DNA library
KR100482718B1 (en) Nucleic Acid Probe-Immobilized Substrate and Method of Detecting the Presence of Target Nucleic Acid by Using the Same
JPH0376600A (en) Detection of gene variation
EP0181635A3 (en) Probes and methods useful for detecting chromosomal translocations

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20090412