Изобретение относится к медицине, к области патофизиологии и иммунологии. Описан способ определения фагоцитарной активности лейкоцитов путем приготовления мазков крови на предметных стеклах после предварительной 30-минутной инкубации ее при 37oC с окрашенными анилиновым черным микробами; фиксацией их высушиванием на воздухе и обработкой метиловым алкоголем с последующим окрашиванием их 2% водным раствором метилового зеленого в течение 15 минут и докрашиванием 0,1% водным раствором эозина; последующей отмывкой мазка от избытка красителей, повторным высушиванием его и подсчетом ста или в лучшем случае несколько сот лейкоцитов (Авторское свидетельство N 4345976/14 "Способ определения фагоцитарной активности нейтрофилов").The invention relates to medicine, to the field of pathophysiology and immunology. A method for determining the phagocytic activity of leukocytes by preparing blood smears on slides after a preliminary 30-minute incubation at 37 o C with stained aniline black microbes is described; fixing them by drying in air and treating with methyl alcohol, followed by staining them with a 2% aqueous solution of methyl green for 15 minutes and staining them with a 0.1% aqueous solution of eosin; subsequent washing of the smear from excess dyes, re-drying it and counting a hundred or at best several hundred leukocytes (Copyright certificate N 4345976/14 "Method for determining the phagocytic activity of neutrophils").
Задачей изобретения является улучшение дифференцировки объекта фагоцитоза от субцеллюлярных частиц лейкоцитов, упрощение технологии и сокращение расхода времени. The objective of the invention is to improve the differentiation of the object of phagocytosis from subcellular leukocyte particles, simplifying the technology and reducing time consumption.
Решение поставленной задачи достигается путем замены определения показателей фагоцитоза (фагоцитарного числа, индекса захвата) в мазках на предметных стеклах, фиксацией их, окрашиванием, отмывкой и повторным высушиванием - на определение их в счетной камере Горяева с использованием в качестве объекта фагоцитоза клеток пекарских дрожжей (ПД), меченных предварительно трепановой синькой в интенсивно синий цвет, что обеспечивает хорошую дифференцируемость их от субцеллюлярных частиц фагоцитов; подготовка ПД не требует специальной микробиологической технологии, как в случае использования микробов в качестве объекта фагоцитоза; дополнительно отпадает необходимость в отдельном подсчете общего (абсолютного) числа лейкоцитов для перевода процентных величин показателей фагоцитоза в абсолютные величины в 1 мкл. Способ осуществляется следующим образом. Готовят взвесь клеток ПД. Для этого вносят в центрифужную пробирку на 10 мл 20-50 мг замороженных ПД, хранимых в холодильнике, добавляют 4 мл дистиллированной воды, инкубируют 5-10 мин при 37oC, периодически встряхивая пробирку. Переносят 0,4 мл полученной взвеси в пробирку объемом на 10 мл, добавляют 1,5-2 мл 10% водного раствора трипановой синьки, смесь кипятят на водяной бане 30 мин, центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин, супернатант сливают. Осадок, состоящий из меченных трипановой синькой (ТС) клеток ПД, отмывают от свободного избытка ТС, обычно двукратно добавлением 3 мл дистиллированной воды, центрифугируют при 1000 об/мин. Признаком достаточной отмывки является просветление супернатанта, который сливают; к полученному осадку добавляют 1,2 мл плазмы крови IV группы человека (для опсонизации), инкубируют 30 мин при 37oC; центрифугируют; осадок отмывают от избытка свободной плазмы добавлением 2 мл физ.раствора (0,9%) поваренной соли и последующим повторным центрифугированием при 1000 об/мин 7 мин; осадок ресуспендируют в 0,4 мл физиологического раствора (0,9%) поваренной соли. Приготовленную взвесь ПД можно хранить для опытов в холодильнике при 4oC в течение 3-6 дней. Параллельно выделяют лейкомассу из 5-6 мл исследуемой гепаринизированной крови путем отстаивания в течение 1,5-2 часов и последовательного центрифугирования при 500 и 1000 об/мин (60-200 g) 10 мин; лейкомассу освобождают от примеси эритроцитов "мягким" осмолизисом дистиллированной водой в течение 1-2 с, с последующим добавлением к системе гипертонического (3,6%) раствора поваренной соли из расчета 1 мл 3,6% раствора NaCl на 3 мл H2О. Центрифугируют; к осадку лейкоцитов добавляют 0,5-1 мл физиологического раствора (0,9%) NaCl. Подсчитывают в камере Горяева исходную концентрацию лейкоцитов и готовят взвесь лейкоцитов, содержащую 12-25 тыс. клеток в 1 мкл. Подробно технология выделения лейкомассы описана в авторском свидетельстве N 1735784 "Способ определения супероксидного анион-радикала при фагоцитозе" (Бюлл. "Изобретения", 1992, N 19 и журнал "Патологическая физиология и экспериментальная терапия", 1991, N 1: с.46-50).The solution to this problem is achieved by replacing the determination of phagocytosis indicators (phagocytic number, capture index) in smears on glass slides, fixing them, staining, washing and re-drying them by determining them in the Goryaev counting chamber using baker's yeast cells as an object of phagocytosis (PD ), previously labeled with trepan blue in intensely blue color, which ensures their good differentiability from subcellular particles of phagocytes; preparation of PD does not require special microbiological technology, as in the case of using microbes as an object of phagocytosis; additionally, there is no need for a separate calculation of the total (absolute) number of leukocytes to convert the percentage values of phagocytosis to absolute values of 1 μl. The method is as follows. Prepare a suspension of PD cells. To do this, add to the centrifuge tube for 10 ml 20-50 mg of frozen PD stored in the refrigerator, add 4 ml of distilled water, incubate for 5-10 minutes at 37 o C, periodically shaking the tube. Transfer 0.4 ml of the obtained suspension to a 10 ml test tube, add 1.5-2 ml of a 10% aqueous solution of trypan blue, the mixture is boiled in a water bath for 30 minutes, centrifuged for 10 minutes at 1000 rpm, the supernatant is drained. The precipitate consisting of trypan blue-labeled (TS) PD cells is washed from a free excess of TS, usually twice by adding 3 ml of distilled water, centrifuged at 1000 rpm. A sign of sufficient washing is the enlightenment of the supernatant, which is drained; 1.2 ml of human blood plasma of group IV is added to the obtained precipitate (for opsonization), incubated for 30 min at 37 ° C; centrifuged; the precipitate is washed from the excess of free plasma by adding 2 ml of saline solution (0.9%) of sodium chloride and subsequent repeated centrifugation at 1000 rpm for 7 min; the precipitate is resuspended in 0.4 ml of physiological saline (0.9%) sodium chloride. The prepared suspension of PD can be stored for experiments in the refrigerator at 4 o C for 3-6 days. In parallel, leukomass is isolated from 5-6 ml of the studied heparinized blood by settling for 1.5-2 hours and sequential centrifugation at 500 and 1000 rpm (60-200 g) for 10 minutes; the leukomass is freed from red blood cell impurities by “soft” osmolysis with distilled water for 1-2 s, followed by the addition of hypertonic (3.6%) sodium chloride solution to the system at the rate of 1 ml of 3.6% NaCl solution in 3 ml of H 2 O. Centrifuged; 0.5-1 ml of physiological saline (0.9%) NaCl is added to the white blood cell sediment. The initial concentration of leukocytes is counted in the Goryaev's chamber and a suspension of leukocytes containing 12-25 thousand cells in 1 μl is prepared. The leukomass isolation technology is described in detail in copyright certificate N 1735784 "Method for the determination of superoxide anion radical in phagocytosis" (Bull. "Inventions", 1992, N 19 and the journal "Pathological physiology and experimental therapy", 1991, N 1: p. 46- 50).
Выравнивают концентрации меченных трипановой синькой клеток ПД добавлением физиологического раствора (0,9% NaCl) так, чтобы величина ее превышала концентрацию лейкоцитов минимум в 3-5 раз. Готовят фагоцитарную смесь, состоящую из 0,4 мл приготовленной лейкомассы (12-15 тыс. грануло- и моноцитов в 1 мкл) и 0,4 мл взвеси меченных трипановой синькой и опсонизированных клеток ПД, инкубируют смесь при 37oC 40 минут. После окончания инкубации к 0,19 мл "фагоцитарной смеси" добавляют для фиксации и слабой светло-синей окраски лейкоцитов 0,38 мл 3% уксусной кислоты и 0,015 мл 1% метиленовой синьки. Каплю полученной смеси вводят в камеру Горяева. Лейкоциты и их субцеллюлярные частицы окрашиваются в светло-синий цвет, четко отличающиеся от окрашенных в темно-синий или фиолетовый цвет клеток ПД. Лейкоциты имеют вид точно такой, как показано в гематологическом практикуме (см. Козловская Л.В. , Мартынова М.А. "Учебное пособие по клиническим методам исследования". - М. Медицина, 1975. - с. 60-63); клетки ПД по форме близки к шарикам, сходным с тромбоцитами.The concentrations of trypan blue-labeled PD cells are equalized by adding physiological saline (0.9% NaCl) so that its value exceeds the leukocyte concentration by a minimum of 3-5 times. A phagocytic mixture is prepared, consisting of 0.4 ml of the prepared leukomass (12-15 thousand granulo- and monocytes in 1 μl) and 0.4 ml of suspension labeled with trypan blue and opsonized PD cells, the mixture is incubated at 37 ° C for 40 minutes. After incubation, 0.18 ml of the “phagocytic mixture” is added for fixation and weak light blue staining of leukocytes 0.38 ml of 3% acetic acid and 0.015 ml of 1% methylene blue. A drop of the resulting mixture is introduced into the Goryaev chamber. White blood cells and their subcellular particles are stained in light blue, clearly differing from PD cells stained in dark blue or purple. White blood cells look exactly the same as shown in a hematological workshop (see Kozlovskaya L.V., Martynova M.A. "Textbook for clinical research methods." - M. Medicine, 1975. - S. 60-63); PD cells are similar in shape to balls similar to platelets.
Подсчитывают: 1. Общее абсолютное количество лейкоцитов в 100 больших квадратах сетки камеры Горяева; 2. Число фагоцитов, захвативших клетки ПД - абсолютное и процентное - это фагоцитарное число; 3. Количество клеток ПД в каждом фагоците, захватившем их; суммируют их и делят на фагоцитарное число - это индекс захвата; 4. Наконец умножают фагоцитарное число в абсолютном и процентном выражении на индекс захвата - это общая фагоцитарная емкость - абсолютная (в 1 мкл) и процентная. Считают число клеток с помощью объектива 20 и окуляра 15 или объектива 70 с водной иммерсией и окуляра 10. They calculate: 1. The total absolute number of leukocytes in 100 large squares of the grid of the Goryaev chamber; 2. The number of phagocytes that captured PD cells — absolute and percentage — is the phagocytic number; 3. The number of PD cells in each phagocyte that captured them; summarize them and divide by the phagocytic number - this is the capture index; 4. Finally, multiply the phagocytic number in absolute and percentage terms by the capture index - this is the total phagocytic capacity - absolute (in 1 μl) and percentage. Count the number of cells using the lens 20 and the eyepiece 15 or lens 70 with water immersion and the eyepiece 10.
Пример: Из 5-6 мл гепаринизированой крови венозной крови пациента или донора выделяем отстаиванием и последовательным центрифугированием при 500-1000 об/мин лейкомассу, готовят взвесь лейкоцитов (содержащую фагоциты - грануло- и моноциты) с конечной концентрацией 12-25 тыс. в 1 мкл. В качестве объекта фагоцитоза используют заранее меченные трипановой синькой в интенсивно синий цвет ПД. Подсчитывают концентрацию клеток ПД в 1 мкл и выравнивают ее так, чтобы на 1 лейкоцит приходилось 3-5 или более клеток ПД. 0,4 мл взвеси лейкоцитов инкубируют с 0,4 мл взвеси клеток ПД при 37oC в течение 40 мин. К 0,19 мл инкубированной смеси добавляют для фиксации и слабой окраски лейкоцитов 0,38 мл 3% уксусной кислоты и 0,015 мл 1% метиленовой синьки; каплю этой смеси вводят в камеру Горяева; лейкоциты и их субцеллюлярные частицы окрашены в светло-синий цвет и четко отличимы от окрашенных в темно-синий цвет клеток ПД, имеющих круглую форму (d=2-2,5 мкм) и сходных с тромбоцитами. Лейкоциты имеют вид точно такой, как показано на выпускаемых медучпособиях и гематологических таблицах. Подсчитывают в 100 больших квадратах сетки камеры Горяева с последующим переводом в 1 мкл общее число лейкоцитов, оно было равно у пациента - 12000 в 1 мкл, фагоцитарное число - абсолютное = 5500 в 1 мкл взвеси, процентное = 45,8, индекс захвата через 40 минут = 1,4 клеток ПД. Рассчитывают общую фагоцитарную емкость путем умножения индекса захвата на фагоцитарное число - его абсолютную (в 1 мкл) и процентную величины. Фагоцитарная емкость равна: абсолютная - 7700 клеток ПД, и процентная 45,8 • 1,4 = 64.12 клеток ПД.Example: From 5-6 ml of heparinized blood of venous blood of a patient or donor, we isolate leukomassa by sedimentation and sequential centrifugation at 500-1000 rpm, a suspension of leukocytes (containing phagocytes - granule and monocytes) with a final concentration of 12-25 thousand in 1 μl As an object of phagocytosis, pre-labeled trypan blue in intensely blue color of PD is used. Count the concentration of PD cells in 1 μl and level it so that 3-5 cells or more are PD cells per 1 leukocyte. 0.4 ml of white blood cell suspension is incubated with 0.4 ml of suspension of PD cells at 37 ° C. for 40 minutes. 0.38 ml of 3% acetic acid and 0.015 ml of 1% methylene blue are added to 0.19 ml of the incubated mixture for fixation and weak staining of leukocytes; a drop of this mixture is introduced into the Goryaev chamber; leukocytes and their subcellular particles are stained in light blue and clearly distinguishable from dark blue stained PD cells having a round shape (d = 2-2.5 μm) and similar to platelets. White blood cells look exactly the same as shown on medical manuals and hematological tables. Goryaev’s chamber was counted in 100 large squares of the grid with subsequent transfer to 1 μl of the total number of leukocytes, it was equal to 12,000 in 1 μl in the patient, the phagocytic number was absolute = 5500 in 1 μl of suspension, percentage = 45.8, capture index through 40 minutes = 1.4 PD cells. The total phagocytic capacity is calculated by multiplying the capture index by the phagocytic number — its absolute (in 1 μl) and percentage value. The phagocytic capacity is: absolute - 7700 PD cells, and percentage 45.8 • 1.4 = 64.12 PD cells.