RU2136294C1

RU2136294C1 - Composition containing preparation of clotting factor viii, method of its preparing and use of surface-active substance as stabilizing agent

Info

Publication number: RU2136294C1
Application number: RU94032143A
Authority: RU
Inventors: Эстерберг Томас; Фатоурос Ангелика
Original assignee: Генетик Институт Инк.
Priority date: 1992-10-02
Filing date: 1993-10-01
Publication date: 1999-09-10
Also published as: SE9302006D0; RU94032143A

Abstract

FIELD: medicine, pharmacy. SUBSTANCE: pharmaceutical composition has recombinant clotting factor VIII, polysorbate-80 as a stabilizing agent for prolonged storage and sodium or potassium chloride, calcium salt and L-histidine for system buffering. Method of preparing the claimed composition involves mixing clotting factor VIII with polysorbate-80 and other components or chromatography purification of recombinant clotting factor VIII and its eluting at the last stage of purification with a buffer containing polysorbate-80. Invention relates to also the use of polysorbate-80 as a stabilizing agent of the composition containing recombinant clotting factor VIII. Invention can be used for treatment of patients with hemophilia. EFFECT: stable at storage pharmaceutical composition without an albumiv addition. 22 cl, 2 dwg, 12 ex

Description

Изобретение относится к новым композициям, содержащим фактор коагуляции VIII и неионогенное поверхностно-активное вещество, такое как блок-сополимер, например, полиоксамер, или сложный эфир полиоксиэтиленового (20) производного сорбита с жирной кислотой, в частности, полисорбат 20 или полисорбат 80. Композиция может также включать хлорид натрия, хлорид кальция, L-гистидин и/или сахара и/или спирты сахаров. The invention relates to new compositions containing coagulation factor VIII and a nonionic surfactant, such as a block copolymer, for example, a polyoxamer, or an ester of a polyoxyethylene (20) derivative of sorbitol with a fatty acid, in particular polysorbate 20 or polysorbate 80. Composition may also include sodium chloride, calcium chloride, L-histidine and / or sugars and / or sugar alcohols.

Гемофилия является врожденным заболеванием, которое известно в течение многих столетий, однако лишь в последние три десятилетия удалось различить ее разновидности: гемофилия A, гемофилия B и гемофилия C. Гемофилия A является наиболее часто встречающейся формой. Это заболевание поражает лишь мужчин с частотой один или два индивидуума на 10000 мужчин. Болезнь является следствием сильно пониженного уровня содержания или отсутствия биологически активного фактора коагуляции VIII (антигемофильного фактора), представляющего собой белок, который обычно содержится в плазме. Клиническое проявление гемофилии выражается в сильной тенденции к кровотечению, и до введения в практику лечения с применением концентратов фактора VIII средняя продолжительность жизни таких пациентов составляла менее 20 лет. Концентраты фактора VIII, полученные из плазмы, доступны уже в течение трех десятилетий. Это значительно улучшило возможность лечения пациентов, болеющих гемофилией, и позволило им вести нормальный образ жизни. Hemophilia is a congenital disease that has been known for many centuries, but only in the last three decades have been able to distinguish its varieties: hemophilia A, hemophilia B and hemophilia C. Hemophilia A is the most common form. This disease affects only men with a frequency of one or two individuals per 10,000 men. The disease is the result of a very low level or lack of biologically active coagulation factor VIII (antihemophilic factor), which is a protein that is usually found in plasma. The clinical manifestation of hemophilia is expressed in a strong tendency to bleeding, and before the introduction of treatment with the use of factor VIII concentrates, the average life expectancy of such patients was less than 20 years. Factor VIII concentrates obtained from plasma have been available for three decades. This greatly improved the ability to treat patients with hemophilia, and allowed them to lead a normal lifestyle.

Терапевтические концентраты фактора VIII до недавнего времени готовили фракционированием плазмы. Однако в настоящее время разработаны новые способы получения фактора VIII в клеточных культурах, в которых применяют методики с использованием рекомбинантной ДНК, как это описано, например, J. Gitschier et al., Nature 312, 330-337, 1984 и в Европейском патенте 160457. Until recently, factor VIII therapeutic concentrates have been prepared by fractionating plasma. However, new methods have been developed for the preparation of factor VIII in cell cultures that use recombinant DNA techniques, as described, for example, by J. Gitschier et al., Nature 312, 330-337, 1984 and in European Patent 160457.

Концентраты фактора VIII, выделенные из плазмы человека, содержат несколько фрагментарных полностью активных форм фактора VIII (Anderson et al., Proc. Nat. Acad. Sci, USA, Vol. 83, 2973-83, May 1986). Наименьшая активная форма имеет молекулярную массу 170 килодальтон и состоит из двух цепочек с массами 90 килодальтон и 80 килодальтон, которые связаны друг с другом мостиком из иона металла (см. Европейский патент 197901). Фирма "Kabi Pharmacia" разработала производное рекомбинантного фактора VIII, соответствующее форме фактора VIII из плазмы, который имеет массу 170 килодальтон в терапевтических концентратах фактора VIII. Молекулы усеченного фактора VIII называют r-VIII SQ и производятся в виде конечного продукта клетками яичников китайских хомяков в процессах с использованием клеточных культур. Factor VIII concentrates isolated from human plasma contain several fragmented, fully active forms of factor VIII (Anderson et al., Proc. Nat. Acad. Sci, USA, Vol. 83, 2973-83, May 1986). The smallest active form has a molecular weight of 170 kilodaltons and consists of two chains with masses of 90 kilodaltons and 80 kilodaltons, which are connected to each other by a bridge of a metal ion (see European patent 197901). Kabi Pharmacia has developed a recombinant factor VIII derivative corresponding to the plasma form of factor VIII, which has a mass of 170 kilodaltons in therapeutic concentrates of factor VIII. The molecules of truncated factor VIII are called r-VIII SQ and are produced as a final product by Chinese hamster ovary cells in cell culture processes.

Удельная активность r-VIII SQ может составлять более 12000 м.е./мг белка и предпочтительно составляет более 14000 м.е./мг. Наблюдалась активность около 15000 м.е./мг. Активность приблизительно 10000 м.е. VIII:C на мг белка была ранее продемонстрирована для нашего r-VIII SQ. The specific activity of r-VIII SQ may be more than 12,000 IU / mg protein, and preferably more than 14,000 IU / mg. An activity of about 15,000 IU / mg was observed. Activity approximately 10,000 VIII: C per mg protein was previously demonstrated for our r-VIII SQ.

Рекомбинантный фактор VIII SQ рекомендован для лечения классической гемофилии. Дозировка аналогична дозировка в концентратах фактора VIII из плазмы. Благодаря возможности получать в настоящее время высоко концентрированные препараты, для инъекции необходимы лишь небольшие объемы. Recombinant factor VIII SQ is recommended for the treatment of classical hemophilia. The dosage is similar to the dosage in plasma concentrates of factor VIII. Due to the ability to receive highly concentrated preparations at present, only small volumes are needed for injection.

Общие сведения о структуре и биохимии рекомбинантных производных фактора VIII описаны Кауфманом в Tibtech., Vol. 9, 1991 и в Hamatology, Vol. 63, 155-65, 1991. Структура и биохимия r-VIII SQ описана в Международном патенте WO 91/09122. General information on the structure and biochemistry of recombinant derivatives of factor VIII is described by Kaufman in Tibtech., Vol. 9, 1991 and in Hamatology, Vol. 63, 155-65, 1991. The structure and biochemistry of r-VIII SQ are described in International Patent WO 91/09122.

Стабильность белков является общей проблемой в фармацевтической промышленности. Часто ее решают путем высушивания белка с применением различных способов сушки, таких как сушка замораживанием. После этого белки расфасовывают и хранят в сухом виде. Protein stability is a common problem in the pharmaceutical industry. Often it is solved by drying the protein using various drying methods, such as freeze drying. After this, the proteins are packaged and stored dry.

Раствор перед проведением осушки или сублимационной сушки, сухое вещество и вновь восстановленный из него продукт должны быть стабильными, так чтобы не слишком большое количество активности было потеряно в процессе осушки, во время хранения и при использовании. The solution before drying or freeze-drying, the dry substance and the product reconstituted from it must be stable so that not too much activity is lost during the drying process, during storage and during use.

Фактор VIII, выделенный фракционированием из плазмы, обычно продается в виде лиофилизующегося порошка, который перед употреблением необходимо разбавить водой. Factor VIII, isolated by fractionation from plasma, is usually sold as a lyophilized powder, which must be diluted with water before use.

Составы с небольшим количеством белка в общем случае теряют активность в процессе очистки, стерилизации, упаковки во время приема лекарства. Эту проблему обычно решают введением альбумина человека, который значительно снижает потерю активности активного белка. Альбумин человека играет роль общего стабилизатора при проведении очистки, стерилизации в процессе производства и сублимационной сушки (см. обзор Wang et al., J. of Parenteral Sci. and Tech. , Vol. 42, N 42, Supplement 1988). Альбумин человека способствует также образованию пирожка при сублимационной сушке. Использование альбумина для стабилизации фактора VIII известно и используется в настоящее время во всех поступающих на рынок высоко чистых производных фактора VIII. Compositions with a small amount of protein in the general case lose activity during the cleaning, sterilization, packaging while taking the medicine. This problem is usually solved by the introduction of human albumin, which significantly reduces the loss of activity of the active protein. Human albumin plays the role of a general stabilizer during purification, sterilization during production and freeze-drying (see review Wang et al., J. of Parenteral Sci. And Tech., Vol. 42, N 42, Supplement 1988). Human albumin also contributes to the formation of a pie during freeze-drying. The use of albumin to stabilize factor VIII is known and is currently used in all highly pure derivatives of factor VIII on the market.

Однако добавление альбумина в терапевтический белок, получаемый по технологии рекомбинантной ДНК нежелательно. Использование альбумина человека в качестве вспомогательного вещества часто ограничивает возможности многих наиболее мощных и чувствительных аналитических методов, используемых для исследования белков. However, the addition of albumin to a therapeutic protein obtained by recombinant DNA technology is undesirable. The use of human albumin as an adjuvant often limits the capabilities of many of the most powerful and sensitive analytical methods used to study proteins.

Необходимо получить свободные от альбумина композиции, содержащие фактор VIII, в частности рекомбинантный фактор VIII, которые были бы устойчивы при проведении осушки или сублимационной сушки, стабильны в растворе или в виде раствора после приготовления препарата из порошка. It is necessary to obtain albumin-free compositions containing factor VIII, in particular recombinant factor VIII, which would be stable during drying or freeze-drying, stable in solution or in solution after preparation of the powder.

Для стабилизации различных белков было предложено несколько решений:
В Европейском патенте 35204 (Cutter) описываются методы, которые обеспечивают термическую устойчивость белковой композиции в присутствии полиола.To stabilize various proteins, several solutions have been proposed:
EP 35204 (Cutter) describes methods that provide thermal stability to a protein composition in the presence of a polyol.

В Европейском патенте 381345 (Corint) приводится жидкость, содержащая белок десмопрессин в присутствии карбоксиметилцелюллозы. European Patent 381345 (Corint) discloses a liquid containing desmopressin protein in the presence of carboxymethyl cellulose.

В Международной патентной публикации WO 89/09614 (Genentech) описывается стабилизованный состав, включающий гормон роста человека, который содержит глицин, маннит и буфер, а в предпочтительном варианте осуществления изобретения также и неионогенное поверхностно-активное вещество, такое как полисорбат 80. Неионогенное поверхностно-активное вещество вводится для уменьшения аггрегирования и денатурации. Состав обладает повышенной стабильностью в виде лиофилизованных композиций и после их растворения в носителе. International Patent Publication WO 89/09614 (Genentech) describes a stabilized composition comprising human growth hormone that contains glycine, mannitol and buffer, and in a preferred embodiment of the invention also a nonionic surfactant such as polysorbate 80. Nonionic surfactant the active substance is introduced to reduce aggregation and denaturation. The composition has increased stability in the form of lyophilized compositions and after their dissolution in the carrier.

В Европейском патенте 268110 (Cetus) заявляется раствор, включающий конкретный белок интерлейкин-2, который растворяют в среде инертного носителя, включающего в качестве солюбилизатора/стабилизатора неионогенное полимерное поверхностно-активное вещество. Предпочтительными детергентами являются полиоксиэтилированные октилфеноксипроизводные этанола, производные моностеарата полиэтиленгликоля и сложные эфиры полиэтиленсорбита и жирных кислот. European Patent 268110 (Cetus) claims a solution comprising a specific interleukin-2 protein, which is dissolved in an inert carrier medium comprising, as a solubilizer / stabilizer, a nonionic polymer surfactant. Preferred detergents are polyoxyethylated octylphenoxy derivatives of ethanol, derivatives of polyethylene glycol monostearate and esters of polyethylene sorbitol and fatty acids.

В Патенте США 4783441 (Hoechst) приводится водный раствор, включающий белок, такой как инсулин, и поверхностно-активное вещество. US Pat. No. 4,783,441 (Hoechst) discloses an aqueous solution comprising a protein, such as insulin, and a surfactant.

В Патенте США 4165370 (Coval) описывается раствор гаммаглобулина и способ его приготовления. Раствор содержит полиэтиленгликоль. В раствор может добавлять неоногенное поверхностно-активное вещество. US Pat. No. 4,165,370 (Coval) describes a solution of gammaglobulin and a method for its preparation. The solution contains polyethylene glycol. A neonogenic surfactant may be added to the solution.

В Европейском патенте 77870 (Grеen Cross) заявляется способ повышения устойчивости растворов фактора VIII, заключающийся в добавлении аминокислот, моносахаридов, олигосахаридов или спиртов сахаров или карбоновых кислот, а добавление спиртов сахаров или дисахаридов к водным растворам фактора VIII с целью увеличения стабильности при проведении тепловых обработок описывается в Европейском патенте 117064 (Green, Cross). European patent 77870 (Green Cross) claims a method for increasing the stability of factor VIII solutions by adding amino acids, monosaccharides, oligosaccharides or sugar alcohols or carboxylic acids, and adding sugar alcohols or disaccharides to aqueous solutions of factor VIII in order to increase stability during heat treatments described in European Patent 117064 (Green, Cross).

В Международном патенте WO 91/10439 (Octopharma) заявляется стабильный раствор для проведения инъекций фактора VIII или фактора IX, который содержит дисахарид, преимущественно сахарозу, и один или несколько аминокислот. WO 91/10439 (Octopharma) discloses a stable solution for injecting factor VIII or factor IX, which contains a disaccharide, mainly sucrose, and one or more amino acids.

В Европейском патенте 315968 и Европейском патенте 314095 (Rorer) заявляются стабильные составы разной ионной силы, содержащие фактор VIII. European Patent 315968 and European Patent 314095 (Rorer) declare stable formulations of different ionic strengths containing factor VIII.

Белки отличаются по своим физико-химическим свойствам. При получении фармацевтических препаратов, которые должны быть физико-химически приемлемыми и устойчивыми в течение длительного времени следует учитывать не только физиологические свойства белка, но также и другие аспекты, такие как возможность промышленного производства, простоту в использовании пациентом и безопасность для пациента. Последствия учета всех этих факторов при тестировании различных составов трудно предсказать заранее, а потому зачастую для каждого белка возможен единственный раствор. Proteins differ in their physicochemical properties. Upon receipt of pharmaceutical preparations that must be physically chemically acceptable and stable for a long time, one should take into account not only the physiological properties of the protein, but also other aspects, such as the possibility of industrial production, ease of use by the patient, and safety for the patient. The consequences of taking all these factors into account when testing different formulations are difficult to predict in advance, and therefore often a single solution is possible for each protein.

Фактор VIII, содержащийся в плазме, стабилизируется за счет ассоциации с белком-носителем-фактором фон Виллебранда. В плазме, а также в обычных концентратах фактора VIII промежуточной степени чистоты отношение фактора фон Виллебранда к фактору VIII составляет по крайней мере 50:1 по весу. В очень чистых концентратах фактора VIII, обладающих удельной активностью более 2000 м.е. на мг белка, отношение фактора фон Виллебранда к фактору VIII составляет около 1:1 (по весу) и в основном весь фактор VIII присоединен к фактору фон Виллебранда. Несмотря на эту стабилизацию для достижения приемлемой стабильности в процессе лиофилизации и хранения требуется дополнительная стабилизация за счет введения альбумина. Factor VIII contained in plasma is stabilized by association with the carrier protein factor von Willebrand factor. In plasma, as well as in conventional concentrates of factor VIII of intermediate purity, the ratio of von Willebrand factor to factor VIII is at least 50: 1 by weight. In very pure concentrates of factor VIII with a specific activity of more than 2000 m.u. per mg of protein, the ratio of von Willebrand factor to factor VIII is about 1: 1 (by weight) and basically all of factor VIII is attached to von Willebrand factor. Despite this stabilization, additional stabilization through the administration of albumin is required to achieve acceptable stability during lyophilization and storage.

Все суперчистые препараты, поступающие в продажу, стабилизированы альбумином (альбумином сыворотки человека). All superpure preparations on sale are stabilized with albumin (human serum albumin).

В настоящее время требуется фактор VIII для инъекций без альбумина, содержащий минимальное количество добавок. Factor VIII is currently required for albumin-free injections containing a minimal amount of additives.

Нами разработаны новые композиции, которые позволяют разрешить указанные проблемы для фактора VIII. We have developed new compositions that allow us to solve these problems for factor VIII.

Неожиданно было обнаружено, что фактор VIII, который является очень чувствительным белком, может быть стабилизирован без альбумина добавлением неионогенного поверхностно-активного вещества. It has been unexpectedly discovered that factor VIII, which is a very sensitive protein, can be stabilized without albumin by the addition of a nonionic surfactant.

Таким образом, изобретение относится к композиции, включающей коагулирующий фактор VIII и неионогенное поверхностно-активное вещество в качестве стабилизатора. Наш фактор VIII является высоко чистым, т.е. имеет удельную активность более 5000 ME/мг белка, а композиции стабилизированы без добавления альбумина. Thus, the invention relates to a composition comprising a coagulating factor VIII and a nonionic surfactant as a stabilizer. Our factor VIII is highly pure, i.e. has a specific activity of more than 5000 ME / mg protein, and the compositions are stabilized without the addition of albumin.

Если фактор VIII является рекомбинантным, он может быть либо полноразмерным, либо делеционным производным, таких как производное SQ. If factor VIII is recombinant, it can be either a full-sized or a deletion derivative, such as an SQ derivative.

Количество фактора VIII составляет от 10 до 100000 МЕ/мл, преимущественно от 50 до 10000 МЕ/мл. The amount of factor VIII is from 10 to 100,000 IU / ml, preferably from 50 to 10,000 IU / ml.

Неионогенное поверхностно-активное вещество преимущественно выбирают из блок-сополимера, такого как полиоксамер, или сложного эфира полиоксиэтилена (20) и жирной кислоты, такого как полисорбат 20 или полисорбат 80. В качестве полисорбата 80 используют Tween 80. The nonionic surfactant is preferably selected from a block copolymer, such as a polyoxamer, or a polyoxyethylene ester (20) and a fatty acid such as Polysorbate 20 or Polysorbate 80. Tween 80 is used as polysorbate 80.

Неионогенное поверхностно-активное вещество должно присутствовать в количестве выше критической концентрации мицеллообразования (ККМ) (см. Lee, Journal of Pharm. Sci., Vol. 63, 136, 1974). The nonionic surfactant must be present in an amount above the critical micelle concentration (CMC) (see Lee, Journal of Pharm. Sci., Vol. 63, 136, 1974).

Сложный эфир полиоксиэтилена (20) и жирной кислоты преимущественно содержится, таким образом, в количестве по крайней мере 0,01 мг/мл. Это количество может составлять, в частности, от 0,02 до 1 мг/мл. Композиция может также включать хлорид натрия или калия, преимущественно в количестве более, чем 0,1 М. The polyoxyethylene (20) ester of the fatty acid is preferably contained in an amount of at least 0.01 mg / ml. This amount may be, in particular, from 0.02 to 1 mg / ml. The composition may also include sodium or potassium chloride, preferably in an amount of more than 0.1 M.

Композиция преимущественно содержит соль кальция, такую как хлорид кальция или глюконат кальция, предпочтительно в количестве не менее 0,5 мМ, и аминокислоту, такую как L-гистидин, в количестве не менее 1 мМ. Это количество может быть, например, выбрано в интервале от 0,05 до 500 мМ. The composition preferably contains a calcium salt, such as calcium chloride or calcium gluconate, preferably in an amount of not less than 0.5 mM, and an amino acid, such as L-histidine, in an amount of not less than 1 mM. This amount may, for example, be selected in the range from 0.05 to 500 mM.

Могут быть добавлены моно- и дисахариды, такие как сахароза или спирты сахаров, в частности, в количестве от 1 до 300 мг/мл. Mono- and disaccharides, such as sucrose or sugar alcohols, in particular in an amount of from 1 to 300 mg / ml, can be added.

Композиция преимущественно содержит L-гистидин и сахарозу. Отношение в композиции хлорида натрия к L-гистидину составляет не менее 1:1. The composition mainly contains L-histidine and sucrose. The ratio in the composition of sodium chloride to L-histidine is at least 1: 1.

Композиция может включать:
i) 10-100000 м.е./мл рекомбинантного фактора VIII;
ii) по крайней мере 0,01 мг/мл сложного эфира полиоксиэтилена (20) и жирной кислоты;
iii) хлорид натрия, преимущественно в количестве не менее 0,1 М;
iv) соль кальция, такую как хлорид кальция или глюконат кальция, преимущественно в количестве не менее 0,5 мМ;
v) аминокислоту, такую как L-гистидин, в количестве не менее 1 мМ.The composition may include:
i) 10-100000 IU / ml recombinant factor VIII;
ii) at least 0.01 mg / ml polyoxyethylene ester (20) and a fatty acid;
iii) sodium chloride, preferably in an amount of at least 0.1 M;
iv) a calcium salt, such as calcium chloride or calcium gluconate, preferably in an amount of not less than 0.5 mM;
v) an amino acid, such as L-histidine, in an amount of not less than 1 mm.

К этой композиции преимущественно добавляют моно- или дисахариды или спирты сахаров. Preferably mono- or disaccharides or sugar alcohols are added to this composition.

Композиция может быть в твердой форме, преимущественно лиофилизованной, или в виде водного раствора до или после сушки. Высушенный продукт разбавляют стерильной водой для инъекции или буферным раствором. The composition may be in solid form, preferably lyophilized, or in the form of an aqueous solution before or after drying. The dried product is diluted with sterile water for injection or buffer solution.

Заявляемая композиция может быть также готовым к употреблению стабильным водным раствором. The inventive composition may also be ready-to-use stable aqueous solution.

Изобретение относится также к композициям, в которых удельная активность r-VIII SQ составляет более 12000 м.е./мг белка, преимущественно более 14000 м.е./мг. The invention also relates to compositions in which the specific activity of r-VIII SQ is more than 12,000 IU / mg protein, preferably more than 14,000 IU / mg.

Заявляемая композиция может быть получена путем смешивания фактора VIII с неионогенным поверхностно-активным веществом в водном растворе, преимущественно вместе с аминокислотой, такой как L-гистидин, натриевой солью, сахарозой и кальциевой солью или путем элюированием фактора VIII на последнем этапе очистки буфером, содержащим в водном растворе неионогенное поверхностно-активное вещество, преимущественно вместе с аминокислотой, такой как L-гистидин, натриевую соль, сахарозу и кальциевую соль. The inventive composition can be obtained by mixing factor VIII with a nonionic surfactant in an aqueous solution, preferably together with an amino acid such as L-histidine, sodium salt, sucrose and calcium salt, or by eluting factor VIII in the last step of purification with a buffer containing an aqueous solution of a nonionic surfactant, preferably together with an amino acid, such as L-histidine, sodium salt, sucrose and calcium salt.

Изобретение относится также к использованию в качестве стабилизатора композиции, включающей коагуляционный фактор VIII, неионогенного поверхностно-активного вещества, которое преимущественно выбирают из блок-сополимера, предпочтительно полиоксамера или сложного эфира полиоксиэтилена (20) и жирной кислоты, преимущественно полисорбата 20 или полисорбата 80. The invention also relates to the use, as a stabilizer, of a composition comprising coagulation factor VIII, a nonionic surfactant, which is preferably selected from a block copolymer, preferably a polyoxamer or an ester of polyoxyethylene (20) and a fatty acid, mainly polysorbate 20 or polysorbate 80.

Аминокислота используется в системе в качестве буфера, а также для защиты белка в аморфной фазе. Подходящим буфером может служить L-гистидин, лизин и/или аргинин. В основном используют L-гистидин, поскольку он обладает хорошими буферными свойствами при значениях pH около 7. Amino acid is used in the system as a buffer, as well as to protect the protein in the amorphous phase. A suitable buffer may be L-histidine, lysine and / or arginine. L-histidine is mainly used since it has good buffering properties at pH values of about 7.

Для защиты белка можно также добавлять сахарозу или спирт сахара. Sucrose or sugar alcohol may also be added to protect the protein.

Кальций (или ионы двухвалентного металла), в данном случае в виде хлорида кальция, хотя могут добавляться и другие соли, такие как глюконат кальция, глюбионат кальция или глюцептат кальция, необходим для связывания большей и меньшей цепочек фактора VIII. Calcium (or divalent metal ions), in this case in the form of calcium chloride, although other salts such as calcium gluconate, calcium glubionate or calcium gluceptate can be added, is necessary to bind the larger and smaller chains of factor VIII.

Представленные в примерах данные показывают, что r-VIII SQ при хранении при температуре 5±3^oC устойчив в течение по крайней мере 12 месяцев.The data presented in the examples show that r-VIII SQ is stable for at least 12 months when stored at 5 ± 3 ^° C.

Следующие примеры поясняют изобретение и содержат данные о стабильности различных составов, каждый из которых подпадает под объем притязаний по изобретению и которые не ограничиваются указанными примерами. The following examples illustrate the invention and contain data on the stability of various formulations, each of which falls within the scope of the claims of the invention and which are not limited to these examples.

На фиг. 1 приведены данные, полученные методом гель-проникающей хроматографии с использованием жидкостной хроматографии высокого давления, полученные для примера 10A после его хранения в течение 5 месяцев при температуре 25^oC.In FIG. 1 shows the data obtained by gel permeation chromatography using high pressure liquid chromatography, obtained for example 10A after storage for 5 months at a temperature of 25 ^o C.

На фиг. 2 - данные, полученные методом гель-проникающей хроматографии с использованием жидкостной хроматографии высокого давления, полученные для примера 10B после его хранения в течение 5 месяцев при температуре 30^oC.In FIG. 2 - data obtained by gel permeation chromatography using high pressure liquid chromatography, obtained for example 10B after storage for 5 months at a temperature of 30 ^o C.

Получение рекомбинантного фактора VIII SQ (r-VIII SQ) проводят в основном по методике, приведенной в патенте WO 91/09122 в примере 1-3. D HFR дефицитный целин яйцеклеток китайского хомяка DG44N. Y. ) наносят методом электрополировки с вектором экспрессии, содержащим ген r-VIII SQ, и вектором экспрессии, содержащим ген дигидрофолят-редуктазы. Путем постепенного увеличения содержания метотрексата проводят последовательный отбор выживающих колоний из выбранной среды. Жидкость над осадком полученных колоний подвергают индивидуальному скринингу на VIII:C активность. Выбирают клон для продуцирования, который затем подготавливают для роста в не содержащей сыворотки суспензии в выбранной среде, и наконец разрабатывают полномасштабный процесс получения. Жидкость над осадком отбирают через определенные промежутки времени и подвергают дальнейшей очистке; как это описано далее. Obtaining recombinant factor VIII SQ (r-VIII SQ) is carried out mainly by the method described in patent WO 91/09122 in example 1-3. D HFR deficient ovine virginity of the Chinese hamster DG44N. Y.) is applied by electropolishing with an expression vector containing the r-VIII SQ gene and an expression vector containing the dihydrofolate reductase gene. By gradually increasing the content of methotrexate, sequential selection of surviving colonies from the selected medium is carried out. The liquid above the sediment of the obtained colonies is subjected to individual screening for VIII: C activity. A clone for production is selected, which is then prepared for growth in serum-free suspension in the selected medium, and finally a full-scale production process is developed. The liquid above the precipitate is taken at regular intervals and subjected to further purification; as described below.

Устанавливают необходимое значение pH осветленной и доведенной до кондиции среды и переносят ее в колонку, наполненную S-Sepharose FF. После промывки фактор VIII элюируют солевым буферным раствором, содержащим 5 мМ хлорида кальция. Set the required pH value of the clarified and adjusted to medium condition and transfer it to a column filled with S-Sepharose FF. After washing, factor VIII is eluted with saline buffer solution containing 5 mM calcium chloride.

Изучение иммуноадсорбции проводят на иммуноафинной смоле, лигандом в которой служит моноклональное антитело (8A4). воздействующее на длинную цепочку фактора VIII. Перед загрузкой в колонну S-элюат подвергают обработке раствором, содержащим 0,3% TNBP и 1% октоксинола 9. The study of immunoadsorption is carried out on an immunoaffinity resin in which the monoclonal antibody (8A4) serves as a ligand. acting on a long chain of factor VIII. Before loading into the column, the S-eluate is treated with a solution containing 0.3% TNBP and 1% octoxynol 9.

Колонку приводят в равновесное состояние, промывают и фактор VIII элюируют буферным раствором, содержащим 0,05 М хлорида кальция и 50% этиленгликоля. The column is brought into equilibrium, washed and factor VIII is eluted with a buffer solution containing 0.05 M calcium chloride and 50% ethylene glycol.

mAb-Элюат помещают в колонку, наполненную Q-Sepharose FF, и при проведении иммуноафинного анализа приводят в равновесное состояние элюированием буферным раствором. The mAb Eluate is placed in a column filled with Q-Sepharose FF, and upon immunoaffinity analysis, it is equilibrated by elution with a buffer solution.

После промывки фактор VIII элюируют 0,05 М раствором L-гистидина, 4 мМ раствором хлорида кальция и 0,6 мМ раствора хлорида натрия с pH 6,8. After washing, factor VIII is eluted with a 0.05 M solution of L-histidine, 4 mm solution of calcium chloride and 0.6 mm solution of sodium chloride with a pH of 6.8.

О-элюат помещают в колонку для фильтрования (Superdex 200 p.g.). Приведение в равновесное состояние и элюирование проводят с помощью состава, содержащего хлорид натрия, L-гистидин, хлорид кальция и полисорбат 80. The o-eluate is placed in a column for filtering (Superdex 200 p.g.). Bringing to equilibrium and elution is carried out using a composition containing sodium chloride, L-histidine, calcium chloride and polysorbate 80.

Собирают фракции, содержащие белок, и готовят раствор перед проведением сублимационной сушки. Fractions containing protein were collected and a solution was prepared before freeze-drying.

Устанавливают активность VIII: C и концентрацию неактивных компонентов путем разбавления подходящим буфером. Раствор затем стерилизуют фильтрованием (0.22 мкм), распыляют и подвергают сублимационной сушке. Образцы каждого состава замораживают и хранят при -70^oC. Эти образцы после оттаивания используют в качестве стандарта при проведении исследований VIII:C.The activity of VIII: C and the concentration of inactive components are established by dilution with a suitable buffer. The solution is then sterilized by filtration (0.22 μm), sprayed and freeze-dried. Samples of each composition are frozen and stored at -70 ^o C. These samples after thawing are used as a standard in studies VIII: C.

Коагулирующую способность VIII: C определяют по методу пигментообразующего субстрата (Coatest Factor VIII, "Chrovogenix AB", Мелндал, Швеция). Активированный фактор X (Xa) генерируется по внутреннему механизму, при этом фактор VIII:C играет роль кофактора. Затем определяют содержание фактора Xa, используя синтетический пигментообразуюищй субстрат S-2222 в присутствии ингибитора тромбина 1-2581 для предотвращения гидролиза субстрата под действием тромбина. Реакцию прерывают добавлением кислоты, а содержание VIII: C, которое пропорционально выделению п-нитроанилина, определяют фотометрически на длине волны 450 нм по отношению к чистому реагенту. Содержание фактора VIII: C выражено в международных единицах (м.е.) в соответствии с требованиями Международного стандарта по концентратам, принятого Всемирной организацией здравоохранения. The coagulating ability of VIII: C is determined by the method of a pigment-forming substrate (Coatest Factor VIII, "Chrovogenix AB", Melndal, Sweden). Activated factor X (Xa) is generated by an internal mechanism, while factor VIII: C plays the role of a cofactor. Then, the content of factor Xa is determined using a synthetic pigment-forming substrate S-2222 in the presence of a thrombin inhibitor 1-2581 to prevent hydrolysis of the substrate under the action of thrombin. The reaction is interrupted by the addition of acid, and the VIII: C content, which is proportional to the release of p-nitroaniline, is determined photometrically at a wavelength of 450 nm with respect to the pure reagent. The content of factor VIII: C is expressed in international units (i.e.) in accordance with the requirements of the International Standard for Concentrates adopted by the World Health Organization.

Регенерацию VIII:C вычисляют в процентах как отношение содержания VIII:C во вновь приготовленном растворе, деленного на содержание VIII:C в замороженном, а затем оттаянном растворе для процесса сублимационной сушки, предусматривающего соответствующие приспособления для разбавления. The VIII: C regeneration is calculated as a percentage as the ratio of the VIII: C content in the newly prepared solution divided by the VIII: C content in the frozen and then thawed solution for the freeze-drying process, which includes appropriate dilution devices.

Растворимые аггрегаты определяют методом гель-проникающей хроматографии. Используют наполненную колонку Superdex 200 HR 13/30 (фирмы "Pharmacia") и флюоресцентный детектор (частота возбуждения 280 нм, полоса испускания 340 нм). Анализируют вновь приготовленные составы. Оценку результатов гель-проникающей хроматографии проводят визуальным изучением хроматограмм или интегрированием площадей пиков в том случае, когда образуются аггрегаты. Soluble aggregates are determined by gel permeation chromatography. A filled column Superdex 200 HR 13/30 (Pharmacia) and a fluorescence detector (excitation frequency 280 nm, emission band 340 nm) were used. Analyze the newly prepared compounds. The results of gel permeation chromatography are evaluated by visual examination of the chromatograms or by integration of peak areas in the case when aggregates are formed.

Величину регенерации в процессе сублимационной сушки выражают в процентах по отношению к замороженным стандартным образцам. The amount of regeneration in the process of freeze-drying is expressed as a percentage in relation to frozen standard samples.

Пример 1. Сравнение альбумина и неионогенного поверхностно-активного вещества
Рекомбинантный фактор VIII получают как описано в Экспериментальной части.Example 1. Comparison of albumin and a nonionic surfactant
Recombinant factor VIII is obtained as described in the Experimental part.

2 мл раствора подвергают сублимационной сушке, а затем вновь растворяют в 5 мл стерильной воды для инъекций. 2 ml of the solution is freeze-dried and then redissolved in 5 ml of sterile water for injection.

Состав композиций представлен в табл. 1
Приведенный пример показывает, что не наблюдается различий в регенерации фактора VIII : C при использовании неионогенного поверхностно-активного вещества или альбумина.The composition of the compositions is presented in table. 1
The above example shows that there is no difference in the recovery of factor VIII: C using a nonionic surfactant or albumin.

Пример 2. Зависимость результатов от силы неионогенного поверхностно-активного вещества. Example 2. The dependence of the results on the strength of a nonionic surfactant.

Рекомбинантный фактор VIII получают как описано в Экспериментальной части. Recombinant factor VIII is obtained as described in the Experimental part.

2 мл раствора подвергают сублимационной сушке, а затем вновь растворяют в 2 мл стерильной воды для инъекций. 2 ml of the solution is freeze-dried and then redissolved in 2 ml of sterile water for injection.

Состав композиции представлен в табл. 2. The composition is presented in table. 2.

Нетрудно заметить, что удивительно высокое стабилизирующее воздействие оказывает добавление неионогенного поверхностно-активного вещества. It is easy to see that the addition of a nonionic surfactant has a surprisingly high stabilizing effect.

Пример 3. Изменение концентрации поверхностно-активного вещества
Рекомбинантный фактор VIII получают как описано в Экспериментальной части.Example 3. The change in the concentration of surfactant
Recombinant factor VIII is obtained as described in the Experimental part.

Состав композиций представлен в табл. 3. The composition of the compositions is presented in table. 3.

Результаты, приведенные в этом примере, показывают, что регенерация фактора VIII (VII : C) была очень высокой после повторного растворения и хорошей для всех использованных концентраций полисорбата 80. The results in this example show that the regeneration of factor VIII (VII: C) was very high after reconstitution and good for all polysorbate 80 concentrations used.

Пример 4. Изменение концентрации хлорида натрия. Example 4. The change in the concentration of sodium chloride.

2 мл раствора подвергают сублимационной сушке, хранят при различных температурах в течение до 6 месяцев, а затем вновь растворяют в 5 мл стерильной воды для инъекций. 2 ml of the solution is freeze-dried, stored at various temperatures for up to 6 months, and then redissolved in 5 ml of sterile water for injection.

Состав композиций представлен в табл. 4. The composition of the compositions is presented in table. 4.

Растворы с содержанием 0,3 или 0,6 М хлорида натрия показывают очень хорошую стабильность. Оба состава устойчивы при хранении при 37^oC в течение 6 месяцев.Solutions containing 0.3 or 0.6 M sodium chloride show very good stability. Both formulations are stable when stored at 37 ^o C for 6 months.

Пример 5. Изменение концентрации L-гистидина
Рекомбинантный фактор VIII получают как описано в Экспериментальной части.Example 5. The change in the concentration of L-histidine
Recombinant factor VIII is obtained as described in the Experimental part.

2,2 мл раствора подвергают сублимационной сушке, хранят при различных температурах в течение до 3 месяцев, а затем вновь растворяют в 5 мл стерильной воды для инъекций. 2.2 ml of the solution is freeze-dried, stored at various temperatures for up to 3 months, and then redissolved in 5 ml of sterile water for injection.

Состав композиций представлен в табл. 5. The composition of the compositions is presented in table. 5.

Этот пример показывает, что различные количества L-гистидина не влияют на стабильность. This example shows that various amounts of L-histidine do not affect stability.

Пример 6. Рекомбинантный фактор VIII получают как описано в Экспериментальной части (см. табл. 6). Example 6. Recombinant factor VIII receive as described in the Experimental part (see tab. 6).

Эти растворы замораживают/оттаивают 1, 5 и 10 раз и получают значения для регенерации, представленные в табл. 7. These solutions are frozen / thawed 1, 5 and 10 times and get the values for regeneration, are presented in table. 7.

Полученные результаты показывают, что VIII : C устойчив после повторных циклов замораживание/оттаивание и что ПЭГ-4000, который, как считается, играет роль защиты при охлаждении, не обязателен в указанных составах. The results show that VIII: C is stable after repeated freeze / thaw cycles and that PEG-4000, which is believed to play a protective role during cooling, is not required in these formulations.

Пример 7. Изменение pH. Example 7. Change in pH.

2,2 мл раствора подвергают сублимационной сушке, а затем вновь растворяют в 5 мл стерильной воды для инъекций. 2.2 ml of the solution is freeze-dried and then redissolved in 5 ml of sterile water for injection.

Состав композиций представлен в табл. 8. The composition of the compositions is presented in table. eight.

Приведенный пример показывает, что pH не оказывает заметного воздействия в интервале значений от 6,0 до приблизительно 7,5. The above example shows that the pH does not have a noticeable effect in the range from 6.0 to about 7.5.

Пример 8. Добавка сахарозы. Example 8. The addition of sucrose.

Состав композиций представлен в табл. 9. The composition of the compositions is presented in table. nine.

Сахарозу добавляют в раствор B после стадии финишной очистки перед сублимационной сушкой. Sucrose is added to solution B after the finishing step before freeze-drying.

Восстановление после сублимационной сушки составляет 76% для A и 87% для B. Та же активность наблюдается после хранения вновь полученного раствора при комнатной температуре в течение 4 ч. Recovery after freeze-drying is 76% for A and 87% for B. The same activity is observed after storing the newly obtained solution at room temperature for 4 hours.

Это исследование показывает, что добавка сахарозы благоприятствует регенерации VIII : C после сублимационной сушки. This study shows that sucrose supplementation favors the regeneration of VIII: C after freeze-drying.

Пример 9. Изменение концентрации соли кальция. Example 9. The change in the concentration of calcium salts.

Состав композиций представлен в табл. 10. The composition of the compositions is presented in table. ten.

Представленные данные показывают, что хлорид кальция можно заменить глюконатом кальция. The data presented show that calcium chloride can be replaced with calcium gluconate.

Пример 10. Рекомбинантный фактор VIII получают как описано в Экспериментальной части. Example 10. Recombinant factor VIII receive as described in the Experimental part.

2,2 мл раствора подвергают сублимационной сушке, а затем вновь растворяют в 5 мл стерильной воды для инъекций. Содержание VIII : C на пузырек во вновь приготовленном препарате составляет около 1000 и.е. (см. табл. 11). 2.2 ml of the solution is freeze-dried and then redissolved in 5 ml of sterile water for injection. The content of VIII: C per vial in a newly prepared preparation is about 1000 i.u. (see tab. 11).

Регенерация хорошая и в том случае, если часть L-гистидина заменяется на сахарозу. Regeneration is good even if part of L-histidine is replaced by sucrose.

Указанные композиции исследуют методом гель-проникающей хроматографии после 5 месяцев хранения при температуре 25^oC и 30^oC соответственно, и полученные результаты представлены на фиг. 1 и 2. Единственными наблюдаемыми пиками является пик при 42, указывающий на присутствие фактора VIII : C, и пик при 70, который соответствует гистидину. Аггрегаты должны наблюдаться при значениях, меньших 40. Из фиг. 1 видно, что для 10A после 5 месяцев хранения аггрегаты не обнаруживаются. На фиг.2 дл 10В после 5 месяцев хранения при 30^oC наблюдается небольшое количество аггрегатов, содержание которых составляет менее 2%.These compositions are examined by gel permeation chromatography after 5 months of storage at a temperature of 25 ^° C and 30 ^° C, respectively, and the results are presented in FIG. 1 and 2. The only peaks observed are the peak at 42, indicating the presence of factor VIII: C, and the peak at 70, which corresponds to histidine. Aggregates should be observed at values less than 40. From FIG. 1 shows that for 10A after 5 months of storage aggregates are not detected. In Figure 2, for 10B, after 5 months of storage at 30 ^° C, a small amount of aggregates is observed, the content of which is less than 2%.

Пример 11. Рекомбинантный фактор VIII получают как описано в Экспериментальной части. Example 11. Recombinant factor VIII receive as described in the Experimental part.

2,2 мл раствора подвергают сублимационной сушке, а затем вновь растворяют в 5 мл стерильной воды для инъекций. Содержание VIII : C на пузырек во вновь приготовленном препарате составляет около 500 и.е. (см. табл. 12). 2.2 ml of the solution is freeze-dried and then redissolved in 5 ml of sterile water for injection. The content of VIII: C per vial in a newly prepared preparation is about 500 i.u. (see tab. 12).

Оба состава показывают хорошую стабильность. Both formulations show good stability.

Эти составы исследовались методом гель-проникающей хроматографии и полученные результаты аналогичны приведенным на фиг. 1 и 2. These compositions were investigated by gel permeation chromatography and the results are similar to those shown in FIG. 1 and 2.

Аггрегирование не наблюдается при хранении составов в течение 5 месяцев при 25^oC и 30^oC, соответственно.Aggregation is not observed during storage of the compositions for 5 months at 25 ^o C and 30 ^o C, respectively.

2 мл раствора подвергают сублимационной сушке, хранят при различных температурах в течение до 3 месяцев, а затем вновь растворяют в 4 мл стерильной воды для инъекций. Содержание VIII : C на пузырек во вновь приготовленном препарате составляет около 500 и.е. (см. табл. 13). 2 ml of the solution is freeze-dried, stored at various temperatures for up to 3 months, and then redissolved in 4 ml of sterile water for injection. The content of VIII: C per vial in a newly prepared preparation is about 500 i.u. (see tab. 13).

Удовлетворительная стабильность достигается при хранении в течение пяти месяцев при температуре 7^oC.Satisfactory stability is achieved when stored for five months at a temperature of 7 ^o C.

Пример 12. Рекомбинантный фактор VIII получают по методике, описанной в Экспериментальной части. Example 12. Recombinant factor VIII obtained by the method described in the Experimental part.

2 мл раствора подвергают сублимационной сушке, хранят при различных температурах вплоть до 3 месяцев, а затем вновь растворяют в 4 мл стерильной воды для инъекций. Содержание VIII : C на пузырек в приготовленном растворе составляет около 500 и.е. (см. табл. 14). 2 ml of the solution is freeze-dried, stored at various temperatures for up to 3 months, and then redissolved in 4 ml of sterile water for injection. The content of VIII: C per bubble in the prepared solution is about 500 i.u. (see table. 14).

Удовлетворительная стабильность наблюдается после хранения при 7^oC в течение 5 месяцев.Satisfactory stability is observed after storage at 7 ^o C for 5 months.

Claims

1. A pharmaceutical composition comprising a recombinant coagulation factor VIII and a stabilizer of factor VIII activity during storage over an extended period of time, said composition being either initially and of course an aqueous solution, ready for use, or initially an aqueous solution, which is then dried and finally recreate in the form of an aqueous solution before use, characterized in that the composition contains a recombinant coagulation factor VIII with specific activity of more than 2000 IU / mg protein and in quantity tve 10-100000 IU / ml, as a stabilizer, polysorbate 80 in an amount of at least 0.01 mg / ml, sodium or potassium chloride in an amount of more than 0.1 M, a calcium salt such as calcium chloride or calcium gluconate, preferably in an amount of more than 0.5 mM, and L is histidine for buffering the system and protecting the protein in the amorphous phase.

2. The composition according to p. 1, characterized in that factor VIII is highly pure and stable without the addition of albumin.

3. The composition according to p. 1 or 2, characterized in that factor VIII is a full-sized or deletion derivative of recombinant factor VIII.

4. The composition according to any one of paragraphs. 1-3, characterized in that the content of factor VIII is 10-100000 IU / ml, preferably 50-10000 IU / ml

5. The composition according to any one of paragraphs. 1-4, characterized in that polysorbate 80 is present in an amount above the critical micelle concentration.

6. The composition according to any one of paragraphs. 1-5, characterized in that it contains polysorbate 80.

7. The composition according to p. 6, characterized in that polysorbate 80 is present in an amount of at least 0.01 mg / ml.

8. The composition according to any one of paragraphs. 1-7, characterized in that it contains sodium or potassium chloride, mainly in an amount of more than 0.1 M.

9. The composition according to any one of paragraphs. 1-8, characterized in that it contains a calcium salt, such as calcium chloride or calcium gluconate, mainly in an amount of more than 0.5 mm.

10. The composition according to any one of paragraphs. 1-9, characterized in that it contains an amino acid, such as L-histidine, in an amount of more than 1 mm.

11. The composition according to any one of paragraphs. 1-10, characterized in that it contains mono - or disaccharides, mainly sucrose or sugar alcohols.

12. The composition according to any one of paragraphs. 10 and 11, characterized in that it contains L-histidine and sucrose.

13. The composition according to PP. 8 and 10, characterized in that the ratio of sodium chloride to L-histidine is more than 1: 1.

14. The composition according to any one of paragraphs. 1-13, characterized in that it includes:
10-100000 IU / ml recombinant factor VIII; at least 0.01 mg / ml polysorbate 80; sodium chloride, mainly in an amount of more than 0.1 M; a calcium salt such as calcium chloride or calcium gluconate, preferably in an amount of more than 0.5 mM; an amino acid such as L-histidine in an amount of more than 1 mm.

15. The composition according to any one of paragraphs. 1-14, characterized in that it is dried.

16. The composition according to any one of paragraphs. 1-14, characterized in that it is subjected to lyophilization.

17. The composition according to any one of paragraphs. 1-14, characterized in that it is a stable aqueous solution, ready to use.

18. The composition according to any one of paragraphs. 3-17, characterized in that the specific activity of r-VIII SQ is more than 12000 IU / mg, mainly more than 14000 IU / mg.

19. The composition according to p. 1, characterized in that the specific activity of factor VIII is more than 5000 IU / mg protein.

20. A method of obtaining a composition according to claim 1, characterized in that factor VIII is mixed with polysorbate 80 in an aqueous solution, said solution additionally containing sodium or potassium chloride, a calcium salt such as calcium chloride or calcium gluconate, and L-histidine .

21. The method for producing a composition according to claim 1, characterized in that it involves purification of the recombinant factor VIII obtained by fermentation in a chromatographic sequence containing at least two stages selected from cation exchange chromatography steps, anion exchange chromatography steps, immunoaffinity chromatography steps, and gel filtration steps, followed by elution of factor VIII from the last purification step using a buffer containing polysorbate 80 in an aqueous solution, said solution additionally containing sodium or potassium chloride, calcium salts such as calcium chloride or calcium gluconate, and L-histidine.

22. The use of polysorbate 80 as a stabilizer of a composition containing a recombinant coagulation factor VIII.

Priority on points:
10/02/92 according to claims 1-9, 11-13, 15-17, 19-21;
01.10.93 PP 10, 14, 18, 22;
06/11/93 according to claim 18.