RU2133965C1

RU2133965C1 - Serological method for diagnosing tuberculosis in patients suffering from immunodeficiency

Info

Publication number: RU2133965C1
Application number: RU97111288A
Authority: RU
Inventors: А.В. Баенский; А.В. Ватазин; Д.В. Перлин; Е.О. Щербакова; Е.И. Прокопенко; И.П. Иванова
Original assignee: Московский областной научно-исследовательский клинический институт
Priority date: 1997-07-08
Filing date: 1997-07-08
Publication date: 1999-07-27

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: method involves applying immunoenzyme bioassay for determining contents of antibodies to mycobacterium antigen in case and control serum samples. Contents of antibodies to general bacterial antigen of high cross-activity relative to most of infectious disease pathogen antigens is additionally determined. Reaction with case serum and additional control one is to be set in the dilution showing control donor serum extinction level to mycobacterium antigen correspondence to its extinction level with the general bacterial preparation of high cross-activity. Coefficient value is calculated describing reaction reduction level of case serum relative to the control one in setting reaction with the general bacterial antigen. Reaction level is to be increased by multiplying case serum sample extinction value with mycobacterium antigen by the value of the coefficient. EFFECT: higher accuracy in diagnosing tuberculosis due to reduced number of false negative results.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологической диагностике туберкулеза. The invention relates to medicine, namely to immunological diagnosis of tuberculosis.

Известен способ серологической диагностики туберкулеза на основании определения уровня антимикобактериальных антител в непрямом твердофазном иммуноферментном анализе, где в качестве антигена применялся препарат, выделенный из M. H37Rv с молекулярной массой 38, 42, 54 кДа. Положительными считались результаты реакции с опытной сывороткой, превышающие результаты контрольной сыворотки на 3 SD /Khomenko et al. Serodiagnosis of tuberculosis: detection of mycobacterial antigens and antibodies. Tubercle. N 77(6), p. 510-515/. Недостатком этого способа при обследовании больных с иммунологической недостаточностью, несмотря на его высокую специфичность, является то, что в качестве контроля использовалась нормальная сыворотка доноров без иммунных нарушений. Применение данного способа для диагностики туберкулеза у больных с нарушениями иммунитета давало значительное количество ложноотрицательных результатов из-за снижения общего уровня антител в сыворотке больного, причем оценить количественно степень снижения антителообразования у конкретного пациента не представлялось возможным. A known method for the serological diagnosis of tuberculosis based on the determination of the level of antimycobacterial antibodies in indirect enzyme-linked immunosorbent assay, where a drug isolated from M. H37Rv with a molecular weight of 38, 42, 54 kDa was used as an antigen. Positive were considered the results of the reaction with experimental serum, exceeding the results of the control serum by 3 SD / Khomenko et al. Serodiagnosis of tuberculosis: detection of mycobacterial antigens and antibodies. Tubercle. N 77 (6), p. 510-515 /. The disadvantage of this method when examining patients with immunological deficiency, despite its high specificity, is that normal donor serum without immune disorders was used as a control. The use of this method for the diagnosis of tuberculosis in patients with impaired immunity gave a significant amount of false negative results due to a decrease in the total level of antibodies in the patient's serum, and it was not possible to quantify the degree of decrease in antibody formation in a particular patient.

Известен и другой способ серологической диагностики туберкулеза, включающий в себя иммуноферментный анализ для определения антител в опытной и контрольной сыворотках по уровню относительной экстинкции, на основании которой судят об уровне положительности реакции у больных с тяжелой психической патологией, часто сопровождающейся иммунодефицитными состояниями /Фишер Ю. Я., Баенский А.В., Федорова И.В. Опыт использования серологических тестов при выявлении туберкулеза у больных с тяжелой психической патологией. Проблемы туберкулеза. N 1, 1996, стр. 19-20/. There is another method for serological diagnosis of tuberculosis, which includes an enzyme-linked immunosorbent assay for determining antibodies in the experimental and control sera by the level of relative extinction, which is used to judge the level of positive reaction in patients with severe mental pathology, often accompanied by immunodeficiency states / Fisher Yu. Ya ., Baensky A.V., Fedorova I.V. The experience of using serological tests in the detection of tuberculosis in patients with severe mental pathology. Tuberculosis problems. N 1, 1996, pp. 19-20 /.

В этом случае выявлялся высокий процент ложноположительных результатов, и возникала необходимость дальнейшего клинического обследования больных с подозрением на туберкулез для подтверждения диагноза. Такой метод также малоэффективен при индивидуальных обследованиях, когда требуется верификация диагноза и в то же время выявление у больного иммунодефицита, влияющего на особенности проводимой в дальнейшем специфической противотуберкулезной терапии. In this case, a high percentage of false-positive results was detected, and there was a need for further clinical examination of patients with suspected tuberculosis to confirm the diagnosis. This method is also ineffective in individual examinations, when it is necessary to verify the diagnosis and at the same time to identify the patient's immunodeficiency, which affects the features of specific anti-tuberculosis therapy that will be carried out in the future.

Задачей настоящего изобретения является устранение указанных недостатков за счет создания надежного способа серологической диагностики туберкулеза, эффективного при обследовании больных с иммунологической недостаточностью в результате учета снижения антителообразования у больных с иммунодефицитом. The objective of the present invention is to remedy these disadvantages by creating a reliable method for serological diagnosis of tuberculosis, effective in the examination of patients with immunological deficiency as a result of taking into account the decrease in antibody formation in patients with immunodeficiency.

Эта задача достигается посредством того, что в способе серологической диагностики туберкулеза у пациентов с иммунодефицитом, включающем в себя иммуноферментный анализ для определения уровня антител в опытной и контрольной сыворотках к микобактериальному антигену по уровню относительной экстинкции, на основании которой судят о положительности реакции, предложено ввести дополнительный контроль: определение уровня антител к общему бактериальному антигену, имеющему высокую перекрестную активность с антигенами возбудителей большинства инфекционных заболеваний. При этом постановка реакции с опытной сывороткой и дополнительным контролем осуществляется в том разведении, в котором уровень реакции (экстинкция) контрольной донорной сыворотки с микобактериальным антигеном соответствует уровню ее реакции (экстинкции) с дополнительным антигеном - общим бактериальным перекрестно реагирующим препаратом. В случае понижения уровня реакции с этими двумя антигенами рассчитывается коэффициент, характеризующий понижение уровня реакции опытной сыворотки по отношению к контрольной, и уровень положительности реакции повышается путем умножения величины экстинкции опытной сыворотки на значение этого коэффициента. This task is achieved by the fact that in a method for the serological diagnosis of tuberculosis in patients with immunodeficiency, which includes an enzyme-linked immunosorbent assay to determine the level of antibodies in the experimental and control sera to mycobacterial antigen by the level of relative extinction, on the basis of which the positive reaction is judged, it is proposed to introduce an additional control: determination of the level of antibodies to the common bacterial antigen having high cross-activity with the antigens of the causative agents and infectious disease. In this case, the formulation of the reaction with experimental serum and additional control is carried out in that dilution in which the level of reaction (extinction) of the control donor serum with mycobacterial antigen corresponds to the level of its reaction (extinction) with an additional antigen - a common bacterial cross-reactive drug. In case of a decrease in the reaction level with these two antigens, a coefficient is calculated that characterizes the decrease in the reaction level of the experimental serum relative to the control, and the level of positive reaction is increased by multiplying the extinction value of the experimental serum by the value of this coefficient.

Способ осуществляется следующим образом. The method is as follows.

Планшеты для иммунологических реакций параллельно сенсибилизируются общим перекрестно реагирующим бактериальным антигеном и антигеном, выделенным из M.tuberculosis. Реакцию контрольной сыворотки с микобактериальным антигеном ставят в рабочем разведении и определяют уровень ее экстинкции. Параллельно реакцию этой же сыворотки ставят с общим перекрестно реагирующим антигеном в раститровке и определяют разведение, уровень экстинкции которого соответствует экстинкции этой же сыворотки с микобактериальным антигеном в рабочем разведении. Реакцию опытной сыворотки больного с подозрением на туберкулез ставят также с общим перекрестно реагирующим антигеном в разведении, ранее определенном при раститровке контрольной сыворотки и в рабочем разведении при постановке с микобактериальным антигеном. Рассчитывают коэффициент, характеризующий разницу в экстинкции при определении уровня антител контрольной и опытной сывороток к общему бактериальному перекрестнореагирующему антигену. Экстинкцию опытной сыворотки при постановке реакции с микобактериальным антигеном умножают на величину этого коэффициента. Дополнительная реакция с общим перекрестно реагирующим бактериальным антигеном позволяет выявить уровень снижения антител у больных с иммунодефицитом и значительно уменьшить процент ложноотрицательных результатов при применении способа у данной категории больных. Например, относительная экстинкция контрольной сыворотки с микобактериальным антигеном равна 1,0 в разведении 1: 400, а опытной - 0,7. Такой уровень экстинкции при постановке контрольной сыворотки с общим перекрестнореагирующим антигеном (1,0) достигается в разведении 1 : 1500. При постановке опытной сыворотки с этим антигеном в том же разведении уровень относительной экстинкции составил 0,6. Следовательно, в данном случае имеется снижение уровня реакции за счет уменьшения продукции антител 1,0 : 0,6 в 1,67 раза. За счет этого истинный уровень реакции должен составить 0,7 • 1,66 = 1,16 и она может быть расценена как положительная. Tablets for immunological reactions are simultaneously sensitized by a common cross-reactive bacterial antigen and an antigen isolated from M. tuberculosis. The reaction of the control serum with mycobacterial antigen is put in working dilution and the level of its extinction is determined. In parallel, the reaction of the same serum is placed with a common cross-reacting antigen in the assay and the dilution is determined, the extinction level of which corresponds to the extinction of the same serum with mycobacterial antigen in working dilution. The reaction of an experimental serum of a patient with suspected tuberculosis is also put with a common cross-reacting antigen in a dilution previously determined during the control test serum and in working dilution when formulated with mycobacterial antigen. Calculate the coefficient characterizing the difference in extinction when determining the level of antibodies of the control and experimental sera to the total bacterial cross-reacting antigen. The extinction of the experimental serum when setting the reaction with mycobacterial antigen is multiplied by the value of this coefficient. An additional reaction with a common cross-reactive bacterial antigen allows us to identify the level of antibody reduction in patients with immunodeficiency and significantly reduce the percentage of false negative results when applying the method in this category of patients. For example, the relative extinction of the control serum with mycobacterial antigen is 1.0 at a dilution of 1: 400, and the experimental - 0.7. This level of extinction when setting a control serum with a common cross-reacting antigen (1.0) is achieved in a dilution of 1: 1500. When setting an experimental serum with this antigen in the same dilution, the relative extinction level was 0.6. Therefore, in this case, there is a decrease in the reaction level due to a decrease in antibody production of 1.0: 0.6 by 1.67 times. Due to this, the true level of reaction should be 0.7 • 1.66 = 1.16 and it can be regarded as positive.

По сравнению с прототипом предложенный способ имеет ряд преимуществ, выражающихся в повышении чувствительности реакции, которые можно проиллюстрировать на следующих примерах. Compared with the prototype, the proposed method has several advantages, expressed in increasing the sensitivity of the reaction, which can be illustrated by the following examples.

Пример 1
Больная К. , 1997 г. диагноз: Хроническая почечная недостаточность. Состояние после пересадки почки. Милиарный туберкулез легких. Получала длительную иммуносупрессивную терапию кортикостероидными препаратами, азатиоприном, циклоспорином A. При подозрении на туберкулез легких было проведено определение уровня антимикобактериальных антител в ИФА с антигеном 10 - 14 КдА. Постановка реакции обычным методом показала в рабочем разведении уровень относительной экстинкции 0,4 (в контрольной сыворотке 1.0). Первоначально реакция была расценена как отрицательная. Было проведено дополнительное исследование с общим перекрестно реагирующим антигеном. Показатель относительной экстинкции в данном случае в разведении 1 : 1500 составил 0,3 (контрольной сыворотки 1,0). Коэффициент 1,0:0,3=3,3. Следовательно, предыдущие показания иммуноферментного анализа должны быть увеличены в 3,3 раза за счет наличия снижения продукции антител, подтвержденного во 2-м тесте. В результате истинный уровень реакции по отношению к контрольной сыворотке составил 1,32, и реакция была расценена как положительная. В данном случае имело место резкое снижение уровня продукции специфических антимикобактериальных антител, и поэтому диагностика туберкулеза в ИФА с помощью постановки стандартного теста была невозможна.Example 1
Patient K., 1997, diagnosis: Chronic renal failure. Condition after a kidney transplant. Miliary tuberculosis of the lungs. Received long-term immunosuppressive therapy with corticosteroid drugs, azathioprine, cyclosporin A. When suspected of pulmonary tuberculosis, the level of antimycobacterial antibodies in ELISA with an antigen of 10-14 KdA was determined. The reaction by the usual method showed a relative extinction level of 0.4 in the working dilution (in the control serum 1.0). Initially, the reaction was regarded as negative. An additional study was conducted with a common cross-reacting antigen. The relative extinction in this case at a dilution of 1: 1500 was 0.3 (control serum 1.0). Coefficient 1.0: 0.3 = 3.3. Therefore, the previous readings of the enzyme immunoassay should be increased by 3.3 times due to the presence of a decrease in antibody production, confirmed in the 2nd test. As a result, the true level of reaction with respect to the control serum was 1.32, and the reaction was regarded as positive. In this case, there was a sharp decrease in the level of production of specific antimycobacterial antibodies, and therefore the diagnosis of tuberculosis in ELISA using a standard test was impossible.

Пример N 2
Больной К., 1996 г. Диагноз: Хроническая почечная недостаточность. Состояние после пересадки почки. Подозрение на туберкулезный плеврит. Получал длительную (более 3 лет) иммуносупрессивную терапию кортикостероидами, азатиоприном. При постановке реакции для обнаружения антимикобактериальных антител в иммуноферментном анализе коэффициент составил 1,1, в результате чего она была расценена как сомнительная. При постановке реакции с перекрестно реагирующим бактериальным антигеном уровень реакции составил 0,74. Следовательно, уровень положительности реакции за счет снижения продукции антител должен быть уменьшен до 1,0 : 0,74, т.е. в 1,35 раза. В результате истинный уровень реакции составил 1,1 • 1,35 = 1,45, и она была расценена как положительная. Диагност плеврита туберкулезной этиологии подтвержден положительными результатами посева плевральной жидкости на БК и эффективностью специфической терапии.Example N 2
Patient K., 1996. Diagnosis: Chronic renal failure. Condition after a kidney transplant. Suspicion of tuberculous pleurisy. Received long-term (more than 3 years) immunosuppressive therapy with corticosteroids, azathioprine. When setting up the reaction for the detection of antimycobacterial antibodies in an enzyme-linked immunosorbent assay, the coefficient was 1.1, as a result of which it was regarded as doubtful. When staging a reaction with a cross-reacting bacterial antigen, the reaction level was 0.74. Therefore, the level of positive reaction by reducing the production of antibodies should be reduced to 1.0: 0.74, i.e. 1.35 times. As a result, the true level of reaction was 1.1 • 1.35 = 1.45, and it was regarded as positive. The diagnosis of pleurisy of tuberculous etiology is confirmed by the positive results of inoculation of pleural fluid on CD and the effectiveness of specific therapy.

Пример N 3
Больной Р., 1997 г. Диагноз: Сахарный диабет, I тип. Диабетическая нефропатия. Хроническая почечная недостаточность. Состояние на программном гемодиализе. Подозрение на туберкулезный плеврит. Не получал иммуносуппресивных препаратов. При постановке иммуноферментного анализа для определения уровня антимикобактериальных антител уровень реакции составил 1,56 по сравнению с контрольной сывороткой (1,0). При постановке реакции с общим перекрестно реагирующим бактериальным антигеном уровень экстинкции составил 0,85 по сравнению с контролем (1,0). Следовательно, истинное значение реакции было понижено за счет иммунодефицитного состояния, связанного с сахарным диабетом и терминальной хронической почечной недостаточностью, в 1,0 : 0,85 = 1,19 раза и должно было составлять 1,56 • 1,19 = 1,85, и реакция должна быть расценена как резко положительная. Диагноз туберкулеза подтвержден данными комплексного клинического и микробиологического обследования.Example N 3
Patient R., 1997. Diagnosis: diabetes mellitus, type I. Diabetic nephropathy. Chronic renal failure. Programmed hemodialysis status. Suspicion of tuberculous pleurisy. Did not receive immunosuppressive drugs. When an enzyme immunoassay was performed to determine the level of antimycobacterial antibodies, the reaction level was 1.56 compared to the control serum (1.0). When staging a reaction with a common cross-reactive bacterial antigen, the extinction level was 0.85 compared to the control (1.0). Consequently, the true value of the reaction was reduced due to the immunodeficiency associated with diabetes mellitus and terminal chronic renal failure, 1.0: 0.85 = 1.19 times and should be 1.56 • 1.19 = 1.85 , and the reaction should be regarded as sharply positive. The diagnosis of tuberculosis is confirmed by a comprehensive clinical and microbiological examination.

Данный способ позволяет повысить эффективность серологической диагностики туберкулеза у больных с иммунодефицитными состояниями различной природы за счет снижения количества ложноотрицательных результатов, в итоге предоставляется возможность раннего установления диагноза, повышается эффективность специфического лечения, и соответственно снижается летальность и сокращаются сроки пребывания больных в стационаре. This method allows to increase the efficiency of serological diagnosis of tuberculosis in patients with immunodeficiency states of various nature by reducing the number of false negative results, as a result, the opportunity for early diagnosis is provided, the effectiveness of specific treatment is increased, and mortality is reduced and the length of hospital stay of patients is reduced.

Claims

A method for the serological diagnosis of tuberculosis in patients with immunodeficiency, including an enzyme-linked immunosorbent assay to determine the level of antibodies in the control and experimental sera to the mycobacterial antigen according to the level of relative extinction, on the basis of which they judge the positivity of the reaction, characterized in that after determining the extinction of the control serum with mycobacterial the antigen additionally put the reaction of the same serum with a common cross-reactive bacterial antigen and its extinction level bred to the reaction level with mycobacterial antigen, then the test serum is placed in the same dilution with the total bacterial antigen, the relative extinction value of the test serum is measured, and then the coefficient corresponding to the difference in relative extinction between the control and experimental serums is determined when the reaction is set up with the common bacterial antigen , and when setting the reaction of the experimental serum with mycobacterial antigen, the level of positive reaction is increased taking into account this coefficient.