RU2126044C1

RU2126044C1 - Process for preparing hyaluronidase

Info

Publication number: RU2126044C1
Application number: RU95102697A
Authority: RU
Inventors: Наталия Владимировна Глазова; Гелий Эмильевич Елькин; Наталия Вачеславовна Заинкова; Людмила Михайловна Игонина; Юлия Михайловна Попова; Наталия Викторовна Рудометова; Людмила Ивановна Юнкерова
Original assignee: Наталия Владимировна Глазова
Priority date: 1995-02-23
Filing date: 1995-02-23
Publication date: 1999-02-10
Also published as: RU95102697A

Abstract

FIELD: preparation of gualuronidase enzyme from milt. SUBSTANCE: disintegrated milt is subjected to acid extraction. Extract is centrifuged and separated. Clarified extract is filtered on nutsch filter and directed to column with macroporous cationite. Enzyme is eluted from carrier at pH lower or equal to 9.0 since at pH of higher than 9.0 gel formed makes it difficult for solution to flow. Desalting with ammonium sulfate is carried out at saturation degree of 0.82-0.85 to recover monomeric forms of hyalurodinase. EFFECT: more efficient preparation process. 3 cl, 1 ex, 1 tbl

Description

Изобретение относится к производству ферментов, а именно, к способу получения фермента гиалуронидазы /гиалуронат-3-гликаногидролаза КФ 3.2.1.3б/ из перспективного вида сырья - молок рыб. The invention relates to the production of enzymes, and in particular, to a method for producing the enzyme hyaluronidase / hyaluronate-3-glycanohydrolase KF 3.2.1.3b / from a promising raw material is fish milk.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ получения гиалуронидазы из семенников половозрелого крупного рогатого скота, основанный на экстракции измельченных семенников водным раствором уксусной кислоты при pH 4,5 - 4,7 в атмосфере инертного газа и дальнейшей очистке экстракта обработкой его белой глиной /SU, авт.свид. N 1666534, кл. C 12 N 9/26, 1991/. The closest to the invention in technical essence and the achieved result is a method for producing hyaluronidase from the testes of mature cattle, based on the extraction of crushed testes with an aqueous solution of acetic acid at pH 4.5 - 4.7 in an inert gas atmosphere and further purification of the extract by treating it with white clay / SU, autosvid. N 1666534, CL C 12 N 9/26, 1991 /.

Однако в связи с недостаточностью дефицитного сырья, каким являются семенники крупного рогатого скота, актуальным является поиск другого доступного источника сырья, содержащего гиалуронидазу в количестве, достаточном для получения препарата в промышленном масштабе. Таким сырьем являются молоки рыб, большая часть которых в настоящее время составляет отходы рыбной промышленности. However, due to the insufficiency of scarce raw materials, such as cattle seed, it is relevant to search for another available source of raw materials containing hyaluronidase in an amount sufficient to produce the drug on an industrial scale. Such raw materials are fish milk, most of which is currently the waste of the fishing industry.

Технической задачей изобретения является возможность использования перспективного источника сырья для получения гиалуронидазы. An object of the invention is the ability to use a promising source of raw materials for hyaluronidase.

Это достигается тем, что в способе получения гиалуронидазы, заключающемся в экстракции измельченного сырья водным раствором уксусной кислоты, отделении экстракта, очистке целевого продукта сорбцией и десорбции его с сорбента, согласно изобретению, экстракции подвергают измельченные молоки рыб при pH 4,0-4,5, сорбцию целевого продукта проводят на макропористом катионите при pH 4,0-4,5, а десорбцию - раствором сульфата аммония в растворе аммиака с последующим осаждением фермента сульфатом аммония, при этом после отделения экстракта подвергают фильтрации на нутч-фильтра. This is achieved by the fact that in the method of producing hyaluronidase, which consists in the extraction of crushed raw materials with an aqueous solution of acetic acid, separation of the extract, purification of the target product by sorption and desorption from the sorbent, according to the invention, the crushed fish milk is subjected to extraction at pH 4.0-4.5 sorption of the target product is carried out on macroporous cation exchange resin at a pH of 4.0-4.5, and desorption is carried out with a solution of ammonium sulfate in an ammonia solution, followed by precipitation of the enzyme with ammonium sulfate, and after separation of the extract is subjected to ltratsii on the suction filter.

Для десорбции следует использовать 0,5 - 1,0 H раствор сульфата аммония в 0,02-0,5 H растворе аммиака. For desorption, a 0.5 - 1.0 H solution of ammonium sulfate in 0.02-0.5 H solution of ammonia should be used.

Осаждение фермента сульфатом аммония следует вести при степени насыщения 0,82-0,86. The precipitation of the enzyme with ammonium sulfate should be carried out at a degree of saturation of 0.82-0.86.

Способ получения гиалуронидазы осуществляют следующим образом. The method of obtaining hyaluronidase is as follows.

Предварительно измельченные молоки рыб подвергают экстракции 0,1 н раствором уксусной кислоты в течение 3-4 часов. Увеличение времени экстракции больше 4 часов нецелесообразно, так как может привести к уменьшению гиалуронидазной активности фермента в экстракте. Pre-crushed fish milk is subjected to extraction with 0.1 N acetic acid solution for 3-4 hours. An increase in extraction time of more than 4 hours is impractical, since it can lead to a decrease in the hyaluronidase activity of the enzyme in the extract.

Экстракцию необходимо проводить при t=3-5^oC, так как это важно для стабилизации активности выделяемого фермента. Полученный экстракт подают на центрифугу, где разделяют на жмых и неосветленный экстракт. Затем экстракт сепарируют, при этом pH экстракта должен быть 4,3-4,8.Extraction must be carried out at t = 3-5 ^o C, as this is important for stabilizing the activity of the secreted enzyme. The resulting extract is fed to a centrifuge, where it is divided into cake and unclarified extract. Then the extract is separated, while the pH of the extract should be 4.3-4.8.

Экстракт молок, подаваемый на колонну с макропористым катионитом, должен быть абсолютно прозрачным, в противном случае, при сдвиге pH в щелочную сторону в процессе элюции возможно образование геля в колонне, что делает невозможным протекание раствора. В связи с этим осветленный экстракт после сепарирования передают на стадию дополнительной фильтрации на нутч-фильтре. Затем экстракт подают в сборник и охлаждают. Осветленный экстракт с t=+5^oC передают при помощи центробежного насоса из сборника на ионообменную колонну через расходомер со скоростью 50-150 мл/см. 2 час. После окончания сорбции колонну промывают дистиллированной водой в количестве, равном объему колонны. Затем осуществляют десорбцию с ионита путем подачи сверху вниз элюента со скоростью 25-75 мл/см. 2 час. В качестве элюента используют 0,5 - 1,0 н раствор сульфата аммония в 0,02-0,5 и раствора аммиака. pH элюента должно быть 8,5-9,0. Изменение pH больше значения 9,0 приводит к образованию геля и невозможности элюирования, а также к значительным потерям гиалуронидазной активности. Уменьшение скорости элюента приводит к размыванию целевого пика, увеличению его объема, что не дает достаточной степени концентрирования. После процесса десорбции проводят регенерацию катионита, чтобы его можно было использовать в дальнейшем. Полученный после десорбции элюат подают на стадию осаждения сульфатом аммония при степени насыщения 0,82 - 0,85.The milk extract supplied to the column with macroporous cation exchange resin must be completely transparent, otherwise, when the pH is shifted to the alkaline side during elution, gel formation in the column is possible, which makes it impossible for the solution to flow. In this regard, the clarified extract after separation is passed to the stage of additional filtration on a suction filter. Then the extract is served in the collection and cooled. The clarified extract with t = + 5 ^o C is transferred by means of a centrifugal pump from the collector to the ion exchange column through a flow meter at a speed of 50-150 ml / cm. 2 hours After sorption, the column is washed with distilled water in an amount equal to the volume of the column. Then, desorption from the ion exchanger is carried out by feeding the eluent from top to bottom at a rate of 25-75 ml / cm. 2 hours A 0.5 - 1.0 N solution of ammonium sulfate in 0.02-0.5 and an ammonia solution are used as eluent. The pH of the eluent should be 8.5-9.0. A change in pH greater than 9.0 leads to the formation of a gel and the inability to elute, as well as to significant losses of hyaluronidase activity. A decrease in the speed of the eluent leads to erosion of the target peak, an increase in its volume, which does not give a sufficient degree of concentration. After the desorption process, cation exchanger is regenerated so that it can be used in the future. The eluate obtained after desorption is fed to the stage of ammonium sulfate precipitation at a degree of saturation of 0.82 - 0.85.

Полученный высол растворяют в воде на стадию обессоливания. The resulting efflorescence is dissolved in water at the stage of desalination.

Технический результат изобретения заключается в следующем:
1) возможность использования перспективного источника гиалуронидазы - молок рыб, являющихся отходом рыбной промышленности;
2) сырье хорошо измельчается, выход фермента практически не зависит от степени измельчения / см. таблицу/;
3) удельная гиалуронидазная активность молок рыб в 1,5 раза больше, чем удельная активность семенников /см. таблицу/;
4) при осаждении сульфатом аммония выделяются, в основном, мономерные, а не олигомерные формы гиалуронидазы /см. чертеж/;
5) удельная активность получаемого по данной технологии фермента из молок в 5 раз больше удельной активности субстанции препарата "Лидаза".The technical result of the invention is as follows:
1) the possibility of using a promising source of hyaluronidase - fish milk, which is a waste of the fishing industry;
2) the raw material is well crushed, the yield of the enzyme is practically independent of the degree of grinding / see table /;
3) the specific hyaluronidase activity of fish milk is 1.5 times greater than the specific activity of the testes / cm. table /;
4) upon precipitation with ammonium sulfate, mainly monomeric rather than oligomeric forms of hyaluronidase / cm are released. drawing/;
5) the specific activity of the enzyme obtained from milk in this technology is 5 times greater than the specific activity of the substance of the drug "Lidaza".

Способ иллюстрируется следующим примером. The method is illustrated by the following example.

Пример 1. Example 1

В качестве сырья для получения фермента используют молоки лососевых рыб. 50 кг замороженных молок лососевых рыб измельчают до величины частиц около 2 мм и подвергают экстракции 150 л и 0,1 н раствором уксусной кислоты при t= +5^oC в течение 3,5 часов при периодическом перемешивании. После окончания экстракции жмых отделяют на центрифуге, а экстракт сепарируют, подвергают дополнительной фильтрации на нутч-фильтре и охлаждают до t=+5^oC. Затем экстракт подают на ионообменную колонну, заполненную макропористым сульфокатионитом КУ-23 в H⁺-форме в количестве 30 кг. Скорость сорбции 10 мл/см. 2 час. Объем пропущенного экстракта 150 л pH 4,3. Затем сорбент промывают дистиллированной водой V=125 л и проводят десорбцию фермента 1 н раствором сульфата аммония в 0,03 н растворе аммиака, подавая элюент сверху вниз со скоростью 55 мл/см. 2 час при t=+5^oC. pH элюента 9,0. На выходе колонны собирают фракции объемом 5 л, в которых определяют количество белка по методу Лоури, фракции, содержащие более 2,5 мг/мл белка, объединяют, доводят pH элюента до 4,5 и проводят осаждение фермента сернокислым аммонием при степени насыщения 0,85.As raw materials for the preparation of the enzyme, salmon milk is used. 50 kg of frozen salmon milk is ground to a particle size of about 2 mm and subjected to extraction with 150 L and 0.1 N acetic acid solution at t = +5 ^o C for 3.5 hours with periodic stirring. After extraction is completed, the cake is separated in a centrifuge, and the extract is separated, subjected to additional filtration on a suction filter and cooled to t = + 5 ^° C. Then, the extract is fed to an ion-exchange column filled with KU-23 macroporous sulfocationite in an H ⁺ form in an amount of 30 kg Sorption rate 10 ml / cm. 2 hours The volume of the missed extract is 150 l pH 4.3. Then the sorbent is washed with distilled water V = 125 L and the enzyme is desorbed with a 1 N solution of ammonium sulfate in a 0.03 N ammonia solution, feeding the eluent from top to bottom at a rate of 55 ml / cm. 2 hours at t = + 5 ^o C. The pH of the eluent is 9.0. Fractions with a volume of 5 l are collected at the column outlet, in which the amount of protein is determined by the Lowry method, fractions containing more than 2.5 mg / ml of protein are combined, the pH of the eluent is adjusted to 4.5, and the enzyme is precipitated with ammonium sulfate at a saturation degree of 0, 85.

Claims

1. The method of obtaining hyaluronidase, which consists in the extraction of crushed raw materials with an aqueous solution of acetic acid, separation of the extract, purification of the target product by sorption and desorption of it from the sorbent, characterized in that the extracted fish milk is subjected to extraction at pH 4.0 - 4.5, sorption of the target the product is carried out on macroporous cation exchange resin at a pH of 4.0 - 4.5, and desorption is carried out with a solution of ammonium sulfate in an ammonia solution, followed by precipitation of the enzyme with ammonium sulfate, and after separation, the extract is filtered on a suction filter re.

2. The method according to claim 1, characterized in that for desorption using a 0.5 - 1.0 N solution of ammonium sulfate in a 0.02 - 0.5 N solution of ammonia.

3. The method according to p. 1, characterized in that the deposition of ammonium sulfate is carried out at a degree of saturation of 0.82 to 0.86.