RU2125062C1

RU2125062C1 - Protected oxytocin derivatives

Info

Publication number: RU2125062C1
Application number: RU97105666A
Authority: RU
Inventors: В.В. Самуков; П.И. Поздняков; А.Н. Сабиров
Original assignee: Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"
Priority date: 1997-04-10
Filing date: 1997-04-10
Publication date: 1999-01-20

Abstract

FIELD: organic chemistry, chemistry of peptides, hormones. SUBSTANCE: invention relates to derivatives of oxytocin of the formula (I)

where R₁ is tert.-butoxycarbonylamino-, amino-group or hydrogen. Synthesized compounds can be used as parent substances for synthesis of oxytocin and deaminooxytocin. EFFECT: improved method of synthesis. 10 ex

Description

Изобретение относится к новым исходным соединениям, применяемым для получения окситоцина и его аналогов, а именно к защищенным производным окситоцина общей формулы I

где R₁ - трет-бутоксикарбонил-аминогруппа (Ia), аминогруппа (Ib) или атом водорода (Ic).The invention relates to new starting compounds used to obtain oxytocin and its analogues, namely to protected derivatives of oxytocin of General formula I

where R ₁ is a tert-butoxycarbonyl amino group (Ia), an amino group (Ib) or a hydrogen atom (Ic).

Окситоцин, нонапептид, содержащий дисульфидный цикл, имеет структуру

и является одним из важнейших регуляторов репродуктивной сферы млекопитающих.Oxytocin, a nonapeptide containing a disulfide cycle, has the structure

and is one of the most important regulators of the reproductive sphere of mammals.

Окситоцин и его структурные аналоги, получаемые методами химического синтеза, широко применяются в медицине и ветеринарии в качестве лекарственных средств утеротонического действия. Oxytocin and its structural analogues obtained by chemical synthesis methods are widely used in medicine and veterinary medicine as uterotonic drugs.

Дисульфидный цикл, образованный двумя остатками цистеина, является существенным элементом структуры, определяющим биологическую активность окситоцина. С точки зрения химического синтеза образование дисульфидного цикла в молекуле окситоцина - очень важная и ответственная стадия, от которой зависит эффективность всего синтеза, а именно выход, химическая чистота и биологическая активность конечного продукта. Дисульфидный цикл химически нестабилен и легко подвергается восстановлению, окислению и изомеризации, поэтому в процессе синтеза окситоцина или его аналогов формирование дисульфидного цикла осуществляют, как правило, на одной из финальных стадий синтеза. С этой целью при сборке пептицидной цепи окситоцина остатки цистеина вводят в синтез с предварительно блокированными сульфгидрильными (SH) группами. Защитные группы для блокирования SH-групп подбирают таким образом, чтобы они, с одной стороны, были устойчивы ко всем реагентам и условиям реакций, применяемым при сборке пептидной цепи, с другой стороны, легко и селективно отщеплялись после сборки пептида с освобождением SH-групп или с непосредственным образованием дисульфидного цикла. The disulfide cycle formed by two cysteine residues is an essential structural element that determines the biological activity of oxytocin. From the point of view of chemical synthesis, the formation of a disulfide cycle in an oxytocin molecule is a very important and crucial stage on which the effectiveness of the entire synthesis depends, namely the yield, chemical purity and biological activity of the final product. The disulfide cycle is chemically unstable and easily undergoes reduction, oxidation, and isomerization; therefore, during the synthesis of oxytocin or its analogues, the formation of a disulfide cycle is usually carried out at one of the final stages of the synthesis. For this purpose, during the assembly of the peptide chain of oxytocin, cysteine residues are introduced into the synthesis with previously blocked sulfhydryl (SH) groups. Protecting groups for blocking SH-groups are selected so that, on the one hand, they are resistant to all reagents and reaction conditions used in the assembly of the peptide chain, on the other hand, they are easily and selectively cleaved after assembly of the peptide with the release of SH-groups or with the direct formation of a disulfide cycle.

Окситоцин является весьма нестабильным соединением и плохо подается очистке от примесей пептидной природы и солей. Падение его биологической активности может происходить даже при таких операциях, как колоночная хроматография и упаривание растворов; инактивации могут способствовать различные органические и неорганические примеси, присутствующие в растворах. Поэтому очень важно, чтобы после деблокирования и окисления окситоцин был получен в водном растворе с минимальным содержанием солей и нелетучих органических примесей. Oxytocin is a very unstable compound and is poorly cleaned of peptide impurities and salts. A drop in its biological activity can occur even during operations such as column chromatography and evaporation of solutions; various organic and inorganic impurities present in solutions can contribute to inactivation. Therefore, it is very important that after release and oxidation, oxytocin is obtained in an aqueous solution with a minimum content of salts and non-volatile organic impurities.

На практике при планировании синтеза окситоцина выбор защитных групп и условий их отщепления для остатков цистеина является важнейшим элементом, от которого зависит выбор других защитных групп, реакционных условий и реагентов. In practice, when planning the synthesis of oxytocin, the choice of protective groups and the conditions for their cleavage for cysteine residues is an important element on which the choice of other protective groups, reaction conditions and reagents depends.

Наиболее известным способом защиты SH-групп остатков цистеина при синтезе окситоцина является S-бензилирование, описанное в J. Amer. Chem. Soc., v. 76, N12, pp. 3115-3121 (1954). S-Бензильная защитная группа отличается большой устойчивостью и совместима практически с любыми типами временных N_α-защитных групп и методами образования пептидной связи. Однако единственным приемлемым способом деблокирования ди-(S-бензил)-окситоцина после синтеза является обработка натрием в жидком аммиаке. В таких условиях происходит частичная деструкция пептида и образуется значительное количество побочных продуктов. В результате после окисления деблокированного пептида получается окситоцин, содержащий большое количество трудноотделимых примесей и имеющий низкую биологическую активность.The best-known method of protecting SH groups of cysteine residues in the synthesis of oxytocin is S-benzylation described in J. Amer. Chem. Soc., V. 76, N12, pp. 3115-3121 (1954). The S-benzyl protecting group is highly stable and is compatible with almost any type of temporary N _α -protecting groups and peptide bond formation methods. However, the only acceptable way to release di- (S-benzyl) -oxytocin after synthesis is to treat with sodium in liquid ammonia. Under such conditions, partial destruction of the peptide occurs and a significant amount of by-products are formed. As a result, after the oxidation of the released peptide, oxytocin is obtained, which contains a large amount of impurities and has low biological activity.

В патентах Германии 1038053 и 1059471 описаны способы получения N_α, S, S-трис-трифенилметил-окситоцина и его превращения в окситоцин. Одновременное отщепление всех трифенилметильных (тритильных) защитных групп легко достигается путем обработки защищенного пептида смесью дихлорметана и соляной кислоты. Деблокированный пептид, находящийся в водной фазе, окисляют затем в окситоцин кислородом. По другому способу (патент Швейцарии 498805) ди-(S-тритил)-пептид можно окислять иодом непосредственно в циклический дисульфид. S-Тритильная защита неустойчива в кислых средах, в частности в условиях отщепления трет-бутоксикарбонильной (Boc) и бензилоксикарбонильной (Cbz) N_α-защитных групп. Это создает значительные трудности для синтеза защищенных пептидов, содержащих S-тритилцистеин, поэтому производные ди-(S-тритил)-окситоцина получаются, как правило, с низкими выходами.German patents 1038053 and 1059471 describe methods for producing N _α , S, S-tris-triphenylmethyl-oxytocin and its conversion to oxytocin. The simultaneous cleavage of all triphenylmethyl (trityl) protecting groups is easily achieved by treating the protected peptide with a mixture of dichloromethane and hydrochloric acid. The released peptide in the aqueous phase is then oxidized to oxytocin with oxygen. In another method (Swiss patent 498805), the di- (S-trityl) -peptide can be oxidized with iodine directly to the cyclic disulfide. S-trityl protection is unstable in acidic environments, in particular under conditions of cleavage of tert-butoxycarbonyl (Boc) and benzyloxycarbonyl (Cbz) N _α -protective groups. This creates significant difficulties for the synthesis of protected peptides containing S-tritylcysteine; therefore, derivatives of di- (S-trityl) -oxytocin are obtained, as a rule, in low yields.

В патенте США 3560521 для получения окситоцина использовали производные ди-(S-ацетамидометил)-окситоцина. S-Ацетамидометильные защитные группы отщепляли действием избытка ацетата ртути (II), удаляли ионы ртути из раствора сероводородом, затем окисляли деблокированный дигидроокситоцин кислородом. Способ, описанный в Изв. АН Латв. ССР, Сер.хим., N 4, с.503-505 (1977), позволяет избежать использования соединений ртути. Согласно этому способу удаление S-ацетамидометильных групп с одновременным замыканием дисульфидного цикла проводят путем обработки иодом разбавленного раствора защищенного пептида в смеси диметилформамида и метанола. Недостатком данного способа является сложность выделения целевого продукта из большого объема органического растворителя без потери биологической активности. In US Pat. No. 3,560,521, di- (S-acetamidomethyl) -oxytocin derivatives were used to prepare oxytocin. S-Acetamidomethyl protective groups were cleaved off by the action of excess mercury (II) acetate, mercury ions were removed from the solution with hydrogen sulfide, and then the dehydrated dihydrooxytocin was oxidized with oxygen. The method described in Izv. Academy of Sciences of Latvia. SSR, Ser.chem., N 4, pp. 503-505 (1977), avoids the use of mercury compounds. According to this method, the removal of S-acetamidomethyl groups with simultaneous closure of the disulfide cycle is carried out by treating iodine with a diluted solution of the protected peptide in a mixture of dimethylformamide and methanol. The disadvantage of this method is the difficulty of isolating the target product from a large volume of organic solvent without loss of biological activity.

В J.Chem. Soc., Chem. Commun., N 20, pp. 1501-1502 (1986), описано получение окситоцина из ди-[S-(9-флуоренил)метил]-окситоцина, синтезированного твердофазным методом. Указанный защищенный пептид в концентрации 0,5 мкмол/мл деблокировали 50% пиперидином в диметилформамиде; при этом происходило одновременное окисление SH-групп в циклический дисульфид. Синтез проведен на микромольном уровне; очевидно, что при увеличении масштаба необходимо пропорционально увеличить объем органических растворителей, используемых на стадии деблокирования-окисления. In J. Chem. Soc. Chem. Commun., N 20, pp. 1501-1502 (1986), describes the preparation of oxytocin from di- [S- (9-fluorenyl) methyl] -oxytocin synthesized by the solid-phase method. The specified protected peptide at a concentration of 0.5 μmol / ml was unblocked with 50% piperidine in dimethylformamide; at the same time, the SH groups were simultaneously oxidized to cyclic disulfide. The synthesis was carried out at micromole level; it is obvious that when zooming in, it is necessary to proportionally increase the volume of organic solvents used in the deblocking-oxidation step.

Задачей предлагаемого изобретения является синтез новых цистеин-защищенных производных окситоцина, применение которых позволило бы получать окситоцин и его аналоги в виде растворов с минимальным содержанием солей и нелетучих органических примесей. The objective of the invention is the synthesis of new cysteine-protected derivatives of oxytocin, the use of which would allow to obtain oxytocin and its analogues in the form of solutions with a minimum content of salts and non-volatile organic impurities.

Задача решается путем получения новых соединений, а именно защищенных производных окситоцина общей формулы I:

где R₁ - трет-бутоксикарбонил-аминогруппа (Ia), аминогруппа (Ib) или атом водорода (Ic).The problem is solved by obtaining new compounds, namely protected derivatives of oxytocin of General formula I:

Соединения формулы I могут быть получены путем синтеза на твердой фазе или в растворе с использованием известных методов и реагентов. Остатки цистеина и 3-меркатопропионовой кислоты в процессе синтеза вводятся в виде S-дифенилметильных (S-Dpm) производных, получаемых известными способами, например, как описано в J. Chtm. Soc. (C), p. 2683-2687 (1970). В качестве временных N_α-защитных групп используются группы, которые можно селективно отщепить, не затрагивая S-дифенилметильную защиту, например, N_α-Boc-группа. При синтезе в растворе для отщепления N_α-Boc-группы могут быть использованы известные методы и реагенты, например растворы хлористого водорода или сульфокислот в органических растворителях, трифторуксусная кислота или ее растворы в дихлорметане или хлороформе. Для наращивания пептидной цепи применяются известные методы конденсации, например конденсация при действии дициклогексилкарбодиимида и 1-гидроксибензотриазола.The compounds of formula I can be obtained by synthesis on a solid phase or in solution using known methods and reagents. Residues of cysteine and 3-mercopropionic acid during the synthesis are introduced as S-diphenylmethyl (S-Dpm) derivatives obtained by known methods, for example, as described in J. Chtm. Soc. (C), p. 2683-2687 (1970). As temporary N _α -protective groups, groups are used that can be selectively cleaved without affecting the S-diphenylmethyl protection, for example, an N _α -Boc group. In the synthesis in a solution, known methods and reagents, for example, solutions of hydrogen chloride or sulfonic acids in organic solvents, trifluoroacetic acid or its solutions in dichloromethane or chloroform can be used to remove the N _α -Boc group. Known methods of condensation are used to build up the peptide chain, for example, condensation by the action of dicyclohexylcarbodiimide and 1-hydroxybenzotriazole.

Соединения Ia и Ib могут быть использованы для получения окситоцина, соединение Ic - для получения дезаминоокситоцина. Этот процесс проводится в две стадии. На первой стадии проводят отщепление S-Dpm-групп с остатков цистеина и 3-меркаптопропионовой кислоты действием трифторуксусной кислоты в присутствии акцептора дифенилметильных катионов, например фенола (в соединении Ia при этом одновременно отщепляется N_α-Boc-группа). Деблокирование проводят в течение 20 мин при 60-80^oC или в течение 18-24 ч при 20-25^oC. Затем отгоняют трифторуксусную кислоту и выделяют осаждением деблокированный пептид со свободными SH-группами. На второй стадии полученный пептид растворяют в воде или водно-органическом растворителе, например в водном ДМФА, доводят при необходимости pH раствора до значения в интервале от 6 до 8 и окисляют известным способом, например перекисью водорода или кислородом воздуха.Compounds Ia and Ib can be used to produce oxytocin, compound Ic can be used to produce deaminooxytocin. This process is carried out in two stages. At the first stage, S-Dpm groups are cleaved from cysteine and 3-mercaptopropionic acid residues by the action of trifluoroacetic acid in the presence of an acceptor of diphenylmethyl cations, for example phenol (in the case of compound Ia, the N _α -Boc group is simultaneously cleaved). Release is carried out for 20 min at 60-80 ^o C or for 18-24 h at 20-25 ^o C. Then trifluoroacetic acid is distilled off and the released peptide with free SH groups is isolated by precipitation. In the second stage, the obtained peptide is dissolved in water or an aqueous organic solvent, for example, in aqueous DMF, the pH of the solution is adjusted, if necessary, to a value in the range from 6 to 8 and oxidized in a known manner, for example, hydrogen peroxide or atmospheric oxygen.

Отщепление S-Dpm-групп проходит гладко и с высоким выходом. Благодаря осаждению и тщательной промывке первой стадии деблокированный пептид практически не содержит органических примесей непептидного характера и солей и имеет высокое содержание основного вещества. При растворении деблокированного пептида в воде или водном ДМФА раствор имеет кислую реакцию, что позволяет минимизировать неконтролируемое окисление на стадии растворения. В результате окисления получается окситоцин или дезаминоокситоцин с высокой биологической активностью в растворе, не содержащем солей и органических примесей. Такой раствор может быть сконцентрирован известными способами, например упариванием при пониженном давлении или лиофилизацией, без потери биологической активности целевого продукта. Cleavage of S-Dpm groups proceeds smoothly and with a high yield. Due to the deposition and thorough washing of the first stage, the released peptide practically does not contain non-peptide organic impurities and salts and has a high content of the basic substance. When a deblocked peptide is dissolved in water or aqueous DMF, the solution has an acid reaction, which minimizes uncontrolled oxidation at the dissolution stage. As a result of oxidation, oxytocin or desaminooxytocin is obtained with high biological activity in a solution that does not contain salts and organic impurities. Such a solution can be concentrated by known methods, for example by evaporation under reduced pressure or lyophilization, without loss of biological activity of the target product.

Таким образом, предлагаемые защищенные производные окситоцина можно эффективно использовать для получения окситоцина и дезаминоокситоцина, причем целевые продукты получаются с высокими выходами и в форме, удобной для концентрирования и очистки без потери биологической активности. Thus, the proposed protected derivatives of oxytocin can be effectively used to obtain oxytocin and desaminooxytocin, and the target products are obtained in high yields and in a form convenient for concentration and purification without loss of biological activity.

Сущность предлагаемого изобретения иллюстрируется примерами. При описании примеров используются следующие сокращения и условные обозначения:
ДМФА - диметилформамид
ДЦГК - дициклогексилкарбодиимид
Сокращенные обозначения аминокислот и защитных групп используются в соответствии с рекомендациями Комиссии по биологической номенклатуре при IUPACIUB, опубликованными в Eur, J. Biochem, v.138, N 1, pp. 9-37 (1984). Оптически активные аминокислоты, приведенные в описаниях примеров, по умолчанию имеют L-конфигурацию.The essence of the invention is illustrated by examples. When describing the examples, the following abbreviations and conventions are used:
DMF - dimethylformamide
DHCA - dicyclohexylcarbodiimide
The abbreviated designations of amino acids and protective groups are used in accordance with the recommendations of the Commission on Biological Nomenclature at IUPACIUB, published in Eur, J. Biochem, v.138, N 1, pp. 9-37 (1984). The optically active amino acids shown in the descriptions of the examples have an L configuration by default.

Значения хроматографических подвижностей R_f приведены для пластинок для тонкослойной хроматографии Alufolien Kieselgel 60 F₂₅₄ (Merck, ФРГ) в системах хлороформ-метанол-уксусная кислота 90:10:3 (А) и ацетонитрил-уксусная кислота-вода 40: 1:10 (Б). Обнаружение пятен на пластинках проводили в УФ-свете и нингидриновым реактивом после прогревания. Массы молекулярных ионов (M + H)⁺ измерены на времяпролетном масс-спектрометре МСБХ-1 (НПО "Электрон", Украина).The values of the chromatographic mobilities R _f are given for Alufolien Kieselgel 60 F ₂₅₄ thin-layer chromatography plates (Merck, Germany) in the systems chloroform-methanol-acetic acid 90: 10: 3 (A) and acetonitrile-acetic acid-water 40: 1:10 ( B) Spot detection on the plates was carried out in UV light and ninhydrin reagent after heating. Masses of molecular ions (M + H) ^{+ were} measured on an MSBH-1 time-of-flight mass spectrometer (NPO Elektron, Ukraine).

Пример 1. Получение трифторацетата (S-дифенилметил)цистеинил-пролил-лейцил-глицинамида [H-Cys(Dpm)-Pro-Leu-Gly-NH₂•TFA].Example 1. Preparation of (S-diphenylmethyl) cysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamide trifluoroacetate [H-Cys (Dpm) -Pro-Leu-Gly-NH ₂ • TFA].

К раствору 9.12 г пролил-лейцил-глицинамида, 7.6 г Boc- (S-дифенилметил)- цистеина и 1.35 г 1-гидроксибензотриазола в 30 мл ДМФА при охлаждении в ледяной бане и перемешивании прибавляют 4.3 г ДЦГК. Смесь перемешивают 1 ч при охлаждении и еще 4 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок фильтруют, фильтрат упаривают при пониженном давлении, остаток растворяют в 250 мл этилацетата. Раствор промывают в делительной воронке 3 х 100 мл 5% водного раствора бикарбоната натрия, 2 х 70 мл 1 н. соляной кислоты и 100 мл насыщенного водного раствора хлорида натрия, сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают при пониженном давлении. Остаток растворяют в 30 мл дихлорметана, добавляют 20 мл трифторуксусной кислоты и выдерживают 40 мин при комнатной температуре. Раствор упаривают до вязкого масла, к остатку добавляют 60 мл толуола и вновь упаривают. Остаток растворяют в 30 мл этанола, добавляют 150 мл диэтилового эфира и оставляют на ночь в холодильнике. Выпавший осадок растирают, фильтруют, промывают на фильтре эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе. Получают 11 г целевого тетрапептида в виде белого мелкокристаллического порошка; R_f(A) 0.17; масс-спектр: (M+H)⁺ 556.1 (вычислено: 554.775).To a solution of 9.12 g of prolyl-leucyl-glycinamide, 7.6 g of Boc- (S-diphenylmethyl) -cysteine and 1.35 g of 1-hydroxybenzotriazole in 30 ml of DMF, 4.3 g of DCCA are added while cooling in an ice bath and stirring. The mixture was stirred for 1 hour while cooling and another 4 hours at room temperature. The precipitate was filtered, the filtrate was evaporated under reduced pressure, the residue was dissolved in 250 ml of ethyl acetate. The solution is washed in a separatory funnel 3 x 100 ml of a 5% aqueous solution of sodium bicarbonate, 2 x 70 ml of 1 N. hydrochloric acid and 100 ml of a saturated aqueous solution of sodium chloride, dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated under reduced pressure. The residue was dissolved in 30 ml of dichloromethane, 20 ml of trifluoroacetic acid was added and the mixture was kept at room temperature for 40 minutes. The solution was evaporated to a viscous oil, 60 ml of toluene was added to the residue and evaporated again. The residue is dissolved in 30 ml of ethanol, 150 ml of diethyl ether are added and left in the refrigerator overnight. The precipitate was triturated, filtered, washed with ether and dried in a vacuum desiccator. Obtain 11 g of the target tetrapeptide in the form of a white crystalline powder; R _f (A) 0.17; mass spectrum: (M + H) ⁺ 556.1 (calculated: 554.775).

Пример 2. Получение Boc-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинилпролил-лейцил-глицинамида [Boc-Asn-Cys(Dpm)-Pro-Leu-Gly-NH₂].Example 2. Obtaining Boc-asparaginyl- (S-diphenylmethyl) cysteinylprolyl-leucyl-glycinamide [Boc-Asn-Cys (Dpm) -Pro-Leu-Gly-NH ₂ ].

К раствору 10.8 г трифторацетата (S-дифенилметил)цистеинил-пролил-лейцил-глицинамида (пример 1), 4.2 г Boc- аспарагина и 2.5 г 1-гидроксибензотриазола в 30 мл ДМФА при охлаждении в ледяной бане и перемешивании прибавляют 2.8 мл триэтиламина, затем 4.1 г ДЦГК. Смесь перемешивают 1 ч при охлаждении и еще 3 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок фильтруют, фильтрат упаривают при пониженном давлении, остаток обрабатывают 300 мл воды. Образовавшийся осадок растирают, фильтруют, промывают на фильтре 100 мл 5% водного раствора бикарбоната натрия и 100 мл воды и сушат на воздухе. Полученный сырой продукт растворяют в 30 мл ДМФА и осаждают диэтиловым эфиром, промывают на фильтре эфиром и сушат на воздухе. Получают 10.8 г Boc-пентапептида; R_f(A) 0.35; масс-спектр: (M+H)⁺768.3(вычислено: 769,008).To a solution of 10.8 g of (S-diphenylmethyl) cysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamide trifluoroacetate (Example 1), 4.2 g of Boc-asparagine and 2.5 g of 1-hydroxybenzotriazole in 30 ml of DMF, 2.8 ml of triethylamine are added while cooling in an ice bath and stirring, then 4.1 g of DTSGK. The mixture was stirred for 1 hour while cooling and another 3 hours at room temperature. The precipitate was filtered, the filtrate was evaporated under reduced pressure, the residue was taken up in 300 ml of water. The precipitate formed is triturated, filtered, washed on the filter with 100 ml of a 5% aqueous solution of sodium bicarbonate and 100 ml of water, and dried in air. The resulting crude product was dissolved in 30 ml of DMF and precipitated with diethyl ether, washed with ether and dried in air. 10.8 g of Boc-pentapeptide are obtained; R _f (A) 0.35; mass spectrum: (M + H) ⁺ 768.3 (calculated: 769.008).

Пример 3. Получение Boc-глутаминил-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил-пропил-лейцил-глицинамида [Boc-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro-Leu-Gly-NH₂].Example 3. Obtaining Boc-glutaminyl-asparaginyl- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-propyl-leucyl-glycinamide [Boc-Gln-Asn-Cys (Dpm) -Pro-Leu-Gly-NH ₂ ].

15.4 г Boc-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил-пролил-лейцил-глицинамида (пример 2) растворяют в 40 мл дихлорметана и 30 мл трифторуксусной кислоты и выдерживают раствор 1 ч при комнатной температуре. Раствор упаривают до вязкого масла, к остатку добавляют 60 мл толуола и вновь упаривают. Остаток растирают с 200 мл диэтилового эфира, осадок фильтруют, промывают на фильтре эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе. Полученный трифторацетат пентапептида растворяют в 50 мл ДМФА и добавляют 5.5 г Boc-глутамина и 2.8 г 1-гидроксибензотриазола. При охлаждении в ледяной бане и перемешивании к раствору прибавляют 3.3 мл N-метилморфолина, затем 4.6. г ДЦГК. Смесь перемешивают 1 ч при охлаждении и еще 6 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок фильтруют, фильтрат упаривают при пониженном давлении, остаток обрабатывают 50 мл этилацетата и 100 мл диэтилового эфира. Образовавшийся осадок растирают, фильтруют, промывают на фильтре 100 мл эфира и сушат на воздухе. Получают 15.6 г Boc-гексапептида; R_f(A) 0.22, R_f(Б) 0.45; масс-спектр: (M+H)⁺ 895.5 (вычислено: 897.141).15.4 g of Boc-asparaginyl- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamide (Example 2) was dissolved in 40 ml of dichloromethane and 30 ml of trifluoroacetic acid and the solution was kept for 1 h at room temperature. The solution was evaporated to a viscous oil, 60 ml of toluene was added to the residue and evaporated again. The residue was triturated with 200 ml of diethyl ether, the precipitate was filtered, washed on the filter with ether and dried in a vacuum desiccator. The resulting pentapeptide trifluoroacetate is dissolved in 50 ml of DMF and 5.5 g of Boc-glutamine and 2.8 g of 1-hydroxybenzotriazole are added. While cooling in an ice bath and stirring, 3.3 ml of N-methylmorpholine is added to the solution, then 4.6. g DTsGK. The mixture was stirred for 1 hour while cooling and another 6 hours at room temperature. The precipitate was filtered, the filtrate was evaporated under reduced pressure, the residue was taken up in 50 ml of ethyl acetate and 100 ml of diethyl ether. The precipitate formed is triturated, filtered, washed with 100 ml of ether on a filter and dried in air. 15.6 g of Boc-hexapeptide are obtained; R _f (A) 0.22, R _f (B) 0.45; mass spectrum: (M + H) ⁺ 895.5 (calculated: 897.141).

Пример 4. Получение Boc-изолейцил-глутаминил-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил-пролил-лейцил-глицинамида [Boc-Ile-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro-Leu-Gly-NH₂].Example 4. Obtaining Boc-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamide [Boc-Ile-Gln-Asn-Cys (Dpm) -Pro-Leu-Gly-NH ₂ ].

15.4 Boс-глутаминил-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил-пролил-лейцил-глицинамида (пример 3) растворяют в 40 мл дихлорметана и 40 мл трифторуксусной кислоты и выдерживают раствор 1 ч при комнатной температуре. Раствор упаривают до вязкого масла, к остатку добавляют 80 мл толуола и вновь упаривают. Остаток растирают с 250 мл диэтилового эфира, осадок фильтруют, промывают на фильтре эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе. Полученный трифторацетат гексапептида растворяют в 50 мл ДМФА и добавляют 4.8 г полугидрата Boc-изолейцина и 2.7 г 1-гидроксибензотриазола. При охлаждении в ледяной бане и перемешивании к раствору прибавляют 3.3 мл N-метилморфолина, затем 4.8 г ДЦГК. Смесь перемешивают 1 ч при охлаждении и еще 4 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок фильтруют, фильтрат упаривают при пониженном давлении, остаток обрабатывают 100 мл этилацетата и 150 мл диэтилового эфира. Образовавшийся осадок растирают, фильтруют, промывают на фильтре 150 мл эфира и сушат на воздухе. Получают 15.2 г Boc-гептапептида; R_f(Б) 0.50; масс-спектр: (M+H)⁺1009.1 (вычислено: 1010.314)
Пример 5. Получение Boc-тирозил-изолейцил-глутаминил-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил-пролил-лейцил-глицинамида [Boc-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro-Leu-Gly-NH₂].15.4 Boc-glutaminyl-asparaginyl- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamide (Example 3) was dissolved in 40 ml of dichloromethane and 40 ml of trifluoroacetic acid and the solution was kept for 1 h at room temperature. The solution was evaporated to a viscous oil, 80 ml of toluene was added to the residue and evaporated again. The residue is triturated with 250 ml of diethyl ether, the precipitate is filtered, washed on the filter with ether and dried in a vacuum desiccator. The resulting hexapeptide trifluoroacetate was dissolved in 50 ml of DMF and 4.8 g of Boc-isoleucine hemihydrate and 2.7 g of 1-hydroxybenzotriazole were added. While cooling in an ice bath and stirring, 3.3 ml of N-methylmorpholine is added to the solution, then 4.8 g of DCCA. The mixture was stirred for 1 hour while cooling and another 4 hours at room temperature. The precipitate was filtered, the filtrate was evaporated under reduced pressure, the residue was taken up in 100 ml of ethyl acetate and 150 ml of diethyl ether. The precipitate formed is triturated, filtered, washed with a filter of 150 ml of ether and dried in air. 15.2 g of Boc-heptapeptide are obtained; R _f (B) 0.50; mass spectrum: (M + H) ⁺ 1009.1 (calculated: 1010.314)
Example 5. Obtaining Boc-tyrosyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamide [Boc-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys (Dpm) -Pro-Leu-Gly-NH ₂ ].

15.1 г Boc-изолейцил-глутаминил-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил-пролил- лейцил-глицинамида (пример 4) растворяют в 50 мл дихлорметана и 40 мл трифторуксусной кислоты и выдерживают раствор 1 ч при комнатной температуре. Раствор упаривают до вязкого масла, к остатку добавляют 80 мл толуола и вновь упаривают. Остаток растирают с 200 мл диэтилового эфира, осадок фильтруют, промывают на фильтре эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе. Трифторацетат гептапептида растворяют в 50 мл ДМФА и добавляют 4.8 г Boc-тирозина и 2.6 г 1-гидроксибензотриазола. При охлаждении в ледяной бане и перемешивании к раствору прибавляют 2,9 мл N-метилморфолина, затем 3.6 г ДЦГК. Смесь перемешивают 1 ч при охлаждении и еще 8 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок фильтруют, фильтрат упаривают при пониженном давлении, остаток обрабатывают 300 мл воды. Образовавшийся осадок растирают, фильтруют, промывают на фильтре 100 мл 5% водного раствора бикарбоната натрия и 100 мл воды и сушат на воздухе. Полупродукт растворяют в 30 мл ДМФА, упаривают до масла и растирают с диэтиловым эфиром, промывают на фильтре эфиром и сушат на воздухе. Получают 16.4 г Boc-октапептида; R_f(Б) 0.55; масс-спектр: (M+H)⁺1172.1 (вычислено: 1173.497).15.1 g of Boc-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamide (Example 4) was dissolved in 50 ml of dichloromethane and 40 ml of trifluoroacetic acid and the solution was kept for 1 h at room temperature. The solution was evaporated to a viscous oil, 80 ml of toluene was added to the residue and evaporated again. The residue was triturated with 200 ml of diethyl ether, the precipitate was filtered, washed on the filter with ether and dried in a vacuum desiccator. The heptapeptide trifluoroacetate is dissolved in 50 ml of DMF and 4.8 g of Boc-tyrosine and 2.6 g of 1-hydroxybenzotriazole are added. While cooling in an ice bath and stirring, 2.9 ml of N-methylmorpholine is added to the solution, followed by 3.6 g of DCCA. The mixture was stirred for 1 hour while cooling and another 8 hours at room temperature. The precipitate was filtered, the filtrate was evaporated under reduced pressure, the residue was taken up in 300 ml of water. The precipitate formed is triturated, filtered, washed on the filter with 100 ml of a 5% aqueous solution of sodium bicarbonate and 100 ml of water, and dried in air. The intermediate was dissolved in 30 ml of DMF, evaporated to an oil and triturated with diethyl ether, washed with ether and dried in air. 16.4 g of Boc-octapeptide are obtained; R _f (B) 0.55; mass spectrum: (M + H) ⁺ 1172.1 (calculated: 1173.497).

Пример 6. Получение Boc-(S-дифенилметил)цистеинил-тирозил-изолейцил-глутаминил-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил-пролил-лейцил-глицинамида [Boc-Cys(Dpm)-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro-Leu-Gly-NH₂, соединение Ia].Example 6. Obtaining Boc- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-tyrosyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamide [Boc-Cys (Dpm) -Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys (Dpm) -Pro-Leu-Gly-NH ₂ , compound Ia].

16.2 г Boc-тирозил-изолейцил-глутаминил-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил-пролил-лейцил-глицинамида (пример 5) растворяют в 50 мл дихлорметана и 50 мл трифторуксусной кислоты и выдерживают раствор 1 ч при комнатной температуре. Раствор упаривают до вязкого масла, к остатку добавляют 100 мл толуола и вновь упаривают. Остаток растирают с 200 мл диэтилового эфира, осадок фильтруют, промывают на фильтре эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе. Трифторацетат октапептида растворяют в 50 мл ДМФА и добавляют 5.2 г Boc-(S-дифенилметил)цистеина и 2.2 г 1-гидроксибензотриазола. При охлаждении в ледяной бане и перемешивании к раствору прибавляют 2.9 мл N-метилморфолина, затем 3.3 г ДЦГК. Смесь перемешивают 1 ч при охлаждении и еще 5 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок фильтруют, фильтрат упаривают при пониженном давлении, остаток обрабатывают 300 мл воды. Образовавшийся осадок растирают, фильтруют, промывают на фильтре 100 мл 5% водного раствора бикарбоната натрия и 100 мл воды и сушат на воздухе. Полупродукт растворяют в 30 мл ДМФА, упаривают до масла, затем добавляют 70 мл ацетонитрила и оставляют на ночь в холодильнике. Гелеобразную массу разбавляют 50 мл диэтилового эфира, осадок фильтруют, промывают на фильтре эфиром и сушат на воздухе. Получают 17.3 г соединения Ia; R_f(Б) 0.60; масс-спектр: (M+H)⁺1441.1 (вычислено: 1442.88).16.2 g of Boc-tyrosyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamide (Example 5) was dissolved in 50 ml of dichloromethane and 50 ml of trifluoroacetic acid and the solution was allowed to stand for 1 h at room temperature. The solution was evaporated to a viscous oil, 100 ml of toluene was added to the residue and evaporated again. The residue was triturated with 200 ml of diethyl ether, the precipitate was filtered, washed on the filter with ether and dried in a vacuum desiccator. Octapeptide trifluoroacetate is dissolved in 50 ml of DMF and 5.2 g of Boc- (S-diphenylmethyl) cysteine and 2.2 g of 1-hydroxybenzotriazole are added. While cooling in an ice bath and stirring, 2.9 ml of N-methylmorpholine is added to the solution, followed by 3.3 g of DCCA. The mixture was stirred for 1 hour while cooling and another 5 hours at room temperature. The precipitate was filtered, the filtrate was evaporated under reduced pressure, the residue was taken up in 300 ml of water. The precipitate formed is triturated, filtered, washed on the filter with 100 ml of a 5% aqueous solution of sodium bicarbonate and 100 ml of water, and dried in air. The intermediate was dissolved in 30 ml of DMF, evaporated to an oil, then 70 ml of acetonitrile was added and left in the refrigerator overnight. The gel mass is diluted with 50 ml of diethyl ether, the precipitate is filtered, washed on the filter with ether and dried in air. Obtain 17.3 g of compound Ia; R _f (B) 0.60; mass spectrum: (M + H) ⁺ 1441.1 (calculated: 1442.88).

Пример 7. Получение трифторацетата (S-дифенилметил)цистеинилтирозил-изолейцил-глутаминил-аспарагинил- (S-дифенилметил)цистеинил-пролил-лейцил-глицинамида [H-Cys(Dpm)-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro-Leu-Gly-NH₂ x TFA, соединение 1b].Example 7. Obtaining trifluoroacetate (S-diphenylmethyl) cysteinyltyrosyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamide [H-Cys (Dpm) -Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys (Dpm) -Pro-Leu-Gly-NH ₂ x TFA, compound 1b].

17.2 г соединения Ia (пример 6) растворяют в 50 мл дихлорметана и 50 мл трифторуксусной кислоты и выдерживают раствор 1 ч при комнатной температуре. Раствор упаривают до густого масла, к остатку добавляют 100 мл толуола и вновь упаривают. Остаток растирают с 250 мл диэтилового эфира, осадок фильтруют, промывают на фильтре эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе. Получают 17.1 г трифторацетата соединения Ib; R_f(Б) 4.40; масс-спектр: (M+H)⁺ 1341.2 (вычислено: 1342.75).17.2 g of compound Ia (example 6) were dissolved in 50 ml of dichloromethane and 50 ml of trifluoroacetic acid and the solution was kept for 1 h at room temperature. The solution was evaporated to a thick oil, 100 ml of toluene was added to the residue and evaporated again. The residue is triturated with 250 ml of diethyl ether, the precipitate is filtered, washed on the filter with ether and dried in a vacuum desiccator. Obtain 17.1 g of trifluoroacetate compound Ib; R _f (B) 4.40; mass spectrum: (M + H) ⁺ 1341.2 (calculated: 1342.75).

Пример 8. Получение 3-(дифенилметилтио)пропионил-тирозил-изолейцил-глутаминил-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил-пролил-лейцил-глицинамида [Mpr(Dpm)-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro-Leu-Gly-NH₂(Ic)].Example 8. Obtaining 3- (diphenylmethylthio) propionyl-tyrosyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamide [Mpr (Dpm) -Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys (Dpm) - Pro-Leu-Gly-NH ₂ (Ic)].

4.2 г Трифторацетата тирозил-изолейцил-глутаминил-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил-пролил-лейцил-глицинамида, полученного как описано в примере 6, растворяют в 15 мл ДМФА и добавляют 1.1 г 3-(дифенилметилтио)пропионовой кислоты и 0.7 г 1-гидлроксибензотриазола. При охлаждении в ледяной банен и перемешивании к раствору прибавляют 0.60 мл N-метилморфолина, затем 0.9 г ДЦГК. Смесь перемешивают 1 ч при охлаждении и еще 2 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок фильтруют, фильтрат упаривают при пониженном давлении, остаток обрабатывают 100 мл воды. Образовавшийся осадок растирают, фильтруют, промывают на фильтре 30 мл 5% водного раствора бикарбоната натрия и 50 мл воды и сушат на воздухе. Полупродукт растворяют в 10 мл ДМФА, упаривают до масла, затем добавляют 50 мл этилацетата и оставляют на ночь в холодильнике. Осадок фильтруют, промывают на фильтре диэтиловым эфиром и сушат на воздухе. Получают 4.3 г соединения Ic; R_f(Б) 0.62; масс-спектр: (M+H)⁺ 1327.1 (вычислено: 1327.74).4.2 g of Tyrosyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamide trifluoroacetate obtained as described in Example 6 was dissolved in 15 ml of DMF and 1.1 g of 3- (diphenylmethylthio) propionic acid and 0.7 g were added 1-hydroxybenzotriazole. While cooling in an ice bath and stirring, 0.60 ml of N-methylmorpholine is added to the solution, followed by 0.9 g of DCCA. The mixture was stirred for 1 hour while cooling and another 2 hours at room temperature. The precipitate was filtered, the filtrate was evaporated under reduced pressure, the residue was treated with 100 ml of water. The precipitate formed is triturated, filtered, washed on the filter with 30 ml of a 5% aqueous solution of sodium bicarbonate and 50 ml of water, and dried in air. The intermediate was dissolved in 10 ml of DMF, evaporated to an oil, then 50 ml of ethyl acetate was added and left in the refrigerator overnight. The precipitate was filtered, washed on the filter with diethyl ether and dried in air. Obtain 4.3 g of compound Ic; R _f (B) 0.62; mass spectrum: (M + H) ⁺ 1327.1 (calculated: 1327.74).

Пример 9. Получение окситоцина. Example 9. Obtaining oxytocin.

14.4 г соединения Ia, 60 г перегнанного фенола и 320 мл трифторуксусной кислоты перемешивают в атмосфере аргона 20 ч при комнатной температуре, затем трифторуксусную кислоту отгоняют при пониженном давлении. Остаток встряхивают с 200 мл петролейного эфира, после расслаивания петролейный эфир декантируют, эту операцию повторяют еще дважды. Остаток растворяют в 50 мл ледяной уксусной кислоты и к раствору при перемешивании добавляют 300 мл диэтилового эфира. Выпавший белый осадок быстро фильтруют, промывают на фильтре 3 • 50 мл эфира и сушат в вакуум-эксикаторе. Полученный трифторацетат дигидроокситоцина (11г) при перемешивании растворяют в 10 л бидистиллированной воды, затем добавлением концентрированного водного аммиака доводят pH раствора до 7.5. Раствор интенсивно перемешивают в открытом сосуде 2 суток при комнатной температуре до отрицательной реакции с нитропруссидом натрия. Получают раствор окситоцина с биологической активностью 290 ± 15 ME/мл. К раствору добавляют 500 мл уксусной кислоты и упаривают его при пониженном давлении и температуре бани 35-40^oC до объема 1 л; измеренная удельная активность окситоцина составляет 3010 ± 160 ME/мл.14.4 g of compound Ia, 60 g of distilled phenol and 320 ml of trifluoroacetic acid are stirred under argon for 20 hours at room temperature, then trifluoroacetic acid is distilled off under reduced pressure. The residue is shaken with 200 ml of petroleum ether, after separation, the petroleum ether is decanted, this operation is repeated twice more. The residue was dissolved in 50 ml of glacial acetic acid and 300 ml of diethyl ether was added to the solution with stirring. The precipitated white precipitate is quickly filtered, washed with a filter of 3 • 50 ml of ether and dried in a vacuum desiccator. The resulting dihydrooxytocin trifluoroacetate (11 g) is dissolved with stirring in 10 l of bidistilled water, then the pH of the solution is adjusted to 7.5 with concentrated aqueous ammonia. The solution was intensively stirred in an open vessel for 2 days at room temperature until a negative reaction with sodium nitroprusside. An oxytocin solution with a biological activity of 290 ± 15 ME / ml is obtained. To the solution add 500 ml of acetic acid and evaporate it under reduced pressure and a bath temperature of 35-40 ^o C to a volume of 1 l; the measured specific activity of oxytocin is 3010 ± 160 ME / ml.

Пример 10. Получение дезаминоокситоцина. Example 10. Obtaining desaminooxytocin.

4 г соединения Ic, 20 г перегнанного фенола и 120 мл трифторуксусной кислоты нагревают в атмосфере аргона 20 мин в водяной бане с температурой 70^oC, затем раствор быстро охлаждают и трифторуксусную кислоту отгоняют при пониженном давлении. Остаток встряхивают со 100 мл петролейного эфира, после расслаивания петролейный эфир декантируют, эту операцию повторяют еще дважды. Остаток растирают со 100 мл диэтилового эфира, образовавшийся белый осадок быстро фильтруют, промывают на фильтре 3 х 20 мл эфира и сушат в вакуум-эксикаторе. Полученный дигидро-дезаминоокситоцин (2.85 г) при перемешивании растворяют в 10 мл ДМФА и при интенсивном перемешивании по каплям приливают к раствору 1 мл 25%-ного водного аммиака и 0.5 мл 32%-ной перекиси водорода в 3 л бидистиллированной воды. Раствор перемешивают 12 ч при комнатной температуре до отрицательной реакции с нитропруссидом натрия. Получают раствор дезаминоокситоцина с биологической активностью (350±15) ME/мл. К раствору добавляют 300 мл уксусной кислоты и упаривают его при пониженном давлении и температуре бани 35-40^oC до объема 150 мл, измеренная удельная активность дезаминоокситоцина составляет (6900±200) ME/мл.4 g of compound Ic, 20 g of distilled phenol and 120 ml of trifluoroacetic acid are heated in an argon atmosphere for 20 minutes in a water bath at a temperature of 70 ^° C, then the solution is rapidly cooled and trifluoroacetic acid is distilled off under reduced pressure. The residue is shaken with 100 ml of petroleum ether, after separation, the petroleum ether is decanted, this operation is repeated twice more. The residue is triturated with 100 ml of diethyl ether, the resulting white precipitate is quickly filtered, washed on the filter with 3 x 20 ml of ether and dried in a vacuum desiccator. The resulting dihydro-desaminooxytocin (2.85 g) is dissolved with stirring in 10 ml of DMF and, with vigorous stirring, 1 ml of 25% aqueous ammonia and 0.5 ml of 32% hydrogen peroxide in 3 l of bidistilled water are added dropwise. The solution was stirred for 12 hours at room temperature until a negative reaction with sodium nitroprusside. A solution of desaminooxytocin with biological activity (350 ± 15) ME / ml is obtained. 300 ml of acetic acid was added to the solution and it was evaporated under reduced pressure and a bath temperature of 35-40 ^° C to a volume of 150 ml; the measured specific activity of desaminooxytocin was (6900 ± 200) ME / ml.

Claims

Derivatives of oxytocin of the General formula

where R ₁ is a tert-butoxycarbonyl amino group, an amino group or a hydrogen atom,
as starting compounds for the production of oxytocin and desaminooxytocin.