RU2123498C1

RU2123498C1 - Protected derivatives of vasopressin

Info

Publication number: RU2123498C1
Application number: RU97105816A
Authority: RU
Inventors: В.В. Самуков; П.И. Поздняков; А.Н. Сабиров
Original assignee: Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"
Priority date: 1997-04-10
Filing date: 1997-04-10
Publication date: 1998-12-20

Abstract

FIELD: organic chemistry, chemistry of peptides, biochemistry. SUBSTANCE: invention relates to new derivatives of vasopressin of the formula (I)

where R₁ - tert.-butoxycarbonylamino-group; R₂ - L-arginyl or N₆-tert.-butoxycarbonyl-L-lysyl; R₁ - amino-group and R₂ - L-arginyl or L-lysyl; R₁ - H and R₂ - D-arginyl. Compounds of the formula (I) are useful as parent substances for synthesis of vasopressin and its analogs. EFFECT: new derivatives of vasopressin indicated above. 15 ex

Description

Изобретение относится к новым исходным соединениям, применяемым для получения вазопрессина и его аналогов, а именно к защищенным производным вазопрессина общей формулы I:

где
R₁ есть трет-бутоксикарбонил-амино-группа, а R₂ - L-аргинил или N_ε -трет-бутоксикарбонил-L-лизил;
R₁ - амино-группа, а R₂ - L-аргинил или L-лизил;
R₁ - атом водорода, а R₂ - D-аргинил;
Вазопрессин является нейрогипофизарным пептидным гормоном млекопитающих, который играет важную роль в регуляции водно-солевого обмена и тонуса кровеносных сосудов. Вазопрессин - нонапептид, содержащий дисульфидный цикл, имеет структуру

где
X может быть остатком аргинина (Arg⁸-вазопрессин) или лизина (Lys⁸-вазопрессин).The invention relates to new starting compounds used to obtain vasopressin and its analogues, namely, protected derivatives of vasopressin of the general formula I:

Where
R ₁ is a tert-butoxycarbonyl amino group, and R ₂ is L-arginyl or N _ε -tert-butoxycarbonyl-L-lysyl;
R ₁ is an amino group, and R ₂ is L-arginyl or L-lysyl;
R ₁ is a hydrogen atom, and R ₂ is D-arginyl;
Vasopressin is a mammalian neurohypophysial peptide hormone that plays an important role in the regulation of water-salt metabolism and blood vessel tone. Vasopressin - a nonapeptide containing a disulfide cycle, has the structure

Where
X may be a residue of arginine (Arg ^8- vasopressin) or lysine (Lys ^8- vasopressin).

Вазопрессины и их структурные аналоги, получаемые методами химического синтеза, широко применяются в медицине в качестве лекарственных средств для диагностики и лечения несахарного диабета, гемофилии, травматических кровотечений и ряда других заболеваний. Vasopressins and their structural analogues obtained by chemical synthesis methods are widely used in medicine as medicines for the diagnosis and treatment of diabetes insipidus, hemophilia, traumatic bleeding and a number of other diseases.

Дисульфидный цикл, образованный двумя остатками цистеина, является существенным элементом структуры, определяющим биологическую активность вазопрессина. С точки зрения химического синтеза образование дисульфидного цикла в молекуле вазопрессина - очень важная и ответственная стадия, от которой зависит эффективность всего синтеза, а именно выход, химическая чистота, биологическая активность и устойчивость при хранении конечного продукта. Дисульфидный цикл химически нестабилен и легко подвергается восстановлению, окислению или межмолекулярной изомеризации, поэтому в процессе синтеза вазопрессина или его аналогов формирование дисульфидного цикла осуществляют, как правило, на одной из финальных стадий синтеза. С этой целью при сборке пептидной цепи вазопрессина остатки цистеина вводят в синтез с предварительно блокированными сульфгидрильными (SH) группами. Защитные группы для блокирования SH-групп подбирают таким образом, чтобы они, с одной стороны, были устойчивы ко всем реагентам и условиям реакций, применяемым при сборке пептидной цепи, с другой стороны, легко и селективно отщеплялись после сборки пептида с освобождением SH-групп или с непосредственным образованием дисульфидного цикла. The disulfide cycle formed by two cysteine residues is an essential structural element that determines the biological activity of vasopressin. From the point of view of chemical synthesis, the formation of a disulfide cycle in a vasopressin molecule is a very important and critical stage on which the effectiveness of the entire synthesis depends, namely, yield, chemical purity, biological activity, and storage stability of the final product. The disulfide cycle is chemically unstable and easily undergoes reduction, oxidation, or intermolecular isomerization; therefore, during the synthesis of vasopressin or its analogues, the formation of a disulfide cycle is carried out, as a rule, at one of the final stages of synthesis. For this purpose, when assembling the vasopressin peptide chain, cysteine residues are synthesized with previously blocked sulfhydryl (SH) groups. Protecting groups for blocking SH-groups are selected so that, on the one hand, they are resistant to all reagents and reaction conditions used in the assembly of the peptide chain, on the other hand, they are easily and selectively cleaved after assembly of the peptide with the release of SH-groups or with the direct formation of a disulfide cycle.

Вазопрессины являются весьма нестабильными соединениями. Падение их биологической активности часто происходит даже при таких операциях, как колоночная хроматография и упаривание растворов: инактивации могут способствовать различные органические и неорганические примеси (соли, тяжелые металлы), присутствующие в растворах. Поэтому очень важно, чтобы после деблокирования и окисления вазопрессин был получен в водном растворе с минимальным содержанием солей и нелетучих органических примесей. Vasopressins are highly unstable compounds. A drop in their biological activity often occurs even during operations such as column chromatography and evaporation of solutions: various organic and inorganic impurities (salts, heavy metals) present in solutions can contribute to inactivation. Therefore, it is very important that after release and oxidation, vasopressin is obtained in an aqueous solution with a minimum content of salts and non-volatile organic impurities.

На практике при планировании синтеза вазопрессинов выбор защитных групп и условий их отщепления для остатков цистеина является важнейшим элементом, от которого зависит выбор других защитных групп, реакционных условий и реагентов. In practice, when planning the synthesis of vasopressins, the choice of protective groups and their cleavage conditions for cysteine residues is an essential element on which the choice of other protective groups, reaction conditions and reagents depends.

Наиболее известным и часто используемым способом защиты SH-групп остатков цистеина при синтезе вазопрессинов является S-бензилирование, описанное в J. Amer. Chem. Soc., v. 80, pp. 3355-3358 (1958), для Arg⁸-вазопрессина и в J. Amer. Chem. Soc., v. 82, pp. 2279-2282 (1960), для Lys⁸-вазопрессина. Для защиты остатка аргинина использовали протонирование, ε-аминогруппу лизина защищали тозильной группой, которую можно удалить одновременно с S-бензильными защитными группами. Единственным приемлемым способом деблокирования таких защищенных пептидов после синтеза является обработка натрием в жидком аммиаке. Этот процесс сопровождается побочными реакциями, в том числе частичной деструкцией пептидов. В результате после окисления деблокированных пептидов получаются препараты, содержащие большое количество трудноотделимых примесей и имеющие низкую биологическую активность.The most well-known and frequently used method of protecting SH groups of cysteine residues in the synthesis of vasopressins is S-benzylation described in J. Amer. Chem. Soc., V. 80, pp. 3355-3358 (1958), for Arg ^8- vasopressin and in J. Amer. Chem. Soc., V. 82, pp. 2279-2282 (1960), for Lys ^8- vasopressin. Protonation was used to protect the arginine residue, the ε-amino group of lysine was protected by a tosyl group, which can be removed simultaneously with the S-benzyl protective groups. The only acceptable way to release such protected peptides after synthesis is by treatment with sodium in liquid ammonia. This process is accompanied by adverse reactions, including partial destruction of peptides. As a result, after oxidation of the released peptides, preparations are obtained that contain a large amount of difficultly separated impurities and have low biological activity.

Известны способы получения Lys⁸-вазопрессина (патент Швейцарии 498 805) и Arg⁸-вазопрессина (J. Оrg. Chem., v. 38, N. 16, pp. 2865-2869) из соответствующих ди-S-трифенилметильных (тритильных) производных. Деблокирование ди-(S-тритил)-пептидов проводят путем обработки иодом в разбавленном растворе, при этом происходит одновременное образование циклического дисульфида. S-Тритильная защита неустойчива в кислых средах, в частности в условиях отщепления трет-бутоксикарбонильной (Boc) и бензилоксикарбонильной (Cbz) амино-защитных групп. Это создает значительные трудности для синтеза защищенных пептидов, содержащих остатки S-тритил-цистеина, поэтому производные ди-(S-тритил)-вазопрессинов получаются, как правило, с низкими выходами.Known methods for producing Lys ^8- vasopressin (Swiss patent 498 805) and Arg ^8- vasopressin (J. Org. Chem., V. 38, N. 16, pp. 2865-2869) from the corresponding di-S-triphenylmethyl (trityl) derivatives. The release of di- (S-trityl) -peptides is carried out by treatment with iodine in a dilute solution, with the simultaneous formation of cyclic disulfide. S-Trityl protection is unstable in acidic environments, in particular under conditions of cleavage of tert-butoxycarbonyl (Boc) and benzyloxycarbonyl (Cbz) amino protecting groups. This creates significant difficulties for the synthesis of protected peptides containing S-trityl-cysteine residues; therefore, di- (S-trityl) -vazopressin derivatives are obtained, as a rule, in low yields.

В работе D. Gillessen, A. Trzeciak, опубликованной в "Neurohypophyseal peptide hormones and other biologically active peptides", ed. By D.H. Schlesinger, Amsterdam, 1981, pp. 37-47, для получения Lys⁸-вазопрессина использовали производное ди-(S-ацетамидометил)-Lys⁸(Boc)-вазопрессина. S-Ацетамидометильные защитные группы отщепляли с одновременным образованием дисульфидного цикла путем обработки иодом разбавленного раствора защищенного пептида в смеси 2,2,2-трифторэтанола и метанола; Boc-защитные группы удаляли после выделения окисленного пептида. Недостатком данного способа является необходимость использования большого объема (не менее 1 л/ммол) органического растворителя на стадии деблокирования окисления.In the work of D. Gillessen, A. Trzeciak, published in "Neurohypophyseal peptide hormones and other biologically active peptides", ed. By DH Schlesinger, Amsterdam, 1981, pp. 37-47, a di- (S-acetamidomethyl) -Lys ⁸ (Boc) -vazopressin derivative was used to obtain Lys ⁸ -vasopressin. S-Acetamidomethyl protecting groups were cleaved off with the simultaneous formation of a disulfide cycle by iodine treatment with a dilute solution of the protected peptide in a mixture of 2,2,2-trifluoroethanol and methanol; Boc-protecting groups were removed after isolation of the oxidized peptide. The disadvantage of this method is the need to use a large volume (not less than 1 l / mmol) of an organic solvent at the stage of oxidation release.

Задачей изобретения является изыскание новых цистеин-защищенных производных вазопрессина, применение которых позволяло бы получать вазопрессин и его аналоги в виде растворов с минимальным содержанием солей и нелетучих органических примесей. The objective of the invention is the search for new cysteine-protected derivatives of vasopressin, the use of which would allow to obtain vasopressin and its analogues in the form of solutions with a minimum content of salts and non-volatile organic impurities.

Задача решается путем синтеза новых соединений, а именно защищенных производных вазопрессина общей формулы I:

где
R₁ и R₂ принимают следующие значения:
Ia: R₁ = трет-бутоксикарбонил-амино, R₂ = L-аргинил-;
Ib: R₁ = амино-, R₂ = L-аргинил-;
Ic: R₁ = трет-бутоксикарбонил-амино-, R₂ = > -N_ε -трет-бутоксикарбонил- L-лизил-;
Id: R₁ = амино-, R₂ = L-лизил-;
Ie: R₁ = водород, R₂ = D-аргинил-;
Соединения формулы I могут быть получены путем синтеза на твердой фазе или в растворе с использованием известных методов и реагентов. Синтез в растворе может быть проведен ступенчатым наращиванием пептидной цепи или путем сборки из пептидных сегментов. Остатки цистеина и 3-меркаптопропионовой кислоты в процессе синтеза вводятся в виде S-дифенилметильных (S-Dpm) производных, получаемых известными способами, например, как описано в J. Chem. Soc. (C), p. 2683-2687 (1970). Для защиты остатка аргинина используется солеобразование, ε-аминогруппа лизана блокируется Boc-группой.The problem is solved by the synthesis of new compounds, namely protected derivatives of vasopressin of the general formula I:

Where
R ₁ and R ₂ take the following values:
Ia: R ₁ = tert-butoxycarbonyl-amino, R ₂ = L-arginyl-;
Ib: R ₁ = amino; R ₂ = L-arginyl-;
Ic: R ₁ = tert-butoxycarbonyl-amino, R ₂ => -N _ε -tert-butoxycarbonyl-L-lysyl-;
Id: R ₁ = amino; R ₂ = L-lysyl-;
Ie: R ₁ = hydrogen, R ₂ = D-arginyl-;
The compounds of formula I can be obtained by synthesis on a solid phase or in solution using known methods and reagents. Synthesis in solution can be carried out by stepwise extension of the peptide chain or by assembly from peptide segments. Residues of cysteine and 3-mercaptopropionic acid during the synthesis are introduced as S-diphenylmethyl (S-Dpm) derivatives obtained by known methods, for example, as described in J. Chem. Soc. (C), p. 2683-2687 (1970). To protect the arginine residue, salt formation is used, the ε-amino group of lysane is blocked by the Boc group.

В качестве временных N_α - защитных групп используются группы, которые можно селективно отщепить, не затрагивая S-дифенилметильную защиту, например, N_α -Boc-группа. При синтезе пептидных сегментов в растворе для отщепления N_α -Boc-группы могут быть использованы известные методы и реагенты, например, растворы хлористого водорода или сульфокислот в органических растворителях, трифторуксусная кислота или ее растворы в дихлорметане или хлороформе.As temporary N _α - protective groups, groups are used that can be selectively cleaved without affecting the S-diphenylmethyl protection, for example, an N _α -Boc group. In the synthesis of peptide segments in solution, known methods and reagents, for example, solutions of hydrogen chloride or sulfonic acids in organic solvents, trifluoroacetic acid or its solutions in dichloromethane or chloroform can be used to remove the N _α -Boc group.

Для наращивания пептидной цепи и сборки пептидных сегментов применяются известные методы конденсации, например конденсация при действии дициклогексилкарбодиимида и 1-гидроксибензотриазола. Known condensation methods are used to build up the peptide chain and assemble the peptide segments, for example, condensation by the action of dicyclohexylcarbodiimide and 1-hydroxybenzotriazole.

Соединения Ia и Ib могут быть использованы для получения Arg⁸-вазопрессина, соединения Ic и Id - для получения Lys⁸-вазопрессина, соединение Ie - для получения [дезамино¹, D-Arg⁸]-вазопрессина (десмопрессина). Этот процесс проводится в две стадии. На первой стадии проводят отщепление S-Dpm-групп с остатков цистеина и 3-меркаптопропионовой кислоты действием трифторуксусной кислоты в присутствии акцептора дифенилметильных катионов, например фенола (в соединениях Ia и Ic при этом одновременно отщепляются Boc-группы). Деблокирование проводят в течение 20-40 мин при 60-80^oC или в течение 18-24 ч при 20-25^oC. Затем отгоняют трифторуксусную кислоту и выделяют осаждением деблокированный пептид со свободными SH-группами. На второй стадии полученный пептид растворяют в воде, доводят при необходимости pH раствора до значения в интервале от 6 до 8 и окисляют известным способом, например перекисью водорода или кислородом воздуха.Compounds Ia and Ib can be used to produce Arg ^8- vasopressin, compounds Ic and Id to produce Lys ^8- vasopressin, compound Ie to produce [desamino ¹ , D-Arg ⁸ ] -vasopressin (desmopressin). This process is carried out in two stages. At the first stage, S-Dpm groups are cleaved from cysteine and 3-mercaptopropionic acid residues by the action of trifluoroacetic acid in the presence of an acceptor of diphenylmethyl cations, for example phenol (in compounds Ia and Ic, Boc groups are simultaneously cleaved). The release is carried out for 20-40 minutes at 60-80 ^o C or for 18-24 hours at 20-25 ^o C. Then trifluoroacetic acid is distilled off and the released peptide with free SH groups is isolated by precipitation. In the second stage, the resulting peptide is dissolved in water, adjusted if necessary, the pH of the solution to a value in the range from 6 to 8 and oxidized in a known manner, for example, hydrogen peroxide or atmospheric oxygen.

Отщепление S-Dpm-групп проходит гладко и с высоким выходом. Благодаря осаждению и тщательной промывке после первой стадии деблокированный пептид практически не содержит органических примесей непептидного характера и солей и имеет высокое содержание основного вещества. При растворении деблокированного пептида в воде раствор имеет кислую реакцию, что позволяет минимизировать неконтролируемое окисление на стадии растворения. В результате окисления получается вазопрессин с высокой биологической активностью в растворе, не содержащем солей и органических примесей. Такой раствор может быть сконцентрирован известными способами, например упариванием при пониженном давлении или лиофилизацией, или путем сорбции вазопрессина на ионообменной смоле, без потери биологической активности целевого продукта. Cleavage of S-Dpm groups proceeds smoothly and with a high yield. Due to precipitation and thorough washing after the first stage, the released peptide practically does not contain non-peptide organic impurities and salts and has a high content of the basic substance. When a deblocked peptide is dissolved in water, the solution has an acid reaction, which minimizes uncontrolled oxidation at the dissolution stage. As a result of oxidation, vasopressin with high biological activity is obtained in a solution that does not contain salts and organic impurities. Such a solution can be concentrated by known methods, for example by evaporation under reduced pressure or by lyophilization, or by sorption of vasopressin on an ion-exchange resin, without loss of biological activity of the target product.

Таким образом, предлагаемые защищенные производные вазопрессина можно эффективно использовать для получения вазопрессинов и их аналогов, причем целевые продукты получаются с высокими выходами и в форме, удобной для концентрирования и очистки без потери биологической активности. Thus, the proposed protected derivatives of vasopressin can be effectively used to obtain vasopressins and their analogues, and the target products are obtained in high yields and in a form convenient for concentration and purification without loss of biological activity.

Сущность предлагаемого изобретения иллюстрируется примерами. При описании примеров используются следующие сокращения и условные обозначения:
ДМФА - диметилформамид
ДЦГК - дициклогексилкарбодиимид
ВЭЖХ - высокоэффектиная жидкостная хроматография
Сокращенные обозначения аминокислот и защитных групп используются в соответствии с рекомендациями Комиссии по биохимической номенклатуре при IUPAC-IUB, опубликованными в Eur. J. Biochem. , v. 138, N. 1, pp. 9-37 (1984). Оптически активные аминокислоты, приведенные в описаниях примеров, по умолчанию имеют L-конфигурацию.The essence of the invention is illustrated by examples. When describing the examples, the following abbreviations and conventions are used:
DMF - dimethylformamide
DHCA - dicyclohexylcarbodiimide
HPLC - high performance liquid chromatography
The abbreviations for amino acids and protective groups are used in accordance with the recommendations of the Commission on Biochemical Nomenclature at IUPAC-IUB, published in Eur. J. Biochem. , v. 138, N. 1, pp. 9-37 (1984). The optically active amino acids shown in the descriptions of the examples have an L configuration by default.

Значения хроматографических подвижностей R_f приведены для пластинок для тонкослойной хроматографии Alufolien Kieselgel 60 F₂₅₄ (Merck, ФРГ) в системах хлороформ-метанол-уксусная кислота, 90:10:3 (А); этилацетат-пиридин-уксусная кислота-вода, 60:5:15:10 (Б) и ацетонитрил-уксусная кислота-вода, 40:1:10 (В). Обнаружение пятен на пластинках проводят в УФ-свете и нингидриновым реактивом после прогревания. Массы молекулярных ионов (M + H)⁺ измерены на времяпролетном масс-спектрометре МСБХ-1 (НПО "Электрон", Украина).The values of chromatographic mobilities R _f are given for Alufolien Kieselgel 60 F ₂₅₄ thin-layer chromatography plates (Merck, Germany) in chloroform-methanol-acetic acid systems, 90: 10: 3 (A); ethyl acetate-pyridine-acetic acid-water, 60: 5: 15: 10 (B) and acetonitrile-acetic acid-water, 40: 1: 10 (C). Spot detection on the plates is carried out in UV light and ninhydrin reagent after heating. Masses of molecular ions (M + H) ^{+ were} measured on an MSBH-1 time-of-flight mass spectrometer (NPO Elektron, Ukraine).

Пример 1. Получение гидрохлорида этилового эфира (S-дифенилметил)-цистеинил-пролина [H-Cys(Dpm)-Pro-OEt • HCl]. Example 1. Preparation of (S-diphenylmethyl) -cysteinyl-proline ethyl ester hydrochloride [H-Cys (Dpm) -Pro-OEt • HCl].

К раствору 19.4 г Boc-(S-дифенилметил)цистеина и 7.3 г 1-гидроксибензотриазола в 100 мл ДМФА при охлаждении в ледяной бане и перемешивании прибавляют 10.8 г ДЦГК. Смесь перемешивают 1 ч при охлаждении, затем добавляют 10.8 г гидрохлорида этилового эфира пролина и 10 мл триэтиламина и перемешивают еще 2 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок отфильтровывают, фильтрат упаривают при пониженном давлении, остаток растворяют в 300 мл этилацетата. Раствор промывают в делительной воронке 3 • 100 мл 5% водного раствора бикарбоната натрия, 2 • 70 мл 1 н. соляной кислоты и 100 мл насыщенного водного раствора хлорида натрия, сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают при пониженном давлении. Остаток растворяют в 50 мл ледяной уксусной кислоты, добавляют 50 мл 3 н. раствора хлористого водорода в уксусной кислоте и выдерживают 40 мин при комнатной температуре. Раствор упаривают до вязкого масла, к остатку добавляют 60 мл толуола и вновь упаривают. К остатку добавляют 150 мл диэтилового эфира и оставляют на ночь в холодильнике. Выпавший осадок растирают, отфильтровывают, промывают на фильтре эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе. Получают 18.5 г целевого продукта в виде белого мелкокристаллического порошка; R_f(А)0.33; масс-спектр: (M + H)⁺ 413.2 (вычислено: 413.59).To a solution of 19.4 g of Boc- (S-diphenylmethyl) cysteine and 7.3 g of 1-hydroxybenzotriazole in 100 ml of DMF, 10.8 g of DCCA are added while cooling in an ice bath and stirring. The mixture was stirred for 1 h while cooling, then 10.8 g of Proline ethyl ester hydrochloride and 10 ml of triethylamine were added and stirred for another 2 h at room temperature. The precipitate formed is filtered off, the filtrate is evaporated under reduced pressure, the residue is dissolved in 300 ml of ethyl acetate. The solution is washed in a separatory funnel 3 • 100 ml of a 5% aqueous solution of sodium bicarbonate, 2 • 70 ml of 1 N. hydrochloric acid and 100 ml of a saturated aqueous solution of sodium chloride, dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated under reduced pressure. The residue is dissolved in 50 ml of glacial acetic acid, 50 ml of 3 N are added. a solution of hydrogen chloride in acetic acid and incubated for 40 min at room temperature. The solution was evaporated to a viscous oil, 60 ml of toluene was added to the residue and evaporated again. 150 ml of diethyl ether are added to the residue and left in the refrigerator overnight. The precipitate formed is triturated, filtered off, washed with ether and dried in a vacuum desiccator. Obtain 18.5 g of the target product in the form of a white crystalline powder; R _f (A) 0.33; mass spectrum: (M + H) ⁺ 413.2 (calculated: 413.59).

Пример 2. Получение этилового эфира Boc-аспарагинил-(S- дифенилметил)-цистеинил-пролина [Boc-Asn-Cys(Dpm)-Pro-OEt]. Example 2. Obtaining ethyl ester of Boc-asparaginyl- (S-diphenylmethyl) -cysteinyl-proline [Boc-Asn-Cys (Dpm) -Pro-OEt].

К раствору 18.4 г гидрохлорида этилового эфира (S-дифенилметил)- цистеинил-пролина (пример 1), 12.5 г Boc-аспарагина и 9.4 г 1-гидроксибензотриазола в 130 мл ДМФА при охлаждении в ледяной бане и перемешивании прибавляют 6 мл N-метилморфолина, затем 11.2 г ДЦГК. Смесь перемешивают 1 ч при охлаждении и еще 3 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок отфильтровывают, фильтрат упаривают при пониженном давлении, остаток растворяют в 300 мл этилацетата. Раствор промывают в делительной воронке 3 • 100 мл 5% водного раствора бикарбоната натрия, 2 • 70 мл 1 н. соляной кислоты и 100 мл насыщенного водного раствора хлорида натрия, сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают при пониженном давлении. К остатку добавляют 100 мл диэтилового эфира и 150 мл петролейного эфира и оставляют на ночь в холодильнике. Выпавший осадок растирают, отфильтровывают, промывают на фильтре петролейным эфиром и сушат на воздухе. Получают 24.4 г эфира Boc-трипептида; R_f(А)0.65; масс-спектр: (M + H)⁺ 627.4 (вычислено: 627.823).To a solution of 18.4 g of ethyl ester (S-diphenylmethyl) -cysteinyl-proline hydrochloride (Example 1), 12.5 g of Boc-asparagine and 9.4 g of 1-hydroxybenzotriazole in 130 ml of DMF, 6 ml of N-methylmorpholine are added while cooling in an ice bath and stirring, then 11.2 g of DHA. The mixture was stirred for 1 hour while cooling and another 3 hours at room temperature. The precipitate formed is filtered off, the filtrate is evaporated under reduced pressure, the residue is dissolved in 300 ml of ethyl acetate. The solution is washed in a separatory funnel 3 • 100 ml of a 5% aqueous solution of sodium bicarbonate, 2 • 70 ml of 1 N. hydrochloric acid and 100 ml of a saturated aqueous solution of sodium chloride, dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated under reduced pressure. 100 ml of diethyl ether and 150 ml of petroleum ether are added to the residue and left in the refrigerator overnight. The precipitate was triturated, filtered, washed on a filter with petroleum ether and dried in air. 24.4 g of Boc tripeptide ester are obtained; R _f (A) 0.65; mass spectrum: (M + H) ⁺ 627.4 (calculated: 627.823).

Пример 3. Получение этилового эфира Boc-глутаминил-аспарагинил- (S-дифенилметил)цистеинил-пролина [Boc-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro-OEt]. Example 3. Obtaining ethyl ester of Boc-glutaminyl-asparaginyl- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-proline [Boc-Gln-Asn-Cys (Dpm) -Pro-OEt].

24.3 г этилового эфира Boc-аспарагинил-(S-дифенилметил) цистеинил-пролина (пример 2) растворяют в 80 мл уксусной кислоты, добавляют 50 мл 3 н. раствора хлористого водорода в уксусной кислоте и выдерживают 40 мин при комнатной температуре. Раствор упаривают до вязкого масла, к остатку добавляют 150 мл диэтилового эфира, выпавший осадок растирают, отфильтровывают, промывают на фильтре эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе. Полученный гидрохлорид трипептида растворяют в 100 мл ДМФА и добавляют 11 г Boc-глутамина и 6.2 г 1-гидроксибензотриазола. При охлаждении в ледяной бане и перемешивании к раствору прибавляют 6 мл триэтиламина, затем 9.4 г ДЦГК. Смесь перемешивают 1 ч при охлаждении, добавляют еще 2 мл триэтиламина и перемешивают 6 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок отфильтровывают, фильтрат упаривают при пониженном давлении, остаток растворяют в 300 мл этилацетата. Раствор промывают в делительной воронке 3 • 100 мл 5% водного раствора бикарбоната натрия, 2 • 70 мл 1 н. соляной кислоты и 100 мл насыщенного водного раствора хлорида натрия, сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают при пониженном давлении. К остатку добавляют 150 мл диэтилового эфира, образовавшийся осадок растирают, отфильтровывают, промывают на фильтре 100 мл эфира и сушат на воздухе. Получают 25.2 г эфира Boc-тетрапептида; R_f(А)0.30, R_f(Б)0.75; масс-спектр: (M + H)⁺ 755.3 (вычислено: 755.956).24.3 g of ethyl ester of Boc-asparaginyl- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-proline (Example 2) is dissolved in 80 ml of acetic acid, 50 ml of 3N are added. a solution of hydrogen chloride in acetic acid and incubated for 40 min at room temperature. The solution was evaporated to a viscous oil, 150 ml of diethyl ether was added to the residue, the precipitate was triturated, filtered off, washed with ether and dried in a vacuum desiccator. The resulting tripeptide hydrochloride was dissolved in 100 ml of DMF and 11 g of Boc-glutamine and 6.2 g of 1-hydroxybenzotriazole were added. While cooling in an ice bath and stirring, 6 ml of triethylamine are added to the solution, followed by 9.4 g of DCCA. The mixture was stirred for 1 h while cooling, another 2 ml of triethylamine was added and stirred for 6 h at room temperature. The precipitate formed is filtered off, the filtrate is evaporated under reduced pressure, the residue is dissolved in 300 ml of ethyl acetate. The solution is washed in a separatory funnel 3 • 100 ml of a 5% aqueous solution of sodium bicarbonate, 2 • 70 ml of 1 N. hydrochloric acid and 100 ml of a saturated aqueous solution of sodium chloride, dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated under reduced pressure. 150 ml of diethyl ether are added to the residue, the resulting precipitate is triturated, filtered off, washed with a filter of 100 ml of ether and dried in air. 25.2 g of Boc-tetrapeptide ester are obtained; R _f (A) 0.30, R _f (B) 0.75; mass spectrum: (M + H) ⁺ 755.3 (calculated: 755.956).

Пример 4. Получение этилового эфира Boc-фенилаланил-глутаминил- аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил-пролина [Boc-Phe-Gln-Asn- Cys(Dpm)-Pro-OEt]. Example 4. Obtaining ethyl ester of Boc-phenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-proline [Boc-Phe-Gln-Asn-Cys (Dpm) -Pro-OEt].

25.1 г этилового эфира Boc-глутаминил-аспарагинил-(S- дифенилметил)цистеинил-пролина (пример 3) растворяют в 80 мл уксусной кислоты, добавляют 50 мл 3 н. раствора хлористого водорода в уксусной кислоте и выдерживают 40 мин при комнатной температуре. Раствор упаривают до масла, к остатку добавляют 150 мл диэтилового эфира, выпавший осадок растирают, отфильтровывают, промывают на фильтре эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе. К раствору 10.6 г Boc-фенилаланина и 5.4 г 1-гидроксибензотриазола в 60 мл ДМФА при охлаждении в ледяной бане и перемешивании прибавляют 8.4 г ДЦГК. Смесь перемешивают 1 ч при охлаждении и объединяют ее с раствором гидрохлорида тетрапептида в 80 мл ДМФА. К смеси добавляют 6 мл триэтиламина и перемешивают 2 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок отфильтровывают, фильтрат упаривают при пониженном давлении, растворяют в 300 мл этилацетата. Раствор промывают в делительной воронке 3 • 100 мл 5% водного раствора бикарбоната натрия, 70 мл 1 н. соляной кислоты и 100 мл насыщенного водного раствора хлорида натрия и упаривают до 150 мл. К остатку добавляют 150 мл диэтилового эфира, осадок растирают, отфильтровывают, промывают на фильтре 100 мл эфира и сушат на воздухе. Получают 25.6 г эфира Boc-пентапептида; R_f(Б)0.28; масс-спектр: (M + H)⁺902.2 (вычислено: 903.149).25.1 g of ethyl ester of Boc-glutaminyl-asparaginyl- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-proline (Example 3) is dissolved in 80 ml of acetic acid, 50 ml of 3 N are added. a solution of hydrogen chloride in acetic acid and incubated for 40 min at room temperature. The solution was evaporated to an oil, 150 ml of diethyl ether was added to the residue, the precipitate was triturated, filtered off, washed with ether and dried in a vacuum desiccator. To a solution of 10.6 g of Boc-phenylalanine and 5.4 g of 1-hydroxybenzotriazole in 60 ml of DMF, 8.4 g of DCCA are added while cooling in an ice bath and stirring. The mixture was stirred for 1 h while cooling and combined with a solution of tetrapeptide hydrochloride in 80 ml of DMF. 6 ml of triethylamine was added to the mixture and stirred for 2 hours at room temperature. The precipitate formed is filtered off, the filtrate is evaporated under reduced pressure, and dissolved in 300 ml of ethyl acetate. The solution is washed in a separatory funnel 3 • 100 ml of a 5% aqueous solution of sodium bicarbonate, 70 ml of 1 N. hydrochloric acid and 100 ml of a saturated aqueous solution of sodium chloride and evaporated to 150 ml. 150 ml of diethyl ether are added to the residue, the precipitate is triturated, filtered off, washed with 100 ml of ether on a filter and dried in air. 25.6 g of Boc-pentapeptide ester are obtained; R _f (B) 0.28; mass spectrum: (M + H) ⁺ 902.2 (calculated: 903.149).

Пример 5. Получение этилового эфира Boc-тирозил-фенилаланил- глутаминил-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил-пролина [Boc-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro-OEt]. Example 5. Preparation of Boc-tyrosyl-phenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-proline ethyl ester [Boc-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys (Dpm) -Pro-OEt].

25.5 г этилового эфира Boc-фенилаланил-глутаминил-аспарагинил- (S-дифенилметил)цистеинил-пролина (пример 4) растворяют в 80 мл уксусной кислоты, добавляют 50 мл 3 н. раствора хлористого водорода в уксусной кислоте и выдерживают 30 мин при комнатной температуре. Раствор упаривают до масла, к остатку добавляют 150 мл диэтилового эфира, выпавший осадок растирают, отфильтровывают, промывают на фильтре эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе. Гидрохлорид пентапептида растворяют в 100 мл ДМФА и добавляют 9 г Boc-тирозина и 4,2 г 1-гидроксибензотриазола. При охлаждении в ледяной бане и перемешивании к раствору прибавляют 3.8 мл N-метилморфолина, затем 6.9 г ДЦГК. Смесь перемешивают 1 ч при охлаждении и еще 8 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок отфильтровывают, фильтрат упаривают при пониженном давлении, остаток обрабатывают 400 мл воды. Образовавшийся осадок растирают, отфильтровывают, промывают на фильтре 100 мл 5% водного раствора бикарбоната натрия и 100 мл воды и сушат на воздухе. Полупродукт растворяют в 50 мл ДМФА, упаривают до масла и растирают с диэтиловым эфиром, промывают на фильтре эфиром и сушат на воздухе. Получают 26.4 г эфира Boc-гексапептида; R_f(А)0.20, R_f(Б)0.55; масс-спектр: (M + H)⁺1065.6 (вычислено: 1066.332).25.5 g of ethyl ester of Boc-phenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-proline (Example 4) is dissolved in 80 ml of acetic acid, 50 ml of 3 N are added. a solution of hydrogen chloride in acetic acid and incubated for 30 min at room temperature. The solution was evaporated to an oil, 150 ml of diethyl ether was added to the residue, the precipitate was triturated, filtered off, washed with ether and dried in a vacuum desiccator. The pentapeptide hydrochloride is dissolved in 100 ml of DMF and 9 g of Boc-tyrosine and 4.2 g of 1-hydroxybenzotriazole are added. While cooling in an ice bath and stirring, 3.8 ml of N-methylmorpholine is added to the solution, followed by 6.9 g of DCCA. The mixture was stirred for 1 hour while cooling and another 8 hours at room temperature. The precipitate formed is filtered off, the filtrate is evaporated under reduced pressure, the residue is taken up in 400 ml of water. The precipitate formed is triturated, filtered, washed on the filter with 100 ml of a 5% aqueous solution of sodium bicarbonate and 100 ml of water and dried in air. The intermediate was dissolved in 50 ml of DMF, evaporated to an oil and triturated with diethyl ether, washed with ether and dried in air. 26.4 g of Boc-hexapeptide ester are obtained; R _f (A) 0.20, R _f (B) 0.55; mass spectrum: (M + H) ⁺ 1065.6 (calculated: 1066.332).

Пример 6. Получение Boc-(S-дифенилметил)цистеинил-тирозил- фенилаланил-глутаминил-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил- пролина [Boc-Cys(Dpm)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro-OH]. Example 6. Preparation of Boc- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-tyrosyl-phenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-proline [Boc-Cys (Dpm) -Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys (Dpm) - Pro-OH].

10.7 г этилового эфира Boc-тирозил-фенилаланил-глутаминил- аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил-пролина (пример 5) растворяют в 30 мл уксусной кислоты, добавляют 30 мл 3 н. раствора хлористого водорода в уксусной кислоте и выдерживают 30 мин при комнатной температуре. Раствор упаривают до масла, к остатку добавляют 150 мл диэтилового эфира, выпавший осадок растирают, отфильтровывают, промывают на фильтре эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе. Гидрохлорид гексапептида растворяют в 50 ДМФА и добавляют 4.65 г Boc-(S-дифенилметил)цистеина и 1.4 г 1-гидроксибензотриазола. При охлаждении в ледяной бане и перемешивании к раствору прибавляют 1.4 мл N-метилморфолина, затем 2.8 г ДЦГК. Смесь перемешивают 1 ч при охлаждении и еще 3 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок отфильтровывают, фильтрат упаривают при пониженном давлении, остаток обрабатывают 200 мл воды. Образовавшийся осадок растирают, отфильтровывают, промывают на фильтре 100 мл 5% водного раствора бикарбоната натрия и 100 мл воды и сушат на воздухе. Полупродукт растворяют в 30 мл ДМФА, упаривают до масла и растирают с диэтиловым эфиром, промывают на фильтре эфиром и сушат на воздухе. Полученный эфир Boc-гептапептида (12.1 г; R_f (Б) 0.55) растворяют в 100 мл ацетона и по каплям при перемешивании добавляют в течение 20 мин 25 мл 1 н. водного гидроксида натрия. Перемешивают смесь 1.5 ч при комнатной температуре, затем упаривают наполовину, разбавляют 150 мл воды, раствор фильтруют и подкисляют 3 мл уксусной кислоты. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают водой, сушат на воздухе. Получают 11.2 г Boc-гептапептида; R_f (Б) 0.40; масс-спектр: (M + H)⁺ 1306.2 (вычислено: 1307.647).10.7 g of ethyl ester of Boc-tyrosyl-phenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-proline (Example 5) is dissolved in 30 ml of acetic acid, 30 ml of 3 N are added. a solution of hydrogen chloride in acetic acid and incubated for 30 min at room temperature. The solution was evaporated to an oil, 150 ml of diethyl ether was added to the residue, the precipitate was triturated, filtered off, washed with ether and dried in a vacuum desiccator. The hexapeptide hydrochloride is dissolved in 50 DMF and 4.65 g of Boc- (S-diphenylmethyl) cysteine and 1.4 g of 1-hydroxybenzotriazole are added. Under cooling in an ice bath and stirring, 1.4 ml of N-methylmorpholine is added to the solution, followed by 2.8 g of DCCA. The mixture was stirred for 1 hour while cooling and another 3 hours at room temperature. The precipitate formed is filtered off, the filtrate is evaporated under reduced pressure, the residue is taken up in 200 ml of water. The precipitate formed is triturated, filtered, washed on the filter with 100 ml of a 5% aqueous solution of sodium bicarbonate and 100 ml of water and dried in air. The intermediate was dissolved in 30 ml of DMF, evaporated to an oil and triturated with diethyl ether, washed with ether and dried in air. The resulting Boc-heptapeptide ester (12.1 g; R _f (B) 0.55) was dissolved in 100 ml of acetone and 25 ml of 1N was added dropwise with stirring over 20 minutes. aqueous sodium hydroxide. The mixture is stirred for 1.5 hours at room temperature, then evaporated by half, diluted with 150 ml of water, the solution is filtered and acidified with 3 ml of acetic acid. The precipitate formed is filtered off, washed with water, and dried in air. Obtain 11.2 g of Boc-heptapeptide; R _f (B) 0.40; mass spectrum: (M + H) ⁺ 1306.2 (calculated: 1307.647).

Пример 7. Получение 3-(S-дифенилметилтио)пропионил-тирозил- фенилаланил-глутаминил-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил-пролина [Mpr(Dpm)-Try-Phe-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro-OH]. Example 7. Preparation of 3- (S-diphenylmethylthio) propionyl-tyrosyl-phenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-proline [Mpr (Dpm) -Try-Phe-Gln-Asn-Cys (Dpm) -Pro- OH].

Получают из 10.7 г этилового эфира Boc-тирозил-фенилаланил- глутаминил-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил-пролина и 3.3 г 3-(S-дифенилметилтио)-пропионовой кислоты, как описано в примере 6. Выход 10.1 г, R_f(Б) 0.45; масс-спектр: (M + H)⁺ 1191.4 (вычислено: 1192.507).Obtain from 10.7 g of ethyl ester of Boc-tyrosyl-phenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-proline and 3.3 g of 3- (S-diphenylmethylthio) -propionic acid, as described in example 6. Yield 10.1 g, R _f (B) 0.45; mass spectrum: (M + H) ⁺ 1191.4 (calculated: 1192.507).

Пример 8. Получение гидрохлорида Boc-(S-дифенилметил)цистеинил- тирозил-фенилаланил-глутаминил-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил- пролил-аргинил-глицинамида [Boc-Cys(Dpm)-Tyr-Phe-Glu-Asn-Cys(Dpm)- Pro-Arg-Gly-NH₂ • HCl, соединение Ia].Example 8. Preparation of Boc- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-tyrosyl-phenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-prolyl-arginyl-glycinamide hydrochloride [Boc-Cys (Dpm) -Tyr-Phe-Glu-Asn- Cys (Dpm) - Pro-Arg-Gly-NH ₂ • HCl, compound Ia].

К раствору 6.52 г Boc-(S-дифенилметил)цистеинил-тирозил- фенилаланил-глутаминил-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил-пролина (пример 6) и 1.82 г дихлорида аргинил-глицинамида в 40 мл ДМФА добавляют 1 г 1-гидроксибензотриазола и 0.8 мл N-метилморфолина. При охлаждении в ледяной бане и перемешивании к раствору прибавляют 1.25 г ДЦГК. Смесь перемешивают 1 ч при охлаждении и еще 8 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок отфильтровывают, фильтрат упаривают при пониженном давлении, остаток обрабатывают 150 мл воды. Образовавшийся осадок растирают, отфильтровывают, промывают на фильтре 40 мл 5% водного раствора бикарбоната натрия, 40 мл 0.5 н. соляной кислоты и 50 мл воды и сушат на воздухе. Полупродукт растворяют в 30 мл ДМФА, упаривают до масла, затем добавляют 80 мл этилацетата, осадок растирают, отфильтровывают, промывают на фильтре этилацетатом и эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе. Получают 7.0 г гидрохлорида соединения Ia; R_f(Б) 0.35, R_f(В) 0.65; масс-спектр: (M + H)⁺ 1520.5 (вычислено: 1519.92).To a solution of 6.52 g of Boc- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-tyrosyl-phenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-proline (Example 6) and 1.82 g of arginyl-glycinamide dichloride in 40 ml of DMF are added 1 g of 1-hydroxybenzene and 0.8 ml of N-methylmorpholine. While cooling in an ice bath and stirring, 1.25 g of DCCA is added to the solution. The mixture was stirred for 1 hour while cooling and another 8 hours at room temperature. The precipitate formed is filtered off, the filtrate is evaporated under reduced pressure, the residue is taken up in 150 ml of water. The precipitate formed is triturated, filtered, washed on the filter with 40 ml of a 5% aqueous solution of sodium bicarbonate, 40 ml of 0.5 N. hydrochloric acid and 50 ml of water and dried in air. The intermediate was dissolved in 30 ml of DMF, evaporated to an oil, then 80 ml of ethyl acetate was added, the precipitate was triturated, filtered off, washed on the filter with ethyl acetate and ether and dried in a vacuum desiccator. Obtain 7.0 g of the hydrochloride of compound Ia; R _f (B) 0.35, R _f (C) 0.65; mass spectrum: (M + H) ⁺ 1520.5 (calculated: 1519.92).

Пример 9. Получение гидрохлорида 3-(S-дифенилметилтио)пропионил- тирозил-фенилаланил-глутаминил-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил- пролил-D-аргинил-глицинамида [Mpr(Dpm)-Pre-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro-D- Arg-Gly-NH₂ • HCl, соединение Ie].Example 9. Preparation of 3- (S-diphenylmethylthio) propionyl-tyrosyl-phenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-prolyl-D-arginyl-glycinamide [Mpr (Dpm) -Pre-Gln-Asn-Cys ( Dpm) -Pro-D-Arg-Gly-NH ₂ • HCl, compound Ie].

Получают из 5.96 г 3-(S-дифенилметилтио)пропионил-тирозил- фенилаланил-глутаминил-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил-пролина и 1.82 г дигидрохлорида D-аргинил-глицинамида, как описано в примере 8. Выход гидрохлорида соединения Ie 6.3 г; R_f(Б) 0.32, R_f(В) 0.65; масс-спектр: (M + H)⁺ 1405.3 (вычислено: 1404.79).Prepared from 5.96 g of 3- (S-diphenylmethylthio) propionyl-tyrosyl-phenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-proline and 1.82 g of D-arginyl-glycinamide dihydrochloride as described in Example 8. Yield of hydrochloride of compound Ie 6.3 g; R _f (B) 0.32, R _f (C) 0.65; mass spectrum: (M + H) ⁺ 1405.3 (calculated: 1404.79).

Пример 10. Получение Boc-(S-дифенилметил)цистенил-тирозил- фенилаланил-глутаминил-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил- пролил-(Boc)лизил-глицинамида [Boc-Cys(Dpm)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Dpm)- Pro-Lys(Boc)-Gly-NH₂, соединение Ic].Example 10. Obtaining Boc- (S-diphenylmethyl) cystenyl-tyrosyl-phenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-prolyl- (Boc) lysyl-glycinamide [Boc-Cys (Dpm) -Tyr-Phe-Gln- Asn-Cys (Dpm) - Pro-Lys (Boc) -Gly-NH ₂ , compound Ic].

2.7 г N_α - карбоксил- N_ε -трет-бутоксикарбонил-лизил-глицинамида в 30 мл метанола гидрируют 2 ч над 0.2 г 10% Pd/C, катализатор отфильтровывают и фильтрат упаривают досуха. К остатку добавляют раствор 6.52 г Boc-(S-дифенилметил)цистеинил-тирозил-фенилаланил-глутаминил- аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил-пролина (пример 6) и 1 г 1-гидроксибензотриазола в 40 мл ДМФА. При охлаждении в ледяной бане и перемешивании к смеси прибавляют 1.25 г ДЦГК и 0.2 мл N-метилморфолина. Смесь перемешивают 1 ч при охлаждении и еще 5 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок отфильтровывают, фильтрат упаривают при пониженном давлении, остаток обрабатывают 150 мл воды. Образовавшийся осадок растирают, отфильтровывают, промывают на фильтре 40 мл 5% водного раствора бикарбоната натрия, 40 мл 0,5 н. соляной кислоты и 50 мл воды. Сырой продукт растворяют в 30 мл ДМФА, упаривают до масла, затем добавляют 100 мл этилацетата, осадок растирают, отфильтровывают, промывают на фильтре этилацетатом и эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе. Получают 7.1 г соединения Ic; R_f (Б) 0.45, R_f (В) 0.75; масс-спектр: (M + H)⁺ 1592.2 (вычислено: 1592.03).2.7 g of N _α - carboxyl-N _ε -tert-butoxycarbonyl-lysyl-glycinamide in 30 ml of methanol is hydrogenated for 2 hours over 0.2 g of 10% Pd / C, the catalyst is filtered off and the filtrate is evaporated to dryness. To the residue was added a solution of 6.52 g of Boc- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-tyrosyl-phenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-proline (Example 6) and 1 g of 1-hydroxybenzotriazole in 40 ml of DMF. While cooling in an ice bath and stirring, 1.25 g of DHA and 0.2 ml of N-methylmorpholine are added to the mixture. The mixture was stirred for 1 hour while cooling and another 5 hours at room temperature. The precipitate formed is filtered off, the filtrate is evaporated under reduced pressure, the residue is taken up in 150 ml of water. The precipitate formed is triturated, filtered, washed on the filter with 40 ml of a 5% aqueous solution of sodium bicarbonate, 40 ml of 0.5 N. hydrochloric acid and 50 ml of water. The crude product is dissolved in 30 ml of DMF, evaporated to an oil, then 100 ml of ethyl acetate is added, the precipitate is triturated, filtered, washed on the filter with ethyl acetate and ether and dried in a vacuum desiccator. Obtain 7.1 g of compound Ic; R _f (B) 0.45, R _f (C) 0.75; mass spectrum: (M + H) ⁺ 1592.2 (calculated: 1592.03).

Пример 11. Получение трифторацетата (S-дифенилметил)цистеинил- тирозил-фенилаланилил-глутаминил-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил- пролил-арнинил-глицинамида [H-Cys(Dpm)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro- Arg-Gly-NH₂ • 2TFA, соединение Ib].Example 11. Obtaining trifluoroacetate (S-diphenylmethyl) cysteinyl-tyrosyl-phenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-prolyl-arninyl-glycinamide [H-Cys (Dpm) -Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys ( Dpm) -Pro-Arg-Gly-NH ₂ · 2TFA, compound Ib].

3.2 г соединения Ia (пример 8) растворяют в 10 мл дихлорметана и 10 мл трифторуксусной кислоты и выдерживают раствор 1 ч при комнатной температуре. Раствор упаривают до масла, остаток растирают с 80 мл диэтилового эфира, осадок отфильтровывают, промывают на фильтре эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе. Получают 3.2 г трифторацетата соединения Ib; R_f (Б) 0.12, R_f (В) 0.50; масс-спектр: (M + H)⁺ 1419.2 (вычислено: 1419.80).3.2 g of compound Ia (example 8) was dissolved in 10 ml of dichloromethane and 10 ml of trifluoroacetic acid and the solution was kept for 1 h at room temperature. The solution was evaporated to an oil, the residue was triturated with 80 ml of diethyl ether, the precipitate was filtered off, washed on the filter with ether and dried in a vacuum desiccator. Obtain 3.2 g of trifluoroacetate compound Ib; R _f (B) 0.12, R _f (C) 0.50; mass spectrum: (M + H) ⁺ 1419.2 (calculated: 1419.80).

Пример 12. Получение трифторацетата (S-дифенилметил)цистеинил- тирозил-фенилаланилил-глутаминил-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил- пропил-лизил-глицинамида [H-Cys(Dpm)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro- Lys-Gly-NH₂ • 2TFA, соединение Id].Example 12. Obtaining trifluoroacetate (S-diphenylmethyl) cysteinyl-tyrosyl-phenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl- (S-diphenylmethyl) cysteinyl-propyl-lysyl-glycinamide [H-Cys (Dpm) -Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys ( Dpm) -Pro-Lys-Gly-NH ₂ · 2TFA, compound Id].

Получают из 3.2 г соединения Ic (пример 10), как описано в примере 11. Выход 3.3 г трифторацетата соединения Id; R_f (Б) 0.15, R_f (В) 0.55; масс-спектр: (M + H)⁺ 1390.5 (вычислено: 1391.78).Obtain from 3.2 g of compound Ic (example 10), as described in example 11. Yield 3.3 g of trifluoroacetate compound Id; R _f (B) 0.15, R _f (C) 0.55; mass spectrum: (M + H) ⁺ 1390.5 (calculated: 1391.78).

Пример 13. Получение Arg⁸-вазопрессина.Example 13. Obtaining Arg ^8- vasopressin.

1.65 г соединения Ib, 6 г перегнанного фенола и 32 мл трифторуксусной кислоты перемешивают атмосфере аргона 24 ч при комнатной температуре, затем трифторуксусную кислоту отгоняют при пониженном давлении. Остаток встряхивают с 20 мл петролейного эфира, после расслаивания петролейный эфир декантируют; эту операцию повторяют еще дважды. Остаток растворяют в 5 мл ледяной уксусной кислоты и к раствору при перемешивании добавляют 50 мл диэтилового эфира. Выпавший белый осадок быстро отфильтровывают, промывают на фильтре 3 • 10 мл эфира и сушат в вакуум-эксикаторе. Полученный трифторацетат дигидро-Arg⁸-вазопрессина (1.25 г) при перемешивании растворяют в 1000 мл дегазированной бидистиллированной воды, затем концентрированным водным аммиаком доводят pH раствора до 7.5. Раствор интенсивно перемешивают в открытом сосуде 2 сут при комнатной температуре до отрицательной реакции с нитропруссидом натрия. После окисления раствор наносят на колонку 5 x 20 см с DE-52 (Whatman, Англия) в ацетатной форме, промывают колонку 0.5 л 0.02 M ацетата аммония (pH 6.5), затем элюируют линейным градиентом ацетата аммония (pH 6.5) от 0.02 до 0.2 M. Фракции, содержащие чистый Arg⁸-вазопрессин, объединяют и лиофилизируют. Получают 550 мг Arg⁸-вазопрессина, ацетата; содержание основного вещества 74%; хроматографическая чистота по обращенно-фазовой ВЭЖХ 94%; [α] $\binom{D}{25}$ = -25.5^o (с 0.5, вода) в пересчете на основное вещество; масс-спектр: (M + H)⁺ 1084.8 (вычислено: 1085.312).1.65 g of compound Ib, 6 g of distilled phenol and 32 ml of trifluoroacetic acid are stirred under argon for 24 hours at room temperature, then trifluoroacetic acid is distilled off under reduced pressure. The residue is shaken with 20 ml of petroleum ether, after separation, the petroleum ether is decanted; this operation is repeated twice more. The residue was dissolved in 5 ml of glacial acetic acid and 50 ml of diethyl ether was added to the solution with stirring. The precipitated white precipitate was quickly filtered off, washed with a filter of 3 • 10 ml of ether and dried in a vacuum desiccator. The resulting dihydro-Arg ^8- vasopressin trifluoroacetate (1.25 g) is dissolved with stirring in 1000 ml of degassed bidistilled water, then the pH of the solution is adjusted with concentrated aqueous ammonia to 7.5. The solution is intensively stirred in an open vessel for 2 days at room temperature until a negative reaction with sodium nitroprusside. After oxidation, the solution is applied to a 5 x 20 cm column with DE-52 (Whatman, England) in acetate form, the column is washed with 0.5 L of 0.02 M ammonium acetate (pH 6.5), then eluted with a linear gradient of ammonium acetate (pH 6.5) from 0.02 to 0.2 M. Fractions containing pure Arg ^8- vasopressin are combined and lyophilized. 550 mg of Arg ^8- vasopressin, acetate are obtained; the content of the basic substance 74%; chromatographic purity by reverse phase HPLC 94%; [α] $\binom{D}{25}$ = -25.5 ^o (with 0.5, water) in terms of the basic substance; mass spectrum: (M + H) ⁺ 1084.8 (calculated: 1085.312).

Пример 14. Получение Lys⁸-вазопрессина.Example 14. Obtaining Lys ^8- vasopressin.

1.62 г соединение Ic, 6 г перегнанного фенола и 32 мл трифторукскусной кислоты нагревают в атмосфере аргона 30 мин в бане с температурой 70^oC, после охлаждения трифторуксусную кислоту отгоняют при пониженном давлении и далее проводят процесс, как описано в примере 13. Получают 470 мг Lys⁸-вазопрессина ацетата; содержание основного вещества 79%; хроматографическая чистота по обращенно-фазовой ВЭЖХ 96%; [α] $\binom{D}{25/}$ = -32.1^o (с 0.5, вода) в пересчете на основное вещество; масс-спектр: (M + H)⁺ 1057.6 (вычислено: 1057.302).1.62 g of compound Ic, 6 g of distilled phenol and 32 ml of trifluoroacetic acid are heated in an argon atmosphere for 30 minutes in a bath at a temperature of 70 ^° C, after cooling, trifluoroacetic acid is distilled off under reduced pressure, and then the process is carried out as described in example 13. 470 mg are obtained Lys ^8- vasopressin acetate; the content of the main substance is 79%; chromatographic purity by reverse phase HPLC 96%; [α] $\binom{D}{25 /}$ = -32.1 ^o (with 0.5, water) in terms of the basic substance; mass spectrum: (M + H) ⁺ 1057.6 (calculated: 1057.302).

Пример 15. Получение [дезамино¹, D-Arg⁸]вазопрессина.Example 15. Obtaining [desamino ¹ , D-Arg ⁸ ] vasopressin.

Получают из 1.45 г соединение Ie (пример 9), как описано в примере 13. Выход 490 мг [дезамино¹, D-Arg⁸]вазопрессина ацетата; содержание основного вещества 76%; хроматографическая чистота по обращенно-фазовой ВЭЖХ 96%; [α] $\binom{D}{25}$ = +53.3^o (с 0.5, вода) в пересчете на основное вещество; масс-спектр: (M + H)⁺ 1070.1 (вычислено: 1070.302).Compound Ie (Example 9) was prepared from 1.45 g, as described in Example 13. Yield 490 mg [desamino ¹ , D-Arg ⁸ ] vasopressin acetate; the content of the main substance is 76%; chromatographic purity by reverse phase HPLC 96%; [α] $\binom{D}{25}$ = +53.3 ^o (s 0.5, water) in terms of the basic substance; mass spectrum: (M + H) ⁺ 1070.1 (calculated: 1070.302).

Claims

Derivatives of vasopressin of the general formula:

where R ₁ is a tert-butoxycarbonyl amino group;
R ₂ is L-arginyl or N _ε -t-butoxycarbonyl-L-lysyl; R ₁ is an amino group, and R ₂ is L-arginyl or L-lysyl, R ₁ is a hydrogen atom, and R ₂ is L-arginyl,
as starting compounds for the preparation of vasopressins.